原始研究的文章

前面。昆虫科学。,17August 2022
秒。昆虫神经生物学
卷2 - 2022 | https://doi.org/10.3389/finsc.2022.936826

慢性暴露于杀虫剂影响蜜蜂视动的行为

雷切尔·h·帕金森 ^{1、2、3 *},

卡洛琳进来时 ^{1、4 __}和

约翰·r·格雷 ^{3 __}

¹草实验室,伍兹霍尔海洋生物实验室,美国
²动物学、牛津大学,英国牛津大学
³萨斯卡通,萨斯喀彻温大学生物学系SK,加拿大
⁴神经细胞生物学研究所,慕尼黑工业大学、德国慕尼黑

蜜蜂使用广角视觉运动信息来计算他们的距离从蜂巢飞,这个信息是传达到同种个体在摇摆舞。种子处理杀虫剂,包括烟碱类和小说像sulfoxaflor杀虫剂,显示对野生蜜蜂和管理产生不利影响,即使出席亚致死的数量。这些影响包括赤字飞行导航和制导能力,和减少暴露工蜂的生存。烟碱类杀虫剂杀虫剂在蝗虫破坏视觉运动检测,导致受损的逃避行为,但它以前从未被证明是否种子处理杀虫剂破坏蜜蜂的广角运动检测。在这里,我们表明,接触两种常用杀虫剂亚致死的吡虫啉(烟碱类杀虫剂)和sulfoxaflor,导致受损的蜜蜂视动的行为。这种行为影响与改变大脑的压力和解毒基因表达。接触sulfoxaflor导致神经元凋亡,稀疏增加本地化主要视叶,然而没有吡虫啉的影响。我们建议暴露在胆碱能杀虫剂破坏了蜜蜂准确编码广角视觉运动的能力,导致受损的视动的行为。这些发现提供了一个新颖的解释先前描述的影响烟碱类杀虫剂杀虫剂对导航和链接这些影响sulfoxaflor科学知识有一个缺口。

介绍

预防性使用种子处理杀虫剂是普遍,尽管越来越多的证据表明对传粉者的负面影响(1)和鸟类(2公认),可以忽略不计,农民福利(3)。为了克服杀虫剂耐药性,小说在农业杀虫剂不断被开发和实施包括sulfoxaflor (sulfoximine)使用商业尽管知道大黄蜂繁殖不利影响(4)。Sulfoxaflor和烟碱类吡虫啉作用于同一个目标,烟碱乙酰胆碱受体(乙酰胆),但他们被认为是解毒通过不同途径和不同亲和力乙酰亚基(5,6)。Sulfoxaflor存在于种子处理的混合物,包括烟碱类杀虫剂杀虫剂和杀真菌剂(例如,VISIVIO™,先正达Seedcare)但没有研究已经检查潜在的协同传粉者的这些化合物的毒性作用。

烟碱类杀虫剂杀虫剂在管理与无数的行为异常和野生蜜蜂,包括受损的导航和觅食(7- - - - - -9)。虽然这些影响是广泛与假定的赤字在学习和记忆,烟碱类的可能性或sulfoximines直接影响神经回路控制飞行导航蜜蜂先前未被探索。蜜蜂是习惯性地暴露于这些杀虫剂,它是至关重要的理解范围的亚致死效应有效地调节杀虫剂使用。

除了具有里程碑意义的线索,蜜蜂依靠视觉信息进行导航的两种主要模式:取向极化的阳光,光流的结果自动在飞行。而来自太阳的偏振光作为指南针(10),提供的信息来自视觉流(广角视觉运动)允许蜜蜂保持稳定飞行航向,高度,速度,重要的是它的功能作为一个视觉里程计的集成图像速度随时间(11)。蜜蜂为路径整合使用广角视觉运动线索,这是至关重要的蜂巢和食物来源(之间的旅行12)。已建立监测广角视觉运动检测技术在昆虫视动的响应(13,14)。针对旋转,垂直导向的黑白正弦波光栅,昆虫会的方向运动的视觉场景[评论,看到15)]。视动的响应是一个关键,天生的行为由昆虫用于恢复稳定的方向如果不小心倾斜在飞行。

在这里,我们表明,胆碱能杀虫剂吡虫啉亚致死的接触,sulfoxaflor或这些化合物的混合物会损害蜜蜂的视动的行为。开始理解这些变化的神经基础我们探索神经细胞凋亡的分子标记和基因表达。我们表明,而这些化合物影响解毒与压力相关的基因表达,产生的细胞凋亡在蜜蜂蜜蜂之间大脑很小并显示高可变性。我们预测,杀虫剂影响蜜蜂的视神经flow-sensitive神经通路,导致的损伤行为的关键飞行和导航。

方法

蜜蜂和杀虫剂暴露

抢劫者蜜蜂(的蜜蜂)收集他们回到四个户外蜂巢的入口位于法尔茅斯学院(法尔茅斯,MA)在7月和8月,2019年。减少夹杂物的蜜蜂受到年龄和疾病的影响,蜜蜂丢弃如果他们显示低活动在第一小时后集合或出现其他损坏。附近没有字段用杀虫剂处理,然而我们不知道蜜蜂被暴露于农药前集合。所有蜜蜂研究经历了同一领域的条件。蜜蜂被安置在(MA),伍兹霍尔海洋生物实验室的5天在5厘米2 - 3组蜜蜂³丙烯酸框在一个通风孵化器32°C,湿度55%,蜂房的温度调节的范围内(16)。1.5 M蔗糖提供了解决方案随意控制蜜蜂(CTL),治疗组蜜蜂提供的1.5蔗糖溶液含有50磅(195海里)吡虫啉(IMD,多伦多研究化学品,多伦多,加拿大),50磅(180海里)sulfoxaflor(自解压,多伦多研究化学品,多伦多,加拿大),或25磅(97.5海里)吡虫啉和25磅(90海里)sulfoxaflor(混合)。四个蜂箱的蜜蜂分配同样在治疗组(n = 136每个蜂房蜜蜂)。暴露浓度选择反映领域的浓度sulfoxaflor花蜜(50 - 900磅(17),虽然现场低浓度的吡虫啉通常[0.5 -15磅(18,19)]。

视动的分析

使用开环,虚拟现实领域,允许受蜜蜂走在一个充气球,我们测试的影响慢性暴露于烟碱类杀虫剂吡虫啉(IMD),小说杀虫剂sulfoxaflor (SFX)和两种杀虫剂的混合物(混合),而蔗糖控制视动的响应。视动的领域包括充气的球,一个USB相机模块(ELP)定位15厘米前面的球,和两个电脑显示器(CUK仿生B25GM, 24.5”,面向240 Hz刷新率)在一个直角,这样蜜蜂正面临两个显示器的顶点,离每个屏幕(15厘米图1一个)。显示器的刷新率我们使用(240赫兹)高于其他研究中使用的频率探索广角蜜蜂的运动检测,例如,198赫兹(20.))。电脑显示器显示垂直翻译黑色正弦波酒吧、创造的幻觉旋转光流从蜜蜂的角度。广角视觉运动引起的视动的响应受蜜蜂行走。由此产生的充气球的旋转是视频记录和虚构的行走路径使用FicTrac外推(21)(图1 b;视频S1)。

图1

图1广角视觉运动刺激蜜蜂视动的行为。(一)开环虚拟现实领域拴在蜜蜂上走一个充气球在两个电脑显示器的视觉刺激。(B),累积旋转响应序列的单个蜜蜂在左边(灰色)和向右(白色)控制正弦波光栅(CTL,左面板)治疗或接触后吡虫啉(IMD) sulfoxaflor (SFX)或混合(混合,右面板)。在这个例子中,IMD对待蜜蜂显示不对称将行为与左偏见,SFX蜜蜂显示一个向右的倾向,混合蜜蜂显示浅把左侧的偏见。(C)反应一个动物4和4”的16赫兹,0.0625 cpd光学流刺激(浅灰线)。路径重置为0 rad和0刺激方向发生变化,这样左向右运动是积极的和是负的,而且每个刺激间隔从0开始。线性回归是适合每个路径(例如,红色的线性回归的深蓝色的路径,与斜率, $\tilde{米}$ R²)。响应曲折( ${\tilde{R}}^{2}$ )和绝对速度( $\tilde{米}$ )的平均R²价值观和斜坡上所有8线性回归。(D),与左向右的反应倒反应(相同的数据,在C语言中,浅灰色线是单个路径)。最大累积旋转(ymax)平均在刺激呈现为一个动物。平均反应整个4向右(红线,ymaxr)和左倾(蓝线,ymaxl)也比量化旋转对称(y.sym)。(E),平均偏置和anti-biased响应所有蜜蜂每次治疗视觉刺激不同的时间(上面一行,恒定的空间频率0.0625 cpd)和空间频率(底下一行,时间频率= 16赫兹)。偏见(虚线)的反应积极的斜坡和anti-biased反应(实线)和负斜坡方向匹配的刺激。有显著刺激之间的相互作用和治疗的斜坡累积旋转(即。,把速度)anti-biased方向(GLMM:F_30497年= 1.68,p= 0.014,随机,随机个体的影响: $χ_{1}^{2}$ = 216.7,p<。)。字母表示显著差异anti-biased斜坡之间的治疗。动物的数量为每个治疗和刺激中列出表S1。(F)、蜜蜂显示的图像静止垂直正弦波酒吧(没有光学流)自发地走着。没有显著影响治疗的平均步行速度(克鲁斯卡尔-沃利斯, $χ_{3}^{2}$ = 0.12,p= 0.99,n = 8日至13日蜜蜂/治疗)。(G)转动速度是不受治疗自发走蜜蜂显示固定正弦波刺激(克鲁斯卡尔-沃利斯, $χ_{3}^{2}$ = 0.57,p= 0.13,n = 8日至13日蜜蜂/治疗)。

我们temperature-anesthetized蜜蜂在一个冰箱在4°C到无响应(10 - 15分钟)。麻醉后,胸腔的背侧轻轻擦掉了叶片去除毛发,和1毫升吸管提示贴在胸腔的背表面使用紫外线光固化牙胶(上一页DenPro)。蜜蜂提供蔗糖溶液下降1.5米,允许在一个孵化器恢复后30分钟。32°C的复苏,蜜蜂是定位与显微操纵器(世界精密仪器)支持的空气球在视动的舞台上。玻璃容器灯能够温暖的蜜蜂,直到它开始自发的走。蜜蜂被排除在实验如果他们不开始步行在15分钟。这占大约15%的人口,无论治疗。总的来说,n = 22 CTL, n = 25 IMD, n = 28自解压,n = 25混合蜜蜂被包含在行为分析。0.0625所有蜜蜂都测试了16赫兹,cpd刺激。的一个子集,这些蜜蜂也测试了一系列时空频率(9 - 16 n =每刺激,表S1)。

视觉刺激

视觉刺激在MATLAB编程R2019b (MathWorks纳蒂克,MA)通过调整代码从Psychtoolbox-3工具箱(22)。翻译垂直黑白正弦条显示在10年代间隔,首先在左边两个屏幕然后立刻改变方向向右。这个序列重复了4次,合计共有80年代/刺激。十二个视觉刺激进行了测试,通过不同的空间或时间频率(表S1),并给出了伪随机顺序3分钟inter-stimulus区间。刺激了0.5到0.0039的空间频率周期每度(cpd),在一个较小的值代表了广泛的光栅,显示在一个常数时间16赫兹的频率。此外,时间4 - 48赫兹的频率以恒定的空间频率测试0.0625 cpd。空间频率选择基于Ibbotson et al。(20.),这表明下行神经元响应空间频率在0.028和0.071之间200度以上cpd和速度/ s¹。这个范围内(即外我们包括刺激。,with very small spatial frequencies and low velocities), which was necessary to quantify how bees perform when the stimulus is either not visually resolvable or does not elicit the optomotor response for comparison of pesticide treated bees with the control. A subset of animals were also tested with stationary black bars to measure differences between treatments in walking behavior in the absence of optic flow.

Fictrac视频分析

视动的行为跟踪进行在线使用FicTrac (21)。另外一个项目是在Matlab FicTrac数据对齐视觉刺激和提取积累的所有轴旋转和总运动(图1 b)。累计时间和旋转复位为0在每个刺激和刺激的起始方向开关(例如,左向右)这样的输出左方的结果是积极的,而产生负向右转和每个刺激间隔开始时间= 0 (图1 c)。

我们符合线性回归到8规范化响应复制(4复制/方向)对于一个给定的animal-stimulus对(图1 c)。山坡上的线性回归的每个四左向右的刺激(即。,将平均速度)来评估的对称性行为反应。绝对旋转速度为0表示完全对称和”的反应,而斜坡增加级表示更大的反应不对称。R²值为每个线性回归也平均产生的路径曲折。反应了从左向右方向缓慢或那些动摇产生较低的R²值比反应迅速切换方向遵循视觉刺激和维护一致的偏航刺激的持续时间。运动距离(所有转动轴)和直径的空气支持球被用来计算平均步行速度,这是整个4和4”的刺激的演讲(80年代的步行行为)。

比较左倾的大小和向右视动的反应,我们改变了这两个方向向右的符号反应的反应是相同的规模(即。都是积极的斜坡,图1 d)。我们计算的响应大小的最大累积旋转(ymax两个方向)平均刺激症状。最大累积旋转也向右左和刺激之间进行比较,以确定如果反应是不对称的。平均ymax值计算分别为左向右的反应,和旋转不对称(y.sym)得到:

\begin{array}{l} \frac{| y 米 一个 x r - y 米 一个 x l |}{米 一个 x (y 米 一个 x r, y 米 一个 x l)} = y 。 信谊, & (1) \end{array}

在哪里ymaxr是向右的,ymaxl是左方的最大累积旋转。的值y.sym接近于零代表对称反应,而高度不对称反应y.sym值接近1。反应标记“偏见”的方向,引起较大的反应和“anti-biased”在另一个方向。

基因表达的相对量化

另一组的蜜蜂是长期暴露于IMD,自解压,混合,或蔗糖(CTL) 5天,如上所述(n = 25蜜蜂/治疗分配随机从4殖民地)。新鲜的蜜蜂大脑被吸附在干冰冷冻和储存在-80°C,直到进一步使用(≤2周)。材料从5只蜜蜂大脑汇集到一个样本,每治疗组5样本生成。总RNA从每个示例使用麦克斯韦是孤立的^®RSC工具包(Promega)和麦克斯韦microrna的组织^®RSC 48仪器(Promega)根据制造商的指示。使用QuantiFluor RNA浓度测量^®总RNA RNA系统(Promega),量化了Quantus荧光计(Promega)制造商的协议后,收益率之间120 - 210 ng /μl RNA和7.2 - 12.6μl。

烟碱类杀虫剂杀虫剂曾被证明导致神经失活和细胞死亡的蜜蜂大脑(23,24)。行动的一种机制取决于氧化损伤导致生成活性氧的解毒杀虫剂(25)。评估是否IMD,自解压,或者混合蜜蜂中枢神经系统基因表达的影响,我们进行了一步逆转录酶(RT) -qPCR蜜蜂的大脑暴露在相同的治疗方法用于行为分析。我们检查了相关的基因表达(未经处理的蜜蜂和表达式)的两个细胞色素P450酶(CYP9Q2 CYP9Q3)参与解毒的杀虫剂,以及两种酶参与清除活性氧,超氧化物歧化酶1 (SOD1)和过氧化氢酶(CAT)。感兴趣的是超氧化物歧化酶基因1 (SOD1)、过氧化氢酶(CAT),细胞色素P450酶(CYP9Q2和CYP9Q3),参考GAPDH基因。正向和反向引物序列和序列加入数字中描述表S2。设计引物都是使用NCBI底漆爆炸(NCBI)感兴趣的基因特异性100%或从先前的研究(26,27)。RT-qPCR进行互译方法结合逆转录和放大在单个管使用GoTaq互译RT-qPCR系统(Promega)。20μl最终卷包含10μl GoTaq qPCR大师混合,0.4μl GoScript互译RT大师混合,0.5μl 10μM正向和反向引物组合(Genewiz,新泽西州),7.1μl核酸酶游离水,0.8μl MgCl₂和RNA样本。样本被加载到一个QuantStudio 5 (ThermoFisher科学)和运行以下循环条件:45°C 15分钟,95°C 10分钟,40 95°C的周期为15秒和60°C 30秒(数据收集步骤),最后72°C 60秒钟融化曲线紧随其后。RT-qPCR放大与规范化评估荧光信号(δRn)从每个样本(图S1A)。我们使用1 - 0.0001 x系列稀释的RNA样品和标准曲线是用来证明PCR抑制剂的存在(不太可能图印地)。没有RT酶的反应被用作评估缺乏反应控制DNA样本:没有放大可以检测到这些样品。

我们验证qPCR特异性使用融化曲线分析(图就是S1C)。样品导致qPCR效率低于90%分析中遗漏了20个样品(3)。数据分析使用QuantStudio5 (ThermoFisher科学)使用Cq阈值方法(28,29日)。RNA扩增的基因感兴趣的是归一化的放大GAPDH为每个样本(δCt),然后与控制样本的均值放大(δδCt)。

TUNEL分析

额外的蜜蜂(n = 4,每组一个蜜蜂从蜂巢)服用IMD,自解压或蔗糖(CTL) 5天如上所述。对于组织处理,cold-anesthetized蜜蜂被斩首,大脑解剖受到寒冷的PBS, pH值7.4(正如前面所描述的30.))和浸没式固定在4% PFA / PBS, pH值7.4一夜之间在4°C。组织在PBS冲12小时在4°C和孵化在30%蔗糖/ PBS一夜之间在4°C。组织切片之前,沉浸在Tissue-Tek O.C.T.化合物(樱花)和干冰冷冻。大脑在12μm分段使用低温恒温器,收集SuperFrost +粘附幻灯片(热科学),储存在-20°C,直到进一步的使用。两个部分每个大脑(120μm切割距离)被安装在每个幻灯片。

TUNEL分析,组织与PBS解冻,洗5次,pH值7.4。部分是permeabilized Triton x - 100年的0.1%,0.1柠檬酸钠pH值6.0 RT 30分钟。与PBS 4洗后,部分治疗与TUNEL试剂(原位细胞死亡检测装备,荧光素;罗氏公司)在一个黑暗的,湿润37°C室3小时根据制造商的指示。消极的控制,没有酶解决方案应用在此步骤(图S2)。积极的控制,部分处理DNase我在10毫米(1.5 U /μl) Tris-HCl, pH值7.4,10毫米MgCl₂1毫克/毫升BSA在37°C前60分钟TUNEL发展图S2)。所有部分都洗3次与PBS和孵化与赫斯特33342年在PBS(1:1000) 10分钟。在PBS 2洗后,部分安装了Fluoromount水安装介质(Sigma-Aldrich)。

图像获得使用一个正直FV1000共焦显微镜系统(奥林巴斯)配备20 x /附加说明0.85油浸物镜和使用激光线赫斯特405 nm和488 nm的TUNEL标准过滤器设置。图像分析进一步使用开源软件ImageJ /斐济(执行31日)。我们选择感兴趣的领域(MB,洛杉矶,看哪,我的蜜蜂大脑和量化TUNEL +细胞只对地区丰富的核(赫斯特染色);因此,除神经纤维网(图5一个)。不知情的条件下,细胞在这个区域被定义为2 - 4部分每只蜜蜂。赫斯特染色强度差的部分被排除在分析之外。我们没有观察到明显的地区高细胞凋亡在大脑区域而不是量化分析。

共识聚类和其他统计分析

我们进行统计分析R版本4.0.3 (32)。视动的响应类型是集群使用k - means算法组五个行为反应特性(最大累积旋转、弯曲度、行走速度,绝对速度,和旋转不对称)在治疗和视觉刺激。总共有612 4 115只蜜蜂的治疗的反应。在聚类之前,响应特性是z分数。最优簇数使用蒙特卡罗集群(M3C reference-based共识预测(33),一个无监督学习技术,聚集多个集群运行的结果。使用ConsensusClusterPlus共识集群被确认和实现(34))。对于每个聚类迭代,我们包括反应总数的90%和80%的行为反应特性(4,5)。2000年的聚类算法是重复迭代,每个集群运行的输出是比较矩阵定义一个共识。行为反应的比例分配给每个集群定义为每一个治疗和视觉刺激。在每个集群行为反应相比,然后提供一个定量说明整个视觉刺激的不同反应类型和治疗。

数据测试正常使用Shapiro-Wilk正常测试并使用列文方差相等的测试车包(35)。lmerTest (36)和nlme (37)包我们使用广义线性混合模型(GLMM)比较的特点在治疗和刺激的行为反应,以动物为随机效应占重复措施(∼治疗的反应*刺激+(1 |蜜蜂)。模型探讨治疗和刺激之间的交互作用是否显著。非标准模型与交互条款重新运行没有交互项(反应~治疗+刺激+(1 |蜜蜂))。使用高斯分布模型的数据积累旋转,平均步行速度和绝对速度,而β回归分布用于旋转不对称和曲折。GLMM最吝啬的模型的选择进行评估每个固定因素的相对重要性逐步减法的方法。这种方法与假设检验基于比较嵌套模型使用函数方差分析或轻铁。后者函数应用β回归以前包。集群任务是分析GLMM和二项分布,通过测试集群1跨刺激反应的发生和治疗(集群治疗1 ~ +刺激+(1 |蜜蜂)集群和集群分布的2和3为其余的反应(集群治疗2 ~ +刺激+(1 |蜜蜂)。事后进行多重比较使用emmeans包(38)Kenward-Roger自由度方法和图基假定值调整占多个统计测试。平均消费,相对基因表达,自发(不刺激)行为反应与克鲁斯卡尔-沃利斯量化等级和曼Whitney U测试与Bonferroni调整成对比较。TUNEL量化无法评估统计由于低样本大小的自解压治疗。统计显著性进行评估p< 0.05。在数据,(*,< 0.05;* *,< 0.001;* * *,< 0.0001)统计学意义事后多个比较,或字母显示组间显著影响。

结果

接触杀虫剂损害视动的反应

在为期5天的曝光时间没有明显差异的消费或生存之间的控制解决方案的数量和农药治疗组(图S3)。蜜蜂每天平均消耗46μl糖溶液,导致平均剂量的吡虫啉2.3 ng /蜜蜂/天(IMD), 2.3 ng sulfoxaflor /蜜蜂/天(自解压),或1.12 ng吡虫啉/蜜蜂/天+ 1.12 ng sulfoxaflor /蜜蜂/天(混合,表1)。

表1。糖溶液的平均体积和活性成分(我)消耗。

我们测试了蜜蜂的视动的反应在一个开环竞技场使用翻译垂直正弦波光栅显示在两个电脑显示器创建旋转光流的错觉(图1一个)。视动的反应引起了一系列时空光栅频率(表S1)。蜜蜂的行走路径从视频中提取和视动的反应是量化使用累积的旋转反应(图1 b- - - - - -D)。4和4”的刺激反应平均一个动物,和没有农药的影响治疗的变化反应在复制(图S4)。控制(治疗)蜜蜂,光学流视觉刺激引起视动的行为特点,调到角速度> 200度/秒(图1 e)。刺激小空间频率(0.5 - -0.125 cpd)未能引起视动的反应,正如先前所显示的(15)。我们接触独立成群结队的蜜蜂吡虫啉,sulfoxaflor或这些化合物的混合物。刺激引起强大的视动的反应控制蜜蜂蜜蜂引起较弱的反应从农药治疗组。蜜蜂显示不对称的视动的反应,这种反应的累积旋转更大刺激在一个方向上(“偏见”的反应)比其他(“anti-biased”反应,图1 e全球语言监测:F₁₁₃₂= 190.7,p< 0.0001)。anti-biased方向有显著差异,治疗之间的旋转速度(图1 e)。没有影响的杀虫剂在步行速度或将速度没有视觉刺激(图1 f,G)。我们观察到pesticide-exposed蜜蜂同样活跃控制蜜蜂虽然关在笼子里,和蜜蜂的发病率,不会走在充气球(大约15%)与对照组是一致的和其他的研究(39)。

我们比较各种行为反应特性在时空的刺激频率和治疗的范围(图2一个)。蜜蜂sulfoxaflor处理(自解压)或混合物(混合)显示低累积旋转控制(相比图2 b和表2)。道路曲折是影响农药治疗在刺激时间频率导致较低的R²拟合线性回归的路径(图2 c和表2)。低的R²值导致蜜蜂,缓慢的反应时间开关转动方向的刺激,和那些显示蜿蜒行走路径。步行速度,然而,没有受到农药接触的影响,尽管它也随刺激时空频率(图2 d和表2)。蜜蜂走慢回应刺激引起强大的视动的反应(即速度> 200度/秒¹)。

图2

图2行为响应特性随治疗和光学流频率。(一)刺激速度频率作为时间的函数(左,恒定的空间频率0.0625 cpd)和空间频率(16赫兹),持续的时间频率。灰色阴影表示刺激不引起强大的视动的反应控制蜜蜂。(B-F)行为反应特性与光流不同的时间(左面板)和空间(右面板)频率,显示均值±s.e.m.在动物在每个治疗组(n = 23至28日每治疗蜜蜂)。的结果事后测试(emmeans)上显示的数字与字母表示显著影响农药治疗(小写)与控制和刺激(大写)当没有互动,和彩色的星号显示显著差异时特定的刺激和治疗有一个互动。统计数据报告表2。

表2

表2广义线性混合模型输出,包括随机效应的标准偏差行为的响应特性图3。

我们观察到大部分蜜蜂杀虫剂处理显示不对称的视动的反应在刺激我们测试的范围。控制蜜蜂也偶尔显示不对称反应,但这种效果往往发生主要与很小的空间频率刺激。量化这种偏见是否一个工件的实验设置,或杀虫剂处理的实际效果,我们平均的速度将左侧的(积极的斜坡)和向右(负斜率)行走路径的反应(˜m,图1 c)。我们使用绝对转动速度,这样左或向右偏差占相同的规模。完美对称的反应和”的视觉运动导致斜坡(把速度)等于零。我们发现,把偏见存在某种程度上在所有治疗,但是这种偏见与pesticide-treated蜜蜂也显著大于(图2 e和表2)。绝对的偏见把速度不,然而,考虑到响应的大小。考虑到这一点,我们比较了不同的最大累积旋转反应和”的视觉运动(y.sym,图2 f和表2)。控制蜜蜂显示大约有25%的不对称旋转刺激引起强大的反应,而不对称是> 60%所有刺激蜜蜂的农药治疗组。有趣的是,把偏差显著增加控制蜜蜂刺激的反应较低的速度。

共识集群显示三种行为反应

总而言之,跨时空的范围视动的响应频率特性表明,控制蜜蜂显示弱视动的对刺激的反应时间频率较低(< 16赫兹),并显示高水平的响应不对称(> 90%)刺激小空间频率(0.125 - -0.5 cpd)。虽然时间频率低刺激可能不提供足够的角速度引起强大的反应,低空间频率的刺激也在蜜蜂的视觉分辨率的限制(40)。控制蜜蜂对这些刺激的反应,因此,代表蜜蜂的行为在这个范式的例子当视觉运动不刺激天生的视动的反应。pesticide-treated蜜蜂的行为反应特性显示了跨时空的刺激频率变化,尽管这些多维效果难以治疗和刺激类型之间的比较。更有效地描述不同的反应类型,我们雇了一个共识聚类算法的五行为反应特性(最大累积旋转、弯曲度、行走速度,绝对速度和旋转不对称),预测一个优化集群数3 (图S5)。

我们从每个集群行为反应特性相比无论治疗或刺激类型,并发现聚类算法成功地识别反应使用所有参数(图3一- - - - - -E)。这很重要,因为相似的一个参数(例如,绝对把速度)并不总是符合相似在另一个(例如最大累积旋转)。集群的响应是不同的:1被对称的和健壮的视动的响应特征,偏见和anti-biased刺激诱发健壮的转动方向相同的视觉运动;集群2反应快走几步,高度不对称。反应在这个集群包括大型级转一个方向,不间断或只浅浅地纠正与刺激的变化方向;和集群3级较低(即表示响应。,walking forwards rather than turning strongly) and a shallow turn bias (图3 f)。我们得出的结论是,集群1代表健壮的视动的反应,而集群2和3中弱或不成功的视动的反应的两种截然不同的类型。

图3

图3特征的响应类型成功的视动的行为显示了低农药对蜜蜂。(安妮)集群之间的行为反应特性明显不同,无论治疗或刺激,包括最大累积旋转(一)GLMM: F_2594年= 224.85,p < 0.0001,随机个体的影响: $χ_{1}^{2}$ = 165.81,p < 0.0001),路径曲折(B)GLMM: F_2600年= 372.16,p < 0.0001,随机个体的影响: $χ_{1}^{2}$ = 40.25,p < 0.0001),平均步行速度(C)GLMM: F_2570年= 75.69,p < 0.0001,随机个体的影响:χ²₁= 290.37,p < 0.0001),速度(D)GLMM: F_2568年= 47.63,p < 0.0001,随机个体的影响: $χ_{1}^{2}$ = 211.54,p < 0.0001),旋转不对称(E)GLMM: F_2606年= 543.2,p < 0.0001,随机个体的影响: $χ_{1}^{2}$ = 63.52,p < 0.0001,集群1:n = 216响应,集群2:n = 187响应,和集群3:n = 209响应字母表示集群)之间的显著差异。(F)在每个集群,意味着反应(置信区间)。反应在左方刺激=固体,向右=虚线。(G),行为反应的比例分配到每个集群在视觉刺激和治疗。字母表示集群之间的显著差异。

三种响应类型被发现在不同的刺激和治疗的比例,比例最高的控制蜜蜂显示集群1对刺激的反应,诱发最健壮的视动的反应(如16-48赫兹cpd -0.0625和0.0313,图3 g)。集群2和3反应代表更高比例的刺激诱发很弱/不视动的反应在控制蜜蜂(0.125 - -0.5 cpd, 4 - 8 Hz),当他们代表所有视觉刺激在高农药治疗组的比例(图3 g)。总的来说,集群1反应的比例明显高于对照组和农药治疗(GLMM、治疗: $χ_{3}^{2} = 26.51$ (p < 0.0001);刺激: $χ_{10}^{2} = 70.53$ 蜜蜂,p < 0.0001, n = 22 /治疗)。

我们评估是否成功的视动的响应类型(集群2和3)控制和农药治疗组之间的不同。响应类型都是代表的刺激非常小的空间频率(0.25和0.5 cpd,集群2 57%,43%集群3)为控制蜜蜂。Pesticide-treated蜜蜂显示增加集群2和3跨刺激反应(图3 g)。然而,集群2与集群3反应的比例不随治疗,尽管小差异刺激(GLMM、治疗: $χ_{3}^{2} = 0.787$ ,p = 0.85;刺激: $χ_{10}^{2} = 18.39$ 蜜蜂,p = 0.049 n = 22 /治疗)。

基因表达的蜜蜂大脑受到慢性农药接触

视动的行为需要正确处理视觉信息的大脑。我们假设杀虫剂后受损的行为我们观察到治疗导致杀虫剂对神经系统的影响。开始理解神经机制,我们测量基因表达在蜜蜂的大脑。相比于控制条件,IMD导致SOD1的表达减少,而混合表达式(略有增加图4)。所有农药治疗导致显著增加的猫CYP9Q2的表达,而CYP9Q3 IMD治疗后表达明显减少或SFX只(图4)。有趣的是,混合(25磅IMD和25磅SFX)治疗导致基因表达的增加大于IMD或SFX分别为猫CYP9Q2(50磅),表明IMD和SFX在这些途径的相互作用。

图4

图4慢性亚致死的农药暴露影响蜜蜂基因表达在中枢神经系统。Fold change of gene expression versus relative control expression levels for imidacloprid (IMD), sulfoxaflor (SFX), and a mixture (MIX). Pesticide treatment affects gene expression of superoxide dismutase (SOD, Kruskal-Wallis, $(χ_{3}^{2}$ = 13.9,p< 0.01)、过氧化氢酶(猫, $χ_{3}^{2}$ = 14.7,p< 0.01)和解毒酶CYP 9 q2 $(χ_{3}^{2}$ = 15.7,p< 0.001),CYP 9第三季 $(χ_{3}^{2}$ = 10.3,p< 0.01),在蜜蜂的大脑。曼Whitney U测试事后分析比较了农药治疗控制(0褶皱变化)用星号(*,p < 0.05)。酒吧展示意味着±s.e.m。(n = 5 /试验)。

Sulfoxaflor导致视神经叶稀疏的细胞凋亡

改变压力基因的表达可能表明氧化损伤可导致细胞凋亡。我们执行一个TUNEL分析可视化细胞凋亡在蜜蜂的大脑慢性暴露于IMD或自解压。我们量化凋亡细胞视叶和蘑菇体感兴趣的领域(图5 a - c)。量化趋势显示凋亡细胞在接触后的视叶SFX (图5 d)。内侧花萼(MC)和横向花萼(LC)的蘑菇体(MB)包含很少的凋亡细胞在治疗。我们观察到凋亡细胞稀疏分布在板(La)、髓质(我)和lobula视叶(Lo),不过他们的数量不同的主题(图5 d)。

图5

图5Sulfoxaflor导致视神经叶稀疏增加细胞凋亡。(一),共焦图像的蜜蜂大脑与赫斯特染色。TUNEL量化的感兴趣的领域是突出在白色的左边,包括(LC)外侧和内侧花萼(MC)的蘑菇体(MB)和板(La)、髓质(我)和lobula (Lo)视叶(OL,比例尺= 500μm。(B)治疗后,图像的视叶IMD和自解压,用TUNEL染色(比例尺= 100μm)。(C)TUNEL染色的,积极的和消极的控制蘑菇体(比例尺= 100μm)。(D)、量化TUNEL +细胞(归一化面积因子)在大脑中感兴趣的区域。数据点表示的意思是值在2 - 4节/大脑。

讨论

无数的杀虫剂和其他农用化学品环境中浓度低于像蜜蜂传粉者的致命剂量。虽然许多研究报告毒性作用的胆碱能杀虫剂亚致死的数量,有一个不完整的理解杀虫剂暴露和视觉指导的行为之间的关系。第一次我们在这里显示,慢性接触吡虫啉亚致死的,sulfoxaflor,或这些杀虫剂导致受损的视动的蜜蜂的行为。我们假设这些影响结果广角视觉信息的处理的缺陷。蜜蜂依靠准确的宽视场运动检测飞行稳定,和另外的路径整合后回到蜂巢觅食发作(41)。使用视动的行为作为广角运动检测代理(14),我们表明,insecticide-exposed蜜蜂显示可怜的行为反应旋转光流。这是由不对称或浅转向对视觉刺激的反应,引起强烈的视动的反应控制蜜蜂。失败的响应类型匹配由控制蜜蜂当光栅空间频率很小,这表明pesticide-treated蜜蜂可能已经无法感知运动的光栅和方向。其他可能的解释为不对称反应类型取决于假定的不对称的影响大脑中的杀虫剂,或影响头辊稳定这可能损害的大小反应在一个方向上(42)。这些假定的原因应该探索在未来的研究。我们发现,与吡虫啉相比,亚致死的sulfoxaflor暴露导致影响视觉motion-guided略大的行为。这个对比这些杀虫剂对蝗虫,吡虫啉独自一人在那里影响视觉运动检测亚致死的剂量范围(例如,10 ng /蝗虫(43)),表明蜜蜂sulfoxaflor的神经毒性作用更敏感。

视觉运动检测依赖于精确的时间空间输入和组织之间的关系是由胆碱能神经传递在昆虫(44)。最重要的一个机制的神经回路采用动态调整的感觉输入和运动输出增益调制。增益调制过滤不想要的感觉输入和放大突出感官信号变化的环境要求(45)。在视觉运动检测的背景下,增益控制是至关重要的维持一个大动态范围的视觉运动速度和角大小,由国家和注意力(调制46,47)。昆虫视觉内兴奋性信号电路实现主要通过乙酰本地化的突触视觉光学叶视神经元(44)。控制信息的流动在这些电路,因此,很可能由这些受体的动力学,这取决于乙酰亚基组成(48)。暴露于烟碱类影响乙酰胆表达式(6,49- - - - - -51),这是自我调节的机制,受体激动剂后曝光的基础上减少毒性。蝗虫,吡虫啉改变响应的下行视觉视神经元,表明减少激发光叶(43)。也能减少广角吡虫啉在花虻下行神经元的运动响应(52)。我们假设影响我们观察到的视动的反应结果受损的视觉运动处理,产生的影响改变增益调制光叶。

我们测量基因表达的蜜蜂大脑量化解毒和体内平衡机制以应对杀虫剂毒性。基因表达变化的压力和解毒后烟碱类杀虫剂或sulfoxaflor暴露在蜜蜂一直在探索之前,与高度的变化依赖于接触方法和持续时间(49,53,54)。CYP9Q2和CYP9Q3酶参与杀虫剂在蜜蜂解毒(55),尽管它以前从未被证明这些酶是否解毒sulfoxaflor。在我们的试验中,吡虫啉和sulfoxaflor(50磅的曝光)导致的upregulation CYP9Q2 CYP9Q3的差别,对这些暗示这些杀虫剂通过类似的途径蜜蜂解毒。然而,这些通路的规定可能不同,随着混合物(25磅IMD, 25磅SFX)未能诱导CYP9Q3表达式,当CYP9Q2调节。这也是对过氧化氢酶,调节比单个化合物的混合物。二元混合物的杀虫剂曾被证明不同影响蜜蜂的基因表达(50),这值得注意杀虫剂通常应用于混合物(56)。我们另外发现超氧化物歧化酶1表达下调了吡虫啉时调节的混合物。改变监管过氧化氢酶和超氧化物歧化酶1是表明氧化应激,这已被证明来自于烟碱类杀虫剂接触后会引起钙果蝇(57)。氧化应激可以导致神经细胞凋亡,这可能损害视神经叶运动检测电路。我们发现sulfoxaflor导致视神经叶细胞凋亡增加,尽管动物之间有高度的可变性,以及在某些情况下比控制没有影响。我们认为,而细胞凋亡可能增强行为影响我们观察到,这很可能不是影响视动的反应的主要机制。先前的研究发现细胞凋亡的增加接触后吡虫啉在蜜蜂的大脑,而这些矛盾的结果可能的解释不同的曝光时间(例如,6 - 8天(24,58)。

影响我们观察到的另一个可能的解释杀虫剂对视觉引导行为涉及直接毒性电动机通路控制行走,如烟碱类已经被证明能够影响在大黄蜂飞行行为(59),蝗虫(60)和蜜蜂(61年)。然而,我们没有观察到任何差异治疗在自发的步行行为或平均步行速度在空间和时间光栅频率。这表明,行走的运动控制并不是受到杀虫剂的影响。我们相反假设影响观测结果从受损的广角视觉运动处理视叶或在视觉运动信号的转换在中央复杂运动命令。这些假设还有待在将来的研究中测试。

本研究中使用的剂量的吡虫啉浓度高于field-realistic花蜜(如。,0.5 -15磅(18,19),然而他们的花蜜浓度sulfoxaflor[50 - 900磅(17)]。在杀虫剂亚致死的曝光时间,由此产生的影响是戏剧性的视觉指导的行为。甚至一个小广角运动损伤检测可能对飞行稳定有巨大的影响。虽然转动光流的处理是不一样的转化光学流,可能接触杀虫剂可能会影响视觉测程法通过损害广角运动处理。未来的工作应进一步量化field-realistic浓度对飞行行为的影响来评估是否影响我们观察到转化为视觉里程计的一个障碍。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://doi.org/10.5061/dryad.ht76hdrh4。

作者的贡献

RP和概念化的实验设计。RP行为和RT qPCR数据收集和分析。CF执行TUNEL分析、共焦显微镜和图像分析。RP、CF和詹写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究是由2019年神经科学草奖学金(RP和CF)。所有实验(MA),伍兹霍尔海洋生物实验室除了共焦显微镜,是神经细胞生物学研究所的执行(TUM,慕尼黑,德国)。

确认

感谢2019年草基金保管委员会主任(梅丽莎·j·科尔曼)、副主任(克利斯朵夫身上),和其他研究人员和更广泛的MBL社区有价值的讨论这个项目。我们深深地感谢那些参与Promega大使的海洋生物实验室,提供试剂、设备、时间协助RT qPCR优化。我们感谢杰克桑德琳。法尔茅斯学院访问蜜蜂,和托马斯·Misgeld (TUM、慕尼黑)访问FV1000共焦显微镜。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/finsc.2022.936826/full补充材料

补充图S1 |RT qPCR放大。放大(一),标准曲线(B),融化曲线(C)一个控制样本含有RNA提取5蜜蜂的大脑。

补充图S2 |视叶染色。视叶部分与TUNEL染色(核和赫斯特)与(口图像)或DNase我治疗作为正面和负面的控制,分别。比例尺是μm 100元。

补充图S3 |体积消耗和蜜蜂的生存超过5天。(一)每天平均体积消耗每只蜜蜂不随治疗(克鲁斯卡尔-沃利斯, $(χ_{3}^{2}$ = 2.21,p = 0.53, n = 26笼子每次治疗)。(B)蜜蜂的生存超过5天没有随治疗(Cox比例风险,似然比检验= 1.91,df = 3, p = 0.59。n = 130只蜜蜂/治疗。

补充图S4 |Within-animal之间变化累积旋转刺激演示。每个左向右刺激了4次(按顺序左,右,左,等等)。治疗没有显著区别的标准偏差累积旋转单个蜜蜂(LME, F_3,98= 2.01,p = 0.118),而有差异在刺激(LME F₁₁₁₂= 14.0,p < 0.0001)。

补充图S5 |共识聚类验证结果。(模拟)确定最优数量的集群(k)使用蒙特卡罗reference-based共识集群(M3C)包。累积分布函数(CDF),相对集群稳定指数(RCSI, B),蒙特卡罗假定值(C)和熵(D)证明k = 3是最优数量的集群,这些集群健康数据明显优于k = 1集群。(E)二维可视化的k - means聚类3集群。(F)共识矩阵与2、3或4集群。最高的三个集群的集群找到共识,可视化的共识矩阵比较聚类迭代运行。黑暗的蓝色区域代表高集群运行之间的共识,而白色区域表示样本没有聚集在一起。

补充视频S1 |视动的行为跟踪使用FicTrac提取累积旋转。视频面板左侧显示FicTrac的输出,包括输入视频支持的蜜蜂在空中行走的球,球的旋转的跟踪,和外推平面行走路径。右边的面板显示了对应的累积旋转,表示向右方向向上运动,向下是在左边。星号出现刺激时瞬间开关方向。视觉刺激光栅的空间频率0.0625 cpd和颞16赫兹的频率。蜜蜂是对照组。

引用

1。Rundlof M,安德森门将,Bommarco R,薯条,Hederstrom V, Herbertsson L, et al。种子涂层与烟碱类杀虫剂杀虫剂对野生蜜蜂都有不利的影响。自然(2015)521:77 - 80。doi: 10.1038 / nature14420