基于大黄鱼的合成肽(gydF4y2BaLarimichthys稚鱼gydF4y2Ba)IFNG1R蛋白质序列有潜在的抗菌活性gydF4y2Ba假单胞菌plecoglossicidagydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

水产食品安全作出了重要的贡献,但水产养殖细菌感染构成严重威胁,因为他们可能会导致高死亡率和减少生产力(gydF4y2BaKatzenback 2015gydF4y2Ba)。抗生素可以用来防止细菌疾病。然而,过度使用抗生素加速了耐多药细菌的进化(gydF4y2BaRoope et al ., 2019gydF4y2Ba)。迫切需要新的抗菌药物由于高成本的传统抗生素用于水产养殖和耐药细菌的崛起。gydF4y2Ba

抗菌肽(安培),也称为宿主防御肽(黄芪丹参滴丸)(gydF4y2BaShafee et al ., 2017gydF4y2Ba),有能力杀死肿瘤细胞,寄生虫,病毒、真菌、细菌和其他微生物(gydF4y2Ba钟et al ., 2017gydF4y2Ba)。另外,安培可以调解细胞趋化作用、细胞凋亡以及增加细胞免疫和促进伤口修复(gydF4y2Ba钟et al ., 2017gydF4y2Ba)。安培是两亲性的肽(疏水性氨基酸有超过40%),主要是阳离子(通常是在+ 2,+ 10)尽管一些鱼是阴离子(安培gydF4y2Ba赖et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2Ba瓦莱罗能源et al ., 2020gydF4y2Ba),短(约10到60个氨基酸)(gydF4y2Ba拉赫曼et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba查图尔维迪et al ., 2020gydF4y2Ba)。根据其结构特点,放大器可以分为四组,α-helical,β-sheet,循环,并扩大了肽。值得注意的是,大多数安培属于α-helical和β-sheet肽(gydF4y2Ba查图尔维迪et al ., 2020gydF4y2Ba)。安培的总净正电荷和疏水性杀灭细菌的能力至关重要。虽然革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞膜的成分不同,脂多糖(LPS)对革兰氏阴性细菌的外膜和革兰氏阳性细菌的细胞壁表面的磷壁酸阴离子,从而可以与安培的净正电荷(gydF4y2BaStromstedt et al ., 2009gydF4y2Ba)。已经证明,提高整体的净正电荷安培提高绑定能力细菌膜的表面,因此增加抗菌活性(gydF4y2Ba朱et al ., 2014gydF4y2Ba)。安培的疏水性也可以改变他们的抗菌作用。当安培附着在表面的细菌,疏水性氨基酸与细菌细胞膜的磷脂交互,从而破坏细胞膜完整性(gydF4y2BaSchmidtchen et al ., 2014gydF4y2Ba)。一般来说,高疏水性会改善安培的抗菌能力,但过度的疏水性可能损害宿主细胞膜(gydF4y2Ba木头et al ., 2014gydF4y2Ba)。安培也可以杀死细菌gydF4y2Ba通过gydF4y2Banon-membrane瞄准机制,如抑制核酸和蛋白质的生产,减少细菌的酶活性(gydF4y2BaBrogden et al ., 2005gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

基于膜和non-membrane瞄准机制,安培显示广谱抗菌活性和低电阻的选择,和被认为是最可行的替代抗生素(gydF4y2Ba亚希尔et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaMwangi et al ., 2019gydF4y2Ba)。尽管如此,内生安培有几个缺点,比如高毒性和可怜的耐温度、pH值和蛋白酶(gydF4y2Ba金正日et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaAnunthawan et al ., 2015gydF4y2Ba)。此外,生产大量的氨基酸残基的费用限制的治疗应用安培(gydF4y2Ba金正日et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaAnunthawan et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba欢et al ., 2020gydF4y2Ba)。为了克服这些缺点,研究人员最近集中在开发人工安培,并有很强的抗菌活性,宿主细胞低毒性,高温度和pH值的稳定性和低生产成本(gydF4y2Ba欢et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba谭et al ., 2021gydF4y2Ba)。音箱设计的方法包括基于模板的设计、定点突变、gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba创建肽、计算机设计、合理的设计(gydF4y2Ba欢et al ., 2020gydF4y2Ba)。基于模板的设计技术使用天然蛋白质序列模板作为起点,然后喜欢和修改根据残渣肽序列类型,如残留电荷、极性或疏水性(gydF4y2BaZelezetsky Tossi, 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba华人et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba杨et al ., 2019gydF4y2Ba)。变更后,肽的特征包括cationicity amphiphilicity,可以系统地调整生产最优安培(疏水性gydF4y2Ba欢et al ., 2020gydF4y2Ba)。这种方法可以降低成本的设计和合成,同时保留自然肽序列信息。对于物种的基因组已经测序,例如,大黄鱼(gydF4y2BaLarimichthys稚鱼gydF4y2Ba)(gydF4y2BaAo et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Baμet al ., 2018gydF4y2Ba),小说安培可能会生成基于基因组序列使用模板的设计技术。gydF4y2Ba

假单胞菌plecoglossicidagydF4y2Ba是一种革兰氏阴性细菌,可引起内脏白色结节病(VWND)大黄鱼(gydF4y2Bal .稚鱼gydF4y2Ba),orange-spotted石斑鱼(gydF4y2BaEpinephelus coioidesgydF4y2Ba)和虹鳟鱼(gydF4y2Ba雄鱼mykissgydF4y2Ba)(gydF4y2BaZhang et al ., 2018gydF4y2Ba)。这种疾病,特点是白色结节在肾、肝、脾的被感染的鱼,导致巨大的经济损失cage-cultured大黄鱼(gydF4y2BaZhang et al ., 2014gydF4y2Ba)。它已经证明了一个名为β-defensin的AMP对杀菌效果gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba(gydF4y2Ba李et al ., 2021gydF4y2Ba),这表明放大器可以用于预防和治疗VWND鱼。值得注意的是,大多数安培可以不加选择地杀死致病细菌和益生菌,从而破坏肠道菌群,破坏健康的微生物群和免疫系统之间的平衡(gydF4y2Ba埃克特et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba谭et al ., 2021gydF4y2Ba)。因此,用窄谱抗菌活性与安培gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba将对VWND理想的抗菌药物。gydF4y2Ba

在这项研究中,大黄鱼IFNG1R克隆,SKL17-2,合理的肽使用基于模板的设计技术,设计合成了基于SKL17 17-aa肽总净正电荷和IFNG1R存在的疏水性蛋白序列。SKL17-2合成肽具有很强的抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba2μM麦克风的,但对其他测试细菌抗菌活性,表明其窄谱抗菌活性。SKL17-2被发现有广泛的温度和pH值稳定、低细胞毒性和溶血可以忽略不计。进一步的研究表明,细胞膜的α-helical SKL17-2至关重要的结构破坏和抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

完整的cDNA克隆大黄鱼IFNG1RgydF4y2Ba

RNA进行了隔离和互补脱氧核糖核酸合成(如前所述)(gydF4y2BaZhang et al ., 2022gydF4y2Ba)。基因序列的基础上IFNG1R大黄鱼基因组序列中标识(加入基因库号:NC_040020.1),引物(F: CGTTTGTATCGAAGCGGTCCATT R: TGATTCATGATTTCTGTTTTTATTCG)设计。和Eastep超级总RNA提取工具包(Promega)被用来extrat总RNA,合成第一链cDNA利用Eastep RT大师(Promega)混合,然后PCR是放大了开放阅读框(ORF)大黄鱼IFNG1R。PCR产物测序在Sangon生物技术有限公司(上海,中国)。随后,ClustalW软件(版本1.83)被用来执行多重序列比对。蛋白质识别进行了使用专家分析系统(gydF4y2Bahttp://www.expasy.org/tools/gydF4y2Ba),信号肽预测使用SignalP计划(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/gydF4y2Ba)。Neighbor-joining (NJ)方法的大型项目(11.0.11版)被用来构建系统树与1000年启动复制。gydF4y2Ba

多肽合成gydF4y2Ba

肽是由Sangon合成生物技术有限公司(上海,中国)。原油肽纯化了反相高效液相色谱法(rp)最终纯度大于95%。合成肽是储存在−80°C的冻干干燥粉和resuspended在磷酸缓冲盐(PBS)时使用。gydF4y2Ba

菌株gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2Ba(写明ATCC 25922),gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba(写明ATCC 9027),gydF4y2Ba鼠伤寒沙门氏菌gydF4y2Ba(写明ATCC 14028),gydF4y2Ba弧菌parahaemolyticusgydF4y2Ba(写明ATCC 17802),gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(写明ATCC 25923)gydF4y2Ba链球菌agalactiaegydF4y2Ba(写明ATCC 13813)从美国获得类型文化集合(写明ATCC)。gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba为患病的大黄鱼孤立,保存在我们的实验室(gydF4y2Ba李et al ., 2020gydF4y2Ba),这一毒株被发现感染各种各样的鱼类,如大黄鱼、石斑鱼orange-spotted,虹鳟鱼、香鱼(gydF4y2BaPlecoglossus altivelisgydF4y2Ba),pejerrey (gydF4y2BaOdontesthes bonariensisgydF4y2Ba),发现鲈鱼(gydF4y2BaLateolabrax maculatusgydF4y2Ba),mandarinfish (gydF4y2BaSiniperca chuatsigydF4y2Ba)、澳洲肺鱼(gydF4y2Ba尖吻鲈属calcarifergydF4y2Ba)和斑马鱼(gydF4y2Ba鲐鱼类gydF4y2Ba)(gydF4y2BaZhang et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba太阳et al ., 2020gydF4y2Ba)。细菌培养在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)和营养媒介gydF4y2Ba诉paraheamolyticusgydF4y2Ba与3%生理盐水补充。gydF4y2Ba

抗菌活性分析gydF4y2Ba

的抗菌活性肽决心使用采用的方法。细菌细胞种植到mid-logarithmic阶段之前被稀释在TSB最后1×10的浓度gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU /毫升。随后,90μLμL合成肽结合的细菌在96孔板的解决方案。孵化后18 h在37°C (28°CgydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba),最低抑制浓度(麦克风)通过无限M在600 nm纳米分光光度计(Tecan、瑞士)。麦克风被定义为最低的肽浓度,抑制95%以上的细菌生长。此后,50μL每个孵化的混合物被转移到胰蛋白酶的大豆琼脂(TSA)板块隔夜孵化确认最小杀菌浓度(MBCs)。MBCs被定义为肽浓度最低,99.9%以上的细菌细胞死亡。抗菌活性的SKL17-2也是衡量一个细菌生长抑制区试验。在这个分析,60μL肽的浓度32μM被发现在TSA板包含gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba(约10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在TSA CFU /毫升),同样体积的10毫米PBS是作为控制。板是储存在28°C 16 h观察抑菌圈。gydF4y2Ba

动力学肽的杀菌活性gydF4y2Ba

p . plecoglossicidagydF4y2Ba被曝光的肽的浓度1×MBC,收集和细胞的混合物在不同时间点,连续稀释,转移到TSA盘子来确定存活率。接受pbs的gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba作为控制。细菌的存活率(%生存)计算peptide-treated细胞的数量除以接受pbs细胞的数量。gydF4y2Ba

细胞毒性和溶血肽gydF4y2Ba

一个CCK-8试验进行调查的影响肽大黄鱼巨噬细胞的可行性。总之,100μL LYC-FM细胞(约2×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞)被添加到96 -孔板和培育在28°C。十二小时后,新鲜的培养基是100年取代μL介质与肽的浓度范围的补充。细胞培养48 h CCK-8之前解决方案(Biosharp,中国)。大约4 h(孵化后,吸光度测量在450 nm的无限纳米分光光度计(Tecan、瑞士)。细胞治疗2% Triton x - 100作为积极的控制(AgydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba}),而未经处理的细胞作为消极的控制(AgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)。细胞生存能力率计算使用以下公式:细胞生存能力率(%)= (gydF4y2Ba_肽gydF4y2Ba−一gydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba})/ (gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba−一gydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba})×100。LYC-FM细胞培养在同样的方式如前所述(gydF4y2BaZhang et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

评估肽溶血,血红蛋白的数量在大黄鱼红细胞(红血球)肽治疗后评估。总之,新鲜血液细胞大黄鱼在500×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟在4°C,与PBS洗了三次,在PBS resuspended最终浓度为1.5×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba细胞/毫升。然后,120μL红血球混合80μL一系列肽的解决方案和孵化1 h在28°C。后使离心细胞混合物在500×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,上层清液的吸光度测量在405 nm的无限Nano分光光度计(Tecan、瑞士)。红细胞表面处理2% Triton x - 100作为积极的控制(AgydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba}),而未经处理的细胞作为消极的控制(AgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)。溶血肽比例计算使用以下公式:溶血(%)= (gydF4y2Ba_肽gydF4y2Ba−一gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)/ (gydF4y2Ba_{One hundred.gydF4y2Ba}−一gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)×100。gydF4y2Ba

温度和pH肽的稳定性gydF4y2Ba

确定热稳定性,肽孵化20 30分钟,40岁,60岁,80,或100°C。评估pH值稳定,4 h的肽是孵化50 mM glycine-HCl缓冲区(pH值2.0),50毫米醋酸钠缓冲(pH值4.0),50 mM 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic acid-NaOH缓冲区(pH值6.0),50 mM Tris-HCl (pH值8.0),或50 mM glycine-NaOH (pH值10.0)。治疗后,10μL肽的解决方案是添加到90μLgydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba解决方案在一个96孔板,最终在1×MBC肽的浓度。18 h的孵化后28°C,细菌细胞连续稀释和转移到TSA板块来衡量存活率。细菌细胞治疗PBS作为控制。杀菌活性计算存活率100% -每个治疗的存活率。gydF4y2Ba

结构测量gydF4y2Ba

mos - 500光谱偏振器(的生物逻辑的造物九律,法国格勒诺布尔)是用来测量肽的圆二色性(CD)光谱在190到250纳米之间。的光谱样本含0.2毫克/毫升肽在PBS或膜环境检查,与膜环境包括60毫米SDS胶束和100% 2,2,2-trifluoroethanol (TFE)。三个独立的光谱扫描,平均计算得到三个技术复制。扫描光谱被转换为平均摩尔椭圆率使用公式:gydF4y2BaθgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba=gydF4y2BamdeggydF4y2Ba·gydF4y2Ba米/gydF4y2Ba(gydF4y2BalgydF4y2Ba·gydF4y2BacgydF4y2Ba·gydF4y2BangydF4y2Ba),gydF4y2BaθgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba是摩尔椭圆率(度·厘米吗gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba·dmolgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba});gydF4y2BamdeggydF4y2Ba是衡量缓冲在给定波长椭圆率修正;gydF4y2Ba米gydF4y2Ba的摩尔质量是肽;gydF4y2BalgydF4y2Ba是路径长度(mm);gydF4y2BacgydF4y2Ba是肽浓度(毫克/毫升);和gydF4y2BangydF4y2Ba是氨基酸的数量。HeliQuest分析网站(gydF4y2Bahttps://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.pygydF4y2Ba)是用于显示螺旋轮SKL17-2的投影。gydF4y2Ba

膜完整性测试gydF4y2Ba

确定细菌膜完整性肽治疗后,180μLgydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba细胞(1×10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU /毫升)mid-logarithmic相结合20μL肽的最终浓度为4,8、16、32μM和孵化为2 h 28°C。孵化后,最终6μg /毫升的浓度propidium碘(π,Sigma-Aldrich)补充道。π的涌入到细菌细胞研究使用一个Accuri C6 +流式细胞分析仪(BD生物科学)与10000事件。使用FlowJo cell-penetrating效率分析软件包(树明星)。gydF4y2Ba

扫描电子显微镜成像gydF4y2Ba

细菌形态改变肽治疗后使用扫描电子显微镜观察。10毫升的肽是90μL补充道gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba细胞(1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU /毫升TSB)决赛中肽的浓度4μM。孵化2 h后28°C,细菌被固定,脱水,真空干燥,溅射镀黄金,并观察σ300场发射扫描电子显微镜(蔡司)5 kV的加速电压。细菌处理同样体积的PBS作为控制。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有的实验都是在三个独立的场合进行,除非另有说明。数据提出了均值的平均值±标准误差(SEM)。进行了统计比较使用单向方差分析或t与SPSS软件(版本19日,IBM)。不同的价值gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

完整的cDNA序列分析的大黄鱼IFNG1RgydF4y2Ba

大黄鱼的完整cDNA序列IFNG1R克隆(加入基因库号:ON997294)是基于其基因组序列PCR(加入基因库号:NC_040020.1)。IFNG1R由552个碱基对的ORF (bp),编码183个氨基酸(aa)的蛋白质(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。根据多重序列比对结果,大黄鱼IFNG1R共享身份最高的(约54.2%)和全鱼IFNG1R和最低的身份(大约5.4%)与鲤鱼IFNG1R (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。构建系统发育树,进一步确认识别大黄鱼IFNG1R。与其他鱼类大黄鱼IFNG1R是组合在一起IFNG1R序列(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba),这表明基因克隆是大黄鱼IFNG1R。gydF4y2Ba

SKL17-2具有很强的抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba

使用大黄鱼IFNG1R蛋白质序列作为一个模板,一个17-aa肽SKL17合成。不幸的是,SKL17肽没有表现出抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba(数据没有显示)。之后,一种新的肽称为SKL17-2被替换第七和合理开发十二SKL17肽与精氨酸氨基戊二酸(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。有趣的是,合成SKL17-2肽具有抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba,麦克风和2和4μM MBC值,分别为(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。更直观地演示SKL17-2的抗菌活性,抑菌圈法是利用。所示gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba相比,一个明显的抑菌圈出现在SKL17-2 TSA板的控制。随后,SKL17-2的杀菌动力学活动gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba被检查。结果表明,SKL17-2可以杀死90%的gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba在8 h,所有的细菌被SKL17-2根除后14 h (gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

SKL17-2具有微弱的抗菌活性与其他测试细菌gydF4y2Ba

上述结果表明,SKL17-2有很强的抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba,然后与其他细菌的活动进一步调查。在32μM肽浓度时,SKL17-2显示对微不足道的抗菌活动gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba诉parahaemolyticusgydF4y2Ba,gydF4y2Ba美国agalactiaegydF4y2Ba和弱抗菌活动gydF4y2Ba美国沙门氏菌感染gydF4y2Ba和gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

低细胞毒性和溶血的SKL17-2可以忽略不计gydF4y2Ba

CCK-8化验表明,细胞存活率大于70%肽政府后,表明SKL17-2只有弱细胞毒性LYC-FM细胞(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。对大黄鱼SKL17-2红血球的溶血试验剂量低于0.5%,表明SKL17-2微不足道的溶血活性(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。因此,SKL17-2表现出良好的生物安全,进一步保证其临床应用的安全性。gydF4y2Ba

高稳定性的SKL17-2温度和pH值gydF4y2Ba

SKL17-2显示强大的抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba临床病原体,严重影响鱼类养殖,从而表明其应用的潜在治疗VWND鱼。在实际应用程序中,SKL17-2的稳定必须考虑各种条件下的温度和pH值。SKL17-2的抗菌活性是不变的,当接触到20岁,40岁,60岁,80,或100°C (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)。SKL17-2表现出强大的抗菌活性,pH值从2到10 (gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。这些结果表明,SKL17-2很宽容不同的温度和pH值,甚至极端条件下的温度和pH值。gydF4y2Ba

结构分析的SKL17-2gydF4y2Ba

二级结构的膜环境对肽抗菌活性至关重要,和SKL17-2结构使用CD分光光度法测定不同的解决方案。所示gydF4y2Ba图6gydF4y2BaSKL17-2在PBS的二级结构是由一个线圈的特点,与消极的最低在200海里。有趣的是,CD谱SKL17-2 SDS和TFE模仿细菌细胞膜的环境,显示两个负的最小值在208和222海里,暗示α-helix SKL17-2的主要结构。此外,轮图(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)透露,SKL17-2展出一个疏水的脸和阳离子的脸。gydF4y2Ba

SKL17-2细菌膜透性gydF4y2Ba

PI染色细胞的核酸可以反映出破坏细胞膜结构(gydF4y2Ba杨et al ., 2019gydF4y2Ba)。这是一个全面的方法来决定细胞膜的完整性。根据相对荧光强度、渗透的效率SKL17-2细菌所示gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba。结果表明,控制(没有肽)导致只有0.3% PI-positive细胞,而SKL17-2治疗导致积极的核酸染色14.1%(4μM), 15.8%(8μM), 41.1%(16μM)和50.9%(32μM),这表明SKL17-2破坏了细菌膜剂量依赖性的方式。这些结果表明SKL17-2杀死细菌通过membrane-permeabilizing行动。gydF4y2Ba

观察细菌形态SKL17-2对待gydF4y2Ba

使用扫描电子显微镜观察细菌的形态变化与SKL17-2治疗后。细胞膜的完整性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba被SKL17-2治疗严重受损gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。控制细菌细胞表现出光滑的表面和正常形态,但是gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba对待SKL17-2显示明显的形态学变化。peptide-treated细胞的膜表面被广泛破坏,变得明显粗糙和破损。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

p . plecoglossicidagydF4y2Ba是一个致命的病原体,可导致鱼(VWND和随之而来的高死亡率gydF4y2BaZhang et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2020gydF4y2Ba)。在中国,氟喹诺酮类抗生素常用于治疗鱼类疾病(gydF4y2Ba他et al ., 2012年gydF4y2Ba)。然而,耐药细菌的崛起由于抗生素的过度使用造成了重大威胁,水产养殖和创造了棘手的临床治疗瓶颈(gydF4y2BaKatzenback 2015gydF4y2Ba)。目前,开发新型抗菌药物在水产养殖的战斗抗生素耐药性是至关重要的。安培,独特的抗菌活性,破坏细菌细胞膜,显示可能取代传统的抗生素是一种新颖的选择(gydF4y2Ba王et al ., 2018gydF4y2Ba)。然而,天然安培的缺点包括弱有效性,溶血或细胞毒性影响宿主细胞,合成成本高。相比之下,gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba合成肽抑菌效果和降低的缺点可能的耐药(gydF4y2BaCampoccia et al ., 2010gydF4y2Ba)。规避上述缺点,短肽生成人工从自然肽模板被认为是一个有效的策略(gydF4y2Ba罗et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

基于大黄鱼IFNG1R蛋白质序列,一个叫SKL17-2 17-aa短肽合成显示强大的抗菌活性。正电荷和整体的净电荷放大器已被证明是至关重要的肽和阴离子分子之间的静电吸附在膜表面的细菌(gydF4y2Ba周et al ., 2016gydF4y2Ba)。值得注意的是,合适的正电荷的AMP提高其抗菌活性,而过度的正电荷可能会降低其抗菌活性(gydF4y2Ba周et al ., 2016gydF4y2Ba)。一般来说,一个正电荷从+ 4 + 6是最优的肽的抗菌活性和正电荷由带正电的残留的贡献如赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H) (gydF4y2Ba杨et al ., 2019gydF4y2Ba)。通过在其侧链胺组,赖氨酸可以与带负电荷的phosphatidylglycerol交互,脂多糖,lipoteichoic酸的细菌膜,冗长的脂肪族侧链可以本地化的肽细菌细胞膜的脂质双分子层(gydF4y2BaBhat et al ., 2022gydF4y2Ba)。其侧链胍盐组,精氨酸可以形成强大的双配位基的氢键phosphor-rich膜表面的细菌,促进更深层次的膜插入和安培更能够膜中断(gydF4y2Ba杨et al ., 2019gydF4y2Ba)。SKL17-2包含八个正电荷,包括五个赖氨酸和精氨酸残基三,四个正电荷在SKL17相比,并显示强大的抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba,而SKL17没有抗菌活性(数据没有显示)。这可能是因为SKL17缺乏足够的正电荷吸附到细菌膜。令人惊讶的是,SKL17-2显示强大的抗菌活性gydF4y2Bap . PlecoglossicidagydF4y2Ba,而表现出软弱或微不足道的对其他细菌的抗菌活性。可能的原因是,有限合伙人的结构变化在不同的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性菌的细胞壁成分是不同的(gydF4y2Ba李et al ., 2018gydF4y2Ba)。这些结果表明,总净正电荷安培的抗菌活性的影响。gydF4y2Ba

是否抗生素或安培,理想的抗菌药物应瞄准特定病原体。如果抗菌药物有广谱抗菌活性,它们可能杀死益生菌,造成肠道菌群疾病和破坏健康的微生物群和免疫系统之间的平衡(gydF4y2Ba谭et al ., 2021gydF4y2Ba)。有趣的是,SKL17-2肽设计可以杀死gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba但薄弱或微不足道的抗菌活性与其他细菌,表明其窄谱抗菌活性。相比之下,β-defensin,自然AMP,显示对广谱抗菌活动gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba以及其他细菌(gydF4y2Ba李et al ., 2021gydF4y2Ba)。SKL17-2的窄谱抗菌活性,使其成为理想的治疗防治剂gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba在水产养殖感染。gydF4y2Ba

许多调查表明,一个稳定的空间二级结构的形成是一个重要的元素在分子水平上AMP抗菌活性(gydF4y2Ba杨et al ., 2019gydF4y2Ba)。在SDS和TFE的解决方案,我们的CD的发现表明SKL17-2截然不同的和稳定的α-helical二级结构。此外,SKL17-2有两亲的α-helical一侧与疏水残基结构和阳离子残留物在另一边。它已经证明了安培的两性分子的特征是至关重要的交互与细菌细胞膜和抗菌活性(gydF4y2BaZelezetsky Tossi, 2006gydF4y2Ba)。这种效应是一致的与膜透化作用和扫描电镜获得的数据。gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba对待SKL17-2显示积极的核酸染色,染色阳性的比例与肽浓度增加,表明膜的透化作用gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2BaSKL17-2后治疗。此外,扫描电镜数据明确显示,SKL17-2形态学改变细菌引起的膜,如粗化和腐败,表明SKL17-2可能发挥其强大的抗菌效应主要是通过破坏细菌的膜结构。gydF4y2Ba

临床应用之前,安培真核细胞的毒性应评估。在我们的研究中,SKL17-2 LYC-FM细胞细胞毒性很低以及一个贫穷的溶血反应和红细胞的溶血率小于0.5%,表明SKL17-2可能维持细胞选择性gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba并将在大黄鱼是安全的应用程序。这些发现进一步支持的潜力SKL17-2 VWND治疗管理。我们的长期目标是使用SKL17-2作为饲料添加剂在水产养殖,因此抗菌活性变化在不同的温度和pH值应该评估由于高温和复杂条件变化在饲料加工。在我们的调查中,SKL17-2展示良好的温度和pH值稳定,暗示它有一个很好的治疗在临床的应用潜力。gydF4y2Ba

总之,肽的目标gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba开发和生产基于大黄鱼IFNG1R蛋白质序列。肽具有低细胞毒性和溶血活性可以忽略不计,以及高温和pH值稳定,表明有前途的治疗的潜在治疗VWND所致gydF4y2Bap . plecoglossicidagydF4y2Ba。作为SKL17-2很强的抗菌活性gydF4y2Bap . plecoglossicida体外gydF4y2Ba,SKL17-2的治疗潜力作为饲料添加剂在未来需要进一步的调查。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步调查可以直接到相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

YL执行大部分的实验,分析数据,并写了手稿。SY和XW导致了抗菌化验。RX, JC,帮助与实验操作。X-YZ和XC设计研究和修订后的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作是支持由中国国家重点研发项目(2018 yfd0900505),中国国家自然科学基金(32102837),中国农业研究系统的财政部和马拉(格兰特CARS-47)、福建省自然科学基金(2021 j05021),福建科学技术厅(2021 n5008),并为大学生创新训练项目和创业(X202210389122)。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba