分子流行病学的继续恶性疟原虫在厄瓜多尔爆发后疾病传播

介绍

最近全球推动国家消灭疟疾在21个国家2020年导致三个被宣布无疟疾(阿尔及利亚、萨尔瓦多和巴拉圭),但其余的目标没有实现国家(1,2)。这些国家现在的一部分重新倡议发起的他在2021年支持共有25个国家,称为e - 2025国家,共同目标在2025年前消除当地疟疾的传播通过减少土著或本地传播的病例的发生率为零(2)。这些国家包括墨西哥、巴拿马、厄瓜多尔、南非、Eswatini,泰国,马来西亚等。疟疾传播在很多国家流行/不稳定的风险爆发,寄生虫进口和复兴的疟疾(3- - - - - -5)。

厄瓜多尔、9 e - 2025的国家之一在拉丁美洲,不符合2020年消除目标因疟疾复兴自2015年(2,6,7)。在厄瓜多尔消灭疟疾的努力主要集中在热带地区,特别是西北海岸和亚马逊地区(8- - - - - -12)。这些区域边界非e - 2025国家,哥伦比亚和秘鲁,还有流行和中度至低传输(13- - - - - -20.)。临床病例引起的恶性疟原虫大多集中在西北海岸和厄瓜多尔已经流行/不稳定吗恶性疟原虫传输,间日疟原虫成为优势种。决定是否继续的发生率恶性疟原虫临床病例是由于进口或本地收购了寄生虫的主要公共卫生利益更好的理解疾病传播模式和救援决策分配有限的资源来达到消除e - 2025的目标。

应用pcr方法流行病学分析可以帮助公共卫生反应这样设置通知在寄生虫多样性和亲缘识别输入性病例并描述残余和/或复兴的疾病传播与发病率更高的分辨率比常规监测模式(21,22)。这样的流行病学调查中可以有效的描述疟疾传播的热点地区,如果有的话,在一个流行区。分子监测疟疾传播模式依赖于特征基因分型中性分子标记,如微卫星或单核苷酸多态性(SNPs)比全基因组测序更具成本效益的方法。相关的低或流行病传播,中性变异通常用于通知单克隆和亲缘以及跟踪基因组空间。基因在选择可以提供另一种微进化(但互补的观点23- - - - - -25)。

分子监控基于多样性的基因编码病原体的主要表面抗原是一种行之有效的微生物范式通常用于病毒学(例如甲型流感,hiv - 1, SARS-CoV-2)和细菌学(如。奈瑟氏菌属spp,酿脓链球菌型),因为这种抗原提供了重要的信息重组率,与这些重组事件相关的因素,和传输动力学。采用这种监测方法是然而更复杂的恶性疟疾的主要表面抗原变异血阶段称为PfEMP1的编码var基因家族与奖金的var每个基因组的基因(26)和广泛的多样性var基因存在于寄生虫种群(27)。的确,var多样性已被证明是与传播强度最高的多样性,在成千上万的变体,在非洲人口和最低的在美洲,数以百计的顺序(27- - - - - -31日)。Var基因和体验多元化的减数分裂重组在专性阶段生命周期的蚊子以及有丝分裂重组。我们定义了一个指纹的var高度分化的DBLα曲目孤立的基因分型标记的恶性疟原虫var基因家族(29日- - - - - -33)。这个指纹方法我们称之为“var编码”需要一个与简并引物PCR扩增子深测序紧随其后。我们样品DBLα的多样性恶性疟原虫在人类宿主之间,以及测量之间相似或相同var体验我们称之为var代码。贝叶斯统计是用来占基因家族的所有成员变量抽样(基因组包含奖金var基因)在野外样品放大劣质寄生虫DNA亲缘与简并引物和量化的不确定性估计(图1)。这种分析方法是专门为var基因免疫选择下等位基因本身不能分配由于染色体的位置是未知的,和常用的方法来推断等亲缘identity-by-descent (IBD)并不是简单的应用由于这多拷贝的复杂性var基因家族。

在这里,我们应用var编码的第一次不稳定,疟疾流行看这些免疫逃避基因的多样性和种群结构。具体来说,我们临床的传播的特点恶性疟原虫情况下在厄瓜多尔和2012 - 2013年爆发两年后,这是以前由微卫星基因分型(即发现克隆。,由一个寄生虫血统)(19)。分析var代码亲缘网络允许我们定义不同的基因组寄生虫血统(或var本地代码)循环,以及检测签名高度相关的寄生虫,可能最近重组基因组与尊重var体验。寄生虫的var疫情的代码克隆或重组/高度相关var代码相对于爆发克隆血统主要是与临床病例的发病率持续爆发后。热点的var代码存在的多样性被确定暗示当地水库的感染。进一步比较分析从历史南美隔离(发表的数据30.)阐明可能的起源厄瓜多尔寄生虫,证明大多数的临床病例是由于局部传播,而不是最近的进口。

方法

研究设计和样本收集

在这个分子流行病学研究中,我们审查恶性疟原虫分离收集2013 - 2015年在厄瓜多尔从个人所有年龄段的呈现与简单的疟疾病例证实了显微镜和/或PET-PCR (34)。研究人口和细节数据收集之前发布的(19,35,36)。短暂,这些样本期间收集的被动监测的厄瓜多尔卫生部允许参与者住的地区采集标本,2岁以上,同意参与,提供了一个血液样本(静脉血或干血的地方)和回答一个基本的人口调查问卷(包括最近的地方旅行,他们的地址)。基因组DNA提取静脉血液或干血滴使用QIAamp DNA迷你包(美国试剂盒)推荐的制造商。伦理委员会批准的这项研究是天主教大学del厄瓜多尔基多、厄瓜多尔和墨尔本大学(澳大利亚墨尔本)。

VarDBLα扩增和测序

VarPCR、PCR测序的细节,和相关数据处理步骤之前发布的(33,37)。简单地说,每恶性疟原虫隔离,一个单步PCR扩增DBLα域var目标基因进行了使用通用简并引物相同块D(正向引物)和H(反向引物)最初描述的(38),外加10 bp GS FLX钛多元条码标识符引物序列(39)。PCR反应制备了总量的40μl,包含3μl基因组DNA, MgCl₂2毫米的最终浓度,核苷酸的最终浓度0.07毫米,每个引物的最终浓度0.375毫米和3单位福莱希DNA聚合酶(Promega)。循环条件如下:最初的变性步骤2分钟在95°C随后30的循环:退火40秒在95°C,扩展为90秒49°C,变性为90秒65°C,然后最后一个扩展步骤10分钟在65°C。结果单独编码DBLα扩增子(约450 - 700 bp的长度)合用的克分子数相等的,编码库准备使用KAPA低吞吐量图书馆准备工具包(KAPA生物系统公司)。库测序MiSeq Illumina公司平台上使用2 x300bp paired-end协议和MiSeq试剂盒v3化学(澳大利亚墨尔本澳大利亚基因组研究设施)。

VarDBLα数据处理

原始的illumina公司序列数据然后使用DBLaCleaner管道清洗和加工((37,40),http://github.com/Unimelb-Day-Lab/DBLaCleaner]。我们定制的生物管道已经详细描述(37,40)。短暂,我们de-multiplexed合并配对读取和删除低质量的读取和使用几个过滤参数(见嵌合体补充图S1详情)。这个管道导致2141清洁DBLα序列(补充图S1)。识别不同的或独特的DBLα类型(即。,unique genetic variants), we clustered the DBLα sequences from Ecuadorian恶性疟原虫隔离与5699年以前出版的(30.)DBLα序列从其他南美国家(哥伦比亚(N = 21隔离)、法属圭亚那(N = 76隔离),秘鲁(N = 21隔离),和委内瑞拉(N = 10隔离)在96%的标准序列标识(32)使用clusterDBLalpha管道(http://github.com/Unimelb-Day-Lab/clusterDBLalpha)。我们进一步策划由DBLα类型翻译成氨基酸序列数据集使用classifyDBLalpha管道(http://github.com/Unimelb-Day-Lab/classifyDBLalpha)和删除任何DBLα类型是不可翻译的(N = 4)。所有的清洁DBLα序列在这项研究中(补充图S1)已被提交给DDBJ / ENA基因库(BioProject号:PRJNA642683)。可以找到的教程DBLα处理管道http://github.com/Unimelb-Day-Lab/tutorialDBLalpha。

此外,任何恶性疟原虫隔离测序质量较低(< 10 DBLα类型)从分析中删除。因此,从70基因分型恶性疟原虫厄瓜多尔隔离,12 P。恶性疟原虫分离DNA质量较低和/或测序质量差被移除,我们获得的var58 DBLα数据隔离(82.9%)。共有543个独特DBLα类型确定186年南美恶性疟原虫隔离(N = 58厄瓜多尔恶性疟原虫隔离从这项研究中,N = 128南美恶性疟原虫隔离之前发表在(30.)被用于后续的var分析在区域级,只有195年厄瓜多尔独特DBLα类型识别用于Ecuador-specific分析。评估我们采样的池var(即DBLα多样性。,the true number of genetic variants circulating) in Ecuador and in South America, we used the R package素食主义者(41)生成物种积累曲线独特的数量DBLα类型被绘制为采样序列的数量的函数。停滞不前的曲线表明饱和和健壮的抽样的多样性池(即采样序列不确定任何新类型)。

遗传相似度分析

测量成对类型共享

估计var代码相似度或所有隔离对之间的关联性,我们计算相似性指数成对类型共享(P_TS)(28),为适应他et al。(37)在隔离DBLα取样差异(我。e,隔离曲目的差异大小),无偏估计(BP贝叶斯成对类型共享_TS)进一步解释P中的不确定性_TS估计。P_TS代表的比例共享DBLα类型之间的隔离。它是计算定向的数量除以共享DBLα类型,N_年代两个分离株之间,一个和b通过DBLα类型的总数在每个隔离或剧目大小,N_一个或N_b。因此,对于每一对我们计算的隔离P_{TS (a, b)}= N_年代/ N_一个和P_{TS (b)}= N_年代/ N_b。

Var代码相似度还可以探索更严格公正的贝叶斯成对类型共享(BP_TS)(42,43)。这种方法使用贝叶斯推理方法,估计剧目重叠和不确定性,并使用它们在随后的P_TS计算,这种不确定性。曲目的先验分布大小,用于推理、被观察通知如下。首先,在厄瓜多尔隔离观察曲目中值大小37类型,从11到43 (补充表S1)。其次,预期的数量var基因与DBLα域从全基因组测序数据的洪都拉斯实验室参考应变HB3 42 (26)和50var基于基因读PacBio HB3测序(44)。第三,基于我们的测序数据的37 HB3技术复制,曲目中值大小或数量的每个隔离DBLα类型为39(36-41类型),与40类型一致确定大多数复制(范围21-37复制)。因此,我们使用一个统一的曲目大小40至50类型之前,结合通用贝叶斯曲目重叠框架(42)产生无偏估计(后)。这些都是用来证实我们的P_TS估计。正如所料,P_TS和英国石油公司_TS估计呈正相关(皮尔逊相关系数= 0.919,p< 0.001,补充图S3)。中部的测量不确定性的估计,我们计算的95%的最高密度后间隔(HDPI),贝叶斯置信区间,对于每一个成对的估计。像一个频率论的置信区间的宽度HDPI提供了一个衡量每一个成对比较的不确定性。屁股都使用马尔可夫链蒙特卡罗采样。

解释varcode亲缘的措施

每一个寄生虫隔离与其他寄生虫隔离人群中确定的比例共享DBLα类型。理论上,两两比较P_TS0的共享类型(0%),0.5(50%共享类型),和1共享类型(100%)将反映遗传学上截然不同的隔离与不同var指令系统,分离与重组或高度相关var体验,克隆和基因相同的隔离与相同的var分别曲目。然而在实践中,在传播缓慢的地区经常“固定”亲缘阈值可能掩盖真实的亲缘估计因为近亲繁殖的事件,因此需要确认通过测量的不确定性估计等方法的贝叶斯推理P_TS。我们应用这种方法来定义”var码“孤立的群体分享≥90%的DBLα类型(P_TS≥0.90),确定推定地相同的基因组检测的误差内1 - 5 DBLα类型在一个隔离。我们确认的解释var代码,重组/高度相关,遗传学上截然不同的隔离的阈值0,0.5和0.90,分别通过比较公正的英国石油公司_TS(后)和检查HDPI估计。

的可视化varcode亲缘网络

形象化var代码分离株之间的关系由P_TS或英国石油公司_TS我们构建的网络使用R包ggraph(45),tidygraph(46),隔离描绘成节点和边的P_TS或英国石油公司_TS在给定的阈值。R包ggspatial(47)是用来绘制空间网络使用采样位置的纬度/经度坐标。可视化var代码相似度的寄生虫随着时间的推移,我们用R包gganimate(48)构建时空关系网络。我们生成的集群的热图基于DBLα类型可视化的存在/没有矩阵每个隔离在厄瓜多尔的遗传资料,每个国家在南美洲使用R包pheatmap(49)和“完整”聚类方法。拔起neighbor-joining系统发育树计算基于成对遗传距离(1 - p_TS)建立了使用R包猿(50),ggtree(51,52)。

统计分析

我们用R版本3.5.2 (53),基地R, R包dplyr(54),epiR(55对所有分析)。我们使用卡方测试单变量分析的分类变量比较比例和非参数测试来比较两组之间的连续变量的分布(Mann-Whitney U测试)或中k组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验),Bonferroni调整为多个比较。

结果

有限的var厄瓜多尔的多样性恶性疟原虫人口

的多样性var基因被评估var编码58页。恶性疟原虫分离,收集所有年龄段的2013年至2015年从个人经历临床疟疾(图2)。这些隔离代表病例总数的21%,2013年61%,2014年和2015年的3%(60%的病例报告今年1月,2015年11月5月份的7%和8%)。总的来说,我们发现195种独特的DBLα变异或从2141年DBLα序列(补充图S1从58隔离),代表多样性在厄瓜多尔的传播恶性疟原虫人口,所显示的采样累积曲线接近高原(补充图S2)。

九个不同的定义var代码在厄瓜多尔和描述时空传播疾病传播的趋势

定义不同的var本地代码循环在厄瓜多尔,我们估计之间的关系两个隔离的var代码通过计算相似性指数,成对类型共享(P_TS)和构建关系网络来识别相同的基因组var代码(P_TS≥0.90)。我们通过比较证实了这个事实var代码来自P_TS那些来自后意味着英国石油公司_TS估计(补充图S3),包括统计的不确定性,通过检查95%的上下边界密度最高后间隔(HDPIs)。这显示9遗传学上截然不同的var代码在本研究36隔离varcode1(代表克隆爆发埃斯梅拉达斯市橙红色var代码图3和图4一),在另一个极端varcode4,varcode5,varcode9被认为只有一次(图4一,S4A)。我们的定义var码证明预测基因血统(identity-by-descent≥0.99)发表的基于全基因组序列数据的隔离30 (6var由WGS(编码)进行了分析56),var编码。正如所料,疫情varcode1克隆(由HDPIs表示,其中包括1;图S5B之前),证明了微卫星基因分型(19)和最近的WGS (56)。爆发varcode1识别还确定了埃斯梅拉达斯市圣洛伦佐,埃斯梅拉达斯(2013年~ 150公里从埃斯梅拉达斯城),然后Cascales Sucumbios(> 300公里)2014年,然后在Tobar Donoso, Carchi(~ 150公里)2015年(图4 b)。总的来说,持续相同的疾病传播var代码都被观察到随着时间的推移,(图4 b)和远距离(图3 a - c)。中位数时间之间的第一个和最后一个相同的识别var代码与任何临床病例是216天或大约7个月(范围= 190 - 823天)在研究期间。这是符合报告在秘鲁(57)和哥伦比亚(18,58)克隆寄生虫被证明是循环五和八年后第一次鉴定,分别。

Var代码亲缘网络显示签名高度相关的寄生虫和当地的疾病传播

我们下一个构造时空var代码亲缘网络探索当地疾病传播爆发后签名。图4 c显示15隔离有四个var代码(varcode3,varcode4,varcode6,varcode7)集中爆发varcode1阈值的P_TS≥0.50 (图4 c)。其余7隔离不同var代码没有集群网络和遗传学上截然不同的。这些模式被证实使用BP_TS基于后验估计手段(补充图S6A)及其相应的95% HDPIs (补充数据S5C-F,S6B C)。

为了更好地理解var代码亲缘签名集群“暴走”我们检查了两个P_TS和英国石油公司_TS估计。在某些情况下,高度相关var代码共享~ 50%的爆发DBLα类型,如爆发varcode1与varcodes3、4、6、7(平均P_TS范围= 37 - 58%,平均基点_TS= 45 - 70%,数字S5C D)。这种级别的var代码相似度,将符合新一代的var代码通过外交传统减数分裂重组var能爆发克隆。当检查的两两组合var代码3、4、6、7、共享类型也表明高关联性(P值_TS范围= 27 - 50%,平均基点_TS= 32 - 64%,数字S5C D),指向前交叉,后跟一个回交的可能性考虑到整体有限var寄生虫种群多样性。然而,这种跨越的时间是未知的。有趣的是,所有可能的重组和高度相关var代码(varcodes3、4、6、7)被确定在圣洛伦佐varcode7是主要的一个,显示这个区域是寄生虫的传播热点和水库与多样化var体验(图3 d)。

为了进一步确认var代码亲缘签名,我们构建了一个集群的热图可视化每个孤立的基因资料的基础上,存在/没有195 DBLα类型,这样基因相似隔离集群在一起(图4 d)。这种分析证实,在孤立的情况下确定为高度相关疫情varcode1, DBLα类型以及不同比例的爆发DBLα类型。相比之下,隔离的遗传资料var代码2,5,8,9不同DBLα类型有更多的其他所有var代码,即。,p一个rasites with genetically distinctvar与共享代码,只有< 30%的类型在大多数情况下(P值_TS范围= 2 - 29%,除了2成对比较34 - 37%;中石油_TS范围= 4 - 30%,除了5成对比较31 - 41%,数字S5E F)。

寄生虫与高度相关的/重组var代码是最常见的伴随恶性疟原虫临床发作在2012 - 13年的爆发

爆发前有一个稳定的临床病例下降;然而,疾病爆发后发生的几率增大。因此,我们的流行病学趋势分析恶性疟原虫情况下发生post-outbreak了解是否有关键的风险因素。25个人的临床研究恶性疟原虫集post-outbreak,我们有18人(72%,年龄数据表1)。没有显著差异(克鲁斯卡尔-沃利斯检验,p= 0.65)平均年龄的个人经历临床发作由寄生虫引起的疫情varcode1(19年,范围= 19 - 57年,N = 3例),高度相关/重组的varcode1(例如,var代码3、4、6或7)(25年,射程= 17 - 58年,N = 13个病人),或由不同var代码(34.5年,射程= 32 - 37年,N = 2例)。更大的多样性var码(1 - 9包容性)与临床疟疾发病率post-outbreak比在2013年爆发var代码1、2、3)。事实上在2014年,79%的情况下取样,或者是由寄生虫引起的疫情varcode1(21%)或任何的四个高度相关/重组varcode1 (58%)。相似的趋势在2015年以83%的情况下采样引起的寄生虫与爆发varcode1(33%)或任何的四个高度相关/重组varcode1(50%),虽然我们的抽样报告病例后,于2015年1月是有限的。重要的是,总的来说,我们发现,80%的情况下采样后爆发的疫情是由要么寄生虫引起varcode1(24%)或任何的四个高度相关/重组varcode1(56%),尤其是varcode7(代表57%的病例由寄生虫引起的高度相关/重组var码)。因此,疾病传播爆发后,2014年到2015年是主要与寄生虫与高度相关的/重组有关var能爆发克隆,多数病例发生在圣洛伦佐热点。

南美洲:比较分析阐明厄瓜多尔的起源var历史输入的代码和签名

我们接下来检查可能的起源var本地代码循环在厄瓜多尔通过比较唯一出版var从该地区DBLα数据集(30.),包括128恶性疟原虫隔离来自南美恶性疟原虫人口在2002 - 2008年疟疾传播与厄瓜多尔相比较高的国家(图5一个)。在所有国家(除了一些隔离在法属圭亚那),每个隔离DBLα类型的数量,一个代理的复杂性感染(COI,即的数量恶性疟原虫基因组在感染),是唯一的象征恶性疟原虫基因组感染个体(即。,曲目尺寸≤50或COI = 1,补充图S9;补充表S1)。尽管抽样的不同年,543独特的DBLα类型确定186年这些隔离代表多样性在南美传播恶性疟原虫人口,所表示的DBLα取样积累曲线接近饱和(补充图S7)。一个拔起系统发育树neighbor-joining成对遗传距离(1 - p_TS)显示不同的国别集群相关的隔离var代码(图5 b),符合先前的分析展示地理人口结构(30.)。因此,尽管相对较低var多样性,有足够的分辨率来区分疟原虫种群从不同的南美国家,并探索可能的地理起源的国家DBLα类型,而且这些类型的独特组合var代码。

Var编码解决97var代码在南美洲(P_TS≥0.90),从九在厄瓜多尔和委内瑞拉,到56var在法属圭亚那和编码var代码是来自不同国家的国家因为没有隔离集群与隔离来自另一个国家在这个阈值(补充图S8)。然而,尽管相同var规范没有明确在多个国家,我们对研究感兴趣var代码相似度。评估的整体共享类型var编码识别在厄瓜多尔的采样在其他南美寄生虫种群,我们汇总所有可能的DBLα类型中标识隔离每个厄瓜多尔组成var代码(范围:每varcode 34-47类型)和所有DBLα类型在任何隔离从一个给定的国家(范围:112 - 249每个国家类型)。的整体共享类型高,最高的平均分享与秘鲁(53%,范围:26 - 72%)之后,哥伦比亚(39%,范围:19 - 89%)和委内瑞拉(27%,范围:12 - 76%),只有10%与法属圭亚那(范围:3 - 86%)除外varcode5 (86%) (图5 d)。

接下来,我们估计P_TS之间所有可能的隔离对厄瓜多尔的检查是否有寄生虫var编码基因相关的这些历史南美寄生虫(P_TS≥0.50)和构建区域var代码亲缘网络(图5 c)。我们发现了一个基因相关的秘鲁恶性疟原虫隔离集群的集群“暴走”,特别是与爆发varcode1 (P_TS0.66 = -0.75varcode1隔离)。这是与先前的使用微卫星分析相符爆发源可能是残余寄生虫血统流传在1999 - 2000年在秘鲁和厄瓜多尔在1990年代早期(13,19)。最近的全基因组序列数据还指出,疫情var在哥伦比亚code1循环在2000年代早期(56)。没有其他南美隔离集群与集群“暴走”基于我们的网络分析,表明可能有其他本地传播寄生虫在厄瓜多尔身份不明的水库,例如父母的var代码可能的重组。在的情况下varcode3, WGS研究表明,隔离varcode1和varcode3属于不同的基因血统但是相同的下降在80%的基因组从而属于一个“超级集群”(56),这是符合我们的英国石油公司_TS估计70 - 84%类型的共享(图S5D)。此外,WGS研究确定varcode6和varcode7哥伦比亚隔离从2014 - 2016年和2016年,分别,但是varcode4不是任何确定的哥伦比亚隔离(56)。

我们也想更好的了解这些的起源var代码没有集群与集群“暴走”,因为从历史上看,他们可能是进口和其他可能代表本地传播寄生虫没有爆发后向前传播的直接结果。我们发现两个假定的病例的证据从邻国的寄生虫,var从哥伦比亚code9 (EC53,表1),基于遗传和流行病学数据varEC40 code5(情况,表1)的起源是不太清楚。假定的感染的流行病学数据位置被记录为秘鲁(EC40,表1),但是根据我们的数据var代码更相关的历史恶性疟原虫人群从法属圭亚那比秘鲁和委内瑞拉。剩下的厄瓜多尔隔离var代码2和8没有集群与其他南美隔离。假定的感染的流行病学数据的位置varcode8被记录为哥伦比亚(EC49 EC50,表1),但这些隔离没有集群与哥伦比亚隔离在我们的网络分析。在这些共享DBLα类型var代码与哥伦比亚类型是高(44%varcode2 67%,varcode8,图5 d),提供证据表明,寄生虫varcode2和varcode8可能代表剩余寄生虫从哥伦比亚进口的历史。这是符合WGS数据隔离varcode2,展示他们是相同的血统(IBD > 0.99)与哥伦比亚从2000年代早期隔离(56),表明最近的过去,而不是进口。值得注意的是,varcode2被圣洛伦佐,热点的埃斯梅拉达斯确认这个位置可以作为储层不同的寄生虫var体验,如上所述。

讨论

我们调查的时空的临床事件发生率恶性疟原虫在厄瓜多尔的var编码支持这样的观点,疾病传播后,2012 - 2013年疫情是由寄生虫持续循环在厄瓜多尔,其中一些可能有历史渊源的邻国。我们观察到持久性的爆发克隆血统(相同的标识var编码)和寄生虫与高度相关var代码主要与临床相关疾病爆发后。观察到的var代码亲缘签名可能指向潜在的爆发外交血统与其他本地传播的寄生虫。是否这些重组var代码导致性寄生虫之间的重组事件爆发varcode1和遗传学上截然不同的寄生虫已经流传在无症状的低水平和/或水库在厄瓜多尔(e。g (12)或那些以前进口,不能确定从当前研究人口。我们的结果指出需要在本地资源集中在厄瓜多尔发现感染的循环水库。在这种背景下,var无疑会起到重要作用的基因在这些寄生虫的持久性和毒性。还应该考虑人类迁移的作用的传播恶性疟原虫在厄瓜多尔,像寄生虫一样的var代码也观察到在远距离(~ 150 - 300公里)和两个假定的病例来自哥伦比亚和秘鲁根据流行病学和识别var编码数据。

圣洛伦佐被发现是一个传播热点可能由于采矿活动和occupation-related旅游在这些领域,以及靠近Ecuador-Colombia边界(4,35,59- - - - - -61年)。这些发现指出圣洛伦佐遗传监测和有针对性的干预措施。重要的是,我们的研究结果提供强有力的证据在厄瓜多尔和持续的局部传播提供的第一个基线特征恶性疟原虫抗原多样性和寄生虫var码在厄瓜多尔西北海岸和亚马逊地区流传。这形成了历史数据库,可以利用在未来的分子流行病学研究。值得注意的是,varcode5确定奥雷利亚纳省,一个邻居秘鲁亚马逊地区的面积,有一个非常不同的基因档案厄瓜多尔var惟一类型代码(≥83%)。更相关的基因历史寄生虫从法属圭亚那和委内瑞拉指向高度多样化的恶性疟原虫厄瓜多尔的亚马逊地区的人口可能循环和Ecuador-Peru边界。最近暴发发生在相同的厄瓜多尔边境地区(2016年(9),2018 (10),2019 (11)和2020年(62年)]。我们的研究结果高度相关和可能的重组寄生虫引起临床疾病的爆发克隆后不久爆发可能会提供一个解释如何持续流行的疾病在当地继续发生。寄生虫结合本地传播的进口可以明显增加的抗原变异以及整体基因组多样性,尽管周期性爆发的地方寄生虫也可能提供足够的条件发生在本地没有寄生虫进口。

我们表明,58%的临床情况下采样后立即在2014年爆发在厄瓜多尔是由寄生虫引起的高度相关或重组var代码。同样的趋势在2015年被发现,虽然我们的抽样报告病例的数量相对有限个月取样。这是一个偶然的发现,或选择的结果,即。、药物或免疫选择?以前有抗性标记基因分型数据报道,所有出版恶性疟原虫隔离在我们研究基因型与chloroquine-resistance相关(例如,pfcrt76 t)和绝大多数基因型与灵敏度磺胺多辛-乙胺嘧啶(例如,pfdhps和pfdhfr)(36)。突变pfdhfr只有在寄生虫varcode2和一个高度相关的var代码(varcode6)而不是其他var代码。过去的抗疟治疗恶性疟原虫疟疾在厄瓜多尔包括青蒿琥酯和磺胺多辛-乙胺嘧啶单独或结合伯氨喹蒿甲醚直到2012年当切换到苯芴醇+伯氨喹被引入作为一线治疗(63年)。因此,从我们的研究结果没有出现药物相关选择var人口结构我们观察在临床情况下爆发后。因此,我们假设寄生虫与这些高度相关var码有新的或抗原性上小说的组合varDBLα类型和可能不同antigen-encoding等位基因的单拷贝基因。这可能会提供一个优势在一个人口变量水平的免疫记忆,预计将为这些社区在厄瓜多尔seroprevalence抗体恶性疟原虫据报道高达22% (12)。支持这一观点,之前网络分析和计算模型结合进化和流行病学指向variant-specific免疫选择定义var人口结构,即使在低传输,尽管在一个小得多的程度上比预期的高传播环境下选择行为强烈反对重组或高度相关体验由于交叉免疫(37,64年)。的可用性varDBLα序列提供了潜力测试这个假设通过血清学方法测量variant-specific免疫力,如血清学研究在巴布亚新几内亚(所示65年)和巴西亚马逊河(66年)。此外,抗原变异的特征varDBLα序列可以利用在未来理解寄生虫毒性基因表达研究。的确,未来调查潜在的健身的好处varcode1以及它如何可能会加强疟疾传播都是合理的,除了探索最近爆发的起源,无论他们是相同的或新的var代码。

一项研究,其中包括一些相同的恶性疟原虫隔离从埃斯梅拉达斯城和圣洛伦佐在西北海岸描述三个主要基因集群基于微卫星基因分型(35)。相比之下,当考虑相同的隔离,var编码解决六个var代码循环。类似的观察描述了在委内瑞拉的一项早期研究分布区重叠的寄生虫一样的在中性微卫星位点有非常不同的var体验(67年)。这并不奇怪var编码将提供更高的分辨率比微卫星基因分型,我们正在寻找更多的位点,在选择。重要的是,我们的var代码会员名称符合定义的基因血统identity-by-descent (IBD)分析(IBD≥0.99)和“超级集群”(IBD≥0.80)从全基因组测序(WGS)最近的一项研究恶性疟原虫隔离厄瓜多尔和哥伦比亚太平洋沿岸的收集在2000年代早期和2013 - 2017年(包括30相同的隔离在这项研究)(56)。虽然恶性疟原虫WGS数据不包括var数据由于装配的难度高度多样化的变异抗原基因,WGS结果符合我们推断从人口结构var编码。据我们所知这是第一个直接比较的寄生虫亲缘取决于WGS IBD和推理var编码P_TS(和英国石油公司_TS),鉴于此设置,低传输定义由中性标记和人口结构var编码似乎收敛。这提供了令人信服的证据的效用var编码和下游P_TS和英国石油公司_TS分析方法在这样的设置。事实上,值得注意的是var预测编码相同的基因血统和解决寄生虫亲缘与WGS分析,同时提供监测信息的优势主要表面antigen-encoding基因变体。一个有趣的调查超出了本研究将探讨的范围是否IBD-based方法可以应用到var编码数据,尤其是在消除设置的人口可能高度近交和大多数感染单克隆。

扩增子测序被提升为一个潜在的具有成本效益的方法分子监控通知传输模式,潜在亲缘进口寄生虫和寄生虫消灭疟疾的努力。Var编码是一种有针对性的扩增子测序的方法需要一个未来保持与简并引物PCR扩增的基因var基因家族编码的大多数免疫原性蛋白家族恶性疟原虫。这里我们展示其成本效益的潜力和高分辨率方法检查恶性疟原虫寄生虫抗原多样性、关联性和全基因组分子多样性模式监测在传播缓慢的设置高度相关的寄生虫传播。这将证明特别有用在改变模式的背景下人类的机动性和基因流在美国哪里有高需求等分子监测方法。鉴于在本地实现消灭疟疾,var编码可能是有用的在WGS地区可能不定期进行,或当地基础设施和能力可能不存在。即使在WGS经常进行的地区,var编码有可能筛选样本和识别需要下游WGS节省资源。其他流行的工具也会有用或传播缓慢的设置目标在全球范围内消除。毫无疑问,要到2025年消除的距离必须由适当的分子监测支持更好地了解和跟踪疾病传播以及揭示当地水库抗原不同的寄生虫的存在。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到复位器。的清洁双ɑ序列生成在这项研究中已经提交给DDBJ / ENA基因库(BioProject号:PRJNA642683)。python脚本双ɑ序列处理可以在GitHub上找到以下开源库:双ɑ清洁管道(https://github.com/Unimelb-Day-Lab/DBLaCleaner);clusterDBLalpha管道(https://github.com/Unimelb-Day-Lab/clusterDBLalpha);classifyDBLalpha管道(https://github.com/Unimelb-Day-Lab/classifyDBLalpha)与教程详细数据处理工作流https://github.com/Unimelb-Day-Lab/tutorialDBLalpha。所有其他的鉴定数据和分析代码可用的开源GitHub库https://github.com/shaziaruybal/varcode-ecuador。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和批准天主教大学del厄瓜多尔和墨尔本大学。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

SR-P KPD的构思和设计研究。菲斯和CAV-A获得进行野外工作恶性疟原虫隔离和流行病学的元数据。SR-P和刃发达var编码方法。SR-P SLD分子进行实验和测序;SR-P,菲斯和CAV-A策划的临床和流行病学的元数据。SR-P执行正式的数据分析和可视化。EKJ和双设计并进行了贝叶斯统计分析。SR-P、菲斯刃和KPD的解释数据。KPD监督工作。SR-P,菲斯。和KPD收购资金。SR-P和KPD写论文所有作者的贡献。 All authors contributed to the article and approved the submitted version.

资金

这项研究是财务支持的天主教大学del厄瓜多尔(格兰特数字:L13058 L13248, M13416, N13416, O13087 [QINV0084]菲斯),在美国国立卫生研究院福格蒂国际中心(项目生态和进化的传染病(EEID),授予数量:R01-TW009670 KPD),和美国国立过敏和传染病,国立卫生研究院(格兰特数量:R01-AI084156 KPD)。SR-P支持由墨尔本大学的国际参与奖墨尔本和感激地承认J.D.史密斯旅游奖澳大利亚社会的寄生虫,使她前往厄瓜多尔建立这种合作。

确认

作者要感谢的病人提供样品和田间团队参与样本集合。我们感谢厄瓜多尔卫生部,特别是路易斯·E·卡斯特罗,胡里奥·瓦伦西亚和哈维尔·戈麦斯Obando。我们感谢的支持澳大利亚llumina测序的基因组研究设施样本。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fitd.2023.1085862/full补充材料

引用