从帮助调节转录组配置文件的Ifng⁺Il10⁺Il21⁺Cd4⁺Th1细胞表明他们的角色在调节炎症实验锥虫病

1介绍

锥虫属evansi(t . evansi),也称为锥虫属brucei evansi,是一种单细胞原生动物寄生虫导致salivarian动物锥虫病(伊氏锥虫病),在极少数情况下,非典型人类锥虫病(1,2)。在牲畜以及小鼠模型,t . evansi感染常引起贫血的慢性消耗性疾病品质,肌肉分解和减肥(1,3)。尽管t . evansi基因相关t . brucei,它缺乏能力是周期性通过采采蝇传播由于其动基体部分或完全缺乏DNA。因此,t . evansi寄生虫依靠机械传动由几个物种hematophagous苍蝇(4)。这使得寄生虫从非洲采采蝇传播带世界其他地区(5)。相比之下,采采蝇传播动物引起的感染t . brucei和t . congolense人类锥虫病引起的,以及t . b . gambiense和t . b . rhodesiense是局限于撒哈拉以南的非洲地区(6)。

几十年来,侵染诱导细胞反应和他们的相互作用与寄生虫已经深入研究更好的理解疾病机制。在锥虫病的情况下,这导致了普遍的了解寄生虫逃避抗体介入杀戮和诱导免疫抑制的一般状态和疾病(7,8)。然而,调查这些事件在细胞决议,如流式细胞仪和大多数传统技术在体外培养技术是不够的。转录组的引入方法,包括scRNA-seq分析,最近允许获取新的深入了解病理事件锥体虫感染相关的大脑、肝脏、脂肪组织、脾(3,9- - - - - -13)。后者一直特别重要的理解机制驱动的感应感染相关的贫血,以及一般的免疫病理反应。

作为salivarian锥细胞外的病原体,抗体反应构成的主要宿主防御系统。因此,要想成功,锥获得多个独立的方法来规避抗体介入破坏。抗原变异的表面层和抑制complement-mediated裂解的主要工具是受雇于锥虫感染(确保成功的发展14,15)。此外,锥虫有能力操纵宿主抗体生产能力直接影响B细胞和浆细胞(pc) (16- - - - - -19)。这里,最近实现scRNA-seq分析提供了一个详细的细胞图来说明如何infection-associated B细胞内稳态的破坏,以及如何加速终端分化成电脑没有天真的B细胞补充结果的整体废除在慢性锥体虫感染宿主产生抗体(10,20.)。

当考虑宿主适应性免疫系统,三个原则是很重要的。首先,自适应B细胞反应是T细胞依赖。因此,得到一个全面的看待trypanosomosis-associated改变B细胞内稳态,全面了解T细胞生物学是必要的。其次,T细胞在多种免疫调节过程非常重要,因为他们可以构成一系列细胞因子的主要来源。最后,主持人T细胞室包含一系列复杂的不同,包括天真的CD4细胞⁺细胞、CD4⁺辅助T细胞(Th1、Th2), T卵泡辅助(Tfh)细胞,FOXP3⁺调节性T细胞亚群),细胞毒性CD8⁺T细胞,记忆效应记忆T细胞、组织居民表型T (T_RMNKT细胞)细胞,根据一个特定的病理背景其他较小的人口扩张(Th3 Th9, Th17, Th22, ILC1, 2和3)(21- - - - - -23)。

在锥体虫感染,也被称为T细胞炎性病理的重要因素。有趣的是,他们也被描述为监护人的免疫系统产生抗炎细胞因子通过他们的能力。这种双重角色的参与是最好的反映trypanosomosis-induced T细胞在诱导INF-γ促炎细胞因子和抗炎细胞因子il - 10。而首先是为主机提供一个初始的关键免疫环境,支持控制寄生虫血症(24,25),随后诱导il - 10对预防至关重要IFN-γ/ TNF驱动hyper-inflammation (26- - - - - -29日)。迄今为止,然而一直很难取得共识的T细胞和亚种群是完全负责个人免疫功能,使用细胞化验和常规免疫方法。如前所述,这些技术只是缺乏决议在本例中提供详细的答案。例如,CD4细胞⁺Th1 T细胞已经被一些作者认为是重要的早期IFN-γ(27,30.,31日),CD8的贡献⁺细胞在细胞因子的细胞外锥体虫感染更模棱两可(30.,31日)。当谈到调节性T细胞的作用,通常被认为是重要的抗炎的il - 10,情况更加混乱。这里,发现不同研究之间使用不同的非洲锥虫物种,和在一个案例中,例如实验模型t . congolense,没有共识这些细胞的作用。事实上,虽然多次研究表明亚群的有害作用在感染控制(32- - - - - -36),至少有一项研究表明,这些细胞在调停延长主机生存(37)。为t . brucei相互感染,结果更一致。事实上,尽管在体外发现CD4细胞的分化⁺可以触发T细胞亚群的作用t . brucei释放细胞外囊泡(TbEVs) (38),在活的有机体内结果表明,没有扩张的亚群在感染期间,,他们作为抗炎介质必须是最小的(32,39)。

除了在细胞因子的作用在生产、CD4细胞⁺Th细胞亚群也至关重要的抗原呈递细胞的激活的监管,特别是B细胞。他们这样做的时候通过从事信息接触相互作用由CTLA-4 (CD152),目前的CD4细胞亚群和激活⁺Th细胞和抗原呈递细胞CD80和CD86伙伴。在这种背景下,CTLA-4通常应该提供的“了”的信号函数作为hyper-activation预防信号。有趣的是,我们所知,到目前为止,这种交互的上下文中没有解决锥虫病。最后,同时Tfh细胞通常被认为是一个合适的抗原刺激B细胞的关键,因为他们需要亲和力成熟和类切换,这些细胞的作用至今没有明确的背景下锥虫病。目前也没有任何信息的贡献之间的交互CD28、CD40L、国际安全和发展理事会(CD278)和PD1 (CD279) Tfh CD86和互补绑定合作伙伴,CD40, ICOSL (CD275或B7-H2)和PD1L B细胞(CD274或B7-H1)。

总之,虽然trypanosomosis-activated T细胞一般被认为是重要的细胞因子平衡的维护,并扮演着一个关键角色在大脑infection-associated病理学(40- - - - - -42)和肝脏炎症(43),他们也认为是关键的潜在玩家B细胞内稳态的破坏特征的慢性阶段的牲畜和实验锥虫病。因此,T细胞剧目的复杂性,和表型的变化,可以引起感染和阻碍传统免疫学调查方法,这里我们报告的结果scRNA-seq分析关注解开脾脏CD4的详细的异质性⁺在慢性T细胞t . evansi小鼠模型。通过关注的回应各种进步感染T细胞亚群,我们可以首次报告一个独特的监管对CD4基因签名⁺Th1 T细胞。这些细胞,而不是亚群,似乎守门的平衡炎症和抗炎细胞因子在慢性感染。最后,一个独特的基因签名调制(T)卵泡辅助细胞呈现在这项研究中,这也是锥虫病的慢性感染阶段特征。

2材料和方法

2.1老鼠和伦理语句

女性C57Bl / 6小鼠年龄在7 - 9周买来KOATECH(京畿道、韩国),分别安置在通风笼(IVC),并提供笼浓缩。实验动物程序授权的根特大学校园全球动物保健机构(GUGC IACUC)。实验动物协议编号是2020 - 016和2021 - 019。

2.2寄生虫和感染

camel-derived血液stabilatet . evansi这里到梅合组噶93 (ITMAS 150399 c),在老鼠和存储在50% Alsever传播的解决方案(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)和10%甘油(最终),获得了从热带医学研究所,安特卫普,比利时。stabilate是类型t . evansi式(3)。由腹腔内感染(i.p)在100年与200年寄生虫注入μL杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS;表达载体、钙、美国)。

2.3脾细胞准备单细胞测序

孤立的脾脏均质使用使用gentleMACS™分离器(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)在6毫升的DMEM添加10%的边后卫(美国有限公司阿特拉斯生物制剂)和1%青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。70µm细胞过滤器过滤后(SPL生命科学、Gyeongi-do、韩国)摆脱任何碎片,细胞被离心机在4°C g 314 x 7分钟。细胞颗粒然后re-suspended孵化在5毫升的红细胞裂解缓冲(美国CA Biolegend) 5分钟在冰上。随后,30毫升DPBS(表达载体、钙、美国)补充0.04% BSA (Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)被添加到停止裂解反应,后跟一个离心(314 x在4°C g 7分钟)。使离心后,细胞被保存在DPBS补充0.04% BSA在冰上。细胞的浓度和可行性评估通过混合细胞悬液在1:1比例0.4%台盼蓝溶液(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)之前使用血细胞计数器计数。大约10000个细胞准备脾匀浆可行性高(80%以上)样本用于单细胞分区使用10倍基因组学和scRNA-seq库代铬单细胞3 '试剂盒v3(10倍基因组学、钙、美国)。测序进行NovaSeq600平台上使用TruSeq Illumina公司引物。样品准备,脾脏从一个未受感染,感染后的14天(dpi)鼠标使用。作为42 dpi发布之前(3),脾细胞悬液从一个鼠标以及汇集小鼠脾细胞悬架从3个人(比比率)准备,使scRNA-seq结果的再现性的确认。

2.4单一细胞RNA序列数据处理

2.4.1多路分解、对齐和UMI计数

生成基于原始调用(BCL)文件从音序器处理10倍基因组Cellranger管道。总之,使用cellranger mkfastq基类库文件去复用到sample-specific FASTQ文件。随后,星对准器是用来使测序读the10X预构建小鼠参考基因组计划(mm10)cellranger计数命令。因此,细胞条形码和独特的分子标识符(UMI),过滤,并纠正创建矩阵表达式分别为每个样本(未受感染的,14 dpi, 42 dpi),然后用于进一步的处理和分析。

2.4.2 RNA和技术环境噪声去除

在分析修包之前,cellranger计数输出,包括矩阵表达式之前和之后空滴过滤,被SoupX利用软件来为每个样本估计和消除环境污染mRNA (44)。总之,环境RNA表达谱计算从空滴。这个概要文件帮助评估污染分数前的每一个细胞,让每个细胞的表达式被纠正的基础上预测污染。此外,基因是已知的导致技术背景噪音,Gm42418和AY036118 (45)手动移除矩阵表达式。

2.4.3预处理和样品合并

环境RNA删除矩阵表达式被用作修(v4.0)输入生成3个人修对象为每个时间点(未受感染的,14 dpi, 42 dpi)。标准程序过滤低质量细胞分别申请每个样本。细胞拥有超过6000个基因,细胞线粒体基因表达计数超过总额的10%基因检测被排除在分析之外。接下来,3对象合并后创建一个数据集,包含脾细胞在感染资料来自三个不同的时间点。随后,表达数据规范化使用LogNormalize法与比例因子设置为默认值。和谐包是用来删除任何批影响创造的技术合并样本之间的差异(46)。

2.4.4空间减少,集群、注释和细胞类型

2000高度可变的基因被发现使用FindVariableFeatures修包的命令。前者被用来计算主成分分析(PCA)的输出用于非线性降维使用统一的歧管近似和投影(UMAP)方法。FindNeighbors和FindClusters函数实现了细胞集群。一般细胞类型注释结合脾细胞从文献收集的数据进行了使用标记或在每个集群基于签名的基因表达的结果FindAllMarkers函数。

2.4.5 CD4⁺T细胞识别和重聚簇

集群表达CD4⁺等传统标记T细胞Trbc1,Cd3e,Cd4但不是自然杀伤T细胞等Klrb1c或CD8 T细胞等Cd8a,Cd8b识别和提取从合并后的数据集使用吗子集函数创建一个新的修对象。从FindVariableFeatures一步,这个新生成的对象受到新一轮的维减少和聚类分析。细胞集群的形成是由于这重聚簇分析将使用CD4注释⁺从文献收集的标记T细胞群。聚类分析的分辨率提高,进一步把Th1舱分成亚类。

2.4.6可视化和下游分析

获得带注释的亚种群之间的差异表达基因,Wilcoxon等级和测试的执行FindMarkers修拉的函数。所有p值纠正了多个使用Benjamin-Hochberg方法比较。显著不同的基因表达(p值≤0.05)调整排名根据他们log2褶皱变化和作为输入使用g基因本体功能分析:分析器web服务器(47)。Cellchat R包实施预测信息交流中的由co-expression模式细胞群之间基于数据库,其中包含两个老鼠和人类中的交互信息(48)。对于这个分析,包括卵泡B细胞和B细胞群生发中心B细胞被认为从联合数据集描述在我们之前的研究(10)。可视化,BBrowser3 (BioTuring Inc .)、美国加州圣地亚哥)是用于显示修对象UMAP和基因表达。

3的结果

3.1 scRNA-seq期间脾细胞的分析t . evansi感染

系统地研究宿主免疫细胞的转录景观t . evansi感染,scRNA-seq进行脾细胞从老鼠收集的样本在三个不同的时间点:未受感染,感染后的14天(dpi), 42 dpi (图1一个)。作为t . evansi这里到梅合组噶93模型导致小鼠慢性感染,可以持续16周(10从14天、42),数据代表宿主免疫细胞转录组剖面在感染的急性和慢性阶段,分别。均质单细胞悬浮液直接从孤立的脾脏是用来为scRNA-seq构建图书馆,没有任何细胞分选流程。对于每一个时间点,进行测序和加工单独使用10倍基因组学管道。UMI计数的数量,确定基因的数量和比例的线粒体基因被用于质量评估步骤选择高质量的细胞进行进一步调查。值得注意的是,为了捕捉中性粒细胞人口只有几百的基因表达,而不是成千上万的其他免疫细胞(49),只有上层阈值确定基因的数量(6000个基因)设置为消除对比,没有指定阈值较低。环境RNA删除步骤是强制性的在处理受感染老鼠,因为后者有一个过度数量的环境污染来自免疫球蛋白编码RNA基因泄露从宝石一代过程中浆细胞。此外,基因产生的技术背景噪音,如Gm42418和AY036118从矩阵表达式删除之前修处理和下游分析(图1一个)。

无人监督的基于聚类的共有30321个细胞整合从三个数据集在三个不同的时间点了33个集群,这是进一步注释到14单元组,基于规范的表达细胞类型标记(图1 b, C)。B细胞(G1)浆细胞(G2), CD4细胞⁺(G3)和CD8⁺(G4) T细胞,NK1.1⁺细胞(七国集团),中性粒细胞(八国集团)、单核细胞(G9)、巨噬细胞(G10),树突细胞(G11),红细胞谱系细胞和干细胞(G12)已确定(图1 b)。在感染期间,CD4高度增殖激活⁺和CD8⁺T细胞形成了一个不同的组(G5),由他们的杰出不仅细胞类型制造商(Cd3g, Trbc1,Cd4或Cd8a),但也通过扩散基因包括Mki67和Pclaf。值得注意的是,因为没有低阈值的确定基因是为了捕捉中性粒细胞人口,一些低质量的细胞(低检测基因的数量),表现出没有中性粒细胞等标记的表达S100a9或Ly6g被包括在研究。这些细胞没有然而调节基因在个人资料。因此,他们被称为低质量的细胞(G13),进一步分析淘汰。此外,细胞B / T细胞组(G6)表达水平高的B细胞标记(Cd79a、Ms4a1 Cd79b)和T细胞标记(Cd3g Trbc1, Cd4细胞从进一步分析)也被删除,因为他们被报告为一个工件contact-dependent相互作用引起的T细胞和B细胞(50,51)。

3.2逐步细胞集群揭示CD4的异质性⁺T细胞亚群和Th1细胞的主要t . evansi感染

CD4⁺T细胞(G3和Cd4表达细胞G5)选择的集成数据集内,并受新一轮的维减少和无监督聚类分析。这种方法产生了不同的6个集群CD4的注释6不同的亚种⁺T细胞(图2一个),包括幼稚CD4⁺T细胞,滤泡辅助细胞(Tfh), 1型辅助T细胞(Th1),自行车T细胞,调节性T细胞(Treg),和一种新发现的骨髓细胞表型表达T细胞(T)。图2 b显示的列表用于注释的基因,以及这些基因表达谱的亚种群。天真的CD4⁺T细胞被确定增强的表现Il7r,出售,Ccr7基因,以及他们的低表达记忆和效应T细胞标记Cd44。Th1细胞高表达Ccr5、Id2 Ccl5,Tbx21,著名的转录因子的基因编码T-bet。有趣的是,在此设置Th1细胞也表现出很高的表达水平IfngIFN-γ编码,一个关键的炎性细胞因子在锥体虫感染。多个签名基因2型辅助T细胞(Th2)和17辅助T细胞(Th17)被用于试图确定这两个亚种群,但缺乏一致的表情终于表示缺乏人口(图S1)。的转录因子Tox2和Bcl6,Cxcr5被用于Tfh识别。自行车T细胞亚群的调节两种增殖基因的表达Mki67和Pclaf,而亚特别杰出的转录因子Foxp3,Il2ra编码的受体- 2,co-inhibitory分子Ctla4。有趣的是,聚类分析表明CD4的族群⁺我的T细胞,强烈表达基因包括骨髓细胞签名载脂蛋白e、Lyz2 S100a9。这个族群的Cd3e⁺Trbc1⁺T细胞可以表达基因通常与骨髓转录组(52)。这是第一次在锥虫病这个子集被观察到。描述一个可能作用的T细胞在感染期间,使用Cellchat信息交互分析。结果显示分子网络之间的沟通我的T细胞,巨噬细胞,单核细胞,树突状细胞,滤泡B细胞,中性粒细胞,慢性感染老鼠。图S2表明我的T细胞和巨噬细胞交流,基于整合蛋白之间的相互作用alpha 4 / beta 1 (ITGA4 / ITGB1)和血管粘连蛋白1 (Vcam1)。另一个主要界面包括Ccl5基因表达我的T细胞,巨噬细胞信号Ccr5表达,Ccr5⁺/ Ccr1⁺单核细胞,Ccr1⁺中性粒细胞。这些主题趋化因子5之间的相互作用及其受体触发T细胞迁移到感染的网站。此外,表达Selplg我的T细胞与中性粒细胞表达表示一个可能的交互出售。而Selplg基因编码p-selectin糖蛋白配体1,出售编码calcium-dependent L -selectin,调节细胞粘附结合糖蛋白在邻近的细胞。最后,我们的数据表明,巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和B细胞可能与我的T细胞参与抗原表达。

的基础上,概述了细胞注释,侵染诱导改变的细胞数量为每个分组人口计算(图2 c)。作为t . evansi感染诱导T细胞活化,天真的CD4细胞⁺T细胞计数显示比例持续下降,由66.07%的健康人样本,29.59%在14 dpi和12.60%在42 dpi。另一方面,效应T细胞包括自行车T细胞和Th1细胞迅速扩大的人口。事实上,虽然Th1细胞CD4总额的贡献只有5.78%⁺T细胞在体内平衡,他们的人口规模迅速增加,达到15.68% 14岁42岁dpi dpi和48.42%。值得一提的是,除了百分比的增加,绝对总脾细胞数的增加引起的侵染诱导脾肿大,结果在一个绝对数量的增加Th1细胞被感染的老鼠。Tfh细胞CD4总额的占32.40%⁺T细胞在感染后的14天,未受感染的样本中发现的比例的两倍。然而,在慢性阶段(42 dpi),这些细胞的比例下降到17.72%。令人惊讶的是,亚预计发挥重要作用在调节炎症锥虫病的慢性阶段,仅占总数的8.78% T l形的人口在14 dpi。这个数字进一步降低至4.93%,感染后的42天。最后,而我在未受感染的T细胞存在作为一个小群和14 dpi条件(分别为1.26%和0.41%),他们对CD4的4.57%⁺感染的T细胞在慢性阶段。

3.3 Th1细胞的转录组的概要文件显示激活表型在感染。

注释和量化的细胞类型表明,Th1细胞积累和主宰没有Th2和Th17细胞,表明持续炎症1型反应t . evansi感染。而助手1型反应与炎性细胞因子的生产可能有助于减少寄生负载在急性阶段,长期炎症反应通常是与免疫病理相关。因此,为了更好地理解积累Th1 T细胞的作用在疾病进展,这个族群的可能功能进行更详细的调查通过他们的转录组配置文件(图3)。除了表达转录因子T-bet (Tbx21)、微分表达分析表明,Th1细胞表现出增强的表达水平Ifng和Il21。Th1细胞的整体基因表达模式显示了某种程度的异质性(图3一)。提供深入分析细胞的多样性,Th1细胞被进一步分为4个亚种群(S1-S4)通过提高聚类分析的分辨率。证明了在图S3upregulation显示,分组人口S1基因编码Ifng,Il10,和分子参与T细胞激活和生存等Nkg7或Lgals1。在另一方面,S2细胞调节的表达SrgnTNF分泌的基因,负责监管。分组人口S3-S4显示转录模式与T细胞分化有关,品质的高表达Klf2和Id2下基因,编码因素加强分化Th1。有趣的是,还骑自行车T细胞表达Tbx21、Ifng Il21基因,尽管一定程度上,这表明自行车T细胞亚群倾向于Th1细胞表型(图3一)。

Th1细胞的主要功能在感染的急性期帮助炎症的发病概率模式计算了种群之间的信息交流的表达基因编码信号配体、受体和分泌细胞内分子簇的14 dpi scRNA-seq数据集(图3 b)。结果表明一个重要的互动Th1细胞和B细胞,单核细胞和巨噬细胞。除了涉及mhc ii交互和信息联系,co-stimulation和细胞间粘附(图S4),Th1细胞参与B细胞和单核细胞/巨噬细胞之间的沟通通过之间的交互Th1-derived巨噬细胞移动抑制因子(MIF)及其CD74 / CD44 / CXCR4受体(图3 b)(53)。分析还表明,感染触发IL-21介导信号之间Th1、Tfh,自行车T细胞和IL-21受体表达在卵泡B细胞(FoB),在较小程度上,生发中心B细胞(GC) (图3 b左面板)。此外,IFN-γ信号之间展示Th1细胞、单核细胞和巨噬细胞(图3 b右面板)。综上所述,信息交互分析表明,第14天的感染,Th1 T细胞显示转录组签名表明协助B细胞的感染和先天免疫细胞的反应。

令人惊讶的是,Th1细胞的一小部分人口的特点是同时高表达Il10和Ifng。这些“双明示”数量的增加感染(末图3 c)。同时,信息接触分析显示IL-27-driven单核细胞/巨噬细胞之间的通信和Th1 /自行车T细胞(图3 d)。高IL-27编码基因的表达,包括Il27(Il27a),Ebi3(Il27b)被记录在单核细胞和巨噬细胞(图S5),恰逢upregulation IL-27受体基因Il27ra在14 dpi (Th1细胞图3 e)。随着IL-27信号通路是已知的导致il - 10生产、IL-27通路相关基因的表达,如Stat1,Stat3,Prdm1(隔音罩),加(c-Maf),在Th1细胞检查。一般来说,这些基因的平均表达高峰,第14天dpi之前向42 dpi略有降低,但仍高于水平记录在未受感染的老鼠(图3 e)。Th1细胞存在于14 dpi和42 dpi样品还显示调节的表达Il12rb2基因编码β2白介素受体亚基,在IFN-γ升高。的表达Il12rb1亚基基因的白介素受体在所有样品保持在低位。

3.4 Th1细胞,但不是亚群,表现出一种il - 10在监管签名t . evansi感染

在慢性感染,il - 10的生产通常被认为是一个主要功能亚群的特征,防止过度的炎症病理。然而,我们scRNA-seq数据集显示几乎没有Foxp3⁺Il2ra⁺亚高Il10基因表达(图3 c左面板)。此外,侵染诱导Treg细胞不表达任何细胞因子参与锥虫病控制或病理学(图S6)。相比之下,大多数的细胞表达Il10Th1细胞,这些细胞的替代作用,除了帮助感染的发病相关的炎症反应。有趣的是,尽管Th1细胞保持高表达Il10ra感染的基因在两个时间点,亚群是暂时性的调节表达在14 dpi 42 dpi(差别之后,对这些图S6)。因此,进行详细的差异基因表达分析比较转录组的感染诱导Th1细胞(分别为14和42 dpi) Th1细胞未受感染的控制(图4 a, C)。接下来,调节基因在14 dpi和42 dpi受到进一步的功能基因本体分析(图4 B、D)。结果表明,由14 dpi, Th1细胞调节基因以前描述为参与(i)对感染的反应,如对原生动物寄生虫防御反应,(ii)淋巴细胞和T细胞激活包括它们的代谢途径,如蛋白质水解或细胞蛋白质代谢过程,和(3)阳性细胞因子的生产途径。此外,Th1细胞在14 dpi也调节基因与细胞程序死亡有关通过凋亡过程(图4 b)。相比之下,通过42 dpi, Th1细胞调节的基因更多相关(i)监管途径参与T细胞和免疫系统激活或(ii)负调控细胞因子的生产(图4 d)。重要的是要注意,14 dpi和42 dpi Th1细胞显示upregulation派生而来Il10相对于未受感染的th1 (图4 a, C)。14 dpi相比,42 dpi-derived Th1细胞的特点是负调控的相关基因的表达增加淋巴细胞和T细胞分化以及负调节IFN-γ生产(图4 f)。

3所示。5Ctla4基因表达在Tfh可能在生发中心反应中发挥作用

在早期t . evansi感染(dpi) 14日,Tfh族群的特征是高表达水平的Ctla4CTLR-4 co-inhibitory受体的基因编码,参与调节Tfh激活在生发中心反应(图5 a, B)。抗原呈递滤泡树突细胞、B细胞、和Tfh细胞都参与生发中心形成感染,这些细胞之间的细胞间通讯检查在14 dpi。图5 c表明,除了B7-2 (CD86) cd28信号通路之间的交互B7-2 (CD86)和抑制分子CTLR-4 Tfh诱导。反过来,这可能对抗原表现有负面影响,在生发中心B细胞的选择和生存(54)。由于对B细胞种群infection-induce损耗包括生发中心B细胞(GCs)和作战基地(10),同样的分析是不可能的在42 dpi。最后,值得一提的是,的表达Ctla4Treg人口中基因表达下调在42 dpi (图5 b),再次表明有限的监管功能的细胞类型感染在慢性阶段。

4讨论

scRNA-seq的实现技术在传染病研究不断增加宿主-病原体相互作用的理解。尤其是在锥虫病研究领域,使用scRNA-seq最近揭示了重要的新发现在感染免疫细胞异质性和响应机制。这些有助于更好地理解细胞间通讯在感染期间,在各种组织微环境(3,10,12,13)。利用这项技术,我们目前的研究提供了一个全面的定制管道处理infection-derived scRNA-seq数据集,捕捉(i)免疫细胞的转录组景观,和(2)CD4的异质性和变更⁺T细胞特别是,连同他们的潜在的相互作用与其他细胞群。为了理解的病理锥体虫感染人类或动物,专注于T细胞生物学是至关重要的。事实上,启动大脑的炎症病理观察到昏睡病的病人,以及后续的渗透锥深入大脑实质,都开始通过主人的激活T细胞室(7)。在动物锥虫病,一般不与神经病理学而是浪费严重贫血驱动的障碍,炎症也引发早期活化的T细胞(30.)。作为第一个t细胞发起锥虫病炎症的迹象在实验感染模型已报告在主人的脾脏,这种细胞免疫舱被选为目标。因此,这项研究是第一个在同类CD4的识别和定义一个新的监管功能⁺Th1细胞,诱导在锥虫感染的进展。

在脾细胞类型注释和量化分析表明CD4的异质性⁺T细胞在t . evansi感染,揭示存在的6个不同的细胞亚群。这些包括天真CD4⁺T细胞,th1、Tfhs亚群、自行车T细胞,T细胞。有趣的是,没有Th2细胞存在于这C57BL / 6感染模型。同样,scRNA-seq数据的聚类并没有产生Th17细胞群。这些观察观察从早些时候证实t . congolense感染模型,表明Th2和Th17细胞主要发生在hyper-susceptible BALB / c小鼠,患有早期感染,诱发死亡率和失败发展长期控制寄生虫血症阶段(55)。有趣的是,我的T细胞,T细胞的新发现的族群,出现在我们的分析。这些难以捉摸的生物学功能在这个阶段(52)。但是显示在我们的数据集t . evansi感染,这个细胞群表达低到中度的基因与细胞因子的生产。

抵抗t . brucei和t . congolense依赖于主机的容量增加早期Th1反应,生产品质的促炎细胞因子如INF-γTNFα,以及一氧化氮(NO) (25,56- - - - - -58)。在的情况下t . evansi,控制感染的主要归功于早期IgM的感应响应(10,59)。然而,在细胞内抗原疫苗的设置,其次是致命的t . evansi挑战,增加INF-γ生产也被认为是作为一个相关的保护(60)。在我们的研究中,我们表明,侵染诱导小鼠的免疫力是极化Th1反应,指数增长和主导地位Tbx21⁺Ccr5⁺Id2下⁺Th1细胞在14和42 dpi。这些细胞的转录profile-suggested功能不同然而之间感染的急性和慢性阶段。事实上,在急性阶段,信息接触分析提出Th1细胞参与反应生产INF-γ感染。这样有助于激活单核细胞和巨噬细胞。此外,这些细胞还负责生产的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和IL-21。的存在Mif转录upregulation很有趣,像在锥虫病炎症的重要中介,引发B细胞和单核细胞/巨噬细胞趋化作用(29日)。另一方面,T细胞衍生IL-21感应的信号被认为是至关重要的Aicda,Blimp1,Xbp-1B细胞表达,从而推动终端分化成免疫球蛋白生产个人电脑(61年)。这是符合我们之前的发现,表明在t . evansi感染B细胞表现出加速终端分化的免疫球蛋白⁺个人电脑(10)。不幸的是,在锥虫感染的情况下,这种适应性反应似乎无效的控制寄生虫血症。事实上,我们建议在过去t . evansi寄生虫劫持,加快自然宿主免疫球蛋白分化过程,作为诱饵机制逃避igm的致命杀效果。因此,Th1在早期的积极的helper函数t . evansi感染主要归因于他们的生产能力INF-γ,后续生产TNF和trypanotoxic所需通过激活巨噬细胞一氧化氮(NO)。这是证实了使用调节基因的功能基因本体分析Th1细胞在感染急性期,显示签名积极的生产和淋巴细胞/ T细胞激活细胞因子。

众所周知,为了平衡INF-γ-associated炎症,锥虫感染的主机必须能够抗炎山il - 10的回应。这两个之间的不平衡导致的过早死亡主机(3,26,62年)。有趣的是,我们的分析表明,Th1细胞在感染的积累与double-positive的感应Il10⁺Ifng⁺CD4⁺T细胞。这观察证实了以前的报告,显示CD4的感应⁺il - 10⁺INF-γ⁺细胞的流式细胞术t . brucei受感染的老鼠(28)。相比之下,在分析这些细胞也不见了t . congolense感染(34),这表明寄生虫可能已经开发出不同的互动方式与免疫系统在感染的早期阶段。这应该让人大惊小怪t . congolense从血液寄生虫无法漂泊,而t . brucei和t . evansi寄生虫已知使用各种组织生存的利基市场(9,12,63年,64年)。值得注意的是,的表型Il10⁺Ifng⁺CD4⁺T细胞中描述这项研究非常类似于1型调节性T细胞(Tr1),两者都是Foxp3^{- - - - - -}CD4⁺T细胞。然而,在我们的分析,Il10⁺Ifng⁺Th1细胞表现出瞬态的表达谱Il10同时保持较高的表达水平的Th1特定的标记Tbx21(T-bet)。无监督聚类分析分类这些细胞在同一集群与传统Th1细胞,这表明upregulationIl10是Th1感染的反应,而不是不同的紧急程序。未受感染的Th1细胞相比,感染诱发upregulation IL-27和IL-21信号相关的基因,通路都被触发Il10转录(65年- - - - - -68年)。同时信息接触分析显示一个IL-27-driven单核细胞/巨噬细胞和T细胞之间的沟通。根据我们的数据,我们建议在锥体虫感染单核细胞和巨噬细胞分泌IL-27,它结合IL-27 Th1细胞上受体。这反过来触发STAT1和STAT3-dependent转录c-Maf或Blimp1,开车Il10和Il21基因转录。随后,il - 10和IL-21 Th1细胞启动生产。此外,绑定的IL-21 IL-21 Th1细胞表面受体进一步增强了自分泌il - 10分泌。这个转录组的发现解释了为什么以前的锥虫病病理学研究发现CD4 IL-27信号的至关重要的作用⁺Th1细胞,有必要对预防早期死亡率通过抑制t细胞驱动hyper-inflammation (69年)。

如前所述,il - 10延长锥虫感染动物的生存是必要的(58,62年)。虽然il - 10可以分泌多种细胞(70年- - - - - -72年),生产亚提出了重要的各种感染模型(73年)。这些细胞对锥体虫感染,然而只有在长期被发现t . congolense感染。相比之下,人工诱导亚被证明的生存产生有益的影响t . brucei感染小鼠,这些细胞的感应感染本身从未被证明(39)。在我们的研究中,只有一个小小的Treg人数增加观察在14 dpi,紧随其后的是在慢性感染细胞频率下降阶段。最重要的是,这些细胞显示没有表达Il10。因此,我们建议在t . evansi感染诱导亚不发挥重要作用在调节抗炎反应。相反,我们提出,il - 10生产从il - 10⁺INF-γ⁺Th1细胞抑制炎症是至关重要的,同样发现了什么弓形虫和l .主要感染(74年,75年)。事实上,我们的数据表明,upregulation的Il10在t . evansi感染可能是一个Th1细胞自分泌调节信号,抑制INF-γhyper-activation触发。此外,这一事实Il10早在14 dpi,是调节T细胞免疫抑制的可能是一个签名(76年,77年)。当考虑trypanosomosis-associated免疫抑制,存在Tfh细胞在急性期t . evansi感染是另一个重要的发现。这些细胞通常扮演着一个关键角色,滤泡生发中心B细胞的活化过程,涉及之间的交互的B7-2 (CD86) B细胞和树突状细胞表面和CD28分子表面的T细胞(78年)。然而,在14 dpi Tfh细胞表达高水平的Clta4。抑制分子最初被认为是主要由Treg表示,竞争对手众多CD28绑定B7分子阻止costimulatory信号(73年)。通过展示其表情Tfh在14 dpi,我们的分析表明,引起的感应CD86-CTLA-4相互作用将导致缺乏cos-stimulatory信号,随后将导致低效的生发中心反应(GC)在急性期t . evansi感染。这个结果与我们的结果报道缺乏GC期间形成t . evansi感染进展(10)。这一发现的生物学意义是,它解释了为什么锥体虫感染宿主的免疫系统齿轮对生产低亲和力多克隆抗体,并阻止高亲和性特定细菌感染的抗体。

5的结论

总之,我们的研究利用捕获scRNA-seq分析t . evansi寄生虫血症相关的转录组CD4的概要文件⁺T细胞。这种高分辨率的方法提供的结果可以推测CD4细胞的功能⁺为了应对感染T细胞的细胞亚群。首先,我们的研究结果表明不同的感应Ifng⁺Il10⁺Il21⁺Th1 T细胞数量。后者协助控制感染的早期阶段,在自我调节其hyper-activation在慢性阶段。反过来,这有助于减少inflammation-induced病理学,使长期受感染动物的生存。此外,我们表明,在t . evansi感染亚不贡献的主要调节细胞因子的表达方式,因此只能发挥有限的作用在控制炎症的慢性感染。最后,结合细胞转录组分析的基础上,我们提出了一个新的CD4免疫抑制作用⁺锥虫病的铬阶段期间Tfh细胞。

数据可用性声明

scRNA-seq中公开数据集BioStudies EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk biostudies)数据库下加入数字e - mtab - 10174和e - mtab - 12109。

道德声明

动物研究是进行审核和批准通过根特大学全球校园制度动物保健(GUGC IACUC)。

作者的贡献

概念化,先生,SM, HN,调查,HN,先生,SM,数据分析和解释,接下来,先生,SM,写作,HN, SM,先生,关键的修订,先生,SM,可视化,HN,融资收购,SM,都促成了这篇文章,作者先生批准提交的版本。

资金

这项工作是由根特大学全球校园核心资助,UGent转炉格兰特BOF.STG.2018.0009.01/01N01518数量和FWO格兰特G013518N数量。

确认

我们感谢崔Boyoon讨论基因本体分析。我们也要感谢Bolortsetseg Baatar援助的样品制备。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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