原始研究的文章

前面。Immunol。,19May 2023
秒。免疫宽容和监管
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1130600

M-MDSC在体外一代从小鼠骨髓IL-3揭示高表达和精氨酸酶1的机能活动

Arpa Aintablian

桑德拉Strozniak

马里恩豪雅

曼弗雷德·b·鲁茨 ^*

维尔茨堡大学病毒学和免疫生物学研究所,德国维尔茨堡

Myeloid-derived抑制细胞(MDSC)代表免疫反应的主要监管机构,它可以控制T细胞通过他们诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和精氨酸酶1 (__arg1)介导效应函数。尽管gm - csf是促进MDSC发展良好的文档记录,对这种潜在IL-3,肥大细胞的生长因子建立。在这里,我们表明,IL-3,类似于gm - csf,产生单核细胞的MDSC (M-MDSC)小鼠骨髓(BM)细胞经过3天的在体外文化。在这个时间点,主要是CD11b⁺CD49a⁺单核细胞的和CD11b⁺CD49a^{- - - - - -}FcεR我^{- - - - - -}中性细胞被检测到,而CD11b^低/否定FcεR我⁺肥大细胞积累后才扩展文化时期。生长因子都相当于生成M-MDSC表型,细胞产量和典型的表面标记。然而,IL-3生成M-MDSC产生更少的TNF、IL-1β和il - 10与LPS激活后+ IFN-γ但__arg1表达式显示高于gm - csf M-MDSC生成。__arg1进一步诱导后连同伊诺MDSC激活。因此,增加Arg1-dependent IL-3 M-MDSC生成抑制活性的观察使用各自的伊诺和__arg1抑制剂。在一起,这些数据表明,可以生成M-MDSC在体外IL-3,类似于gm - csf,但增加__arg1表达式和Arg1-mediated抑制能力。这个协议进一步现在允许在体外研究IL-3 MDSC生物学的作用。

介绍

MDSC代表主要的粒细胞和单核细胞的细胞不成熟阶段功能直接进入免疫细胞抑制状态,而非免疫原性效应细胞。基于Ly6C和Ly6G分子的表达水平,MDSC可以进一步分为两个子集M-MDSC和粒细胞MDSC (G-MDSC)。前者类似monocyte-like而后者主要是一个不成熟的neutrophil-like表型(1)。MDSC使用不同的抑制机制来发挥免疫调节的影响。在这些L-arginine-metabolizing酶伊诺和M-MDSC __arg1出现最常见的报道。,伊诺诱发没有释放灭活目标分子通过亚硝基化作用或产生毒性作用,精氨酸转运体的老年病CAT-2B和__arg1引起代谢饥饿的微环境由精氨酸不足会影响T细胞增殖(2- - - - - -5)。

一些细胞因子和生长因子促进MDSC代(6- - - - - -8)。其中,gm - csf已被广泛研究,因为历史上首次明确提示作为诱导物的抑制骨髓细胞群(9)。基于这些发现,我们开发了一个协议从小鼠生成MDSC BM和gm - csf细胞在体外(10)。最近,我们还发现,gm - csf激活特定信号通路如IRF-1和mTOR单核细胞“许可”的一步,这是需要收购iNOS-mediated M-MDSC抑制功能(11)。

gm - csf和IL-3首先描述为造血生长因子,属于β-common家族细胞因子(12)。heterodimeric受体参与,由一个特定的α亚基和共享βc亚基,最终形成dodecamer最佳信号复合物(13- - - - - -15)。这两种细胞因子发挥促炎症功能(16,17),因此候选人antibody-directed封锁auto-inflammatory或自身免疫性反应(18)。另一方面,这些因素可以表现出免疫抑制作用(19)。的条件直接相反的功能并不完全理解但可能取决于剂量和微环境因素在其生产的解剖部位(20.)。

IL-3促进增长的多能干细胞(21),是主要的生长因子,刺激他们的进一步分化为肥大细胞在体外,尽管它并不是必不可少的稳态代的肥大细胞在活的有机体内所示IL-3 gene-deficient老鼠(22)。因此,小鼠BM文化与IL-3生成4 - 6周后纯肥大细胞的数量(23)。我们可以表明IL-3生成monocyte-derived直流(MoDC)从小鼠BM文化时期的只有1周(24使用gm - csf),类似于我们的协议(25)。IL-3报道倾斜在体外代的巨噬细胞对il - 4的M2效应表型通过支持信号或IL-13由嗜碱粒细胞(26),但也促进免疫抑制小鼠骨髓细胞黑色素瘤模型(27)。相比之下,IL-3被报道部分人类G-MDSC代从CD34的抑制剂⁺细胞(28)。因此,没有显示IL-3 MDSC代的试验装置在体外(6,7)。

在这里,我们描述一个协议为代M-MDSC IL-3从小鼠细胞。IL-3-generated M-MDSC __arg1表达式显示高于GM-CSF-generated M-MDSC,和使用__arg1,除了伊诺,抑制T细胞增殖。我们的研究结果揭示的另一种方法在体外代的小鼠MDSC IL-3,增强__arg1表达对促炎的T细胞和抑制的能力。

结果

BM文化与IL-3或gm - csf诱发类似的频率和祖细胞增殖在体外

IL-3和gm - csf是众所周知的造血生长因子。比较的角色gm - csf和IL-3骨髓细胞祖细胞的扩张,我们分析了他们的频率,绝对数字,扩散在第三天的BM文化与生长因子。高频率和绝对数量的粒细胞单核细胞祖细胞(GMP)与单核细胞树突细胞祖细胞(MDP)观察与gm - csf或IL-3文化。相比之下,MDP的频率和绝对数量略少IL-3文化与gm - csf文化(图1模拟)。GMP激增超过MDP Ki67染色检测,但无显著差异可能发现gm - csf和IL-3之间文化(图1 a, B, E)。这表明gm - csf和IL-3可比在促进BM祖扩张在体外。

图1

图1类似的频率和GMP和MDP祖细胞的增殖。代表流式细胞术情节在BM细胞培养的第3天gm - csf或IL-3的存在。(一)控制策略和gm - csf和IL-3文化例子染色。(B)控制策略与Ki67检测祖细胞增殖。最初的盖茨所示(一)转储通道包括血统表面标记Ter119 B220, CD4、CD8和Ly6G。GMP是定义为CD11b^{- - - - - -},Sca1^{- - - - - -},CD117 / c - kit⁺,CD16/32⁺,CD34⁺;和MDP CD11b^{- - - - - -},Sca1^{- - - - - -},CD117 / c - kit⁺,CD16/32^{- - - - - -},CD34⁺细胞。图表显示评估Ki67的频率⁺增殖祖细胞在第三天(强烈的彩色直方图)。无污点的细胞显示为FMO控制(弱彩色直方图)。(C)统计频率的细胞如盖茨所示(B)。(D)每道菜绝对细胞数量,使用频率的计算(C)每道菜和活细胞计数在纽鲍尔用台盼蓝室。(E)统计Ki67染色在盖茨所示(B)统计未配对,双尾t、n = 3独立实验。价格!斜面(ns)。

IL-3和gm - csf显示类似的力量从小鼠BM生成M-MDSC表型在体外

我们以前建立一个协议生成优先M-MDSC从小鼠的细胞培养在gm - csf的存在为3天(10,29日)。在这里,我们采用了同样的程序,但与gm - csf IL-3相比,它使用。校长发展细胞应对这些生长因子可分为CD11b⁺CD49a⁺单核细胞的细胞(M门)和CD11b⁺CD49a^{- - - - - -}粒细胞性细胞(G门)(图2一个)。进一步细分在这些盖茨允许CD11b的区别⁺CD49a⁺Ly6C^高CD11c^{- - - - - -}单核细胞,CD11b⁺CD49a⁺Ly6C^高CD11c⁺M-MDSC, CD11b⁺CD49a⁺Ly6C^{- - - - - -}CD11c^{- - - - - -}巨噬细胞,CD11b⁺CD49a⁺Ly6C^{- - - - - -}CD11c⁺MoDC, CD11b⁺CD49a^{- - - - - -}趋化因子受体CXCR4⁺Ly6G⁺不成熟和CD11b⁺CD49a^{- - - - - -}趋化因子受体CXCR4^{- - - - - -}Ly6G⁺成熟的中性粒细胞(图2一个)。进一步分析的频率和绝对细胞计数每道菜的骨髓细胞类型表示类似的模式和大多数子集的比例,除了单核细胞的频率高和MoDC低与IL-3与gm - csf (图2 b, C)。这也符合我们之前的结果显示,MoDC开发低效率使用IL-3从单核细胞与gm - csf文化(1周后24)。这些数据进一步支持同等能力生成M-MDSC IL-3和gm - csf的表型在体外。

图2

图2相似的表型和M-MDSC频率。(一)流式细胞术的例子和控制策略的第四天BM细胞培养的gm - csf或IL-3。单核细胞的细胞(M)被定义为CD11b⁺和CD49a⁺并进一步细分为Ly6C^高CD11c -古典单核细胞(Mono), Ly6C^高CD11c⁺单核细胞的myeloid-derived抑制细胞(M-MDSC), Ly6C^{- - - - - -}CD11c⁺树突状细胞(DC)和Ly6C^{- - - - - -}CD11c^{- - - - - -}巨噬细胞(英里/小时)。粒细胞性细胞(G)被定义为CD11b⁺和CD49a^{- - - - - -}并进一步细分为趋化因子受体CXCR4⁺Ly6G⁺不成熟的中性粒细胞(imNeu)和趋化因子受体CXCR4^{- - - - - -}Ly6G⁺成熟的中性粒细胞(matNeu)。染色和控制策略改编自(29日)。(B)频率的单核细胞的细胞和粒细胞子集。盖茨所示(一)。(C)每道菜绝对细胞计数,计算使用频率(B)每道菜和活细胞计数在纽鲍尔用台盼蓝室。统计比较gm - csf和IL-3文化未配对,双尾t、n = 5独立实验。不显著(ns);* p < 0.05。

形态和肥大细胞IL-3和gm - csf的文化内容

进一步评估gm - csf和IL-3培养细胞的形态出现,cytospin准备从这些文化都沾染了)。微观评价显示的许多细胞与单核细胞的肾形的核图3一,“M”)或不成熟的中性粒细胞和一些成熟的典型环形核中性粒细胞与分段核(图3一如图所示,“G”) (10,30.)。

图3

图3IL-3 BM文化在d3生成主要是中性粒细胞和单核细胞的细胞和肥大细胞仅在晚些时候在体外文化。(一)单核细胞的形态学和粒细胞CD11b⁺细胞培养与gm - csf或IL-3 3天。(B)BM细胞培养在gm - csf或IL-3 3 - 13天,流式细胞术分析了肥大细胞的存在。识别CD11b控制策略^低/^负的FcεR我⁺肥大细胞。(C)统计总肥大细胞gm - csf的频率或IL-3文化。肥大细胞被确定由FSC-A / SSC-A和单细胞盖茨一样图2一个和标记所示(B)统计未配对的双尾t检验,n = 3独立实验。

IL-3被描述为一个细胞因子在小鼠肥大细胞代驾车BM文化(23)。然而,肥大细胞不能被他们的形态)染色后第三天(图3一)。因此,我们的流式细胞术检测他们的存在3天13的文化。肥大细胞被检测为CD11b^低/否定FcεR我⁺在文化与IL-3天13细胞,但很少在第三天,和在任何时间点不在gm - csf文化(图3 b, C)。这些数据进一步证实,IL-3是一种有效的生长因子诱导肥大细胞与gm - csf发展,而且发展缓慢。值得注意的是,主要发展细胞在第三天文化早期时间点是中性粒细胞和单核细胞的细胞,后者有能力进一步发展成MoDC,所述前(24)。

细微的差别存在于细胞因子和趋化因子受体的表达和文化之间的信号分子IL-3和gm - csf

进一步比较分析进行评估基线和activation-dependent表达的细胞因子和趋化因子受体粒细胞和单核细胞的细胞提升通过生长因子的子集。表达GM-CSFRα(CD116) gm - csf的文化和IL-3Rα(CD123) IL-3文化表现出降低的趋势有或没有刺激相比他们的纵横交错的条件(补充图1 a, B),然而他们没有达到统计学意义。也,没有实质性的表达水平的差异观察IL-4Rα(CD124) M-CSFR (CD115)或IL-3和gm - csf文化之间CCR2 (补充图1汉英)。最近,我们发现某些信号通路相关的单核细胞诱导的“许可”gm - csf MDSC所需开发(11)。调查是否IL-3也激活相同的分子,我们比较的基线和activation-dependent表达水平磷酸化mTOR S6激酶。没有观察到基线差异以及有限合伙人/ IFN-γ-或Zymosan-induced IL-3和gm - csf文化之间的两个分子的表达水平(补充图2 a, B)。这些发现表明,有一个高相似度的影响IL-3和gm - csf细胞因子和趋化因子受体的表达以及在BM细胞信号通路。

IL-3文化显示较低的职业和抗炎细胞因子的释放

接下来,我们试图比较刺激的细胞因子的生产或如果gm - csf IL-3文化。文化的ELISA分析了上层的细胞因子IL-1β,TNF和il - 10。细胞从有限合伙人/ IFN-γ——或者Zymosan-stimulated IL-3文化显示出显著降低这三种细胞因子的释放与gm - csf(相比图4 a - c)。这表明大部分IL-3文化更强有力的生产支持和抗炎细胞因子。

图4

图4IL-3文化显示较低的细胞因子释放与gm - csf的文化。细胞培养与gm - csf或IL-3和刺激在第三天0.1µg /毫升有限合伙人+ 0.01 ng / ml IFN-γ或5µg /毫升酵母聚糖。4天,文化上层清液进行收集和ELISA检测(一)IL-1β,(B)肿瘤坏死因子和(C)il - 10浓度。统计未配对,双尾t、n = 6独立重复实验。不显著(ns);* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * * p < 0.0001。

激活IL-3文化诱发__arg1的频率更高⁺细胞与gm - csf的文化

我们以前的工作表明,暴露在gm - csf 3天“授权”成为抑制单核细胞通过iNOS-induced没有释放。然而,gm - csf就不足以诱导伊诺表达式和第二个一步LPS激活/ IFN-γ其他兴奋剂,需要将这些单核细胞转化为功能性M-MDSC (11)。测试是否IL-3也能够诱导代M-MDSC许可,第三天细胞培养的生长因子与LPS刺激/ IFN-γ或酵母聚糖/ il - 4和评估的胞内伊诺和__arg1表达式。酵母聚糖或il - 4刺激单独显示和非重要水平较低的__arg1 IL-3文化中,因此没有进一步调查(补充图3)。流仪分析显示相似的表型和单核细胞的细胞比例子集后有限合伙人/ IFN-γ和酵母聚糖/ il - 4的刺激而如果文化,但象限控制需要一些调整(图5一个)。与先前的研究一致,伊诺表达式中最小如果IL-3或者在第四天gm - csf文化。然而,IL-3 __arg1文化包含更高的频率⁺后细胞M-MDSC大门内,进一步增加了刺激和保持高于GM-CSF-generated M-MDSC。伊诺表达细胞相似的频率在两种类型的刺激(图5 b;补充图3 b)。刺激后,再次Ly6C^高CD11c⁺双阳性人口显示最强的伊诺和__arg1表达每个细胞,被他们GeoMFI值(图5 c)。只有低水平的__arg1表达观察的单核细胞和MoDC IL-3文化(补充图3 b),基本上没有在巨噬细胞和嗜中性细胞(图5 c;补充图3 b)。因此,正如前面已经发现的gm - csf文化(29日),也包含CD11b IL-3文化⁺CD49a⁺Ly6C^高CD11c⁺细胞代表伊诺⁺__arg1⁺M-MDSC (图5 c)。

图5

图5IL3-MDSC文化诱发高__arg1感应M-MDSC LPS激活后/ IFN-γ。BM细胞培养在gm - csf或IL-3被转移到一个24-well板在第三天,一夜之间刺激与0.1µg /毫升有限合伙人+ 0.01 ng / ml IFN-γ或5µg /毫升酵母聚糖+ 100 u /毫升il - 4或如果。(一)染色流式细胞术例子显示扇形闸门调节单核细胞的细胞(M门)子集的gm - csf或IL-3培养的细胞(如前图2一个)和刺激后第四天。(B)染色流式细胞术例子在第四天显示细胞内的表达伊诺和__arg1 M-MDSC门。文化如果或刺激表示。(C)统计评估伊诺和__arg1 GeoMFI单核细胞的嗜中性细胞gm - csf的子集或IL-3培养BM,有或没有刺激表示。盖茨在图2一个。统计:未配对,单侧t检验比较如果细胞(黑色,只有显著差异表示);或未配对,双尾t检验比较gm - csf和IL-3文化(蓝色、红色),n = 4个独立的实验。不显著(ns);* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。

IL-3培养M-MDSC抑制CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞增殖__arg1活动增加与gm - csf的文化

因为显示大量的__arg1 IL-3文化⁺M-MDSC,我们假设IL-3生成M-MDSC也应该支持Arg1-mediated抑制激活T细胞,而不是或除了伊诺。因此,我们进行了抑制CD4批量脾细胞的分析和评估⁺和CD8⁺T细胞增殖培养3天后。我们的数据表明,CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞增殖抑制了IL-3——或者GM-CSF-generated M-MDSC 1:1和3:1脾细胞(包含响应方T细胞)M-MDSC比率(图6 a, B)。这种抑制是几乎完全恢复在所有条件下伊诺抑制剂L-NMMA被使用的地方。此外,CD4的降级⁺和CD8⁺__arg1抑制T细胞抑制的观察nor-NOHA只有IL-3——但不是GM-CSF-generated M-MDSC在比率(图6 b)。进一步分析表明,CD4的生活频率⁺和CD8⁺细胞减少的IL-3——或者GM-CSF-generated M-MDSC,和活细胞频率恢复只有当伊诺抑制剂L-NMMA使用(图6 a, C)。接下来,我们猜测这是否标志着T细胞抑制T细胞的疲惫。因此,我们分析了一些CD4 T细胞衰竭标志物的表达⁺和CD8⁺T细胞共培养3天后与通用汽车——或IL-3-MDSC。我们的结果显示没有upregulation抑制标记TIM-3 PD-1, LAG-3 TIGIT CD4和CD8 T细胞共培养后与M-MDSC比率(补充图4)。在一起,这些数据表明IL-3-generated __arg1⁺M-MDSC使用__arg1在更大程度上比GM-CSF-generated M-MDSC。然而,这两种生长因子的主要抑制机制仍然iNOS-induced没有分泌抑制剂完全恢复以来在各种比率和对CD4 T细胞增殖⁺和CD8⁺T细胞。抑制T细胞似乎没有疲惫,而是接受细胞死亡。因此,IL-3-generated M-MDSC __arg1表达较高的基线水平,这是进一步上调后M-MDSC激活和相应地扮演也增加了角色作为抑制T细胞增殖的机制。

图6

图6IL-3-generated MDSC显示增加精氨酸酶1-mediated T细胞抑制能力与GM-CSF-generated MDSC散装脾细胞被刺激anti-CD3 / CD28抗体和培养3天的gm - csf或IL-3-generated MDSC表示比率,和有或没有伊诺抑制剂L-NMMA或nor-NOHA Arg-1抑制剂。(一)流式细胞术块代表大部分在第三天的文化刺激脾细胞抗体。控制策略来识别CD4⁺和CD8⁺T细胞。初始控制包括FSC-A / SSC-A和紧身上衣排斥。为B。,live cells were gated as negative for fixable viability dye incorporation. CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞隔离基于他们的表面表达CD4和CD8,分别。为C。,CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞隔离基于他们的表面表达CD4和CD8,分别和活细胞被封闭在每个子集为阴性可以解决的可行性染料公司(B)T细胞增殖是通过流式细胞术和描绘成Ki67的频率⁺在CD4⁺或CD8⁺T细胞的子集。(C)统计内活细胞CD4的频率⁺或CD8⁺T细胞的子集。统计数据进行双向方差分析和图基的文章显示的测试线(黑、蓝、红)之间各自的酒吧,和绿色的比较的脾细胞只与Dunnett后测试(在这里)。n = 3 - 5个独立的实验。不显著(ns);* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。

讨论

在这里,我们描述一个替代方法来生成M-MDSC小鼠BM在体外通过使用生长因子IL-3代替gm - csf。我们的结果表明,gm - csf和IL-3产生表型和功能上高度相似M-MDSC经过3天的文化。这两个因素都是等价的,1)驾驶骨髓祖细胞分化和增殖,2)生成中性粒细胞和单核细胞的细胞子集,3)收益率M-MDSC频率相似,4)表面的细胞因子和趋化因子受体的表达,5)细胞内信号分子的表达,6)伊诺的上调表达有限合伙人/ IFN-γ刺激的反应。IL-3区分他们和gm - csf文化的主要特点1)一个低效率的单核细胞转化为MoDC, 2)较低的细胞因子的生产,3)增加的频率和GeoMFI __arg1有限合伙人/ IFN-γ刺激,和4)增加Arg1-mediated t细胞的抑制能力IL-3 M-MDSC生成。

IL-3和gm - csf受体形成高相似性,作为生长因子信号和功能,赞成但也抗炎细胞因子。因为我们自己的工作和其他出版物描述gm - csf作为强有力的因素促进抗炎MDSC的一代在体外(10,29日,31日)。其他协议提出的il - 6开发MDSC gm - csf的文化在体外(31日)。然而,在这个和另一篇论文(32)可以直接比较显示,而定性而不是定量差异MDSC生成的有或没有il - 6。由于单独使用il - 6没有透露任何MDSC频率增加或允许生成抑制细胞(31日),注射il - 6的抑制性抗体不能减少MDSC频率或CD8的增加⁺T细胞的黑色素瘤模型(32),我们得出结论,gm - csf M-MDSC生成和il - 6的主要驱动力是满足二次增强剂的功能。因此,我们限制我们的协议gm - csf和IL-3的比较。然而,il - 6的角色MDSC代尚不完全清楚,奖励进一步调查。

这里,我们测试了这里IL-3能否发挥相似的分化和功能与gm - csf相比。没有正式的演示,以至于M-MDSC可以由BM IL-3细胞生成在体外。我们的数据显示广泛的表型和功能重叠BM M-MDSC生成两种生长因子。IL-3和gm - csf引发同样的祖细胞扩张和分化成单核细胞的和中性细胞介导的。

在这方面,值得注意的是,在第三天的文化与IL-3中性粒细胞生成可以观察到,gm - csf高度相似的文化。这有点出乎意料IL-3以来历史描述为一个在体外和在活的有机体内生长因子对人类和小鼠嗜碱粒细胞和肥大细胞(23,33,34)。有趣的是,IL-3-deficient老鼠没有显示改变频率的肥大细胞和嗜碱粒细胞,指着另一个生长因子提供他们分化信号在稳定状态(22)。IL-3也不是中性粒细胞的稳态发展所必需的。然而,在疟疾感染,降低中性粒细胞的百分比是诱导比野生型小鼠(35)。这个指向IL-3生长因子,扩展促炎只中性粒细胞炎症条件下。同样,IL-3转基因小鼠显示出高与自身免疫炎性表型和motoneural变性症状(36)。最近的数据表明,在脓毒症小鼠IL-3扩大单核细胞和中性粒细胞,导致炎性细胞因子风暴,特性,没有观察到IL-3-gene老鼠实际上是防止败血症(不足37)。因此,我们为期3天在体外培养法可能反映了紧急骨髓形成IL-3的函数。

IL-3或gm - csf的响应性文化有限合伙人/ IFN-γ刺激相当,并导致等效伊诺归纳。伊诺的表达和随后的版本没有被描述的是最著名的免疫抑制机制M-MDSC (6,8)。我们的研究结果支持我们之前发现CD11b⁺Ly6C⁺CD11c⁺M-MDSC主要伊诺表达细胞gm - csf的子集(11),但也在IL-3文化。这种激活的抑制功能只是完成与IL-3为期3天的启动/许可后,类似与gm - csf,紧随其后的是一个简短的微生物/像之前描述的那样刺激细胞因子(11)。

我们观察到一个较低的转化率的单核细胞进入MoDC IL-3文化。这是在和谐与我们先前的调查结果,8天BM文化与IL-3区分低效率BM-DC与gm - csf作为生长因子(24)。同样,IL-3无法模仿gm - csf产生朗格汉斯细胞从人类血液单核细胞与TGF-β1和delta 1 (38)。然而,M-MDSC的频率在更早的时间点在第三天文化中是等价的。我们没有调查原因在这里,因为我们的关注M-MDSC一代。但是,它很容易推测这可能表明是否M-MDSC发展沿着从单核细胞与MoDC相比单独的发展途径。以前,我们已经表明,古典Ly6C完全分化^高鼠标或CD14⁺人类单核细胞可以直接转化为M-MDSC pre-exposed gm - csf的时候,一个印记,我们称为“单核细胞许可”(11)。此外,池内的BM微分印记的干细胞和祖细胞单核细胞的细胞gm - csf或IL-3可能强加他们的发展方向但不同的区段。较低的细胞因子的生产文化以ELISA与生成的低频率的MoDC IL-3文化。自产生的细胞因子分析通常由大量直流,但M-MDSC显示类似的抑制能力从IL-3和gm - csf的文化,我们没有进一步研究这个问题。

肥大细胞和嗜碱细胞激活是2型免疫反应的典型特征,如感染蠕虫的寄生虫。因此,IL-3,产生的T细胞和嗜碱性粒细胞,也一直与嗜碱性粒细胞和肥大细胞增多症感染(22,39,40)。许多研究支持IL-3-dependent嗜碱细胞激活和释放细胞因子在小鼠过敏模型中,突出的贡献IL-3在过敏性哮喘。嗜碱粒细胞的曝光IL-3可以大大增加组胺和细胞因子释放FcεR交联反应,促进过敏性气道过敏(41)。然而,这促炎作用IL-3也受到挑战,因为在哮喘儿童之间的直接相关性观察血液IL-3水平和改善肺功能,从而支持分辨率哮喘(42)。

也知道IL-3提高il - 4生产从嗜碱粒细胞在寄生虫感染等分泌强烈压抑没有IL-3 (43- - - - - -46)。相对地,il - 4可以调控嗜碱粒细胞IL-3Rα表达式(47),一个双向信号交流的象征。以前的研究结果表明IL-3存在il - 4也作用于人类单核细胞向MoDC指导他们的发展,最终也将通常诱导Th1反应向Th2方向(48)。虽然我们没有进一步的测试是否存在或产生的il - 4细胞类型IL-3文化,这是一个最有可能的场景,在场的几个肥大细胞已经在第三天文化中分泌大量的il - 4,这是缺乏gm - csf的文化。这个活动的il - 4可以解释__arg1表达式中观察到我们的第三天IL-3 BM文化没有刺激。这与先前的报道是一致的,__arg1活动可以刺激小鼠巨噬细胞il - 4和IL-13 (49)。__arg1高表达与2型疾病有关,显示从肺部哮喘动物和人类患者(50)。这是进一步证实哮喘豚鼠动物模型,在应用__arg1抑制剂nor-NOHA完全逆转疾病(51)。此外,__arg1活动增加了Th2细胞因子抑制肺部细菌感染小鼠的免疫力,暗示__arg1封锁作为治疗干预降低哮喘病人肺部感染(52)。

__arg1由MDSC免疫抑制的另一个关键机制,除了伊诺,发挥其耐受性活动通过精氨酸的吸收和分解代谢,从而剥夺了这种氨基酸从环境中,导致T细胞饥饿(3,53)。肿瘤患者和小鼠肿瘤模型的前期研究结果表明Arg1-mediated抑制活动可能主要由G-MDSC施加(54,55),而iNOS-mediated M-MDSC(抑制是一个主要的特点56)。此外,很大程度上独家伊诺的表达或__arg1 M1——或者M2-polarized巨噬细胞,分别为(57),解释了他们共同底物竞争精氨酸(3)。它已经表明,高__arg1表达水平促进的发展弓形虫以超强的竞争力将伊诺在小鼠巨噬细胞的活动,而__arg1删除重新安装伊诺活动和结果在一个更好的生存的老鼠由于一氧化氮增加微生物杀死(58)。虽然替代或中间伊诺⁺__arg1⁺巨噬细胞阶段已确定,尤其是当生成的文化(49),这显然没有M-MDSC解剖。我们的研究结果表明,M-MDSC可以同时生产这两种介质的抑制与LPS激活/ IFN-γ或酵母聚糖/ il - 4。有趣的是,有限合伙人/ IFN-γ刺激M-MDSC调控的主要进气阀打开,然后选择co-induce __arg1,而酵母聚糖/ il - 4的刺激M-MDSC似乎生成两种类型的单个生产者的主要频率之前M-MDSC成为双阳性伊诺和__arg1。后者激活过程中更加突出IL-3文化激活前__arg1更高水平。因此,Arg1-dependent t细胞抑制被生成IL-3 M-MDSC也更高。这些数据清楚地表明,在M-MDSC伊诺和__arg1表达并不排斥。此外,酵母聚糖/ il - 4的刺激可能存在的不同响应细胞子集或先到先得的感应信号通路导致单一酶在第二co-induced前的第一步。然而,这需要更详细的分子分析。

问题依然存在,是否IL-3诱导MDSC肿瘤发展中发挥作用。一般来说,IL-3研究的还不多的肿瘤。升高血清IL-3水平一直在观察结直肠癌患者与健康对照组相比(59)。在小鼠黑色素瘤轴承IL-3报道偏差造血发展走向提供状态随着MDSC频率(27)。

总之,IL-3是一个强有力的因素在体外代M-MDSC从鼠标BM。他们的表型和功能非常类似于gm - csf M-MDSC生成。作为一个主要区别,IL-3生成M-MDSC表达高水平的__arg1第三天的文化与gm - csf M-MDSC相比,这可以进一步上调后刺激而不影响伊诺的水平。__arg1越高表达也反映在其提升功能使用作为T细胞增殖的抑制分子。我们的数据提供了新颖的见解M-MDSC IL-3作为诱导物,这为进一步铺平了道路信号分子的调查,但也对他们的作用在活的有机体内2型过敏等疾病和寄生虫感染。

材料和方法

老鼠

C57BL / 6 j小鼠(Charles River)是在我们的动物饲养设施,保持在特定的无菌条件下,用在一个7 - 12周的时代。动物实验都是根据德国动物保护法律执行和批准后当地政府的控制。

在体外代IL-3和gm - csf MDSC、刺激和祖细胞的增殖测量

MDSC被培养小鼠BM产生新细胞的存在10 ng / ml的重组小鼠gm - csf或IL-3 (Peprotech) 3天。另外,上层清液从gm - csf生产细胞株(29日)使用相同的活动。细胞的浓度镀3 x10⁶细胞/毫升10厘米培养皿(康宁)在10毫升R10中等(500毫升RPMI 1640 (PAA Paching奥地利),heat-inactivated无菌过滤10%胎牛血清(PAA), 100 u /毫升penincillin (PAA), 100μg /毫升链霉素(PAA), 2毫米谷酰胺(PAA) 50 mmβ-mercaptoethanol (Sigma-Adrich))。在第三天,细胞被转移到一个24-well板1 x 10浓度⁶细胞每1毫升的总量,并刺激一夜之间通过有限合伙人(从0.1µg /毫升大肠杆菌、重组小鼠Sigma-Aldrich) + 100 u /毫升IFN-γ(Immunotools)或5µg /毫升(从酵母聚糖酿酒酵母Sigma-Aldrich) + 100 u /毫升重组小鼠il - 4 (Peprotech),或不及时治疗。在第四天,细胞被收集并用于流式细胞术分析。测量的影响生长因子在GMP和MDP祖细胞的增殖,新鲜BM细胞培养3天的10 ng / ml的重组小鼠gm - csf或IL-3。扩散被流式细胞仪测量3天后增殖标记Ki67的频率。

代与IL-3 BM-derived MC

新鲜的BM细胞培养与10 ng / ml IL - 3浓度1 x10⁶细胞/在6-well板总量的6毫升。在第四天,3毫升每口井的上层清液被丢弃,3毫升新鲜R10 IL-3 1%添加喂养。同样的程序在第七天重复。十天后,细胞悬浊液再次清洗和镀IL-3如上所述。在15天,细胞收获,水洗,并通过流式细胞术分析。

流式细胞术

小鼠抗体直接共轭CD11b-PerCP-Cy5.5 / apc / alexa萤石700 (M1/70) CD49a-PE / -PerCP-Cy5.5 (HMα1)CD11c-Pacific蓝/ -PE-Cy7 (N418) Ly6G-Fitc / -PerCP-Cy5.5 -APC-Cy7 (1 a8) Ly6C-Alexa萤石647 / alexa萤石生活488 /紫510 (HK1.4) CXCR4-Pacific蓝色(L276F12) CD4-APC / -PerCP-Cy5.5 /太平洋蓝/ alexa萤石488 (GK1.5) CD8-PerCP-Cy5.5 / apc / alexa萤石488 (53 - 6.7),Ki67-PE (f6) 11日,Sca-1-Brilliant紫510 (D7) c-Kit-PE-Cy7 (2 b8), CD16/32-PerCP-Cy5.5 (93), CD34-APC-Cy7 (HM34) Terr119-Alexa萤石488 (ter - 119), B220-Alexa萤石488 (RA3-6B2) FcεR Iα-Alexa萤石700 (MAR-1) M-CSFR-Biotin (AFS98) Streptavidin-PE都从Biolegend购买。iNOS-PE (CXNFT),精氨酸酶I-APC (A1exF5) pmTOR-eFluor 450 (MRRBY) pAkt-APC (SDRNR) pS6-eFluor 710 (cupk43k)和可以解决的可行性Dye-eFluor 780(# 65 - 0865年)从eBioscience获得。pSTAT1-Aexa萤石647 (pY701), pSTAT3-Alexa萤石(pY705) pSTAT5-Alexa萤石647 (pY694)从BD获得生物科学。IL-3Rα-PE (# 151231), GM-CSFRα-PE (# 698423), CCR2-PE(# 475301)购买了从研发系统。从BD PharMingen IL-4Rα-PE (mIL4R-M1)获得。细胞染色在PBS包含0.1% BSA, 0.1%叠氮化钠,5%胎牛血清在黑暗中30分钟在冰上。胞内伊诺和__arg1检测、细胞第一标签表面标记,然后清洗,随后固定2% PFA在室温下20分钟。细胞然后permeabilized沾烫缓冲区1 x (eBioscience) 1小时在室温下一起marker-specific抗体。样本在烫洗一次缓冲区,在流式细胞仪resuspended缓冲区和用流式细胞仪测量石中剑,LSR II (Becton Dickinson)或调NxT(热费希尔科学)。结果分析与FlowJo软件(树明星)。

Cytospins,细胞染色和显微镜

可视化的粒细胞和单核细胞的细胞形态、IL-3或gm - csf培养BM第三天细胞收集和清洗。允许固定在玻片,5-20x10⁴细胞被存入cytospin钱伯斯和离心机为10 600 rpm最小值后,晾干。最终,幻灯片暴跌在3种不同Diff-Quick解决方案——Diff-Quick修复,Diff-Quick我和Diff-Quick II。最后,幻灯片洗,脱水,PrimoStar合影和Labscope软件(卡尔蔡司,耶拿,德国)。

酶联免疫吸附试验

BM细胞培养与gm - csf或IL-3如上所述,3天之后,他们与LPS刺激+ IFN-γ过夜。4天,文化收集上层清液,IL-1β,TNF和il - 10生产量化了ELISA (Biolegend)根据制造商的指示。

抑制试验

散装脾细胞被镀在浓度为200.000 96 -孔板细胞/在200µl R10和刺激可溶性aCD3 / aCD28抗体的最终浓度2.5µg /毫升。在体外gm - csf或IL-3-generated MDSCs滴定和添加到脾细胞在不同的比率。在细胞培养3天,扩散是通过流式细胞术来衡量的通过Ki67分别检测CD4和CD8-stained T细胞的子集。伊诺抑制剂N^G-Methyl-L-arginine醋酸盐(L-NMMA 500μM MilliporeSigma)和Arginase-I抑制剂Nω-hydroxy-nor-arginine (nor-NOHA 50μg /毫升,开曼群岛化学)被添加到共培养时必需的。

统计数据

创建数据和统计计算使用Excel或棱镜9 (GraphPad软件)项目。细节图传说中提供使用的统计测试,包括学生的t检验和方差分析。P值小于0.05被认为是重要的。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

作者的贡献

AA, SS和MH进行了实验和分析数据。AA和ML设计了实验,准备数据,写论文。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这个工作是通过资金支持德国研究基金会(DFG LU851/18-1)和跨学科的临床研究中心(IZKF - 408)维尔茨堡大学的医学院。这个刊物是支持的开放获取出版基金维尔茨堡大学的。

确认

我们感谢塞布丽娜施耐德专家技术援助和她的管理我们的鼠标的殖民地。我们还要感谢Ribechini艾丽亚娜一直,伊米莉亚Vendelova艾娜娜塔莉埃克特,米里亚姆Campillo普拉多博物馆,和约翰内斯·韦伯的初步工作,为IL-3项目的成功铺平了道路。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1130600/full补充材料

引用

1。Talmadge我Gabrilovich DI。myeloid-derived抑制细胞的历史。Nat牧师癌症(2013)13 (10):739 - 52。doi: 10.1038 / nrc3581