评估转基因雄性蚊子的交配能力在实验室条件

介绍

埃及伊蚊arboviral疾病是一个普遍的向量,负责传染病在全球范围内,与大多数的人口感染的风险(1)。病原体通过埃及伊蚊包括Zika病毒、黄热病、登革热、基孔肯雅病毒,这些病原体感染造成大量医疗和社会经济负担在发展中国家。缺乏高效的情况下,负担得起的疫苗或抗病毒治疗对一些病毒和蚊子的杀虫剂耐药性增加凸显了需要媒介传播疾病管理的基本方法,如遗传控制方法(2,3)。

在过去的20年里,开发了各种基因策略控制向量蚊子种群中防止蚊媒疾病的传播(4- - - - - -9)。特别是基因动力方法是假设在传播高效合成效应基因(5)。集群的发展经常空隙短回文的重复序列(CRISPR) / CRISPR-associated蛋白9 (Cas9)系统大大加速基因驱动方法的技术发展按蚊和伊蚊家庭根除目标物种或替换与小说特征向量,可以防止疾病传播(10- - - - - -15)。蚊子的基因控制策略是基于laboratory-generated的释放,转基因(GM)蚊子减少野生物种或灭活disease-transmitting能力(16,17)。为了有效地实施这些技术,这是一个先决条件来理解目标的生物学蚊子(例如,开发、交配行为和繁殖)和评估如果改造基因组件和效应器也让转基因蚊子生存在自然种群和成功目标特征传递给后代。

基因控制人口的限制方面之一是转基因的交配竞争力或无菌雄性蚊子(18,19)。埃及伊蚊雄性发育胜任交配后24小时左右出现和群附近血源在日出日落(20.,21)。男性定位和东方女性协调飞行基调排放的女性(22,23)。这些简短的pre-copulatory交互(< 1分钟)通常在同步成功交配飞行或果断拒绝女性(24)。交配频率而言,男性可以让多个雌性受精而女性一生只交配一次和储存足够的精子育种(20.)。鉴于这种male-skewed操作性别比例(osr)群,男性可能通过干扰或scrambling-based争夺雌性的数量有限(23,25)。

蚊子可以测量的交配能力独立自主的雄性和雌性个体(配对26,27)或大型跨越几代人(13)。在这里,我们试图建立一个实验室试验评估竞争交配成功的野生型Ae。蚊蚊子和一个kmo零应变(28),有白色的眼睛由于缺乏色素。后代的穿过眼睛的颜色显示模式,直接表明父母的血统。因此,眼睛的颜色测定提供了一种有效的工具来评估实验室数量的交配雄性转基因蚊子的竞争力。

材料和方法

蚊子菌株和标准饲养条件

的埃及伊蚊利物浦(Lvp)野生型菌株是维持在27°C和70%相对湿度(±10%),日夜循环的光和10-hr 14-hr黑暗。受精卵孵化在平底锅装满500毫升蒸馏水和200毫克的鱼粮粉(TetraMin热带片)。在L1龄阶段,幼虫被手动计算~ 500每锅和补充新鲜水和食物每两天。蛹化时期,蛹是手动捡起和分离性区别基于使用大小分选机和/或通过识别生殖器解剖显微镜下。成年蚊子被喂以10%蔗糖溶液和交配男女的比例在1到3。交配的雌性吃去纤维蛋白的羊血(科罗拉多血清公司)使用一个人工膜馈线和排卵wet-filter纸放在一杯~ 30毫升蒸馏水。鸡蛋论文是脱水和密封在一个塑料袋长达4个月的储存在室温下。

除了Lvp,本研究包括基因敲除和转基因菌株。的kmo零应变(28)的TALEN-generated基因敲除菌株犬尿氨酸3-monooxygenase(kmo)基因。的nos-I-SceI应变(29日)是水手Mos1表达我——的简况转基因蚊子南加州爱迪生公司我核酸酶在germline-specific的活动nano启动子(30.,31日)和遗传背景的kmo零(kmo^{- / -})。的strn^{Δ41 / +}应变是CRISPR / Cas9-driven基因敲除蚊子线埃及伊蚊stretchinpupae-specific肌肉基因(32)和野生型的遗传背景kmo(kmo^{+ / +})。

标准交配竞争分析

埃及伊蚊Lvp(kmo^{+ / +}黑眼圈)男性和kmo零(kmo^{- / -},白人男性眼睛)是利用标记菌株,这使我们能够确定哪些男性有访问权kmo零雌性交配成功。标准的条件下,一式三份交配实验组成的成立25kmo零男性,25Lvp男性和50个处女kmo306.8零雌性³附件数量1:1比例的男性和女性。成人选择在3 - 5天post-eclosion男性交配竞争力测试。交配的同步条件下,男性的两组首先定居在外壳,然后介绍了维珍的女性。交配期是24小时在生长室的室内光线强度~ 75勒克斯。雌性在交配后blood-fed 3天,被允许单独排卵24-well细胞培养板低熔点琼脂糖为2%通过EAgaL板方法(33)。的排卵胚胎孵化EAgaL板,和所有F₁后代在L2/3幼虫龄期阶段取得了眼睛颜色在解剖显微镜下。

交配竞争分析与修改条件

除了初始测试条件下,各种环境因素在蚊子交配申请潜在影响。首先,距离的影响是通过使用一个更大的笼子里(1728年测试³)。其次,成人密度制约的交配效率,我们建立了三个独立的交配附件(306.8³了170盎司)。含50名男性和50名女性(密度= 0.33 /³0.6 /盎司),125男性和125女性(密度= 0.98 /³,1.8 /盎司),或250男性和250女性(密度= 1.63 /³,2.9 /盎司)。第三,~ 515勒克斯的光强度检测黄昏/ dawn-dependent交配竞争等各种课程时间30分钟,5个小时,24小时。每次交配时间允许,所有男性都被从外壳,和女性被保存在一个生长室的光强度~ 75勒克斯。

的密度制约的larval-pupal增长测试

Lvp(kmo^{+ / +}),kmo零(kmo^{- / -})胚胎孵化下真空,以确保所有幼虫是相同的年龄。L1幼虫龄是手动计算低密度(每组LD: 100幼虫)或高密度(每组高清:1000幼虫)并放在各自的盘子装满500毫升蒸馏水和200毫克的鱼类食物。幼虫龄都在孵化室的补充水和食物每两天。幼虫生长是推迟了高密度和竞争有限的食物来源,我们孵化胚胎HD组5天前比LD的组。这使得收购成年蚊子从不同的幼虫生长条件类似的年龄段。测定幼虫和蛹的增长率,数字生活/死幼虫或蛹每天数从3天后孵化(DAH),直到他们完成蛹化。照片拍摄的蛹从每个实验组使用相机附件(徕卡M165 FC)。蛹的大小是由测量使用ImageJ胸腔的纵向长度。

结果

的kmo端依赖眼睛色素是一种有效的特征进行分析,决定了雄性的交配的竞争力

为了评估雄性蚊子的交配能力在不同的实验室条件,我们首先开发了一个交配试验使用Ae。蚊Lvp野生型(kmo^{+ / +}应变和kmo零(kmo^{- / -})应变,有白色的眼睛由于没有色素沉着(28)。在交配试验(图1一个),我们允许和野生型kmo零雄性竞争访问权kmo^{- / -}雌性1:1比例和交配对由得分决定后代的眼睛颜色表型产生个体的女性。如果一个WT男性伴侣成功了kmo零女性,女性应该与黑眼睛产生后代由于杂合的基因型(kmo^{+ / -})。然而,交配的雄性和雌性之间kmo零压力,100%的后代应该显示白色的眼睛(kmo^{- / -})。最后,如果一个kmo空与女性配偶Lvp和kmo零男性,她的后代会有混合表型的眼睛的颜色。

作为优化的第一步,我们在306.8测试上述交配竞争³附件为基本以24小时为交配期(图1 b)。基于F的眼睛颜色表型₁幼虫数量的女性没有区别,交配Lvp或kmo零男性。除了交配的竞争力,我们的分析使我们能够确定post-mating对女性生殖的影响。如果测试菌株携带的雄性不育的遗传因素,这对伴侣会导致女性产生低数量的F₁后代的幼虫。我们的结果表明,两者兼而有之Lvp和kmo^{- / -}后代F₁组相同的幼虫孵化率(图1 c)。有趣的是,我们观察到F的混合表型₁从大约10%的雌性后代(图1 b)。一妻多夫的真实速度高于预测,是因为从交配隐形事件对一个完全相同的基因型,就像那些(> 10%)观察前半实地测试(34)。当我们取得了F的混合表型₁一妻多夫的雌性幼虫产生的表型比例(黑色眼睛和白色的眼睛)都是相同的(图1 d),表示没有潜在post-mating两个菌株之间的竞争力。当这个实验重复在一个更大的外壳(1728³)(图1 e),kmo零男性似乎竞争Lvp雄性交配的雌性~ 25%,这可能导致相对较低的利率(~ 5%)的混合交配事件,这表明蚊子交配行为可能与成人的密度。综上所述,kmo零似乎类似于野生型雄性交配竞争有关生殖健康在我们的测试与成人的数量50 50♀♂+ 306.8³外壳为基本以24小时为交配的时期。

成人密度的影响,光强度,交配时间眼睛color-dependent交配竞争分析

在自然群体,男性通过一个广泛的互动,scrambling-based争夺雌性的数量有限,和一对交配形式后不久,女性进入群(23- - - - - -25)。对于这种情况,我们测试是否变量成人密度可能影响的交配能力kmo空的男性和一妻多夫的交配活动。我们建立了3单独附件各种成年蚊子交配密度(图2♂(25):组1Lvp+ 25kmonull) +♀(50kmo306.8零)³(0.33 /³);组2,♂(75Lvp+ 75kmonull) +♀(150kmo306.8零)³(0.98 /³);组3,♂(125Lvp+ 125kmonull) +♀(250kmo306.8零)³(1.63 /³)。总体而言,没有区别的交配比例在不同密度条件下,观察2组表现出更高的WT雄性交配的竞争力,和所有实验组显示的一妻多夫制速度~ 20 - 30% (图2一个)。然而,表型的比例有明显的偏见₁后代产生的一妻多夫的女性,当成年人数量增加300蚊子在306.8以上³(0.98 /³)(图2 b)。这一结果表明,成人密度高cage-based测试可能会导致偏见的post-mating为不同类型的精子。

而成群的形成和交配对可能发生整整一天,高峰是黎明黄昏,马上以下活动,和Ae。蚊群集是兼性和发生在micro-swarms (20.)。因此,我们还研究了光强度和持续时间将如何影响雄性的交配行为。设立的三个附件包含30Lvp男性,30kmo零男性和60kmo零雌性黎明或黄昏的光强度下(~ 515勒克斯)和30分钟得到交配的机会,5小时或基本以24小时为之后所有的雄性蚊子被移除(图3)。我们没有观察到明显的区别与WT或雌性交配的比例kmo零在所有三组雄性,基本以24小时为组显示更高的交配的竞争力kmo零男性。(图3一)。这个结果表明,黎明和黄昏光强度可能会影响求偶交配行为,因为没有区别的竞争力被确认在标准试验条件下使用室内光线强度(75勒克斯)基本以24小时为交配持续时间(图1 b和2)。所有三组之间有一妻多夫制的速度~ 7 - 14% (图3一)。我们的得分也从单个雌性的产卵率和胚胎孵化每组(图3 b)。30分钟交配组中,只有一半的女性能产卵,和这些大多数孵出幼虫。相比之下,在5小时,基本以24小时为交配组、产卵和胚胎孵化率的增加。此外,30分钟交配组post-mating比例不均一妻多夫的女性组(图3 c)。总的来说,这一结果表明,5小时的窗口是充分评估竞争获得雌性的雄性蚊子。

幼虫密度高弱智蛹的形态发生,但不影响成年雄性的交配能力

蚊子体型与繁殖成功率:更大的雌性和雄性通常与高繁殖力和精子生产能力,分别是(35,36)。与此同时,男性的中间大小往往最成功的群集(37),和有限的糖喂消极与雄性交配成功(38)。在这里,我们进一步测试少年栖息地的质量会如何影响身体大小和成年雄性的交配竞争力(图4)。WT和kmo零蚊子幼虫生长在两个不同的条件下:低密度(LD, 100幼虫0.5 L)或高密度(HD 1000幼虫0.5 L)。LD相比,高清蚊子的身体尺寸更小,可能由于幼虫竞争有限的食物来源(图4一)。同时,幼虫密度高应力显著延迟larva-to-pupa过渡蛹化峰4天后比LD组(图4 b)。然而,当高清男性与LD与LD的雌性交配,雄性没有显著差异识别,基于与雌性交配成功(图4 c每个单独的一妻多夫的女)和post-mating比例(图4 d)。这个结果表明,小型男性,导致幼虫密度高的条件下,完全能够交配与LD-grown大同行竞争。这表明体型本身并不是一个在实验室成功交配竞争的关键因素,与先前获得的结果(39)。有趣的是,当两个LD男性争夺与LD的雌性交配,kmo空比雄性交配有更高的竞争力Lvp(图4 c)。这表明,幼虫密度低营养浓缩可能是有关微分交配的竞争力,随着两种相同的饲养时的标准协议(500年0.5 L的水幼虫)(图1 b和2)。

评估的转基因蚊子交配能力

基因控制的方法,如精确制导昆虫不育技术(pgSIT)一级释放昆虫携带显性致死(FsRIDL)、交配和基因驱动,依靠生物有性生殖的物种(17- - - - - -19)。评估和改善laboratory-produced转基因蚊子交配成功的菌株对基因改造策略的有效性至关重要,涉及大规模释放到自然种群(19)。我们使用眼睛的颜色交配试验评价两个转基因蚊子交配的能力在有限的竞争(图5)。的nos-I-SceI应变(29日)是一个转基因蚊子表达我-南加州爱迪生公司我归巢核酸内切酶在germline-specific的活动nano启动子(30.,31日),它可以自我毁灭基因的遗传因素驱动盒。的strn^{Δ41 / +}菌株的基因敲除蚊子haplo-sufficient飞行肌肉基因命名stretchin,纯合子突变可以完全干扰飞行能力的成年蚊子和女性生育能力(32),一个有前途的控制蚊子种群的遗传特征。WT男性包括同行竞争nos-I-SceI有kmo零遗传背景,kmo^{- / -}男性的竞争对手strn^{Δ41 / +}的野生型菌株kmo。通用显示正常雄性与雌性交配的能力(图5一个),这些修改的存在并没有破坏后在一妻多夫的雌性交配偏见(图5 b等)或生殖健康女性生育能力(图5 c)和孵化后代(图5 d)。因此,当前交配试验提供了最初的实验室实验证据nos-I-SceI和stretchin分别有前途的遗传因素和目标基因,基因控制的方法与策略的大规模释放转基因蚊子。

讨论

在基因控制方法如昆虫不育技术(坐),释放昆虫携带显性致死(RIDL)和/或基因驱动(4- - - - - -7,17),转基因生物携带突变或基因元素允许杀伤力或遗传特征迅速传播到目标物种的人口(5)。蚊媒疾病的预防,nuclease-based基因驱动技术是先进抑制实验室disease-transmitting物种或种群呈现向量无法传播病原体(4,40)。最近编辑合成生物学和基因技术的进步加快发展高效基因驱动策略在疟疾和登革热的蚊子(8- - - - - -15)。对不可预见的生态风险的高侵袭性和基因驱动的自动传输的性质(41- - - - - -45),生物技术也被作为众多开发系统的本地约束(15),self-exhaustion (46),self-elimination (29日),anti-CRISPR CATCHA等优惠,e-CHACRs, ERACRs, anti-CRISPR AcrIIA4蛋白(47- - - - - -49)。

field-effective,任何基因元素或修改在坐,RIDL或基因驱动系统和nuclease-targeted基因组位点应该适当地评估他们的相对健康(13)。许多基因控制程序是基于蚊子释放和有性生殖。因此,通用成年男性,产生的实验室或从发布的鸡蛋,必须成功地竞争与自然同行的伴侣。在这项研究中,我们试图开发一个高效的实验室测试成人的交配竞争力的方法埃及伊蚊蚊子。这导致了一个交配协议利用的发展Ae。蚊Lvp野生型和kmo缺陷菌株交配,这样可以确定父母基于眼睛的颜色(黑色或白色)产生的后代个体的女性。基于我们的研究结果,white-eyed的交配行为和性生殖健康kmo零男性几乎相同的黑眼睛Lvp下面的实验室条件下:100成年人(♂男女1:1的比例Lvp(n= 25)+♂kmo零(n= 25)+♀kmo零(n= 50)];306.8的外壳³;5、12小时交配持续时间;一个室内的光线强度~ 75勒克斯。;生长室27°C和70%相对湿度(±10%);的日夜循环14-hr光和10-hr黑暗;~ 500幼虫锅的0.5 L的蒸馏水。在这些测试条件,我们可以检查laboratory-raised男性的性生殖健康,对幼虫生长条件,成人尺寸,germline-specific核酸酶表达,或杂合的基因敲除的飞行肌肉基因。

值得注意的是,我们的研究结果还指出,有一些测试修改被进一步理解男性交配之间的竞争力Lvp和kmo零压力。首先,当成年人密度低了一个更大的外壳的大小与标准测试条件相比,kmo零雄性交配有较高的竞争力。相比之下,相反的结果(Lvp>kmonull)导致了更高的密度与大量的成年人(n= 300)。第二,黎明和黄昏的光强度(~ 515勒克斯)增加交配的竞争力kmo零雄性,交配时间是24小时。第三,当两个菌株中饲养幼虫密度低条件(100幼虫/ 0.5 L),kmo空比雄性交配有较高竞争力Lvp。尽管它是解释如何,时机尚未成熟kmo端依赖眼睛色素或基因功能与雄性蚊子交配行为有关的,各种环境因素预计将进一步测试,以发展一个更有前途的工具筛查field-optimized转基因菌株。事实上,当前竞争交配试验应评估其能力迅速屏幕对于任何非竞争性转基因菌株,这将进一步优化与潜在异常的交配行为的突变株。

相比个体配对过程得分选择雄性进行交配一次,眼睛的颜色分析允许评估雄性的交配竞争力swarm-imitating设置相对不干涉的方式。此外,个别女性交配产卵允许我们衡量pair-specific产卵,繁殖力,和胚胎孵化,这恰恰表明改造基因的潜在影响组件post-mating流程。有趣的是,这种方法显示一系列女性一妻多夫制基于个人female-produced后代群体的眼睛颜色混合。尽管如此Ae。蚊女性被认为是一夫制的,多个亲子鉴定可以发生在一个自然环境(50)。在实验室环境中,~ 24%的女性显示多个男穿越后第一次交配,但女性成为完全耐火材料在2小时内第二次交配(51)。同样的,我们的分析显示,一妻多夫制被证明发生在~ 5 - 30%的女性和可能更高,因为一个混合男性父权的相同的眼睛颜色不能得分。此外,潜在的交配竞争post-mating阶段显著影响成人密度增加/外壳。因此,多个亲子鉴定的高增长率还应该考虑不同cage-based基因控制的测试方法,它将一定要确定它将如何影响人口率的修改。

眼睛颜色交配竞争分析是一个非常简单,快速和精确的工具筛选基因的传播率为男性释放转基因蚊子蚊子种群控制程序,对它们的交配成功与野生型的竞争对手。这个试验是目前限制埃及伊蚊。然而,的保护作用kmo眼色素基因表明它的多功能性和其他蚊子的物种。优化自然种群的进一步分析,这将是值得进行交配竞争在一个大笼子里或半实地条件。此外,男女的数量1:1比例可以调整进一步测试,因为更少的女性被认为比男性交配,尤其是swarm-like条件(20.,23,25)。最后,这个分析可以进一步验证交配雄性转基因蚊子与自然的竞争力直接获得目标区域。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

作者的贡献

公元前开展实验。公元前,咱和KC构思研究和实验设计和写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作得到了国家过敏和传染病研究所的美国国立卫生研究院(NIH-NIAID)奖数字(R01AI148787和R01AI137112)和美国农业部(USDA)研究所的食品和农业、孵化项目1018401。内容是完全的责任作者和不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点或美国农业部。

确认

我们感谢Chanell道森和象屿史阿德尔曼在德州农工大学的实验室为本研究优秀的技术援助。一些插图图1一个使用BioRender.com生成通过德州农工大学的许可证。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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