搜索行为个体的觅食者涉及神经递质系统社会侦察的特点

介绍

在蜜蜂、寻找食物来源和收集的食物是由两个不同的工人团体,童子军,新兵(1- - - - - -3)。根据季节和殖民地国家,5到25%的觅食者是童子军和所有其他成员。每天侦察兵寻找新的食物来源;和员工继续访问已知的食物来源,只要食物来源提供了充足的优质食品(2,4)。基于这些行为差异,它提出了童子军是类似于鸟类和人类(猎奇5,6)。

相比之下,新兵只在开始寻找食物来源的觅食的职业或当他们决定换一种食物来源,不经常发生在他们短暂的生命(2,4,7)。跳舞后后,新兵寻找食物的位置使用路径整合信息表示的舞蹈,他们已经(7,8)。到达附近区域显示的舞蹈,他们开始寻找食物来源可能使用气味信号感知舞者(7,9)以及视觉和花花的气味信号区(10,11)。除此之外,新兵,觅食者不断地觅食的食物来源,已被证明启动搜索行为训练馈线实验时删除(12- - - - - -16)。增加循环的搜索行为由定心在馈线的位置,他们预计随着半径和hive-feeder轴的取向之前回到蜂巢(12)。此外,类似的实验与无味支线航班隧道表明蜜蜂觅食时主要使用路径整合和具有里程碑意义的记忆寻找失踪的给料机(14)。

在这项研究中,我们探索了两种现象。雷诺兹et al。(12)只观察到飞行的轨迹,当蜜蜂首次经历了失踪的支线。因此,问题仍然是蜜蜂是否继续让其他搜索航班,如果是这样,觅食者是否显示搜索行为的差异。我们测量飞行和蜂巢单独确认的时间为2 h后移除馈线觅食。时态数据都足以描述行为随时间的变化以及区分行为的个体差异。此外,我们想知道这是否搜索行为可能受神经调质系统参与侦察行为将个人行为与社会专业化分工和行为(5)。有越来越多的证据表明,行为专家可能会暂时调到一个特定的大脑和行为状态,发生在任何物种的个体时,执行相应的单独行为(17- - - - - -19)。比较脑基因表达在童子军和新兵和操纵实验梁et al。(5)确定,儿茶酚胺的变化(DopR1)、谷氨酸(Eaat-2、Vglut Glu-RI)和γ-aminobutyric酸信号(Gat-a)与侦察行为相关联。此外,操纵实验证实谷氨酸和章鱼胺治疗增加,和多巴胺拮抗剂治疗的可能性减少侦察(5,6)。因此,我们特别感兴趣的这些神经递质系统也参与搜索行为是否由常规的觅食者,也就是说,新兵,当他们找不到一个已知的支线。我们使用质谱测量(20.)测试新兵的搜索行为是否引起的一个访问器与短期变化神经调质参与社会侦察。效价测量两个大脑区域的行为特征进行个人觅食:中央大脑中央组成复杂和蘑菇体,已被证明参与视觉导航包括路径整合和里程碑式的学习(21- - - - - -24)和光学叶预处理视觉信息用于导航和里程碑式的内存(25- - - - - -27)。

结果

没有预期的给料机引起的一系列搜索航班和随后停止觅食

蜜蜂觅食(1:n= 16,2015n= 16,2020),连续访问一个馈线几个小时立即开始搜索时没有发现支线在预期的位置(图1 a - c)。已经觅食的意思是时间旅行时没有发现馈线(FS,觅食/搜索飞行;补充表1)的平均持续时间明显长于觅食之旅(FS,图1 d, E)。相比之下,蜂巢的平均持续时间呆在这第一次成功旅行(HFS)是那样短后之前的常规觅食之旅(高频;图1 f, G)。的觅食者直接停止觅食FS飞行后(BeeID: E26;图1 c),而所有其他的觅食者执行1到4额外的搜索航班(图1 b, C)。所有觅食后100分钟内停止觅食的支线。连续搜索航班的平均持续时间相对一致的(S: 12.37±6.02分钟)和持续了约3倍时间比平均持续时间的觅食之旅(F: 3.51±1.02分钟;图1 d, E;GLMM伽马家人和广义线性假设检验;另请参阅补充表1GLMM和GLHT结果的细节)。搜索航班相比,平均持续时间的间歇蜂巢保持(HS1-HS3)增加搜索旅行的数量(图1 f, G;GLMM伽马家人和广义线性假设检验;另请参阅补充表1GLMM和GLHT结果的细节)。

额外的控制实验(2)我们把支线后1 h,觅食者降落在馈线上就开了(补充图1)。这一发现表明,搜索航班或多或少限制接近预期的馈电位置和附近觅食者没有寻找任何其他食物的位置。

个体的觅食者显示不同搜索表型

聚类分析的基础上的数量和时间动态搜索航班和蜂群保持识别五个不同表型的独立行为实验(电流-电压;图1 h-j;看到补充图2一个最优数量的集群)。集群1包括蜜蜂停止觅食后第一个搜索航班(S1);n= 3,2015;n2 = 5,2020)和集群包括单一抢劫者后已经停止觅食FS (BeeID: E26, 2020)。在集群III(觅食n= 3,2015n= 7,2020)两个搜索航班和集群四世(n= 7,2015n= 3,2020)在观察期内三个搜索航班。集群III和IV形成最大的组各10蜜蜂。集群V由三个觅食(2015年),执行搜索旅行(见4补充表1详情)。随着搜索航班数量的参数与最强的影响,目前不同的集群行为表型变化他们的动机来搜索和持久性继续觅食。

搜索行为导致了一个健壮的减少谷氨酸和GABA浓度在中央大脑

大脑的神经递质分析部分(补充图3)从不同的采摘者(补充表2)是在多个批次,每个包含蜜蜂从所有行为组(见样品补充材料)。批处理身份增加了统计模型的随机因素。比较中央大脑中神经递质浓度(CB)觅食了在觅食,寻找支线,或者重新给料机(图2一个),我们发现健壮的差异对谷氨酸和GABA (图2 b, C)。觅食,经历过的缺席给料机(FS)和首次被发现,因为他们离开了他们的第一个搜索行程已经显示GABA浓度明显降低在CB (图2 c;减少29.7±10.3 ng,p= 0.025)比成功的觅食。相比之下,谷氨酸浓度的CB拒绝后第一次搜索航班(图2 b;减少242.2±80.8 ng,p= 0.018)。此外,谷氨酸水平继续线性搜索旅行(的数量减少图2 d;减少111.7±34.8 ng每次搜索航班,p= 0.001)。同样,GABA水平也显示出显著的线性减少,然而,最大的减少发生在FS旅行,以下蜂巢呆(图2 e;由29.5±10.6 ng,减少后的第一次经历p= 0.032)。

除了GABA和谷氨酸浓度的变化,我们还发现不同的组胺和天冬氨酸含量中央大脑样本(图2 f, G)。觅食和两个搜索航班组胺含量明显高于那些觅食,和组胺水平显示显著的线性增加,搜索航班(0.21±0.096 ng /搜索航班,p= 0.025)。相比之下,天冬氨酸水平显示显著的线性减少数量的搜索航班(减少86.8±40.28 ng /搜索航班,p= 0.034)。

重新启动觅食导致增加谷氨酸和GABA浓度光学叶

在CB相比,我们没有发现任何变化神经调质浓度光学叶(OL)样品在搜索航班(图3模拟)。然而,当我们重新安装馈线,觅食,重启觅食,表现出更高水平的谷氨酸和GABA比其他任何行为组(图3模拟)。此外,我们还发现其他神经递质及其前体的浓度变化视叶蜜蜂觅食(重新启动后图3开头的)。酪氨酸和左旋多巴,但不是多巴胺,明显高于在觅食,重启觅食而觅食访问在馈线之前删除(图3 f, G)。色氨酸,天冬氨酸、组胺和丝氨酸在觅食,重启觅食相比,执行搜索航班和那些以前采摘的给料机(图3 k o;补充材料)。所有神经调质,我们检测到一个变化,显示出显著增加其浓度由于回顾馈线。这些戏剧性的变化独立于搜索航班的数量(补充图4)。

抢劫者搜索表型显示浓度的差异哈,章鱼胺和左旋多巴

基于我们的研究结果,觅食者的动机不同搜索及其持久性觅食,我们进行了聚类分析的个人时间搜索动态收集到的觅食。当然,收集觅食的行为数据不允许所有收集的清晰识别搜索表型的觅食者在搜索行为,而不是因为我们收集他们已经停止后离开蜂巢。然而,我们能够识别一群觅食,断断续续的蜂巢保持较短的几个搜索航班执行(集群IIIe,图4 a, B)和觅食,已经显示长蜂巢觅食后保持/搜索航班(FS,集群的我,图4 a, B他们收集了之前)。对我们的行为分析,这两个搜索表型强烈动机不同。只有2018年收集实验执行,我们发现了一个足够数量的觅食者与神经递质水平的不同表型搜索比较(图4 a, B)。

觅食的集群IIIc执行两个搜索航班短间歇蜂巢保持显示多巴和HA水平显著升高,显著降低章鱼胺水平在中部的大脑相比,一个或多个样品的食物采集者搜索航班(较少图5 a - c)。集群的觅食IIIc也显示较低的天冬氨酸水平视叶比觅食的其他三个集群(图5 e)。这种差异也观察到类似的表型之间的2017集(图5 d)。

殖民地发生显著的变化在他们的神经化学签名

神经化学的内容从CB和OL量化觅食行为的三种不同的殖民地和用于分析的差异。除了发现变化相关搜索和觅食的重启,我们发现显著差异在殖民地。PCA分析CB和OL滴度表明,殖民地的单独集群(图6 a, B),超过50%的方差仅在发射机殖民地差异解释的内容。单独,发射机显示殖民地之间的显著差异(图6切断和补充图5)。具体来说,殖民地用于CE 1的发射机一般较低,相比其他殖民地。OL, 12的14发射器在公元1明显低于CEs 2和3,而CB, 10发射器明显低于至少一个其他殖民地(补充图5)。尽管大型发射机浓度的差异由于殖民地身份,我们仍能检测到化学物质由于行为状态的变化。

讨论

我们的研究的主要结果是,谷氨酸和GABA浓度在中央大脑区域(包括蘑菇体、中央复杂和相邻前桥区域)在连续搜索行为有所下降之前访问过的但没有馈线。这一发现符合事实,童子军的大脑显示出更高的谷氨酸和GABA信号相关基因的表达。这种相关性表明行为专业化是基于基因组机制调节信号机制用于常规的搜索行为。

搜索行为的觅食者找不到一个已知的支线在预期的位置

我们分析的时间动态飞行和蜂巢觅食的停留时间,没有找到一个已知的支线在预期的位置表明,启动搜索行为由少数几个搜索航班相对类似的持续时间(1:范围1 - 4搜索航班;平均12.37±6.02分钟;-37.3 = 5.79分钟,图1 d, E)和间歇蜂巢保持变长,越来越多的搜索之旅(1:13.43±9.37分钟,距离= 2.33 - -46.4分钟;图1 f, G)。蜂巢的持续时间保持似乎可以很好地预测概率停止搜索(和觅食)一段时间。额外的控制实验(2),我们重新安装后的给料机1 h,觅食者几乎立即开始降落在馈线,表明蜜蜂搜索航班被或多或少地局限于附近的馈电位置。

这些观察结果很好地对应于其他研究的结果进行了类似的实验。雷达跟踪实验表明,觅食,没有发现预期的给料机开始飞行在预期的给料机的位置和循环一段时间后回到蜂巢(平均时间4.49±2.44分钟,12)。此外,搜索航班大多是面向在蜂巢馈线方向(12)。艾尔Toufailia et Al。(28)报道,觅食者训练几天重温了一个空给料机平均4.29±4.47次(范围:0-25)6小时记录一段。持久性重温暂时未获得报偿的给料机,测量作为旅行的旅行数量和总持续时间,与先前的觅食经验,例如,给料机时间可用性和盈利能力,以及季节,影响殖民地食品商店(15,16,28)。此外,训练有素的觅食者被发现继续访问一个清空馈线几天(1.89±1.56天,鹿天,范围(28);看到补充表3]。

所有这些研究表明,搜索行为缺乏引起的一个已知的馈线诱发该馈线的搜索行为。这些采摘者不是寻找新的食物源或位置童子军一样。在几天后重复访问失败,它是报道,大多数的觅食者可能会开始寻找一个新的食物来源,这也很可能只有在舞蹈(2,29日)。没有搜索蜜蜂发现遵循任何无名舞者在蜂巢保持在观察期内。

个体变异和搜索表型

除了一般的描述时序动态搜索行为,聚类分析表明,个体的觅食者访问相同的馈线不同强度的搜索行为或持久性回顾馈线位置。最强的搜索响应的特点是快速的重复搜索航班,包括短断断续续的蜂巢。最弱的反应以1 - 2搜索航班长间歇蜂巢。这些差异很可能基于行为状态的变化取决于经验和基因型。

在早期的研究中,我们的实验室报告说,有长期一致的个体差异在舞蹈活动觅食访问相同的支线。有趣的是,这些差异,至少在某种程度上,取决于组成的集团(30.)。此外,个体变异在舞蹈活动觅食与表达差异基因(Amfor)。同样,线性判别分析大脑的基因表达模式的个人童子军和新兵显示一个独立但重叠分布,表明这些表型(比定性定量的区别5,29日)。未来,这将是有趣的探索是否差异在觅食,舞蹈和搜索活动觅食访问同一馈线相关和基于相同的生理过程。此外,这将是有趣的,看看球探像其中一个抢劫者表型或代表一个单独的一个。

GABA和Glutamatergic系统涉及搜索行为的员工和童子军

觅食的比较与不同数量的搜索航班表明谷氨酸和GABA浓度不断降低的数量在大脑中央(即搜索行程。复杂,蘑菇体,中央和周边前桥的大脑区域)。相比之下,谷氨酸和GABA浓度光学叶并没有改变在搜索但显示突然增加时,觅食者开始回顾馈线。这种反弹增加浓度没有观察到中央大脑区域;此外,低浓度仍相比觅食组在实验的开始。

梁等。(5)报道一个更高的几个谷氨酸和GABA受体和转运蛋白基因的表达比招募童子军的大脑中。此外,治疗实验与谷氨酸钠(味精)侦察行为增加。虽然我们不知道确切的谷氨酸和GABA的函数在搜索行为(31日- - - - - -34),童子军和新兵的比较,我们的研究在觅食的搜索行为(即。,recruits) strongly suggest that these neuromodulators have an important function in search behavior in general. Changes in the glutamate and GABA signaling appear to be major physiological underpinnings of the behavioral specialization of scout bees. Furthermore, this molecular mechanism might not be unique to honey bees, as it was found that glutamate receptors are also upregulated in scouts ofTemnothorax蚂蚁(35)。

最后,最原始的最近的分子在蜜蜂的研究显示GABA-ergic神经元活动增加的航班将重新定位期间视叶采摘者学习蜂巢入口和蜂巢位置(36,37)。在我们的行为实验又发现了给料机的觅食者也表现学习涉及盘旋在支线航班(补充图6;(38)]。因此,突然增加GABA浓度在回顾视叶采摘者可能与琪雅和Kubo说描述的现象(37)。GABA-ergic神经元的视叶果蝇例如,参与优化不同视觉的灵敏度和选择性通道(39,40)。同样,谷氨酸信号光叶参与塑造对象识别和定向运动视觉(41- - - - - -43)。

除了在谷氨酸和GABA浓度的差异,我们发现组胺和天冬氨酸的变化。CB的组胺水平增加强度的搜索(图2 f,5 b),OL,他们由于觅食的重启增加(图3 l)。天冬氨酸被发现减少线性增加搜索旅行在大脑中央(图2 g)以及光学叶(图5 d, E)。之后,在觅食的重启,OL的天冬氨酸水平增加(图3 n)。越来越多的证据表明,神经调节视叶发挥了重要作用,根据行为选择和调整视觉处理上下文(44)。我们的研究结果表明,HA和天冬氨酸,这显示浓度明显高于视叶重蹈觅食者,可能在调节视觉处理方面发挥重要作用(43,45- - - - - -47)。中央大脑的变化更难以解释。以前,我们报道,天冬氨酸水平增加全球在预期的食物(20.)。因此天冬氨酸和组胺可能发挥作用在调节觅食和动机(见(48),尽管这还有待调查。

抢劫者搜索表型显示浓度的差异哈,章鱼胺和左旋多巴

比较搜索表型透露,高强度的觅食者搜索行为(连续几个搜索航班短间歇蜂巢,集群IIIe)多巴和HA水平较高和较低的办公自动化水平在中央大脑区域比觅食者强烈的搜索行为。这些搜索表型之间的神经递质水平的差异可能是由于更高程度的神经信号活动或基线水平的神经递质水平的差异搜索表型。

梁等。(5)报道称,章鱼胺治疗导致一个微弱但显著增加侦察行为和童子军显示更高的表达10月β2 r受体。有趣的是,他们还发现,多巴胺拮抗剂治疗抑制多巴胺信号侦察的显著下降引起的,但它们的分子数据表明,多巴胺信号在童子军可能下调。两个多巴胺受体,AmDopR1和AmDopR2显示较低的全脑表达相比,童子军non-scouts (5)。最近,林等。(49)表明,觅食者对待章鱼胺重新审视一个清空支线通常sham-treated对照组。更重要的是,他们优先考虑已知但清空馈线而不是寻找一个新的支线表示其他同伴,这表明章鱼胺可能增加觅食活动的持久性(或离开蜂巢的概率),但不是在一个特定的搜索(50- - - - - -52)。最近,做饭等。(32)报道称,童子军的大脑显示酪胺水平高于新兵。然而,类似于章鱼胺,酪胺的功能可能不会直接参与搜索行为但觅食和飞行活动,所建议的QTL研究蜜蜂觅食行为(53)。

殖民地不同神经调质水平以及搜索表型

在我们的研究中,我们发现在神经递质浓度> 50%的方差是由于殖民地的觅食者的身份被发现(图6 a, B)。一个有趣的观察是,蚁群的觅食者CE 1显示低浓度相比,觅食的CEs上几乎所有神经调质测试2和3 (图6切断和补充图4)。这些蜜蜂被安置在一个观察蜂房。许多先前的研究蜜蜂报告变化大脑神经递质和神经调质浓度与殖民地国家和季节(54,55)。观察蜂房的殖民地托管可能不同于其他的密度和拥挤的蜜蜂,以及可用的食品商店(影响饥饿状态),这两个已知影响大脑的神经化学成分(56,57)。尽管大型发射机浓度的差异由于殖民地身份,我们仍能检测到化学物质由于行为状态的变化。

殖民地在搜索表型的构成也不同。在行为实验(图1 i, J集合中)以及实验(图4 b),5年以上执行,我们发现殖民地不同表型的存在和相对组成。这些差异可能是由于殖民地条件和饲料调制觅食力可用性。

追求新奇的个性、谷氨酸、GABA和蜜蜂的大脑

梁等。(5)表明大脑巡防队员和员工之间的表达差异与新颖性的球探显然是寻找新的食品网站,和在脊椎动物的研究表明,确定神经调质系统(谷氨酸、GABA和儿茶酚胺)参与追求新奇的个性。追求新奇的个性当然是一个复杂的行为组成的不同行为例程或模块,例如,一个特定的飞行模式和增加视觉和嗅觉寻找花朵时注意。谷氨酸和GABA浓度的变化的差异在中央大脑区域和视叶在我们的研究中可能对应于这些不同的行为模块。我们发现GABA浓度增加与再学习发现GABA神经元的重新建立馈线对应视叶显示增加活动后再学习蚁穴的入口和周边蜂巢实验搬迁(37)。另一个问题是谷氨酸和GABA是否启动或调节(增强)搜索和侦察行为(58)。最近的一项研究果蝇例如,表明大多数octopaminergic神经元也glutamatergic,发射机在这些神经元影响相同的和不同的行为,因此可能参与选择行为模块(59)。在蜜蜂、谷氨酸和GABA的上下文中主要研究学习和记忆(34,60- - - - - -64年)。蚂蚁的一项研究,旨在确定味精增加消费的负面影响超过几天显示减少“精密的反应,减少“对信息素的反应”,减少“认知能力的影响,”和“在很大程度上减少了学习和记忆”(65年)。因此,目前最合理的假设可能是谷氨酸和GABA是参与调节大脑回路参与搜索行为,从而改变执行行为例程参与搜索行为的概率。昆虫大脑区域包括蘑菇体中部,中部复杂和相邻前桥领域涉及启动并选择行为(66年- - - - - -69年),路径整合和里程碑式的学习(21- - - - - -24);和视叶预处理视觉信息用于导航和里程碑式的内存(25- - - - - -27)。

未来这将是有趣的识别神经元群体参与搜索和侦察。一种方法是执行翻倍现场染色神经元activity-regulated基因和基因参与谷氨酸和GABA信号在大脑的新兵和童子军被搜索的行为,因为它是调整觅食的(37,70年)。确定了神经元参与搜索和侦察,可以比较它们的表达模式识别分子变化的底层行为专业化在细胞水平上。关于确定童子军的神经机制,可能是承诺首先比较童子军如何不同于新兵在搜索行为。例如,童子军执行更长和更扩展搜索航班吗?随后,我们可以研究的基因表达差异是否童子军和新兵都是基于在同一细胞或基因表达的变化在不同的细胞基因表达和识别的扩展的大脑区域差异发生。

蜜蜂觅食,人为的给料机是一种最富有成果的和成功的实验分析研究动物行为。蜜蜂的所有迷人的行为和认知能力已确定使用馈线训练试验(4,7,71年)。觅食行为,可以很好地切割成不同的行为例程,可以单独研究,例如,期待在蜂巢觅食(20.,72年,73年),飞向支线、食物收集给料机(74年,75年),飞回蜂房,招募同伴跳舞(13,76年)。此外,有越来越多的证据表明,觅食者不同的强度行为模块(30.,32,77年,78年)。我们建议详细的行为实验结合复杂的分子技术将有助于识别候选神经机制阐述了行为和认知功能(70年,73年,79年)。当然,决定性的因果机械的研究,才有可能如果转基因蜜蜂广泛使用(80年- - - - - -82年),或者我们可以使用果蝇比较研究来识别的神经基础的一些行为模块(83年- - - - - -86年)。

材料和方法

材料的可用性

的蜜蜂殖民地从HoneyDay蜜蜂农场采购分公司,班加罗尔。所有标准,甲酸(FA)、盐酸(HCl)、硼酸和抗坏血酸以及所需试剂6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl氨基甲酸酯(AQC)合成获得Sigma-Aldrich(印度班加罗尔)。丙酮是来自费舍尔科学。固相萃取墨盒(Strata-X 8 b-s100-tak)获得Phenomenex, Inc .(海得拉巴,印度)。高纯级女士溶剂(甲醇、乙腈和水)从默克密理博(默克密理博印度有限公司、班加罗尔)。氘内部标准:L-serine-2 3 3-d3, L-glutamic-2, 3, 3, 4, 4-d5酸,L aspartic-2 3-d3酸,L-histidine-d3(α-d1;imidazole-2 5-d2) HCl, L-tryptophan-2′, 4′, 5′, 6′, 7′d5, L-4-hydroxyphenyl-d4-alanine-2, 3, 3-d3(酪氨酸)4-aminobutyric-2, 2, 3, 3, 4, 4-d6酸(GABA-d6) histamine-α,α,β,β-d4, serotonin-α,α,β,β-d4, L-dopa-2, 5, 6-d3, 2 - 3, 4-dihydroxyphenyl ethyl-1, 1, 2, 2-d4-amine-HCl (dopamine-d4)和tryptamine-α,α,β,β-d4获得CDN同位素(加拿大魁北克)。氘内部标准2 - (4-Hydroxyphenyl) ethyl-1, 1, 2, 2-d4-amine盐酸和beta-Hydroxytyramine(α-d2β-d1)盐酸由医用同位素,Inc .(美国)。所有分析物和氘的内部标准的纯度≥98%。玻璃珠和珠搅拌器从BioSpec购买。

动物和给料机培训

蜜蜂殖民地(的蜜蜂,N = 6)位于ncb校园,班加罗尔,印度。从蜂巢觅食者被训练为无味糖水给料机(1.75米)浓度。支线距离逐渐增加到300 M从蜂巢/ 2天,觅食者被训练在邻近的道路被茂密的植被UAS-GKVK校园,班加罗尔,印度(13)。

行为实验

两种行为实验研究。在第一个行为实验(1),觅食者(n= 10 - 12)color-marked单独实验前的一天(13)。当天实验,觅食者被允许访问的支线,海拔300米1.5 h(觅食阶段)。馈线随后删除并保持隐藏的采摘者的另一个1.5 h(搜索阶段;图1一个)。(2)在第二个行为实验,提出了馈线最初为1.5 h标记觅食(觅食阶段)(n= 50 - 60)访问。馈线然后删除1 h(搜索阶段)和安装在300 1.5 h(重温阶段)。

殖民地用于1 (N= 2,2015年和2020年)被安置在一个玻璃观察蜂房坐落在一个木屋没有任何外部照明(13)。如果是2 (N= 1,2019)殖民地被安置在一个Langstroth蜂巢框在树荫下,把树旁边的小屋。个月之间的实验在夏季May-July每年。

收集实验

三组实验(公元1 - 3)进行。在每次实验中,color-marked觅食者(n= 50 - 60)最初访问了馈线(2米)浓度为1.5 h(觅食阶段)。在觅食的结束阶段(10分钟),color-marked出站从蜂巢觅食开放被抓获在液态氮的塑料管,瞬间冷冻。隐藏支线随后删除并保持在搜索阶段(1 - 1.5 h)。觅食者没有发现飞出来的支线,海拔300米,回到蜂巢。标志着个人被抓而飞出后10 - 90分钟的支线。馈线重新在300米(重温阶段)和觅食者容易继续觅食馈线的一个小时。回顾个人被捕蜂箱门口做出境航班,每3 - 4次提供给料机(图2一个)。

殖民地用于CE 1 (N= 1,2017)是安置在一个玻璃观察蜂房坐落在一个木屋没有任何外部照明(13)。在CE的情况下2 - 3 (N= 2,2018年和2019年),殖民地被安置在一个Langstroth蜂巢框在树荫下,把树旁边的小屋。个月之间的实验在夏季May-July每年。蜜蜂的数量分析的详细信息,请参阅补充表2。

监控搜索航班

是1和1 - 3,摄像头(日本东京索尼HDR-CX220V)安装在蜂巢入口。实验记录的数量和持续时间搜索航班由个人从出入境的觅食者的视频回放的蜂巢。馈线的录像进行2在觅食、重新审视阶段监控蜜蜂到达馈线。

大脑解剖

收集到的觅食者在液态氮转移到−80°C冰箱。单个蜜蜂的大脑解剖在干冰分成两个不同部分,视叶对(OL)和该地区的大脑含有蘑菇体和中央(CB) (补充图3)。大脑解剖在6分钟和从未被允许解冻。气管覆盖大脑变成一个薄膜,可以很容易地拒绝在不损害大脑。我们没有冲洗大脑在任何液体,以维持组织的完整性,防止生物胺的降解。大脑解剖,准备后续的质谱分析前完成视频分析和分类的个体蜜蜂基于他们的行为。样本排除在统计分析只有在视频分析,蜜蜂无法确定,因为这是模糊,或由于对比度和亮度的问题或蜜蜂是颠倒的,等等。

选择标准进行样品处理

从收集的蜜蜂数量对于一个给定的实验中,我们努力包含相同数量的样本所有行为的群体。女士处理和分析样本的选择是基于捕获的时间在收集实验(觅食、搜索和回顾),而最终的分类行为集团是耗时的视频分析后才完成的。统计分析是F、S、R和F, F, S1, S2和R根据视频分析行为表型鉴定。样品被排除在统计分析如果蜜蜂不能确定在视频分析,因为这是模糊,或由于对比度和亮度的问题或蜜蜂颠倒等。延迟行为分析的结果,我们有质量的样品光谱的几个数据无法纳入最终的统计分析。

质谱的神经递质

质谱测量,大脑样本布洛克曼拉梅什和准备(20)。短暂,包含个人蜜蜂大脑部分的瓶,100μl 0.5毫米的玻璃珠,190μl丙酮包含0.1%的甲酸,10μl 10毫米刚做好的抗坏血酸,和10μl 0.5μg /毫升的内部标准混合物是补充道。5毫升0.5μg /毫升的5 -羟色胺、色胺混合物被添加到每个样本(上升)援助量化这些低电离和高矩阵抑制化合物。珠搅拌器是用来使均匀样品,和上层清液收集在一个新瓶和冻干。衍生化过程,80μl 200毫米硼酸缓冲和10μl 10毫米抗坏血酸添加到冻干提取、混合好,10μl刚做好的解决方案的10毫克/毫升AQC补充道。55°C的反应是孵化为10分钟,停止增加3μl 100%甲酸。

女士年级水(500μl)被添加到样品,和样品被加载到激活和平衡RP-SPE列和洗两次1毫升的水含有0.1%甲酸。洗脱完成1毫升ACN-MeOH(4:1)含有0.1%甲酸和冻干和储存在−20°C到注入仪器。2%的样本重组在50μl ACN含有0.5%甲酸。每个化合物的校正曲线范围是根据生物的丰度矩阵和拉梅什和布罗克一样(20)并给出了补充材料。比较校准的仪器响应曲线测量给出的3年补充图7。

热科学TSQVantage三阶段四极质谱仪(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国),连接到一个安捷伦1290系列无穷UHPLC系统(安捷伦科技印度经纪有限公司、印度)是用于神经化学量化。柱温箱设置在40°C,并在4°C autosampler托盘。流动相的溶剂是10毫米醋酸铵含0.1%甲酸,和溶剂B ACN包含0.1%甲酸。C-18列(2.1毫米×100毫米,1.8μm,安捷伦RRHD ZORBAX)配备一个警卫列(2.1毫米×5毫米,1.8μm安捷伦ZORBAX SB-C18)使用。LC梯度如下:(2% B(0分钟,2%在3分钟,20% B在20分钟,35%在25分钟,80% B在分钟25日- 27日,2% B 27-35 min) 0.2毫升/分钟的流量。女士操作条件如下:3700 V电压喷(正离子模式);270°C毛细管温度;20(任意单位)鞘气体压力;10(任意单位)辅助气体;氩碰撞气体。 The S lens voltage and collision energy were as given in Ramesh and Brockmann(20),也提供的补充材料。量化是使用Xcalibur软件2.2版本完成的。质谱测量大脑的样本做的ncb内部设施。

样品的稳定性和存储

冷冻和解剖大脑可以存储在−80°C冷藏器长达一年和加工和冻干样品可以存储在−20冰箱2周。已知的大量的氘内部标准添加任何类型的样本处理之前,规范化的任何样品损失。保持高度稳定的化合物在多个星期冻干条件下,衍生化。在水溶液中,AQC derivatized产品开始退化,但样本重组之前刚刚注入。水条件下,80%的离子强度仍然存在后48 h。验证这个方法也被他人之前完成(87年)。

统计分析

出境旅游的分类

旅行觅食的分类基于觅食的知识给料机是否存在与否为F, F和S (补充表1)。F和F,抢劫者飞出蜂巢的馈线在场的信息而在S (S)抢劫者馈线的信息是没有更多的礼物。

Hive-To-Hive变化持续时间和蜂巢

行为实验是1,我们想知道如果馈线的取消导致的变化(a) hive-to-hive出站飞行时间和(b)持续时间之间的蜂巢保持两个出境旅行。我们使用一个广义线性mixed-effects模型(GLMM)γ误差分布,考虑到个人身份蜜蜂的随机因素(个体效应)。我们比较(a) hive-to-hive持续时间(F, F和S1-4)和(b)蜂巢保持时间后出站航班(高频、HFS HS1-3)使用广义线性假设检验(GLHT)。P值修正了多个测试使用单步调整。分布结构的数据确定模型建立之前,通过比较AIC值作为拟合优度标准。模型分别用于这两个殖民地。

分布结构,测定GLMM和GLHT使用“fitdistrplus”,“lme4”和“multcomp”包,分别在R版本4.0.2。

搜索行为序列和聚类分析

序列和聚类分析(88年)是用于识别常见的搜索行为模式中馈线切除后个体的觅食行为实验是1。首先,连续搜索航班和中间蜂巢停留一个抢劫者被安排为一个搜索行为概要文件。每个概要文件从蜜蜂的退出FS (t= 0分钟)和终止在120分钟。当一只蜜蜂回来从搜索航班和结束才出现在观察期间,抢劫者的时间花在蜂巢算作是她最后的蜂巢。例如,如果一个蜜蜂四个搜索航班,搜索行为概要文件将包括搜索行为状态:“FS - HFS - S1 - HS1 S2 -那么HS2 - S3 HS3 S4 - HS4”HS4在哪里最后蜂巢(即。在序列,最终状态)。接下来,期间一个抢劫者在给定状态是圆形的到最近的整数(最小时间呆在一个给定的状态是1分钟)。然后,每个搜索行为概要文件(拼写格式)转换为一个搜索行为序列(STS格式)。120分钟的整个观察期分为箱1分钟和抢劫者占领给定状态为1分钟,搬进一个新的或继续在同一个州在接下来的1分钟根据搜索行为概要文件。搜索行为状态的序列被觅食时间顺序存储在一个矩阵(每个抢劫者行和列对于一个给定的状态,见也补充材料详情)。

最后,我们计算一个距离矩阵,即所有成对的搜索行为序列之间的距离使用最优匹配距离度量。度规使用插入/删除1和替代成本使用过渡成本率(最低为相同的替换和max = 0 = 2过渡不是观察)观察到的状态之间的搜索行为序列。患者常见的搜索行为序列被分层烧结的集群使用病房的D2分组聚类准则基于距离矩阵计算。最优数量的集群是由选择的最大平均轮廓宽度(补充图2一个;(89年)]。

收集实验(公元1 - 3),2个人的搜索行为概要文件使搜索航班之前,包括搜索行为状态:“FS - HFS - S1 - HS1 S2 -那么HS2”,那么HS2序列的最终状态。序列和聚类分析进一步做类似行为实验如前所述识别常见的搜索行为模式中个体觅食后馈线删除(见也补充材料详情)。觅食在公元1 - 3 (n= 41)分为三个集群(》;图4一)基于相似性时间呆在给定状态的搜索行为概要文件(图4 b;另请参阅补充图2 b最优数量的集群)。集群我由七FS蜜蜂(n= 6,2018n= 1,2019),最后在蜂巢(HFS)超过20分钟(图4 a, B)。第二集群有两个S1蜜蜂(n= 1,2018n= 1,2019),在蜂巢(HS1)待了超过35分钟前被抓获。最大的集团,集群III包括S1、S2和S3蜜蜂(n2017年= 15日,n= 15,2018n= 2,2019),所有最终留在了蜂巢(分别,那么HS2 HS1和HS3) < 20分钟。

集群三世被进一步分成五组因果(IIIa-IIIe;图4 a, B)。Subcluster iii a由13 FS蜜蜂,最后停留在了蜂巢(HFS)不超过14分钟。Subcluster IIIc (n= 4)都S2蜜蜂,但一个人(BeeID: C36)形成一个异类subcluster希望具有较长的FS和搜索航班(S1和S2超过18分钟)。Subclusters IIId (n= 2)安置S1蜜蜂在蜂巢(HS1)超过15分钟(但< 35分钟)之前被捕获。最后,subcluster IIIe (n= 12)住其余的S1蜜蜂在蜂巢(HS1) <花时间9分钟前被抓获(见也补充材料详情)。这个集群进一步导致比较个体之间的神经递质。

使用包的序列分析“TraMineR”和烧结的集群是由使用“艾格尼丝”功能在R版本4.0.2包“集群”。

帮助神经化学数据分析,FS和S蜜蜂不完整的行为数据(七蜜蜂)手动分为确定集群。为此,搜索航班的数量和总时间一只蜜蜂经历过失去馈线被除了使用不完整的飞行时间和蜂巢保持数据。聚类标准给出的细节补充材料。

在馈线量化觅食动力学

2、标志在馈线觅食的总数统计每2分钟(补充图1)。我们问觅食的速率是不同的在觅食和回顾阶段。我们适合非线性增长曲线在馈线蜜蜂的数量每2分钟评估和比较觅食的速度:

在哪里一个=承载能力(最大数量的蜜蜂),b=设置位移沿时间轴,c=增长率,t=时间在几分钟内和拐点(我)给出方程2 (90年)。

龚珀兹曲线拟合是使用“nlsfit”功能在R版本4.0.2包“easynls”。

质谱的分析结果

神经化学利用线性混合效应模型分析了从“lme4”包。Satterthwaite的t从“lmerTest”包测试值模型被用来估计意义。分析了神经化学作为响应变量的数量,和适当的行为反应/行为组固定的变量。批女士作为随机效应。中给出的公式(R语法)用于模型如下:

lme(神经~组+(1 |批)数据,REML = F)

因果测试都是使用emmeans函数来完成从“emmeans”包使用下面的代码:

•emmeans[模型列表(成对~组),调整=“图基”,lm。df = " satterthwaite ")

使用“ggplot2”包块被吸引。对于一些情节,对于视觉的目的,神经化学值缩放的批处理和女士实验重复。

PCA分析使用“数据”中的“prcomps”功能包的r包“ggbiplot”使用,调整与未成年人视觉的目的,情节prcomp结果。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到通讯作者/ s。

作者的贡献

交流、博士和阿瑟:概念化和写作。交流和DB:田间试验和观察。DB:大脑解剖。AC:行为分析。博士:质谱测量和分析。阿瑟:监督。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

交流是由大学拨款委员会的奖学金,印度。博士是由科学与工业研究理事会,印度(奖。CSIR-SPM-07/0860 [0171] / 2013 - emr我)。AB承认支持NCBS-TIFR机构基金12号p4167和支持部门的原子能,印度政府,在项目没有。12 -研发-总和生育率5.04 - 0800和12 -研发-总和生育率5.04 - 0900。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

作者要感谢实习生森古普塔,a . Suryanarayanan s Chakraborty Chowdhury d和a . Chakrabarty帮助的行为实验。作者还要感谢ncb质谱分析工具。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/finsc.2021.664978/full补充材料

引用