原始研究的文章

前面。Immunol。,22May 2023
秒。免疫宽容和监管
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1142273

单细胞RNA-seq显示胎盘形成和发育缺陷decidualization女性迟发性的子痫前期

杨京 ^{1 __},

丽丽龚^{2 __},

启明创投刘 ¹,

Huanqiang赵 ²,

Zekun王¹,

李院长 ^{2、3 *},

Weidong田 ^{1、4、5 *}和

Qiongjie周 ^{2、3 *}

¹遗传工程国家重点实验室和基因与发展协同创新中心,计算生物学、生命科学学院、复旦大学,上海,中国
²妇产科医院,复旦大学,上海,中国
³妇产科医院,女性生殖Endocrine-Related疾病重点实验室,复旦大学,上海,中国
⁴复旦大学儿童医院,上海,中国
⁵山东大学的儿童医院,济南,山东,中国

子痫前期(PE)是一个孕产妇和胎儿的发病率和死亡率的主要原因。尽管越来越多的证据表明,胎盘和蜕膜可能在发病机制中发挥的作用的PE、聚乙烯的分子机制仍然是难以捉摸的,部分原因是异质性的母胎界面的性质。在这项研究中,我们对胎盘进行单细胞RNA-seq和蜕膜从患者迟发性的PE(洛佩)和女性在正常怀孕。单细胞转录组的分析显示,在洛佩,有可能是全球发展缺乏滋养层受损入侵extravillous滋养层(EVT)和增加产妇胎盘免疫排斥反应和炎症,虽然有可能decidualization不足蜕膜基质细胞(DSC),增加了炎症,抑制蜕膜免疫细胞的监管职能。这些发现改善我们对聚乙烯的分子机制的理解。

背景

子痫前期(PE)的特点是新发病高血压和蛋白尿。它影响5 - 8%的怀孕,使孕产妇和胎儿的发病率和死亡率的主要原因(1,2)。取决于它发生之前或之后34周的胎龄,体育一般分为早发性聚乙烯(EOPE)和晚发性(洛佩)(2),多数(~ 80%)被洛佩(2)。而终止妊娠可能在严重的PE(一个选项3),密切监测通常是第一线治疗。此外,还有有效预测工具结合生物标记(4,5),它已经被全球众多单位验证,目前在许多医院使用。为了改善这种情况,更好的理解空间和动态机制PE的病因是必要的。

PE的古典两阶段模型认为贫穷疾病的胎座式是主要的原因,导致受损的免疫耐受、孕产妇炎症血管压力,因此临床症状(6)。然而,这个模型主要适用于EOPE因为洛佩是常与正常胎盘。事实上,洛佩一直被认为是一种母性的障碍发生继发于孕产妇微血管疾病,如高血压和糖尿病(7)。最近修订经典模型的提出,虽然看似正常,胎盘是在分子水平上固有的功能失调和不足在子宫内胎盘灌注在洛佩8)。最近,decidua-the maternal-fetus母体组织界面也建议在PE的发病机制中发挥作用:一项研究妇女蜕膜严重体育发现缺陷decidualization可能导致受损的滋养层入侵(9)。因此有必要探讨胎盘和蜕膜,以了解洛佩的分子机制。

胎盘和蜕膜都是异构的不同类型的细胞组成的组织(10,11)。在胎盘滋养层细胞的主要人口,可以进一步分为绒毛细胞滋养层(VCT),合胞体滋养层(SCT)和extravillous滋养层(EVT)。SCT和EVT VCT沿着不同的发展谱系分化,与SCT胎盘激素的主要来源(12),evt功能侵入母体蜕膜和改造孕产妇螺旋动脉,这样产妇营养物质可以有效地运送到胎盘(12)。缺乏EVT入侵是可怜的胎盘形成的主要原因,常与理气epithelial-mesenchymal过渡(EMT)过程(9)。通过过程称为decidualization蜕膜的形成涉及到子宫内膜基质细胞的分化(ESCs)蜕膜基质细胞(DSC)通过mesenchymal-epithelial过渡(遇到)过程(13)。蜕膜也富含免疫细胞、自然杀伤(NK)和巨噬细胞等(14)。入侵evt DSCs可以调节通过释放分泌蛋白质如催乳素(PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP1) (9),而蜕膜免疫细胞在调解扮演关键角色激活EVT的胎盘蜕膜和螺旋小动脉的转换(15)。蜕膜和胎盘的发展需要密切协调怀孕期间为了保护胎儿从母体免疫系统的攻击和支持胎儿的成长。解剖的异质性胎盘蜕膜是因此非常重要的对于更好地理解体育的分子机制。

在这项研究中,我们收集胎盘组织和肤浅的子宫肌层蜕膜,以确保一个完整的孕产妇胎儿界面洛佩和在正常怀孕女性的。然后我们进行了单细胞RNA-sequencing胎盘和蜕膜样品。在确定胎盘、蜕膜细胞类型,我们检查基因表达变化不仅在个别细胞类型,而且滋养层的发展轨迹和DSCs洛佩和健康之间控制样本。我们发现胎盘和蜕膜在洛佩可能不正常。在胎盘,有可能在滋养层的发展,全球缺乏缺乏入侵EVT细胞表现为显著下调EVT的EMT过程,增加了炎症。蜕膜,有可能缺乏decidualization特点是重要的老年病DSCs EMT过程,增加了炎症,抑制蜕膜免疫细胞的监管职能。此外,蜕膜中的相互作用的免疫细胞与胎盘滋养层和核心在洛佩蜕膜细胞被改变。这些发现为发展中重要性的小说假设未来大步慢跑的发病机制研究。

结果

描述的细胞类型使用单细胞RNA-seq胎盘、蜕膜

在这项研究中,我们对胎盘进行scRNA-seq (n_洛佩= 3,n_正常的= 3)和蜕膜(n_洛佩= 3,n_正常的= 4)样本使用定制Drop-seq协议(图1一个)。质量控制和预处理后,我们得到12255 (n_洛佩= 5592,n_正常的= 6663)胎盘样品,表达的意思是770个基因,7741独特的分子标识符(UMI)和不到25%每细胞线粒体基因可以检测到(数字S1A B);和20322年(n_洛佩= 9789,n_正常的= 10533)单细胞表达谱从蜕膜标本,其中的827个基因的表达,8924个独特的分子标识符(UMI)和不到25%每细胞线粒体基因可以检测到(数据就是S1C D分别)。批处理影响样本之间成功地纠正了使用狮虎(16)(数字S1E H)。然后,我们生成iNMF(综合非负矩阵分解)子空间并对胎盘、蜕膜细胞进行无监督聚类样本使用修(17)。最后,我们使用了标记基因研究报告的前两次scRNA-seq母胎界面(10,11)注释细胞集群。

图1

图1表征scRNA-seq胎盘和蜕膜样品的数据。(一)实验的示意图工作流策略。(B)左:UMAP情节的胎盘细胞样本。VCTp增殖绒毛细胞滋养层;VCT,绒毛细胞滋养层;EVT, extravillous滋养层;SCT,合胞体滋养层;直流,树突细胞;MC,巨噬细胞细胞;T, T细胞;NK,自然杀伤细胞;B, B细胞; VSM, vascular smooth muscle cells; FB, fibroblasts; EB, erythroblasts. Right: UMAP plots of cells from LOPE (up) and normal (down) placenta samples. In these UMAP plots, each point depicts a cell, and cells are colored according to their cell types.(C)点图显示选择标记基因的表达水平正常化为每个细胞类型中确定胎盘。点尺寸代表细胞表达特定基因的比例表示细胞类型,和点颜色代表基因表达水平,用蓝色和白色对应高和低表达水平,分别。(D)类似于(B),除了蜕膜的细胞样本所示。FB,成纤维细胞;DSC,蜕膜基质细胞;SMC,平滑肌细胞;NK, NK细胞;T, T细胞;APC,抗原呈递细胞;B, B细胞;格兰,粒细胞;经济共同体,子宫内膜上皮细胞; LEC, lymphatic endothelial cells; EB, erythroblasts.(E)类似于(C),除了蜕膜细胞类型的选择标记基因。

我们确定了12个胎盘细胞类型,包括四种类型的trophoblasts-proliferating绒毛细胞滋养层(VCTp)、VCT, EVT SCT,五种免疫cells-dendritic细胞(DC),巨噬细胞细胞(MC), T细胞(T),自然杀伤细胞(NK)和B细胞(B),和其他三个类型的cells-vascular平滑肌细胞(VSM),成纤维细胞(神奇动物),成红血球细胞(EB) (图1 b)。标记基因的表达用于确定这些细胞类型中所示图1 c。滋养层高度表达细胞角蛋白家族基因(KRT7,KRT8和KRT18)(18)和胎盘细胞占所有的74.0%,而高于(41%)报告Suryawanshi等人的胎盘对于妊娠前三个月(10)。细胞滋养层、VCT高度表达PEG10和PAGE4(10定义的),而VCTp细胞进一步增殖标记(TOP2A和MKI67)。为简单起见,这里VCT指不VCTp VCT细胞。EVT细胞高表达HLA-G和PRG2为例与免疫耐受相关,前者(19),后者对应于入侵evt (20.)。SCT细胞高表达注册会计师,GH2,ERVFRD-1,前两个是激素基因和最后一个的标志基因SCT的合胞体的过程,是独一无二的(21)。

我们获得14蜕膜细胞类型,四是细胞外基质(ECM)表达细胞表达COL1A1,COL1A2,COL3A1编码我和III型胶原,和宽带运(decorin蛋白聚糖)(图1 d)。ECM表达细胞占54.5%的蜕膜细胞和包括两种类型的神奇动物细胞(分别叫FB1和FB2),蜕膜基质细胞(DSC)和平滑肌细胞(SMC) (图1 e)。FB1细胞高表达过渡委员会和POSTN成纤维细胞的激活和增殖相关的(22,23),而FB2细胞高表达IGF1(胰岛素样生长因子)(10),TAGLN(间质标记基因)(24),FBLN1(一个典型的FB标志基因)(25)。比较FB1和FB2,发现胶原基因的表达在FB1较高,而宽带的表达在FB2较高(图1 e),表明我们FB1和FB2符合Suryawanshi et al。(10)。DSC细胞高表达的基因——decidualization标志IGFBP1和光杆载荷(26)。SMC细胞高表达ACTA2,RGS5和NOTCH3周边血管平滑肌的标记基因(27)。DSC ECM-expression细胞细胞占68.9%,远高于Suryawanshi报告的比例(27%)等人的蜕膜对于妊娠前三个月(10)。这是符合事实,DSC的比例增加怀孕期间(13)。

Non-ECM表达细胞蜕膜主要是免疫细胞,包括两个子组的NK细胞(NK1和NK2),两个子组T细胞(T1和T2), APC(抗原呈递细胞),B和粒细胞(Gran) (图1 e)。蜕膜免疫细胞占27.0%的蜕膜细胞。NK1和NK2细胞高表达GZMB,NKG7和PRF1编码的经典杀细胞蛋白(28),这些基因的表达更高的激肽1 NK2。另外,NK2进一步高度表达细胞cycle-related基因,如MKI67,TOP2A和STMN1 (10)。T1和T2高表达典型的T细胞标记-CD3D和LTB(10)。但T1明确表达CD8A,T2具体表达CD4和FOXP3这都是Treg标记基因(11)。APC高度表达HLA-DRA与抗原呈递功能和可能同时包含直流和MC因为基因编码细胞表面蛋白质CD68、CD83也APC中高度表达。B细胞高表达基因immunoglobulin-related -IGJ,IGKC和IGHM。格兰细胞是由工具包和MS4A2(11)。所建议的研究从拱形Vento Tormo et al。(11),然而,格兰细胞可能会污染血液细胞。类似于其他的研究中,我们还发现了SMC,子宫内膜上皮细胞(EEC),淋巴内皮细胞(LEC)和成红血球细胞(EB)在蜕膜使用各自的标记基因。

差异基因表达分析表明,胎盘是洛佩可能不正常

我们获得了561个显著差异表达基因总数(度)从胎盘中所有的细胞类型,与大多数抑制在洛佩(图S2A)。绝大多数(506)度在滋养层,其中只有少数是在免疫细胞中发现。胎盘免疫细胞可能混合母体免疫细胞(29日),也显示的表达式XIST男性的胎盘免疫细胞的样本在这个研究(图S1K),我们只关注在胎盘滋养层度的功能富集分析。在这里,我们选择(http://www.geneontology.org)和特征数据集(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/collections.jsp)作为功能富集分析的来源。

首先,有一个全球发展缺乏滋养层(图2一个)。术语“胚胎胎盘发展”抑制在所有四种类型的滋养层。术语“ERK1 ERK2级联”,“p38MAPK调节级联”(30.)和“雌激素反应”(31日),是重要的刺激VCT的分化抑制在VCTp和VCT。EMT过程是至关重要的发展EVT收购迁徙和入侵能力抑制在所有四种类型的滋养层,和很多方面有关EMT过程,如“调节上皮细胞迁移”和“间叶细胞形态发生”是抑制在EVT,表明EVT入侵是不足的。Angiogenesis-related术语,如“积极调节血管生成”和血管重构,抑制在EVT (图2一个)。EVT的相关条款也上调一氧化氮合成活动(图2一个)。据报道,高浓度的一氧化氮抑制胎盘血管生成的过程(32)。在图2 b我们表明,FN1,MFAP5,亮度EMT过程中,间充质状态标记(33- - - - - -35)是显著抑制在所有类型的滋养层细胞,和PGF(胎盘生长因子)、血管重建途径中的关键基因和标记基因PE (36),显著抑制在EVT。

图2

图2描述之间的差异表达的基因在滋养层洛佩和正常样本和特征的基因表达水平动态变化沿着evt的发展轨迹。(一)浓缩度在不同类型的滋养层的结果。(B)点图显示,选择标记基因的表达模式代表的一些丰富/标志术语在不同类型的滋养层。点尺寸代表细胞表达标志基因的比例。点的颜色蓝色和红色表明标记基因向下或向上调节,分别在PE样品,颜色强度对应的日志₂FC值。(C)发展轨迹分析表明基因相似的表达模式以及evt的发展和在洛佩和正常样本。:PCA情节展示滋养层的分布根据他们PC2(横轴)和PC50值(垂直轴)。单个细胞根据各自颜色的细胞类型(VCTp、VCT EVT)。:热图显示基因簇的表达模式的发展拟时间EVT在洛佩和正常样本。集群按级别组织根据他们的表达模式。选择丰富的集群5 - 6和集群的1 - 4列出了浅绿色和浅紫色框,分别。注意发展拟时间由PC2值的分位数表示。(D)四象限图块EMT的基因。横轴对应于一个基因的表达水平之间的相关性和发展拟时间本的细胞,有积极的和消极的相关性表明增加和减少的表达水平,分别。纵轴代表log2叠化细胞之间的基因表达水平的洛佩和正常胎盘样品。(E)四个选择EMT基因的相对表达的发展拟时间evt (PC2值)。

其次,在胎盘免疫耐受减弱(图2一个)。I型干扰素(IFN-I)是一种重要的胎盘免疫反应调节剂。在“I型干扰素信号通路”,HLA-C和HLA-G参与母胎免疫耐受和减少了表达PE (37,38)。这里,“I型干扰素信号通路”VCTp理气,EVT SCT,HLA-C和HLA-G明显抑制在所有类型的滋养层(图2 b)。它已经建立,SCT公布的一种蛋白质,可以诱导细胞凋亡的母体免疫细胞(39),从而调节免疫耐受。在这里,小道显著抑制在SCT (图2 b),其参与过程的术语“积极的外在凋亡信号通路的调控”也显著抑制在SCT (图2一个)。以上证据表明可能减少胎盘免疫耐受。

第三,增加胎盘炎症(图2一个)。中去丰富EVT的差异度和SCT,有些是与炎症反应有关,如“炎症反应的调节”和“活性氧物种生物合成的过程”。这些表明,胎盘可能有炎症,这是符合推断基于衰减度降低孕产妇免疫耐受。作为一个例子,CCL3和亚兰巨噬细胞炎性蛋白家族的成员和经典的促炎症反应标记基因(40),他们明显上调EVT和SCT (图2 b)。

第四,补偿提高胎盘激素的生产可能发生。SCT胎盘激素的主要来源。在这里,去相关激素分泌和运输条款,如上调SCT (图2一个),“积极的监管ERK1和ERK2级联”与SCT的发展也在上调,可能反映出补偿效应的发展缺陷胎盘。同时,下面的差异方面,如“表皮生长因子刺激细胞反应”VCTp和EVT,“生长激素刺激细胞反应”在VCT,“v1 MYC目标”和“RNA拼接”EVT很可能是反应补偿由SCT增强激素生产(图2一个)。上述相应标记基因的上调所示图2 b。

发展轨迹分析显示不正常发展EVT,洛佩SCT

滋养层之间的发展关系。,from VCT to EVT and from VCT to SCT, have been well characterized (10,11)。研究基因表达变化在胎盘在洛佩从发展的角度来看,我们进行PCA(主成分分析)分析VCT的转录概况(包括VCT和VCTp)和EVT细胞和确定PC2值大约代表发展方向从VCT EVT (图2 c)。然后我们使用PC2值将细胞分为垃圾箱并应用maSigPro (41)进行时间序列分析。我们获得6个集群,每个集群基因有类似的表达变化不仅在发展方向还在疾病状态之间。集群1 - 4基因通常沿着发展方向向上调节,但抑制在洛佩,而集群5和6是相反的(图2 c)。浓缩在集群上1 - 4调节或参与EMT过程,表明EMT过程抑制沿着发展方向从VCT EVT在洛佩。浓缩在集群5和6条款与活跃的细胞周期和细胞分裂活动,表明缺乏差异化的VCT EVT大步慢跑。

直接检查洛佩EMT基因的影响,我们绘制的四象限图EMT基因(图2 d),水平轴代表基因表达水平与发育相关的拟时间(PC2值),纵轴代表两个疾病状态之间的基因表达的变化。大多数EMT基因是位于第一象限,即。,the activity of the EMT process generally increases along the development direction, but is down-regulated in LOPE. Among the EMT genes,FN1,SPARC,SERPINE2,MFAP5最极端的行为:他们不仅强烈与发展拟时间呈正相关,也显著地抑制在洛佩(图2 e)。FN1是一个典型的间叶细胞标记基因(35)。SPARC目标激活的转录因子蛞蝓(SNAIL2) EMT过程(42),据报道,被显著抑制在胎盘的PE (43)。SERPINE2和MFAP5据报道,都是促进癌症(EMT过程33)。

我们也采用了相同的发展轨迹分析VCT SCT。有趣的是,在发育中上调的基因簇,一些实际上是上调大步慢跑。丰富的在这些集群包括激素合成和“合胞体形成”(图开通),进一步证实了补偿性的SCT增强激素生产开发的观点。对于那些发育差异基因簇基因抑制在洛佩,丰富去条款包括那些怀孕相关条款所涉及在母胎界面的免疫调节,表明免疫耐受机制的障碍在SCT的发展。巴黎圣日尔曼是一个代表基因在这些集群和被报道参与母胎界面的免疫调节(图S2C)。

差异基因表达分析表明,洛佩的蜕膜可能不正常

我们将蜕膜细胞分成两个groups-non-immune蜕膜细胞和免疫细胞。无免疫力蜕膜细胞包括核心蜕膜细胞(FB1 FB2, DSC)、SMC、欧共体、LEC和EB。蜕膜免疫细胞,B和格兰细胞可能包括血液循环免疫细胞(11,44),因此我们只分析NK T, APC蜕膜细胞存在。我们获得了一个总数662度无免疫力蜕膜细胞,从核心蜕膜细胞(367图S3A)。我们获得328度在蜕膜免疫细胞,它们中的大多数都是洛佩监管。然后我们进行功能富集分析这些度。

首先,有缺乏decidualization蜕膜细胞核心。在理气方面丰富度在蜕膜细胞核心包括那些与干扰素γ和糖酵解有关,如“规范糖酵解”和“NADH再生”,等等。图3一)。蜕膜,由蜕膜NK细胞产生干扰素γ促进decidualization的蜕膜细胞(核心45在DSC),而糖酵解活动被报道与decidualization的程度(46)。这些条款的下调从而意味着decidualization过程可能在洛佩受损。更直接的证据来自丰富的差异度在蜕膜细胞核心,包括标志词EMT参与EMT的规定和条款,如TGFβ,骨形态发生蛋白和WNT信号通路,以及ECM-related术语(图3一)。EMT的反向过程实际上是满足描述细胞表型变化decidualization (47),因此EMT的老年病意味着decidualization不足。在图3 b,我们显示出上述的标志基因的表达途径,包括IFI30和BST2(48),对干扰素γ的标记基因通路,GAPDH和PGK1(49),糖酵解的标记基因,IGFBP1和光杆载荷(9),decidualization的标记基因。然而,糖原合成、特性decidualization通路(50在DSC),上调(图3一)。与细胞增殖相关的术语和激素刺激的反应也在DSC表达显著上调,我们推测可能是一种补偿性的矛盾缺乏应对decidualization DSC和胎盘SCT增强激素刺激。

图3

图3鉴定差异表达的基因在蜕膜核心细胞在洛佩和正常样本和特征之间的基因表达水平动态变化沿着DSCs的发展轨迹。(一)浓缩度的结果在不同类型的蜕膜细胞核心。(B)点图显示,选择标记基因的表达模式代表的一些丰富/标志术语在不同类型的蜕膜细胞核心。(C)发展轨迹分析表明基因相似的表达模式的发展之间DSCs洛佩和正常样本。(D)四象限图块EMT的基因。(E)四个选择EMT基因的相对表达的发展拟时间DSCs (PC2值)。注意,在组织和设置(安妮)是一样的,在吗图2 a e。

其次,可能有增加炎症在蜕膜。FB1丰富度表达的上调和DSC还包括那些与炎症有关,如活性氧(活性氧)和氧化应激相关通路(图3一蜕膜),表明有可能增加炎症。HLA-DRA和HLA-DRB1(10)抗原表达亚兰,CCL5和CCL21(10)免疫细胞趋化作用明显抑制在所有类型的蜕膜细胞核心洛佩(图3 b)。

第三,其他无免疫力的主要功能蜕膜细胞的影响。除了蜕膜细胞核心,其他无免疫力蜕膜细胞包括SMC、EEC, LEC和EB。在这些细胞中,SMC和欧共体度很少,并没有发现富集条件。有大量的LEC度,和大多数衰减。LEC淋巴管的主要细胞类型,函数通过运输产妇母胎界面的免疫细胞(51)。相关条款富含LEC包括免疫抵抗,如“细胞I型干扰素反应”和“抵抗反应病毒”,和其他相关方面的发展和功能LEC本身,如“内皮发展”、“循环系统流程”,“白细胞迁移”和“淋巴管发展”,等等。图S3B),这表明淋巴管运输功能和发展的可能影响。

第四,蜕膜免疫细胞的主要和监管职能都受到影响。在理气方面丰富度在蜕膜NK细胞和T细胞包括那些与他们的主要功能,如“细胞死亡”、“T细胞介导免疫”和“NK细胞介导免疫”(图4 a, B)。subgroup-specific NK细胞和T细胞的功能也受到影响。例如,NK2是增生性NK子群,术语“细胞分裂”是抑制在NK2 (图4一)。T2细胞表达Treg标记基因,术语“调节性T细胞分化抑制在T2 (图4一)。“同种异体移植物排斥”的标志词也抑制NK细胞和T细胞,这意味着他们的角色在调节maternal-fetus免疫耐受可能就会大打折扣。蜕膜NK细胞和T细胞也发挥重要的监管职能通过产生大量的细胞因子和趋化因子调节滋养层细胞的入侵,蜕膜动脉的重建,decidualization过程(52)。在这里,“积极的调节细胞因子的生产”途径,许多白介素生产途径抑制在NK细胞和T细胞(图4一),这表明他们在洛佩监管职能明显受损。只有少数差异度在蜕膜免疫细胞(图4 b)。术语表达的上调APC和途径参与炎症反应通路相关ROS和细胞凋亡在NK细胞和T细胞(图4一),这表明可能有炎症环境在蜕膜。

图4

图4鉴定差异表达的基因在蜕膜免疫细胞中的洛佩和正常样本和特征之间的相互作用的免疫细胞蜕膜胎盘滋养层和蜕膜细胞核心洛佩和正常样本。(一)浓缩度在蜕膜免疫细胞的结果。(B)点图显示,选择标记基因的表达模式代表的一些丰富/标志术语在不同类型的蜕膜细胞核心。注意,在组织和设置(A, B)是一样的,在吗图2 a, B。(C)配体-受体相互作用中确定蜕膜免疫细胞和胎盘滋养层之间在体育和正常样本。(D)配体-受体相互作用中确定蜕膜免疫细胞和蜕膜细胞核心之间在体育和正常样本。在(C, D),一个圆圈的大小表示假定值相应的交互由CellPhoneDB,和圆的颜色代表的意思是平均相互作用分子的表达水平。

发展轨迹分析显示功能失调的洛佩蜕膜细胞核心的发展

我们还进行了一项发展轨迹分析检查基因表达变化的发展轨迹,从DSC的边后卫。由于FB2有少度,我们专注于发展轨迹FB1 DSC。我们获得了六个基因集群(图3 c)。基因在集群中1、2和4通常沿着发展方向衰减DSC,但上调大步慢跑。浓缩条件在这三个集群包括ECM-related EMT过程相关,这表明EMT过程是在洛佩DSC的发展改变。在集群3中,基因是上调的发展轨迹,但抑制在洛佩。这些基因在通路相关抗原呈现丰富。集群5和6的表达模式相对比较复杂,没有发现富集条件。至于EMT的四象限图分析基因,我们发现大多数EMT基因位于第三象限(图3 d),这表明EMT过程的活动通常减少发展轨迹,但上调洛佩,进一步表明洛佩decidualization不足。三大显著改变EMT基因在洛佩FN1、SPARC TAGLN(图3 e),也有很多改变collagen-related EMT的基因,如COL1A2,COL4A1,COL6A2(10)。

信息交流分析显示改变与蜕膜免疫细胞的相互作用,在洛佩蜕膜细胞和胎盘滋养层核心

蜕膜免疫细胞发挥重要的监管作用,我们用CellPhoneDB (53)检查信息是否蜕膜免疫细胞和胎盘滋养层之间的通信是由洛佩(改变图4 c)。为简单起见,我们分类中的(LR)对EMT-related,免疫function-related,和其他基于配体的功能注释或一对LR的受体,并只考虑这些重大的LR组(p值< 0.05)的平均表达值大于0.8的比较。我们发现洛佩EMT-related LRs数量明显减少,在一定程度上表明EMT过程的调节蜕膜免疫细胞在洛佩可能被削弱。例如,在洛佩CD96_PVR和TGFB1_EGFR都失踪。在这两个LRs,配体从蜕膜NK细胞,而受体(EGFR PVR)来自滋养层包括VCT, EVT, SCT已报告及其对应的信号通路促进EMT过程(54,55)。我们还发现免疫function-related LRs显然是减少数量的洛佩,表明建立的免疫保护免疫蜕膜免疫细胞之间的相互作用和洛佩滋养层可能被削弱。一个例子是LGALS9-DAG1失踪的洛佩。在这个LR,滋养层是一个关键基因的受体DAG1同种异体移植物排斥反应途径和被报道参与胎盘的免疫保护(56)。没有这个LR洛佩表明免疫保护洛佩的胎盘可能会受到影响。的另一个例子是LILRB2_HLA-G受体HLA-G是一种自然产生在人类胎盘免疫抑制剂,抑制母体免疫反应的绑定LILRB2免疫受体(57)。没有这个LR洛佩洛佩可能使母体免疫反应障碍。至于其他相关功能LRs,我们没有找到任何可辩解的区别。

我们还检查蜕膜免疫细胞之间的信息交流和蜕膜细胞核心健康对照组和洛佩之间。我们没有找到非常重要的信息交流模式的变化(图4 d)。但是我们发现,在洛佩EMT-related LRs数量的增加。新兴EMT-related LRs以期的例子包括TGFB1-TGFBR3蜕膜NK1和DSC和WNT5A-ANTXR1蜕膜免疫细胞(T2, NK2)和蜕膜细胞核心(FB1、DSC)。ANTXR1据报道,促进癌症的EMT (58)。这些表明,蜕膜细胞可能是增强核心的EMT过程的监管下在洛佩蜕膜免疫细胞。至于免疫function-related LRs,我们发现在洛佩LRs涉及FB1数量减少了。例如,CCR1-CCL5蜕膜免疫细胞与蜕膜细胞核心(FB1和DSC)与免疫细胞趋化性(59),在洛佩缺席。在其他相关功能LRs外,我们还没有找到任何可辩解的区别。

讨论

这是第一个单细胞RNA-seq研究maternal-fetus洛佩的接口。在这项研究中,我们研究了基因表达的变化洛佩和健康对照组之间不仅在个体细胞类型在胎盘和蜕膜还滋养层的发展轨迹和蜕膜基质细胞。我们的分析表明,胎盘和蜕膜在洛佩可能不正常。更具体地说,在胎盘有可能全球缺乏滋养层的发展,缺乏入侵EVT EMT过程的细胞具有明显的下调,母体免疫排斥和炎症,增加和补充增强由SCT细胞激素的生产。蜕膜,有可能不足decidualization DSC细胞显著上调EMT过程的特点,增加了炎症,抑制蜕膜免疫细胞的主要和监管职能。这些发现强调了洛佩的复杂性和洛佩的分子机制提供了新的线索,允许开发新对PE的发病机制假说。

胎座式和decidualization都是关键在胎盘、蜕膜发育过程。在怀孕期间,这两个过程是根据精确的规定以协调的方式和改变的过程可能会导致疾病,如PE (60)。两级PE模型认为贫穷疾病的胎座式是主要的原因,进一步提出,在洛佩,胎盘是固有的功能失调,尽管这似乎正常(8)。在这里,我们的研究也表明,在洛佩胎盘功能失调。然而,功能失调decidualization也提出了我们的研究。虽然我们不能确定功能失调的胎座式和功能失调的decidualization之间的因果关系,我们原因,它们都有助于洛佩的发病机制和可能会相互影响。此外,由于蜕膜免疫细胞在调节胎座式和decidualization扮演重要角色(13,61年),我们的研究表明,他们的监管职能明显抑制在洛佩,我们假设蜕膜免疫细胞的功能障碍也可能导致洛佩的发病机制。母亲的免疫系统的变化可能反映了蜕膜免疫细胞功能失调,因此可探索的洛佩的早期检测和诊断。此外,它也可能是值得探索的可能性,恢复蜕膜免疫细胞通过母亲的免疫系统的恢复,以治疗大步慢跑。此外,有子痫前症不同地区和民族之间的差异(62年,63年)。本研究只包括样本汉人在中国,和未来研究与其他民族更大的样本量和样本需要验证这项研究的结果。虽然洛佩病人在本研究的样本容量是有限的,使用单细胞转录组测序技术允许检测洛佩和正常控制细胞分子水平差异。最近的研究调查人类疾病与单细胞转录组测序技术也利用小样本大小由于高成本的技术,但仍提供了重大的发现。随着技术成本的持续下降,包含更多的洛佩在未来的研究将使样品分子差异的调查不仅洛佩和正常控制细胞之间也大步慢跑患者之间。

结论

综上所述,本研究可以提高我们理解洛佩基因表达变化的影响在细胞水平上的mother-fetal接口,轻快的分子机制提供了新线索,也有助于发展大步慢跑的诊断和治疗的新方法。

材料和方法

病人和样品收集

在这项研究中使用的所有组织样本来自中国汉人,他们从妇科和产科医院,复旦大学与6胎盘样品(3正常,3大步慢跑)和7蜕膜样品(4正常,3大步慢跑)的正常控制样本的孕龄大于38周。洛佩样本的胎龄34至37周(表S1),这些样本不是匹配的患者。1)包括:在中国,称为高血压先兆子痫(两个独立的血压≥140/90毫米汞柱采取至少4 h)和蛋白尿(≥1 +试纸测试在两个尿样或≥300毫克的蛋白质在24小时尿液样本)妊娠20周后。洛佩被定义为疾病的发病在怀孕34周后或有或没有症状的严重程度,如肾功能不全、肝脏介入、神经并发症或血液学的并发症(64年)。2)排除:此类并发症患者被排除在外,包括糖尿病、原发性高血压、肾炎、心脏病、贫血、肝炎、肝内胆汁淤积的怀孕(ICP),性传播疾病,和其他医疗或外科疾病的孕妇。与此同时,没有怀孕或分娩期间的并发症,如前置胎盘、胎盘早剥、胎儿窘迫、羊水异常、巨大胎儿,胎儿贫血等。

预处理

胎盘和蜕膜组织提取胎盘在剖腹产后立即交付。四个胎盘活检(~ 1厘米³)从定义解剖地区产妇胎盘表面,这是~ 5厘米从脐带插入没有钙化和出血。(指定的方向不是65年,66年)。胎盘被免职后,足够的胎盘床蜕膜组织(蜕膜)收集的剪刀。切割活检被洗的pre-cooled林格氏溶液对细胞分裂和图书馆准备立即(67年)。

单细胞的隔离胎盘

是用剪刀绞成2-4mm块胎盘组织,酶消化的鸡尾酒在脐带分离设备(Miltenyi研究,130-105-737)在1克,和孵化37°C 40分钟。此后,暂停100 -μm细胞筛过滤,水洗DMEM和过滤、resuspended红细胞裂解缓冲。重复前程序40-μm细胞筛、除红细胞溶解。整个悬架被汇集在一起,在4°C颗粒状的离心15分钟/ 300 g。此外,水浮层被,分离细胞最终resuspended适当缓冲进一步图书馆建设。

单细胞分离蜕膜

蜕膜组织是用剪刀绞成2-4mm块,消化0.4%胶原酶IV,孵化37°C 40分钟。此后,暂停100 -μm细胞筛过滤,水洗DMEM和过滤、resuspended红细胞裂解缓冲。重复前程序40-μm细胞筛、除红细胞溶解。整个悬架被汇集在一起,颗粒状的离心300克15分钟在4°C。此外,水浮层被,分离细胞最终resuspended适当缓冲进一步图书馆建设。

单细胞图书馆准备和测序

单细胞悬液应该满足的要求如下:1)细胞数量:500 - 2000细胞的浓度/μl,和50多个μl体积。2)细胞活动:超过80%的培养细胞。3)没有聚集:凝结率不到5%,没有过度的细胞碎片,细胞聚集,或红血细胞。4)细胞直径:5-40μm。图书馆准备:1)单细胞封装。三个注射泵(longerPump LSP01-2A)被用来加载油细胞(悬架)和珠(暂停)铬单细胞芯片,因此单分散的液滴生成。水滴被转移到PCR管或96孔板,这是与rt - PCR反应混合液混合,随后反向转录。2)互补脱氧核糖核酸扩增。此外,cDNA放大和纯化。Drop-seq凝胶地图的质量评估。 3) 3’ end library construction. Purified cDNA was fragmented. After the fragments were obtained, the ends were repaired and A-tail ligation is performed. Finally, the length of the cDNA fragments were screened by the magnetic bead screening method. Then, connect the adaptor to the 3′ end of the cDNA, and use the index adaptor with a special sequence to distinguish the library. Library qualification was performed by Agilent 4200 on concentration and length. Finally, Sequencing: Novaseq (Illumina, novaseq6000) was used for sequencing.

scRNA-seq数据处理

Drop-seq测序数据处理使用标准的管道(Drop-seq核心计算如果协议2.3.0,http://mccarrolllab.com/dropseq/没有修改。完成的pre-alignment标签和修剪后阅读根据标准的管道,读取然后对齐的人类(hg19)基因组参考使用星对准器(STAR_2.5.3a),允许不超过10不匹配。最后,我们从一个一致的库中提取数字基因表达数据使用Drop-seq程序“DigitalExpression”。生成的下游基因表达数量矩阵用于分析。质量控制对所有样品进行了使用修V3.0 (68年)。只有那些超过三个细胞基因表达和细胞表达了超过200个基因和不到3000个基因之间和每个细胞的umi数量限制超过2000个基因和少于150000被保留。细胞线粒体含量> 25%被认为是质量差和丢弃的分析。删除批处理效果由于背景污染,无所不在地表达了核糖体蛋白质编码(RPS RPL), MALAT1非编码RNA基因和一组基因在环境倾向于表达RNA (PAEP、HBG1 HBA1, HBA2, HBM, AHSP和HBG2)被移除。

批校正和集群

噪音消除技术和样品之间保持真正的生理差异,我们删除批处理效果之间的样本使用狮虎(16)胎盘、蜕膜,分别。设置参数(k = 20,λ= 5)函数optimizeALS狮虎。K-nearest-neighbor图构造了基于欧几里得距离iNMF空间中使用“FindNeighbors”功能在修拉和鲁汶迭代算法应用于细胞分组在修“FindClusters”功能与最佳的分辨率。实现了可视化UMAP (69年)。最后,在每个集群特定标记“FindAllMarkers”功能被确定的修和集群被分配到已知的细胞类型使用标准的标记。

识别度和富集分析

识别度洛佩和正常个体之间在每一个特定的细胞类型,我们执行度分析使用函数在修“FindMarkers”,这是基于Wilcoxon rank-sum测试。P值的多个测试使用Bonferroni调整修正。只有基因平均log2-transformed叠化大于0.25,调整P值小于0.05,表示细胞的比例大于10%的人认为是度。去分析LOPE-associated度函数enrichGO R包执行clusterProfiler (v3.18.1) (70年),运行在subontologies“生物过程”。R包“pheatmap”是用于生成浓缩的热图的阴谋。对所有条款所示的热图,罗斯福校正后的假定值至少小于0.1。

对不同状态轨迹分析

为了更好地理解洛佩发展轨迹的影响在胎盘和蜕膜,PCA进行细胞类型在每个发展轨迹。首先,我们选择一个PC向量来代表开发拟时间。然后我们选择最好的前400个基因这个电脑绝对相关系数向量的基因表达值(基因排名400年之后几乎没有贡献PC)和计算的平均表达价值每个选择的基因在细胞在不同健康状态(洛佩和健康控制)在每个拟时间间隔。最后,我们使用maSigPro(1.62.0版)(41)集群轨迹相关基因并找到集群洛佩和正常控制样本之间明显不同。

中的作用分析

调查潜在的相互作用在不同的细胞类型的子宫内膜异位病变,子宫内膜,信息交流使用CellPhoneDB分析(53)、受体和配体从CellPhoneDB提供的公共数据库。CellPhoneDB分析使用CellPhoneDB执行Python(包2.0.0)。细胞单细胞转录组数据标注为FB1 / FB2, DSC, NK1 / NK2 T1 / T2, APC在蜕膜,在胎盘滋养层输入CellPhoneDB信息交互分析。丰富receptor-ligand两种细胞类型之间的交互所派生的基于受体的表达一个细胞类型和相应的配体的表达的另一种细胞类型。然后,我们确定最相关的细胞类型特异性配体和受体之间的相互作用,并且只受体和配体表达相应subclusters 10%以上的细胞被认为是。包括细胞类型之间进行两两比较。通过计算的比例意味着高于实际的意思是,P值的可能性相应的细胞类型特异性receptor-ligand复杂。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://github.com/JustMoveOnnn/preeclampsia/tree/main/single_cell_matrix/data。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和批准制度研究复旦大学妇产科医院的伦理委员会(2017 - 57)。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

求WT和XL的构思和监督这个项目。LG和赫兹主要负责样品收集和临床数据的解释。司法院、QL和ZW进行生物信息学分析。客户至上、QL和LG写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究得到了国家重点研究和发展项目(2021 yfc2701600 2021 yfc2701601 2021 yfc2701602 2021 yfc2701603),中国国家自然科学基金(81971411,81971411,82101786,81741047,31871325,32170667),上海帆船项目(yf1403800 21日),上海临床科学和技术创新的关键项目(17411950500号17411950501号和18511105602号),临床研究计划SHDC (SHDC2020CR1047B和SHDC2020CR6021),上海公共卫生优秀年轻学者计划(2020 - 2022年gwv - 10.2 - yq13),精英年轻学者2025年复旦大学(2020 - 2023),上海女性生殖疾病的医疗中心的关键项目(2017 zz01016)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1142273/full补充材料

引用

1。沃克JJ。先兆子痫。《柳叶刀》(2000)356:1260-5。doi: 10.1016 / s0140 - 6736 (00) 02800 - 2