DRB3 * 011:01-restricted CD4的识别⁺对牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白T细胞反应

介绍

人类呼吸道合胞体病毒(HRSV)是全球婴幼儿呼吸道疾病的一个重要原因,估计感染几乎所有孩子两岁(1,2)。据估计,在世界范围内,HRSV负责住院的320万名儿童(3)和死亡之间66000 - 199000 5岁以下儿童,许多在发展中国家(4)。此外,严重的感染HRSV在头两年的生活已经与严重哮喘的发展(5,6)。再感染与HRSV越来越被认为是严重的呼吸道疾病和住院的主要原因在老年人和那些有潜在疾病(7,8)。目前,单克隆抗体是唯一治疗HRSV感染引起的呼吸道疾病,因为没有许可疫苗和开发安全、有效的疫苗HRSV已经阻碍了部分由于缺乏动物模型能够全面概括疾病和感染的免疫反应(9)。

HRSV和牛呼吸道合胞体病毒密切相关(BRSV),也被称为人类orthopneumovirus和牛orthopneumovirus分别结合metapneumovirus组成家庭Pneumoviridae (10,11)。HRSV和BRSV单链,负面意义RNA基因组约15.2 kb和编码11蛋白(12,13)。BRSV是一个重要的呼吸道病原体的奶制品和牛肉牛和牛呼吸道疾病的病原体。的流行病学BRSV HRSV相似,它会导致高发病率呼吸道疾病的暴发年轻、天真的人群。BRSV是已知会导致动物疫情影响超过50%的奶制品和牛肉群(14)与血清反应阳性的比例随着年龄增加70%的成年牛(15- - - - - -17)。BRSV感染的临床病程小牛非常类似于观察与起始HRSV感染人类上呼吸道感染发生的上皮和随后蔓延到下呼吸道(18,19)。免疫反应在小牛BRSV特点是T细胞的招募与M2呼吸道,F, G, N蛋白特异性CD8⁺T细胞显著(20.- - - - - -22),类似于人类T细胞反应HRSV感染(23,24)。此外,BRSV感染小牛偏见向th2型细胞因子反应,类似于人类的反应,被认为使牛易患过敏性疾病(25)。

抗原CD4⁺T细胞反应是免疫力的关键病毒性和细菌性病原体和占主导地位的全面理解T细胞抗原表位对理性的疫苗设计至关重要。类主要组织相容性复合体II (MHC II级)分子,编码的抗原呈递细胞(apc),结合和现在加工pathogen-derived肽被T细胞受体(TCR) CD4细胞表面分子表达⁺T细胞和承认peptide-MHC二类复合物通过T细胞受体启动多个信号级联导致抗原特异性体液免疫反应(26)。人类基因组编码三个高度多态类MHC II基因位点,HLA-DR dp, dq,而牛的基因(牛)编码两个MHC II级蛋白,牛白细胞抗原和DQ博士(流星锤)。DR位点由一个半径标注与DRB3基因和三个DRB基因是唯一功能基因,基因复制数量增加了DQA中和DQB等位基因(图27- - - - - -29日)。应对缺乏功能性MHC II级基因编码在牛基因组中,大多数的等位基因多样性牛是通过高水平的遗传多态性,尤其是DRB3基因(29日,30.)。此外,intra-haplotype和inter-haplotype配对的DQ分子进一步增加潜在的MHC II类曲目牛(27,28)。多样性的重要性在MHC II级位点由微分CD4牛了⁺T细胞抗原表位的反应来自普通牛病原体,在特定的博士或DQ等位基因与中介的一个强大的免疫反应(31日- - - - - -34)。

RSV F蛋白是一种我积分膜糖蛋白负责调停膜融合病毒和宿主细胞膜所需的启动感染(35,36)。中和抗体抗原表位已确定在F蛋白三聚物与抗体结合位点II,第四,Θ中和抗体的重要目标(37- - - - - -39)。BRSV和HRSV F蛋白高度同源,分享81%的氨基酸序列(40),将各自的F蛋白亚基疫苗目前正在开发用于牛和人(41- - - - - -44)。辅助T细胞反应的发展是至关重要的抗体反应后接种疫苗或感染,很少有研究发现allele-restricted CD4⁺T细胞抗原表位BRSV和HRSV (F蛋白的45- - - - - -48)。

这个本研究的目的是确定CD4的小说⁺T细胞抗原表位出现在F蛋白类型的应变brsv - 375。外周血单核细胞(PBMCs)是独立于历史的奶牛BRSV F蛋白通过接种疫苗。CD4⁺T细胞激活是由interferon-γ评估(IFN-γ)后生产的合成肽MHC II级定义的抗原呈递细胞。在实验中利用自体和人工生成的装甲运兵车使转染人类胚胎肾293 (hek - 293)细胞与质粒编码流星锤半径标注,DRB3, CD80分子我们确定了DRB3 * 011:01抗原决定基并定义了最小肽长度限制。一种改进的CD4的理解⁺T细胞抗原表位,其等位基因的限制,目前在BRSV F蛋白将增强细胞反应的理解RSV疫苗在牛和人类。

材料和方法

牛和MHC等位基因的确定

按照美国农业部动物研究进行国家动物疾病中心动物保健和使用协议。女性荷斯坦奶牛黑白花奶牛每年接种疫苗开始在1岁Vira盾6 (Elanco动物健康,印第安纳波利斯,美国)包括一个BRSV组件。大约3毫升的血液收集牛颈静脉的成真空采血管EDTA管(Beckton迪金森,富兰克林湖,新泽西,美国)。使用QIAamp DNA基因组DNA分离血液迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示。DRB3等位基因的基因分型通过序列类型(Sanger测序)利用先前所描述的方法(49,50)和限制性片段长度多态性(RFLP)所描述的范Eijk et al。(30.)。

肽库

肽设计被告知通过识别F蛋白之间的同源多肽序列HRSV和BRSV导致同源BRSV肽序列的识别为每个前所述HRSV抗原决定基(46,51- - - - - -54)。NetMHCpan (www.cbs.dtu.dk /服务/ NetMHCpan)服务器(55)和NetBoLAIIpan服务器(www.cbs.dtu.dk /服务/ NetBoLAIIpan)(56)被用来预测抗原表位的绑定到特定的二类流星锤的等位基因。肽预测结合流星锤二类等位基因与高亲和力(< 500海里)。11-mer肽,十米级重叠(表1)和c端截短肽(表2)被命令从Mimotopes(维多利亚,澳大利亚)。15 - m抗议肽用于人工抗原呈递细胞(aAPC)研究设计充分利用长度brsv - 375蛋白质和被Vivitide合成(加德纳,MA)。肽被稀释的浓度为2.5毫米在二甲亚砜(美国微孔σ,伯灵顿,MA)和存储在-20°C到使用。

PBMC隔离和CD4⁺T细胞浓缩

颈静脉的外周血收集成人Holstein-Friesian牛到柠檬酸2 x酸葡萄糖的缓冲。PBMCs孤立使用SepMate-50管预装15毫升Lymphoprep(干细胞技术,温哥华,不列颠哥伦比亚,加拿大)根据制造商的指示。污染红细胞被使用一个低渗的裂解缓冲。在完整细胞resuspended RPMI (cRMPI) (ThermoFisher沃尔瑟姆,妈,美国)补充10%胎牛血清,不必要的氨基酸,必需氨基酸,丙酮酸钠,2-mercaptoethanol,青霉素和链霉素。单核细胞与淋巴细胞分离的依从性在100毫米组织培养皿37°C, 5%的公司₂为2小时。CD4的积极选择⁺T细胞是由磁珠隔离使用鼠标anti-bovine CD4单克隆抗体(IgG1克隆CACT138A Bio-Rad、大力神、钙、美国)结合anti-mouse免疫球蛋白微和mac LS列(Miltenyi研究,盖瑟斯堡,医学博士,美国)根据制造商的指示。丰富CD4⁺T细胞悬浮液在resuspended 4 x10⁶细胞在cRPMI /毫升。CD4⁺T细胞悬浮液后被发现超过90%纯流仪分析。细胞悬浊液贴上同一个鼠标anti-bovine CD4单克隆抗体如上其次是山羊anti-mouse IgG1-AlexaFluor 488然后分析流式细胞仪交响乐定制流式细胞分析仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。

一代的人类胚胎肾HEK -293人工抗原呈递细胞(aAPCs)

牛半径标注、DRB3 CD80基因克隆到哺乳动物表达质粒pcDNA4 / myc-His-C (ThermoFisher沃尔瑟姆,妈,美国)通过吉布森装配主混合(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)根据制造商的指示。RNA被隔离使用试剂盒从PBMCs RNeasy工具包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指令。互补脱氧核糖核酸生产使用SuperScriptIII逆转录酶和益生元dT底漆(美国ThermoFisher沃尔瑟姆,MA)。插入和质粒混合使用Q5高保真放大2 x大师(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)与基因特定的引物补充表1和用于将全球化学主管大肠杆菌(美国ThermoFisher沃尔瑟姆,MA)。殖民地被Sanger测序筛选和T7启动子引物和使用BGH反向引物。积极的殖民地培养过夜磅媒体,100μg /毫升羧苄青霉素和质粒分离使用ZymoPURE II质粒midiprep工具包(Zymo研究、欧文、钙、美国)。

生成人工抗原呈递细胞,hek - 293细胞转染与BoLA-DRA (NCBI基因ID 506214), BoLA-DRB3 (NCBI基因ID 282530),和牛CD80 (NCBI基因ID 407131)质粒编码和选择抗生素。hek - 293细胞从美国获得类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和完整的鹰的最低基本培养基培养(EMEM)(美国马ThermoFisher,沃尔瑟姆)补充与抗生素/抗真菌的解决方案(美国ThermoFisher沃尔瑟姆,MA)和10%的胎牛血清。在转染前1 x10⁶细胞被播种在每个6-well板和培养在一夜之间在37°C, 5%的公司₂。只是在转染前,媒体被删除,取而代之的是增长1毫升新鲜EMEM完成。转染进行使用Lipofectamine 2000(美国马ThermoFisher,沃尔瑟姆)根据制造商的指示与1μg每个质粒。转染后的一天,媒体被删除,取而代之的是完成EMEM包含400μg /毫升zeocin(美国ThermoFisher沃尔瑟姆,MA)。获得同质人口co-transfected细胞,单个细胞进行排序使用FACSAria融合细胞分选仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。转染细胞被贴上anti-BoLA DR-RPE,克隆CC108(美国Bio-Rad大力神,CA)和anti-CD80-FITC克隆IL-A159 (Bio-Rad、大力神、钙、美国)。双阳性细胞分为96 -孔板和转移到更大的玻璃瓶一旦融合达到90%。使用前确认转基因表达抗原表示化验、转染HEK 293细胞标记如上所述和分析在流式细胞仪的交响乐定制流式细胞分析仪。数据分析使用Flow-Jo软件(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。

酶联免疫吸附点分析

Peptide-specific CD4⁺T细胞被评估量化IFN-γ分泌有关酶联免疫斑点试验的。一天前,96 -多屏幕过滤板(美国马MilliporeSigma,伯灵顿)涂上鼠标anti-bovine IFN-γ抗体(美国Bio-Rad大力神,CA)一夜之间在4°C。两个小时前的细胞,PBS的盘子洗了6次,0.05% Tween-20 (PBST)和阻塞与cRPMI 37°C。阻塞后一步,盘子洗了PBST和100年μl细胞悬液(1 x10⁵CD4⁺细胞/ 2 x10⁴APC /)添加到井。细胞被刺激100年μl解决方案包含肽(最终浓度20μm)或PHA(最终浓度5μg /毫升)在cRPMI稀释。阻断实验anti-bovine MHC II级单克隆抗体克隆TH14B博士anti-bovine MHC II级DQ单克隆抗体克隆TH81B preincubated有贴壁细胞(2小时)或aAPCs(20分钟)前和纯化CD4孵化⁺T细胞。Anti-bovine il - 4单克隆抗体克隆CC303 (Bio-Rad、大力神、钙、美国)或IgG2单克隆抗体克隆COLIS205c(华盛顿州立大学单克隆抗体中心、铂尔曼、佤邦,美国)被用作控制同形像。抗体的浓度被稀释16和160μg /毫升之前与装甲运兵车孵化;最后anti-DR和anti-DQ抗体的浓度分别为0.8μg /毫升和8μg /毫升和控制抗体0.8μg /毫升。盘子被孵化20小时37°C, 5%的公司₂。孵化后盘子洗了PBST然后用鼠标孵化anti-bovine IFN-γ克隆CC302(美国Bio-Rad大力神,CA)在PBS 5μg /毫升1% BSA 2小时37°C。盘子然后洗PBST和染色使用100μl向量ABC美联社标准(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)在室温下45分钟紧随其后50μl向量蓝色美联社衬底三世在室温下30分钟。盘子洗2 x 300μl蒸馏水和允许干燥前一夜可视化ImmunoSpot分析仪(蜂窝技术有限,克利夫兰,哦,美国)。

统计分析

每个组的平均值进行了分析使用单向方差分析测试与多个比较或Mann-Whitney非参数测试。在这之前,正常测试(Anderson-Darling达&皮尔森,Shapiro-Wilk Kolmogorov-Smirnov)进行,数据不是正态分布。差异被认为是重要的,当P值< 0.05。数据分析与GraphPad棱镜9(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。

结果

基因型和疫苗接种奶牛的历史

确定具体BoLA-DRB3等位基因的存在USDA-ARS NADC奶牛,桑格测序和RFLP分析进行从全血中提取基因组DNA。总共18 Holstein-Friesian牛筛选和10个不同DRB3等位基因被确定(表3),先前报道Immunopolymorphism数据库(57)。最高的等位基因检测频率* 011:01动物(n = 7)其次是* 015:01动物(n = 6)和* 014:01:01 (n = 4动物)。所有的动物都收到多个商业BRSV剂量的疫苗。剂量收到的数量随接收至少3 ~ 78% (14/18)。

DRB3 * 011:01礼物合成肽生成BRSV F蛋白区域249 - 296 AA

评估潜在的T细胞抗原表位的位置BRSV F蛋白,一个重叠的肽,图书馆有十米级重叠,设计专注于三个区域所示的完整的蛋白质高同源性地区的港口HRSV F蛋白T细胞抗原表位。肽的三套,第8 - 11 88肽长度从氨基酸,与三个区域(84 - 118、249 - 296和32 - 65)BRSV F蛋白的氨基酸序列(表1)。Peptide-specific CD4⁺T细胞反应进行评估通过IFN-γ有关酶联免疫斑点试验生产。只有CD4⁺T细胞分离牛窝藏DRB3 * 011:01等位基因(1141、1310、2938、2942)回应刺激BRSV F蛋白肽虽然没有反应是细胞中观察到来自牛缺乏DRB3 * 011:01等位基因(数据没有显示)。有趣的是,只有来自BRSV F蛋白肽区域跨越AA 249 - 296产生可衡量的反应。总共5个35肽组2从细胞能诱导IFN-γ隔绝DRB3 * 011:01牛(图1)。最强大的T细胞反应的观察与肽刺激后38 (SLINDMPITND)和39 (LINDMPITNDQ)水平略有减少的T细胞反应观察对肽37 (LSLINDMPITN)和40 (INDMPITNDQK)。相比之下,dimished回应肽31 (LTNSELLSLIN),肽37岁和40相比,观察而刺激肽41 (NDMPITNDQKK)未能引起探测响应。最健壮的CD4的反应是观察⁺T细胞来自奶牛1141和2942后跟2938;而牛1310显示类似的反应模式,反应的强度一直低于其他三个。在一起,这些结果CD4确定一个小说⁺T细胞表位的BRSV F蛋白仅限于DRB3 * 011:01并开始定义核心抗原决定基序列。

有趣的是,T细胞反应的大小与每个牛(疫苗接种的历史表3)。最健壮的T细胞反应观察DRB3 * 011:01积极牛接受超过3年度疫苗(1141,1310,2938,2942)。此外,反应评分最高的T细胞反应被发现从1141年牛收到10剂每年疫苗和牛2942头,接受5剂量。从牛1310年和2938年,T细胞反应,收到4和5剂,分别减少而减少观察奶牛1141年和2942年。相比之下,牛,收到了3个或更少的年度疫苗剂量T细胞反应大大降低(1503)或检测不到(1613)。这些数据表明重复BRSV具体增加CD4免疫是相互关联的⁺T细胞反应,存在一个阈值所需的剂量检测T细胞水平。

DRB3 * 011:01礼物肽的核心序列INDMPITND BRSV F蛋白T细胞抗原表位

进一步定义DRB3 * 011:01-restricted抗原决定基核心序列和最小长度的c端截短肽库为中心的区域BRSV F蛋白,LINDMPITNDQK,用于抗原表达分析。截短肽库是由肽长度从7-mer 12-mer (表2)。评估等位限制和肽长度的影响,CD4细胞⁺T细胞从六个DRB3 * 011:01积极的牛1141,1310,1503,2938,2942 (图2)是刺激与单个截短肽的肽库。最健壮的T细胞反应观察肽长度从10到12不等残留。类似水平的T细胞反应后观察刺激与氨基端亮氨酸和异亮氨酸(肽1 - 3和6 - 8)。去除糖基的肽的氨基酸残基的核心序列依赖的减少导致T细胞刺激。删除c端天冬氨酸残基的肽3和8显著降低IFN-γ如下观察刺激的感应与肽4和9。动物观察到以前,1141年和2942年显示最大响应所有DRB3 * 011:01牛测试,虽然没有反应是观察从1613年开始,可能是因为这头牛只接收一个剂量的疫苗。

确保肽刺激是介导通过MHC II级,阻断实验自体装甲运兵车被孵化与抗体博士流星锤或DQ与CD4分子孵化之前⁺T细胞和刺激肽进行(图3一)。抗原呈递细胞从动物1142年、1310年、2938年和2942年显示类似水平的刺激与媒体,预处理后的anti-BoLA-DQ抗体,TH81A或同形像控制抗体。相比之下,显著减少观察T细胞刺激装甲运兵车anti-DR抗体孵育时,TH14B,治疗前肽。作为初始阻塞实验利用腹水,抗体与G蛋白纯化,纯化抗体用于后续阻断实验(图3 b)。没有观察到降低T细胞刺激装甲运兵车孵化时用纯化anti-DQ抗体相比,媒体只和同形像控制。相反,预处理的装甲运兵车纯化anti-DR抗体明显减少了CD4的刺激⁺T细胞。一起这些结果显示分子MHC II级博士负责调停表示特定CD4 BRSV F蛋白的肽⁺T细胞。

DRB3 * 011:01人工装甲运兵车给F蛋白肽INDMPITND核心序列

测试附加BoLA-DR等位基因BRSV F蛋白肽的演讲中,aAPCs被使转染生成hek - 293细胞与质粒编码四个不同BoLA-DR分子共同NADC奶牛和牛CD80。单细胞排序和克隆扩张后,hek - 293细胞每个BoLA-DRB3等位基因共同表达,* 001:01,* 011:01,* 012:01,和* 014:01:01 CD80通过流式细胞术进行评估。对于每个aAPC线,博士的比例和CD80共同表达细胞大于90% (补充图1)。一个15 - m抗议肽库计算预测结合每个克隆BoLA-DR等位基因合成和抗原表达研究中使用(表4)。至少两个肽反应预测克隆等位基因合成与每个围绕9 mer核心序列。核心序列(INDMPITND)肽3、4、5所示是由DRB3 * 011:01抗原表达的关键分子正如前面所示图2。人工装甲运兵车被装载的每个七肽和评估的能力刺激CD4 BoLA-DR匹配⁺T细胞(图4)。只有肽预测结合DRB3 * 011:01观察诱导响应与自体T细胞培养时(图4 b)。确保二级分子负责调节T细胞激活,我们预处理的人工装甲运兵车anti-DR抗体TH14B肽之前加载。所示图5,显著减少刺激T细胞在细胞与抗体相比,预处理的未经处理的细胞。这些结果证实CD4 BRSV F蛋白的存在⁺T细胞表位,包括核心INDMPINTND序列。此外,这种抗原决定基限制DRB3 * 011:01等位基因的表达。

讨论

新颖的设计和改进疫苗平台和传统策略对病原体,灭活疫苗未能获得许可需要全面的功能性知识对一个特定的病原体的免疫反应和疫苗抗原。呼吸道病毒疫苗开发,目的是诱导中和抗体从而防止感染和导致快速清除病毒颗粒。在1960年代,临床试验使用formalin-inactivated whole-virion HRSV疫苗失败后vaccine-enhanced儿童疾病(58)。观察到增强的疾病现在已知由免疫复合物沉积和补体的激活导致糟糕的生产中和抗体(59- - - - - -61年和Th2免疫反应的诱导62年)。最近RSV疫苗开发工作集中在F中和抗体蛋白,因为它是一个主要的目标与结果1期临床试验使用十二构象稳定F蛋白,DS-Cav1,显示增加的中和抗体滴度在人类志愿者(63年)。中和抗体滴度,诱导接种疫苗或自然感染后,合同随时间变化,因此测量大小和长寿的T细胞反应的病原体是衡量疫苗诱导的免疫原性和寿命的关键反应。

这项研究是第一个CD4地图⁺T细胞抗原表位的F蛋白北美BRSV隔离,BRSV 375。这些研究IFN-γ分泌CD4的数量⁺T细胞是量化后刺激自体或人工合成肽抗原呈递细胞含有有关酶联免疫斑点试验在一个。PBMCs从牛决心积极之前几个BoLA-DRB3等位基因显示响应特定抗原表位的其他疾病牛,即DRB3 * 011:01, * 012:01, * 015:01等位基因(表3)(33,64年)。初步研究发现,只有细胞DRB3 * 011:01牛回应刺激与重叠肽库(数据未显示)。这些结果与之前是一致的抗原决定基映射研究DRB3 * 011:01等位基因已被证明从形形色色的牛容易出现肽病原体包括口蹄疫病毒(65年)和血液寄生虫红孢子虫属边际(28,33,64年)。最近,流星锤二类DRB3 * 009:02等位基因已被证明是显著相关的检测水平牛白血病病毒前病毒的负载在牛表明抗原表示通过等位基因中心发展的一种有效的免疫反应对牛白血病病毒(34,66年),进一步强调特定的流星锤类II等位基因的重要性在防止病毒感染。随着DRB3 * 011:01等位基因能够展示肽从形形色色的病原体,它将感兴趣的研究概况以及抗体的临床结果这些牛BRSV后感染。进一步,研究解决T细胞受体曲目可能阐明抗原决定基的使用,因为这很可能是受MHC II级单体型的影响。

在这项研究中,一个先前不为人知的CD4细胞⁺T细胞表位的BRSV F蛋白被发现。抗原决定基INDMPITND的核心序列和氨基酸261到269。这个序列是守恒的北美模式菌株之间BRSV 375和欧洲模式菌株BSRV斯努克(数据未显示)以及目前在HRSV A和B亚型F蛋白(67年)。有趣的是,这种抗原决定基驻留在一段暴露面共享的抗体结合位点II和III,而治疗性单克隆palivizumab与抗原结合网站二世(68年)。F蛋白的区域跨越残留249 - 296年曾被证明含有其他抗原表位被人类(48和牛45)CD4⁺T细胞虽然T细胞抗原表位存在以外的区域(47)。这里给出的结果表明CD4细胞⁺与自体T细胞反应APC送给11-mer多肽n端氨基酸残基252,258,259,260,261 (图1和表1)。进一步描述该地区使用c端截短肽识别CD4所需最低肽⁺T细胞刺激(图2和表2)。福格等。45)曾发现多个抗原表位提供的249 - 296年地区以外的其他DRB3等位基因。为了识别其他等位基因特定的抗原表位,一个肽库计算预测绑定附加DRB3等位基因* 001:01,* 012:01,* 014:01:01 (图4和表4)是用于抗原表达研究。有关酶联免疫斑点试验,在净化CD4⁺T细胞培养用人造装甲运兵车没有产生IFN-γ针对抗原表达。可以额外DRB3-restricted BRSV 375 F蛋白抗原表位存在,进一步的研究与扩展肽库生成整个F蛋白识别额外的CD4至关重要⁺T细胞抗原表位。

MHC II级位点的遗传多样性是至关重要的演讲肽来源于个人遇到病原体的惊人的多样性的物种。人类基因组编码基因三个MHC II级蛋白质(HLA-DR、dp和dq)虽然只有两个牛基因组编码(BoLA-DR和dq)多态性在两个物种增加遗传多样性(26,29日)。抗原肽表示可以被限制在一个同形像的MHC II级分子,例如BoLA-DR,或结合MHC II级提出的蛋白质,称为interhaplotype配对。来确定这一抗原决定基仅限于表示通过BoLA-DR,我们进行阻断实验,装甲运兵车被孵化前与BoLA-DR或BoLA-DQ抗体分子与CD4细胞共培养⁺T细胞。抑制T细胞刺激后观察APC治疗anti-DR抗体(图3,5),表明抗原决定基仅限于DRB3 * 011:01。尽管缺乏响应其他等位基因测试,肽可能提出的DQ等位基因,没有检查。研究评估抗原肽来源于红孢子虫属边际表明利用牛博士或DQ分子或目前的多肽吗通过interhaplotype配对(28,33)。上面的研究没有调查潜在的抗原表达与DQ或interhaplotype配对。进一步的研究将有助于进一步描述的角色BoLA-DQ后与BRSV接种疫苗或感染。

开发新型疫苗对现有和新兴的病原体是一个高优先级和动物模型的发展,完全概括疾病和随后的免疫反应是无价的。作为BRSV HRSV密切相关,导致类似的疾病,新生儿小腿模型被认为是宝贵的开发新型疫苗HRSV (69年)。最近BRSV polyanhydride纳米疫苗将F蛋白(41,70年)被证实是有效预防小腿严重疾病。Polyanhydride纳米疫苗都具有很强的免疫原性,诱导强烈的抗体和细胞反应BRSV表面糖蛋白和减少病毒效价和肺部病理后的挑战。此外,一项研究评估prefusion-stabilized BRSV F蛋白疫苗也证明是免疫原性和保护小腿从疾病后的挑战44)。这些研究强调F蛋白的重要性BRSV免疫力。感兴趣的是评估疫苗接种后的抗原特异性T细胞的反应包括决心的大小和CD4细胞的寿命⁺T细胞的反应。这些数据将有助于疫苗配方的细化和剂量时间表。小牛BRSV感染模型是适合解决这些问题的氨基酸序列BRSV和HRSV F序列高度同源,分享共同的T细胞抗原表位和抗体结合位点。本文提供的数据建立在先前的研究CD4的通过扩大我们的知识⁺T细胞抗原表位出现在BSRV F蛋白并将帮助定义BRSV感染的免疫反应以及疫苗牛和人类的发展。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

道德声明

动物研究回顾和批准国家动物疾病中心/美国农业部农业研究所IACUC。

作者的贡献

汉堡王的实验设想,啊,JM, RD, RS和由废话啊。分析由BK,啊,约。手稿的作者是BK RS和编辑BK,啊,JM,约,RD, RS。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这部分工作是支持USDA-ARS(项目编号5030 - 3200 - 105 - 00 - d)和美国国立过敏和传染病(批准号R01HD095880)。本文中提到的贸易名称或商业产品是专为提供具体信息,并不意味着推荐或由美国农业部认可。美国农业部是一个机会均等的雇主。

确认

作者要感谢杜兰恩·齐默尔曼,Tera Nyholm,特蕾西·波特,和山姆·汉弗莱的专家技术支持

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1040075/full补充材料

补充图1 |人工抗原呈递细胞共同表达和CD80分子博士流星锤。hek - 293细胞转染质粒编码和CD80博士流星锤。单个细胞种群被隔离、扩大和评估转基因表达通过流式细胞术。表现型分析控制策略(A)。人口co-transfected HEK 293个细胞与每个等位基因(B)博士流星锤。

补充表1 |引物序列用于放大半径标注,DRB3, CD80 aAPC一代。

引用