Co-expression Foxp3的Helios促进人类T调节细胞的识别在健康和疾病

介绍

T调节细胞(T_注册维持免疫系统稳态通过抑制传统T细胞的激活和增殖(T_conv)。具体的一员forkhead或飞螺旋转录因子家族。这个基因的突变对人类造成严重的自身免疫性条件被称为免疫失调,polyendocrinopathy,肠下垂,x综合征(即)。研究表明,Foxp3基因的突变与缺乏抑制CD4的函数⁺CD25⁺T_注册。因此,Foxp3的表达是所需的开发和T的函数_注册(1,2)。赫利俄斯,伊卡洛斯基因转录因子家族的一员,也扮演着重要的角色在T的函数_注册(3- - - - - -5)。桑顿et al。(3)表明,~ 70 - 75%的小鼠Foxp3⁺T细胞中的太阳神赫利俄斯是中的更高比例的人类Foxp3的(~ 85 - 90%)⁺T细胞。赫利俄斯的表情似乎与胸腺T的起源_注册当T_注册生成的外围网站(pT_注册)是赫利俄斯^{- - - - - -}。然而,这一结论仍然是有争议的。

Foxp3可能被视为一个T_注册谱系特定转录因子,Foxp3的表达应该是理想的标记来识别和量化T_注册。事实上,老鼠表达荧光探针或人类细胞表面抗原Foxp3启动子的控制下孤立T已被证明是无价的工具_注册大量研究。尽管一些研究表明Foxp3表达的可能是暂时性的激活小鼠T_conv细胞(6),它很难直接演示这个短暂的表达式。人类Foxp3⁺T_注册可以从健康的捐赠者孤立使用结合细胞表面抗原标记(CD25吗^嗨CD127^罗)(7,8)。多个研究表明在体外刺激人类T_conv通过T细胞受体细胞(TCR)导致重大(~ 30%)3天后Foxp3表达文化的感应。这些研究导致假设Foxp3的表达是一个通用的标志T细胞激活在急性或慢性炎症反应,而不是特定于T_注册这意味着它不能被用作T的明确标志_注册在活的有机体内(9- - - - - -12)。

本研究的目标是双重的。首先,我们希望确定感应Foxp3的表达在人类T_conv细胞在自身免疫和炎性疾病可以被记录下来在活的有机体内。其次,我们将地址是否联合Foxp3的表达和赫利俄斯可以用来更精确地识别人类T_注册。我们首先证明Foxp3,但不是赫利俄斯,表情明显调节在人类T的激活_conv在体外。然后我们检查Foxp3的表达和赫利俄斯在活的有机体内使用xenogeneic-GVHD (xeno-GVHD)模型道hPBMCs点头-激活scidIL2Rγ^零(NSG)小鼠(13)。患者T细胞从4个不同的炎症反应在活的有机体内包括镰状细胞病(SCD) (14)、移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮(SLE)和关键COVID-19被研究分析Foxp3和赫利俄斯表达解决这些炎症环境是否促进T Foxp3的表达_conv细胞。

我们的研究结果表明高Foxp3在T和赫利俄斯表达之间的相关性_注册。Foxp3⁺赫利俄斯⁺细胞均匀失败产生2,T的主要属性_注册,而激活CD25⁺Foxp3^{- - - - - -}赫利俄斯^{- - - - - -}细胞产生强劲- 2。Foxp3表达也不是调节在急性或慢性炎症反应。这个结论是基于观察,当Foxp3的百分比⁺在疾病细胞增加,增加赫利俄斯是由一个类似平行的增加⁺T细胞。总的来说,这些发现表明,Foxp3和赫利俄斯的结合使用表达式应该用于识别和量化T_注册在人类和验证T_注册人群中纯度用于收养T_注册免疫疗法。

方法

老鼠

NOD.Cg-Prkdc^scidIL2rg^tm1Wjl/ SzJ (NSG)小鼠(005557杰克逊实验室)。所有的老鼠都6 - 17日周大。动物协议用于本研究NIAID动物保健和使用委员会的批准。

人外周血单核细胞

健康人类捐赠巴菲外套来自美国国立卫生研究院临床中心血库。PBMCs得到患者的机构审查委员会批准的临床试验和SCD (ClinicalTrials.gov NCT03077542),同种异体造血细胞移植(ClinicalTrials.gov NCT03983850, NCT04959175),和系统性红斑狼疮(NIAMS临床协议94 - ar - 0066)。所有的系统性红斑狼疮患者完成修改后的系统性红斑狼疮疾病的标准。红斑狼疮活动记录使用系统性红斑狼疮疾病活动2000指数(SLEDAI-2K)得分。病人样本集合前提供书面同意的合作者。巴菲大衣在PBS稀释,逐渐用移液器吸取Lymphoprep(干细胞的技术),并通过密度梯度离心法分离。

流式细胞术

细胞(2 - 3 x 10⁶)染色。人类BD Fc块(564220)被用来阻止Fc受体。的混合液表面抗体染色以及live-dead染料制备在PBS(英杰公司生活/死可以解决的近红外线死细胞染色设备)。表面染色反应混合液(50μL)被添加到每个样本,他们在黑暗中在室温下孵化30分钟。细胞然后用3%的边后卫在PBS洗两次。细胞内染色在4°C一蹴而就。英杰公司™eBioscience™Foxp3 /转录因子染色缓冲区设置(表达载体,猫50-112-8857)被用来修复和permeabilize细胞。获取样本之前,一个控制是为每个抗体染色流式细胞仪面板通过孵化1滴UltraComp eBeads(表达载体,猫# 50-112-9040)300年μL PBS和0.3μL每个抗体。生活/死染色控制准备使用弧™胺无功补偿珠工具包(表达载体,猫# A10346)。使用流式细胞仪天后补偿矩阵计算(图S1)。细胞获得使用BD交响乐或BD Fortessa。100万事件是获得每个样本。当一个新的实验被进行,同形像控制和Fluorescence-Minus-One (FMO)控制的细胞准备协助控制。一旦获得FlowJo样本分析,事件的分布与同形像和FMO控制确认合适的补偿和控制。对于一些实验中,补偿矩阵调整根据FlowJo控制样品。所有的实验都是封闭的淋巴细胞,单个细胞,活细胞、CD3⁺细胞获得CD4和CD8 T细胞数量。

抗体用于流式细胞术

反CD45 (HI30) anti-mouse /人类赫利俄斯(f6) 22日从BioLegend获得。反CD127 (HIL-7R-M21),反CD3 (UCHT1),反CD4 (SK3),反TNFα(Mab11),反CD25 (M-A251),反IFN-γ(B27),反Granzyme B (GB11),反- 2 (MQ1-17H12),反CD25 (2 a3)反Foxp3 (236 / E7)是来自BD地平线。荧光团所示数据使用。

T细胞激活在体外

PBMCs (2 x10⁶)被镀在2毫升完成RPMI (RPMI 1640媒体与酚红,2毫米谷酰胺,1 x Penicillin-Streptomycin, 10%胎牛血清,1毫米玫瑰在0.85%氯化钠,丙酮酸钠1毫米,1 x非必需氨基酸,1000 x 2-mercaptoethanol 12-well板块或24-well板块。aCD3 / aCD28涂布珠子(Dynabeads™人类T-Activator CD3 / CD28、gibco,裁判:11132 d)在25μL / 1 x10⁶细胞与30 U的重组人类- 2 (TECIN,霍夫曼-罗氏公司Inc .)或可溶性anti-CD3 (OKT3,功能级、eBioscience猫:16-0037-81)在1μg / mL被添加了3天。在一些实验中,三天刺激细胞重振与鸡尾酒刺激蛋白质运输抑制剂(PMA + Ionomycin +高尔基停止;eBioscience细胞刺激鸡尾酒(加上蛋白质运输抑制剂)(500 x,猫:00-4975-93)2小时,以便检测细胞因子的生产。

看不到Xeno-mixed白细胞反应(MLR)所进行的研究培养hPBMCs (0.5 x10⁶)和脾细胞(0.5 x10⁶)从NSG老鼠。天3、5、7,这些细胞被染色并通过流式细胞术分析。

在活的有机体内激活hPBMC NSG的老鼠

hPBMCs (30 x10⁶/鼠标)从3捐助者retro-orbitally注入NSG老鼠以前辐照(150 rad)。5天,11日,14日,19日和27日,脾脏是收获和加工来获取单个细胞悬液。细胞表面和细胞内染色进行如上所述。流式细胞仪的情节都在封闭的生活,人类CD45单线态,淋巴细胞⁺CD3⁺CD4⁺T细胞。一些小鼠腹腔内注射rhIL-2 15天开始连续3天。18天,从所有小鼠脾脏是收获和加工来获取单个细胞悬液。细胞被刺激的2小时刺激鸡尾酒,染色,通过流式细胞术分析。

CITE-seq数据集的分析

单细胞RNA seq PBMCs来自患者感染COVID-19和数据分析了年龄和性别匹配的健康对照组观察细胞是否表达FOXP3基因,IKZF2(编码赫利俄斯)和IL2RA显示T_注册或效应T细胞签名。在最初的研究中,由刘et al。(15),CITE-seq用于概要PBMCs测量188表面标记的表达,B和T细胞受体序列的V (D) J地区和mRNA转录组。细胞与T_注册要分析和T效应签名孤立使用集群、人工注释,刘et al。(描述的控制策略15)。差异表达分析在四个程控病人组亚种群进行。单细胞RNA-Seq数据的可视化和集群都使用了修v4.1.0包(16)R的函数包括FindClusters DimPlot, DotPlot FeaturePlot, RunUMAP,利用非线性降维算法称为均匀歧管近似和投影(UMAP) (17与桅杆)而微分表达式分析(18),或者“基于模型的单细胞转录组的分析”。一个T_注册特征基因集有62个基因(19)提取的最高排名预测基因T_注册状态。

统计分析

流式细胞术分析使用FlowJo 10.8.1软件和分析统计学意义与棱镜9 (GraphPad软件)。一个未配对的学生t测试是用于单一的比较,而双向方差分析与图基的多重比较检验被用于多个比较。被认为具有统计显著性差异,p < 0.05。所有数据显示平均值与标准偏差。

结果

赫利俄斯作为人类Foxp3的标志⁺T_注册细胞

我们以前的研究表明,赫利俄斯被80 - 90%的Foxp3表达⁺人类T细胞和CD4很少⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞(3)。作为Foxp3表达已被证明是调节CD4的激活⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞在体外,我们比较赫利俄斯和Foxp3的表达在体外激活人类PBMC anti-CD3 / CD28涂布珠子和- 2 (图1 a, B)。与upregulation Foxp3的表达,赫利俄斯的表情不是调节CD4细胞被激活⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞。一个T的其他财产_注册是他们无法产生效应细胞因子。重大生产Foxp3的2^{- - - - - -}赫利俄斯^{- - - - - -},但不具体⁺赫利俄斯⁺观察T细胞在体外刺激。激活Foxp3⁺赫利俄斯⁺T_注册也未能产生大量IFNγTNFα或Granzyme B (图S2)。

它仍然可能增加Foxp3的百分比⁺T细胞观察后在体外选择性地扩大T的刺激所代表的人口_注册现在的PBMCs失去了赫利俄斯的表情。为了排除这种可能性,我们CD4排序⁺CD25^{- - - - - -}CD127^嗨细胞,绝大多数是具体的^{- - - - - -}孵化后,培养他们PBMCs它们在细胞跟踪紫(CTV)和刺激他们anti-CD3 (图S3)。后3天的刺激在体外,大部分CD4排序⁺T细胞表达Foxp3,没有表达赫利俄斯,和高百分比表明Foxp3 - 2⁺T细胞中产生文化起源于Foxp3^{- - - - - -}T细胞。这些结果强烈表明co-expression Foxp3和赫利俄斯可用于识别人类T_注册即使在在体外刺激。

应该注意的是,CD8的10 - 40%⁺T细胞表达Helios新鲜孤立健康供者样品和CD8的百分比⁺赫利俄斯⁺T细胞是高度捐助者之间的变量(图S4)。

结合使用Foxp3和赫利俄斯描述T_注册人性化的小鼠

虽然Foxp3表达CD4的多克隆激活后可以方便地调节⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞在体外的upregulation Foxp3表达CD4细胞激活后⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞在活的有机体内目前还不清楚。为了解决这个问题,我们将人类PBMCs诱导xeno-GVHD NSG的老鼠。同时,我们激活PBMCs来自同一个捐赠者与NSG脾细胞在体外模仿的在活的有机体内情况(13)。如下观察,高钙刺激在体外活化的小鼠脾细胞诱导CD25⁺Foxp3⁺T细胞,大多数赫利俄斯^{- - - - - -}(图S5)。

人类PBMCs NSG转移小鼠后,我们观察到CD4的时间感应⁺CD25⁺T细胞(图2 a, B)。CD4⁺CD25⁺人口很容易被分成Foxp3^{- - - - - -}和具体⁺人群。最大扩张的人口被转移后14天之后下降。CD4⁺CD25⁺Foxp3^{- - - - - -}细胞被赫利俄斯^{- - - - - -}和生产- 2,而CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞是赫利俄斯⁺和失败的产生- 2。也观察到当我们类似的结果排序CD4转让⁺CD25^{- - - - - -}CD127^嗨NSG小鼠细胞(图2 c)。4周后转移,没有转移细胞表达Foxp3,大约35% CD25表达,表示2 40%,比例非常低表达了赫利俄斯。

在活的有机体内政府不- 2诱导Foxp3表达人类T_conv

获得的结果之间的电位差在体外和那些获得在活的有机体内是环境在体外研究可能会被视为人工执行的许多实验用多克隆激活anti-CD3耦合到固体表面。为了验证这个假设,我们提高了在活的有机体内激活条件的管理重组hIL-2 NSG老鼠第11 - 15天后PBMC嫁接,激活峰值的计算。注射后2和3 - 2,增强观察CD25表达相比,PBS注入小鼠(图3一;S6)。增强CD25表达CD4也观察到⁺Foxp3⁺赫利俄斯⁺细胞。然而,大多数的细胞CD25增强⁺保持Foxp3表达^{- - - - - -}和赫利俄斯^{- - - - - -}。没有增强Foxp3 +观察细胞(细胞因子的生产图3 b)。我们也净化CD4转让⁺CD25^{- - - - - -}CD127^嗨T细胞NSG老鼠和峰的激活在活的有机体内接种一剂anti-CD3和分析12 h后小鼠脾细胞(图S7)。激活T_conv细胞保持Foxp3^{- - - - - -}和赫利俄斯^{- - - - - -}。

Foxp3的表达和赫利俄斯在炎症和自身免疫性疾病

而人类T细胞的活化xeno-GVHD模型是一个有用的模型,它并没有解决潜在的细胞之间的相互作用激活T细胞和其他细胞数量缺失或出现在非常低的频率(B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、骨髓细胞)在PBMC重组的NSG老鼠和可能发挥作用在upregulation Foxp3表达的T_conv细胞。因此,我们检查了Foxp3和赫利俄斯之间的关系表达式在异构组患者的炎症和自身免疫性疾病。

我们最初对一群SCD患者已被证明有高浓度的T辅助细胞分泌高水平的IFNγ以及其他炎症介质(14)。我们从严重的SCD患者获得PBMCs收集同一性造血细胞移植前(HCT)以及PBMCs从健康的捐赠者。虽然病人和捐助者之间有伟大的可变性,SCD患者CD4的体现更大的激活⁺T细胞比基于高水平的健康的捐赠者IFNγ生产以及更高的CD25表达的趋势(图4模拟)。然而,几乎所有Foxp3⁺病人的T细胞表达赫利俄斯和CD4的很少⁺CD25⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞表达了赫利俄斯。因此,它不太可能,任何具体⁺T细胞是调节Foxp3的激活效应细胞。还应该指出,CD8⁺在这群患者T细胞激活和表达高水平的IFNγgranzyme B相比,健康对照组;CD8没有激活⁺T细胞表达Foxp3 (数字S8A B)。

我们这些研究在CD4 Foxp3表达的潜在感应⁺non-T_注册通过检查一群病人发展中急性移植物抗宿主病或恶性肿瘤表现后慢性移植物抗宿主病的迹象HCT (表1- - - - - -C)。我们观察到的趋势增加CD25的百分比⁺Foxp3⁺T_注册在GVHD病人相比健康的捐赠者。在这两个病人组,几乎所有Foxp3⁺T细胞是赫利俄斯⁺,而很少Foxp3^{- - - - - -}T细胞表达赫利俄斯(图5 a, B)。在移植物抗宿主病,CD4⁺Foxp3^{- - - - - -}T细胞表现出趋势增强的生产(- 2图5 c)。没有观察到Foxp3效应细胞因子的生产⁺赫利俄斯⁺T细胞表明T_注册严重的炎症non-responsiveness不稳定条件下(图5 d)。

减少由CD4 - 2的生产⁺提出了系统性红斑狼疮患者的T细胞(20.,21)作为原因减少数字和T的函数_注册。此外,CD4⁺辅助T据报道活动异常活跃在许多系统性红斑狼疮患者。以决定是否增加CD4⁺在系统性红斑狼疮会导致T细胞激活upregulation non-T Foxp3_注册细胞,我们孤立PBMCs从全血样品获得八个病人在接受治疗系统性红斑狼疮。疾病严重程度,使用SLEDAI-2K测量,广泛从清廉分数(表1)。我们发现CD4⁺从大多数患者T细胞在我们群有更高比例的CD25⁺Foxp3^{- - - - - -}比健康对照组,T细胞CD25的上升趋势⁺Foxp3⁺T细胞相比,控制(图6 a, B)。重要的是,CD25的百分比⁺Foxp3⁺T细胞与赫利俄斯的比例密切相关⁺Foxp3⁺T细胞在每个病人强烈表明海拔Foxp3的百分比⁺T细胞的患者是由于T的扩张_注册而不是通过non-T upregulation Foxp3的表达_注册(图6 c)。我们也观察到CD4⁺Foxp3^{- - - - - -}但不是CD4⁺Foxp3⁺从患者T细胞负责增强和IFNγ- 2的生产。

活动过度的炎症反应,导致大量的促炎细胞因子的释放,被称为“细胞因子风暴”,被描述患者中度到关键COVID-19条件(22)。患者的炎症状态严重COVID-19可能不同于看到的更多的慢性疾病模型研究,我们执行一个新的分析公开scRNA-seq数据(15)。PBMCs从中度患者、严重和关键COVID-19和年龄和性别匹配的健康对照组异形在最初的研究中。我们的分析检查FOXP3的表达是否与案件有关non-T控制状态_注册程序在任何集群的特点是高FOXP3 IKZF2表达式。我们re-clustered CD4⁺T细胞的患者和健康对照组(集群6图7)来识别具体⁺细胞群进行后续分析。其余集群CD4细胞组成⁺T细胞亚型包括亚群,天真的CD4细胞⁺T细胞和它们之间没有明确的分离效应记忆细胞对集群身份UMAP空间。集群外的人群6已经大体特征刘等人,只专注于这FOXP3我们的分析⁺IKZF2⁺集群。而这两个基因的表达和IL2RA主要是局限于集群6,图7 bIL2表达式表明,只有检测到可以忽略的水平高吞吐量的10倍基因组单细胞分析的集群。细胞表达基因的检测率(百分比),FOXP3 IKZF2和IL2RA集群除了T_注册集群集群(6)0%左右,这些基因之间的差异表达两组病人在T_conv(数据没有显示)。此外,使用线性回归,我们建模FOXP3的表达在集群6的表达水平T的函数_注册从文学特征基因(19),年龄、性别、批处理和定义的细胞群的身份结合病人状态(HC / COVID)和细胞类型(T_注册/ non-T_注册)。FOXP3表达与non-T无关_注册-COVID状态(p值> 0.65),表明FOXP3 non-T并非异常中_注册的条件下的细胞群健壮的炎症患者重症COVID-19 (表S1)。这个观察强烈表明Foxp3不是non-T异常调节的_注册条件下的炎症与COVID-19重症患者。

讨论

T的发现_{海军学校规则}独特,抑制人口的特征表达CD25和Foxp3在老鼠和人类相似的表型和功能,在定义缺陷引起了极大的兴趣在这些细胞的数量和功能在人类自身免疫性疾病。当时出现的主要问题是如何最好地描述和隔离这种独特的人口。Foxp3的可用性单克隆抗体,可用于细胞内染色似乎提供了一个T的主要工具_注册鉴定。然而,它很快证明人类T的刺激_conv在细胞培养中细胞通过细胞信号诱导Foxp3的表达,虽然这些细胞缺乏抑制函数(9- - - - - -12)。的在体外发现与人类T_conv细胞利用Foxp3 T表示担忧_注册标记在人类尤其是患者炎症条件。几项研究(7,8)表明CD25的结合使用^嗨和CD127^罗作为代理标记可以促进Foxp3的高纯度人群的隔离⁺T细胞从正常献血者。然而,该协议定义T的应用_注册在炎症条件下有限表达CD25是调节CD4 T细胞与细胞受体激活所有当CD127的表达下调。因此,我们能够准确地定义人类T_注册仍然是具有挑战性的。其他方法来确定T_注册使用(例:CD4细胞表面标记的组合⁺CD25⁺CD226^{- - - - - -}),但仅在一定程度上取得了成功(23)。

我们利用转录因子一起Helios Foxp3的表达作为一种替代方法,准确地识别大多数人类T_注册。赫利俄斯最初表现为鼠标Foxp3的70 - 75%⁺T细胞也赫利俄斯⁺。我们最初建议胸腺T_注册(tT_注册)是赫利俄斯⁺而T_注册生成的外围(pT_注册)从T_conv细胞被赫利俄斯^{- - - - - -}(3)。Helios在小鼠T的函数_注册仍然有争议,一些研究表明它是在成熟幼稚T生存所需_注册效应T_注册(4),而其他的研究表明它可能参与反应- 2 (24)。在人类外周血,Foxp3的85 - 90%⁺T细胞中的赫利俄斯使用一个人类Helios anti-mouse Helios单克隆抗体的交叉作用。人类T的进一步描述_注册证明了Foxp3⁺赫利俄斯⁺人口已经完全脱甲基的T_注册您脱甲基区域(TSDR),而TSDR Foxp3⁺赫利俄斯^{- - - - - -}细胞只有50%脱甲基符合pT_注册来源(25)。研究人类T_注册林et al。(26)长期(> 13天)后细胞培养在体外在炎症条件下证明了赫利俄斯表达不需要T_注册稳定,但目前尚不清楚这些结果适用在活的有机体内。然而,林et al。(26)同意本文提供的数据,测量Helios结合Foxp3表达是一个宝贵的人类T的表征_注册。此外,大多数的T_注册能产生低水平的效应细胞因子被发现Foxp3⁺赫利俄斯^{- - - - - -}人口也符合一个不太稳定的T_注册表型和pT_注册来源。我们有限的研究报告中具体的分析⁺赫利俄斯⁺CD4⁺T细胞。

一个关键问题是赫利俄斯表达是否可以调节激活人类T_conv细胞同样Foxp3。与小鼠T_conv细胞,赫利俄斯的重要表达可以诱导T细胞激活的_conv细胞在活的有机体内,我们没有观察到Helios表达在人类T_conv细胞后细胞激活后多克隆激活和anti-CD3 anti-CD28 xeno-MLR或刺激在体外。一个变量的百分比CD8人类和老鼠⁺T细胞可以表达赫利俄斯,还需要进一步的研究来确定在CD8 Helios表达的意义⁺T细胞。

有待解决的一个问题就是为什么人类T_conv细胞移植Foxp3在激活在体外,而鼠标激活T_conv细胞保持Foxp3^{- - - - - -}。负责感应Foxp3表达的主要因素在体外TGFβ。之前我们已经表明,在激活期间添加anti-TGFβ人类T_conv细胞在体外减少了upregulation Foxp3表达的90% (11)。因此,看来人类T_conv细胞对外源性更加敏感TGFβ胎牛血清中用于补充媒体文化。其他区别人类和小鼠的反应T_convTGFβ是鼠标T_conv细胞诱导表达Foxp3在TGFβ(它_注册)有许多功能性质的tT_{海军学校规则}并表现出抑制作用在活的有机体内和在体外,尽管他们做展览Foxp3表达的稳定性下降。相比之下,人类T_conv细胞诱导表达Foxp3在TGFβ面前,产生和缺乏- 2抑制功能在体外。还需要进一步的研究来解决这些根本性的差异。

我们第一次验证的结合使用Foxp3和赫利俄斯表达了人类T的识别_注册。多克隆激活人类T_conv导致upregulation Foxp3的表达水平如果Foxp3类似发现⁺T_注册。相比之下,没有upregulation赫利俄斯在纯化T的文化_conv或者如果人类PBMCs。也观察到类似的结果xeno-MLR文化。测试是否激活人类T_conv导致upregulation Foxp3的表达在活的有机体内,我们首先利用xeno-GVHD模型。NSG老鼠灌输hPBMCs转移到免疫功能不全的,但经过一段几周mouse-specific抗原识别,成为激活,最终诱发系统性xeno-GVHD接受次要的死亡。扩张和激活的T_conv感应化验的CD25表达总是观察两周后转让,但没有观察到感应Foxp3的表达即使在激活T细胞CD25表达的最高水平。Foxp3⁺T_注册暂时还扩大了赫利俄斯在这个模型中,近100%⁺。

而人性化的小鼠的研究表明T的失败_conv上调Foxp3,这个模型并不完全模拟人类T细胞的活化在活的有机体内作为唯一的人类细胞的NSG小鼠的T细胞成功地灌输。其他人类细胞类型或产品可能需要上调Foxp3表达在人类T_conv。因此,我们研究T_注册在患者的外周血系统性炎症的表现包括SCD (14)、急性和慢性移植物抗宿主病和系统性红斑狼疮。我们观察到海拔在T的百分比_注册在外周血和CD4的增强的百分比⁺Foxp3^{- - - - - -}CD25⁺T细胞。我们还研究了单个细胞RNA-seq分析一群急性炎症患者继发于严重或关键COVID-19 (15)。流式细胞术并不表现在这项研究中,但检查Foxp3在分子水平证明和赫利俄斯表达一个完整的细胞表达Foxp3赫利俄斯和其他T之间的相关性_注册签名的基因。Foxp3表达和赫利俄斯没有在任何细胞因子产生的子集激活T细胞。我们认识到,只有一小群每个疾病患者仅限于PBMCs进行了研究和分析。还可能与其他疾病患者不同的临床过程或可能出现的Helios upregulation缺乏Foxp3的表达。相反,作为一个具体的小百分比(10 - 15%)⁺赫利俄斯^{- - - - - -}T细胞在正常PBMC,可以找到某些炎症条件下仍有可能在活的有机体内,可以观察一个扩张的人口。这个人口必须区别未能产生出2效应T细胞。

总之,我们的在活的有机体内在人性化的小鼠和病人的研究表明,Foxp3表达不是调节人类T_conv当各种炎症条件下被激活。因此,独自Foxp3的表达可以作为善意的标志T_注册在活的有机体内。然而,当我们没有执行一个详尽的研究广泛的自身免疫和炎症性疾病,我们建议染色赫利俄斯被用于结合Foxp3 Foxp3染色证实⁺T细胞是真实的T_注册。此外,Foxp3的组合和赫利俄斯,应该强制T的量化_注册已经扩大了在体外用于细胞生物疗法或CAR-T的生产_注册(27)。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和批准NIAMS和NCI的机构审查委员会。患者/参与者提供了他们的书面知情同意停止参加本研究。

作者的贡献

贡献:MB和ES的设计研究和写的手稿;LM和乔丹做实验和写的手稿;AG)、CF、CK提供患者样本,对稿件;分析数据和写手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这些研究都支持的部门内部的国家过敏症和传染病研究所的研究,关节炎和肌肉骨骼和皮肤疾病研究所国家心脏,肺和血液研究所,美国国家癌症研究所。

确认

我们感谢NIAID排序的核心设施,国家卫生研究院临床中心血库,NIH动物设施建设50,Zerai吗哪和博士一Hasni (NIAMS)对他们有用的帮助。

的利益冲突

MB是受雇于公司詹森药品。AG是受雇于公司Miltenyi生物技术。公司是受雇于轴信息。无关的研究手稿在Shevach实验室(LM、乔丹、ES、MB)支持由詹森crada制药和勃林格殷格翰集团制药。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1114780/full补充材料

引用