环境相关浓度的抗生素会损害斑马鱼的免疫系统(鲐鱼类),对病毒感染的易感性增加

1。介绍

抗生素化疗药物被用于影响微生物的生长。根据kummer领军et al ., 250多个不同的化学物质被注册为抗生素在农业,人类和/或兽医卫生保健(1)。在204个国家开展的最近的一项研究表明,2000年至2018年,全球抗生素消费率医疗目的增长了46%,主要是由于不断增加的消费在低收入和中等收入国家(2)。一起大规模使用抗生素由于密集的农业和畜牧业(3,4),这导致了一个令人不安的环境情况。

近年来,耐药细菌的出现吸引了大量关注和关心由于对全球公共卫生的影响。耐抗生素的收购是一个自然的进化策略的许多细菌和其他微生物物种对资源的竞争,因为它们产生次级代谢物,类似于许多合成抗生素用作制药(5- - - - - -7)。然而,暴露于人为抗生素作为一个前所未有的选择压力,促进各种基因的动员称为抗生素抗性基因(ARGs)移动遗传元素及其水平转移许多细菌,包括病原物种(7- - - - - -9)。因此,arg游戏盛行的环境中微生物群落及其潜在传播可以显著影响环境微生物群和人类健康(8)。

然而,抗生素对人体健康的影响不仅是由于逐渐增加预防和治疗细菌感染的困难由于收购阻力不同的抗生素也改变人类微生物群(10)。抗生素引起的失调可能支持殖民机会致病菌,自平衡微生物群的一个基本作用防止微生物疾病(10)。某些有益的共生微生物群,称为细菌素产生的代谢物可以直接抑制机会致病菌的生长(11)。此外,其他微生物群产生的代谢物和来自饮食组件或胆汁酸,如短脂肪酸,氨基酸衍生品、维生素和次级胆汁酸,也影响多种生理过程,如免疫(12和能量代谢13)。综上所述,这些证据的重要性凸显了防止微生物疾病的微生物群安静的主机和主机炎症和代谢状态,进而影响对感染性疾病的易感性。

抗生素的间接影响不限于卫生或兽医的水平,因为他们也是一个重要的环境问题。水体中抗生素的存在,这些化合物的重要储层,是一个持续的威胁微生物多样性和生态系统功能,野生动植物和水产养殖物种。因此,抗生素污染是一个严重的环境威胁,需要解决,考虑一个卫生角度(14),它认识到高之间的互连的健康人类,动物,植物和环境。

根据去年技术联合研究中心发布的报告(JRC)欧盟委员会关于抗生素的存在在不同的水源,更常见抗生素在欧洲内陆地表水磺胺甲恶唑(SMX)和克拉霉素(CLA),也表现出更高的平均浓度水平(0.5 ng / L−17µg / L和0.5 ng / L−16µg / L) (15)。正因为如此,我们想要分析的影响这两种抗生素的环境相关浓度模式生物斑马鱼(鲐鱼类)。知识改变的微生物是阐明其对宿主健康的潜在影响的基础。如果抗生素暴露在主机转录组水平的影响正在瓦解,我们可以获得更好的知识抗生素毒性,microbiome-host相互作用及其对免疫系统的潜在影响。记住这个目标,成年斑马鱼暴露在SMX和CLA 14天(0.01 mg / L),和他们的抵抗病毒病原体春天鲤鱼病毒的病毒血症(SVCV)和他们的肠道和肾脏转录组和metatranscriptome概要分析了没有在感染后24 h或感染的存在。获得的数据提供有趣的信息的影响抗生素环境污染对水生生物的微生物群及其对免疫反应的影响。有趣的是,SMX + CLA也影响斑马鱼幼体先天免疫细胞的数量,和免疫细胞的某些改变标记在成年人,这表明微生物群之间的相互作用,生血作用和免疫反应。

2。材料和方法

2.1。鱼和病毒

男性野生型斑马鱼(18个月)从学院获得Investigaciones码头设施(西班牙维哥),斑马鱼在哪里维护后建立协议(16,17)。必要时,斑马鱼是安乐死或麻醉使用三卡因显示(ms - 222)。

春天鲤鱼病毒的病毒血症(SVCV;隔离56/70)在纤维母细胞ZF4传播(写明ATCC crl - 2050)中维护DMEM (Gibco)补充2%的边后卫(Gibco)和1%青霉素和链霉素溶液(Gibco) 22°C。ZF4细胞(TCID病毒效价₅₀/毫升)计算,根据芦苇和Muench方法(18)。

2.2。实验的斑马鱼与SVCV磺胺甲恶唑,克拉霉素和感染

磺胺甲恶唑(SMX;σ−奥尔德里奇;# 31737)和克拉霉素(班;σ−奥尔德里奇;# C9742)被稀释的浓度为10毫克/毫升在DMSO和整除直到使用存储在-20°C。

男性成年斑马鱼被分成两个坦克包含48个鱼每个4 L斑马鱼的水的体积。一罐补充4毫升SMX + 4毫升的CLA(抗生素治疗;最终浓度为0.01 mg / L(每个化合物:0.2% DMSO)和其他坦克作为控制和处理8毫升的DMSO(车辆;最终浓度0.2%)。每两天,一半的水(2 L)再次与淡水补充4毫升的DMSO(汽车水箱)或抗生素(2毫升SMX和2毫升的CLA)。鱼被保持在这些条件下2周。后这段时间里,一半的鱼从每个柜(24人)被麻醉,腹腔内(i.p)感染的20µL SVCV次致死量(3.2 x 10⁵TCID₅₀/毫升),而剩下的鱼ip接种同样体积的培养基(DMEM + 2%的边后卫+青霉素、链霉素)保持在接触ZF4细胞但没有病毒颗粒。在感染后24小时(hpi),四个鱼从每个条件(DMSO-Control、DMSO-SVCV Antibiotics-Control和Antibiotics-SVCV)牺牲,和完整的肠和肾采样和存储在-80°C到RNA隔离和转录组测序。剩下的鱼被分成两个坦克/条件(10鱼/箱)和暴露于相应的治疗(DMSO溶液或抗生素)死亡率监测。

测试SVCV致命剂量的影响,共60斑马鱼暴露在抗生素或车辆。两周后,一半的鱼从每个治疗(30人)的ip感染20µL SVCV致死剂量(6.4 x 10⁶TCID₅₀/毫升),而剩下的鱼ip接种同样体积的培养基。鱼被分成三个坦克/条件(10鱼/罐)死亡率监测。

2.3。RNA隔离和转录组测序

总RNA从小肠和肾脏从鱼获得样品暴露在DMSO溶液或抗生素提取使用麦克斯韦RSC simplyRNA组织工具包(Promega)和一个自动化的麦克斯韦^®RSC 48仪器按照制造商的指示。样品从亚致死的获得感染,RNA的数量在一个量子位4荧光计测量(英杰公司)使用量子位RNA海关化验设备(表达载体);之后,RNA完整性分析的安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技公司,圣克拉拉、钙、美国)根据制造商的指示。所有的样品,通过质量控制测试被用于Illumina公司图书馆准备。

双链cDNA图书馆构建使用TruSeq滞留mRNA LT样本(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。Paired-end 150个基点(PE150)测序进行一个Illumina公司6000年NovaSeq音序器。图书馆准备和测序进行Macrogen Inc .(首尔,韩国)。

获得的原始读序列沉积序列中读取存档(SRA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)加入BioProject PRJNA893568数量。

2.4。修剪,RNA-Seq和差异表达分析

CLC基因组工作台v . 21.1 (CLC生物、奥尔胡斯、丹麦)是用于过滤和修剪读取和行为RNA-Seq分析对最后版本的斑马鱼基因组(GRCz11)。生读修剪移除适配器序列和劣质读质量分数限制为0.05。RNA-Seq分析使用斑马鱼基因组与以下参数:分数= 0.8,长度相似分数= 0.8,不匹配的成本= 2,插入成本= 3,删除成本= 3。最后,一个微分表达式分析测试执行DESeq2包(19)在R公司诉4.1.3比较基因表达水平和识别差异表达基因(度)。过滤步骤进行去除低表达基因分析(只保留基因显示10项)。结果修正使用lfcShrink apeglm R的函数包(20.)。被认为是基因差异表达时提出了一个绝对log2-fold改变≥1,p值< 0.05。

2.5。基因本体论和KEGG通路富集分析和蛋白质相互作用网络

SVCV-infected之间的度和未受感染的斑马鱼,我们进行浓缩生物过程的分析和使用大卫KEGG通路分析软件(21)。显著性水平是设定在一个p值≤0.05在所有情况下,和最小的基因数是3。不同类别的表示是基于fold-enrichment值。

编码的蛋白质的相互作用与字符串v11.5软件感兴趣的度进行分析(https://string-db.org)(22)。

2.6。维恩图、热图和主成分分析

维恩图构造了Venny 2.1工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/。使用均值TPM的选择度,值的热图了使用平均连接方法与使用Clustvis的欧几里得距离web工具(23)(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)。PCA情节也Clustvis使用TPM生成的值。

2.7。量化RNA-Seq SVCV复制和验证的数据定量PCR

RNA隔绝DMSO-Control的小肠和肾脏,Antibiotics-Control, DMSO-SVCV和Antibiotics-SVCV斑马鱼与NZY retrotranscribed合成第一链cDNA工具包(NZYtech)使用0.5和0.15µg小肠和肾脏的总RNA。qPCRs进行使用特定引物与引物设计软件(324)和评估他们的特异性,其效率测试根据Pfaffl描述的协议(25)。个人qPCRs 25-µl反应进行卷使用12.5µL SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司),10.5µL超纯水(Sigma-Aldrich), 0.5µL每个特定引物(10µM)和1µL cDNA模板。所有反应都是使用技术一式三份7300实时PCR系统执行thermocycler(应用生物系统公司)和一个初始变性步骤(95°C, 10分钟),紧随其后的是40周期的变性步骤(95°C, 15 s)和hybridization-elongation一步(60°C, 1分钟)。不同基因的相对表达水平正常化后Pfaffl方法(25)使用18 s核糖体RNA基因(18岁)作为参考。褶皱变化单位计算刺激组织的规范化表达值除以的规范化表达值控制。SVCV复制检测的相对表达SVCV核蛋白(N)基因。RNA-Seq验证、七补体基因属于(c1,c3a.1,c4,c5,c8a,制备过程,masp1)和两个基因参与凝血(f5,身为和血红蛋白的合成cp,组织)选择确认结果。此外,细胞标记物的表达马可,mpeg1.1和mpx的样品进行了分析。中使用的引物对这项工作中列出补充表S1。

2.8。细菌和真菌分类分析

分析测序的细菌和真菌的概要文件读取实验,开发了一项工作计划组成的映射参考数据库的读取。寄主专一性的读取被映射读取到过滤斑马鱼基因组(GRCz11)。微生物参考数据库用于这项工作都是由真菌基因组存入RefSeq 18/05/2022,包含388总成。此外,策划细菌微生物基因组学数据库包含在CLC模块(包括36027细菌总成)被用来执行分析。CLC微生物基因组学模块21.1软件(试剂盒)被用来执行分类分析。

映射参数用于读取成不同的分类群的分类如下:分数= 0.5,长度相似分数= 0.8和种子的最短长度为30。最小种子长度参数定义了最小完美匹配长度位置的引用被认为是一个有效的候选匹配时阅读。

使用纯素食的α多样性计算R包(26),以便我们来描述一些社区生态参数。此外,辛普森指数,香农熵,费雪的α参数和物种数量进行评估。成对曼−Whitney U测试执行,以确定哪些组的不同发行版。

确认高细菌负荷的鱼暴露于抗生素,我们进行了16 s rRNA qPCR分析使用通用引物对PSL-PSR (27)(补充表S1)。为此,我们使用相同的RNA样品和qPCR条件如前一节。

2.9。斑马鱼幼体暴露在抗生素和成像的巨噬细胞和中性粒细胞

Double-transgenicTg (mpeg: mCherry / mpx: GFP)胚胎(7小时postfertilization(高通滤波器)在6-well盘子被暴露在7天DMSO溶液(0.2%)或SMX +班(0.01 mg / L;0.2% DMSO)。含有治疗的水重新每两天。从24个高通滤波器,胚胎幼虫也接受0.2毫米1-phenyl 2-thiourea (PTU;σ−奥尔德里奇),防止色素形成。总共25幼虫/治疗(5生物复制/ 5幼虫/复制)是qPCR采样分析巨噬细胞(马可,mpeg1.1)和中性粒细胞(mpx在-80°C)标记和存储,直到使用。使用的引物对上市补充表S1,qPCR条件第2.7节中描述的相同。另一个女士12幼虫/治疗麻醉了0.003% - 222(σ−奥尔德里奇)和用于显微镜分析。荧光图像被为每个实验条件与徕卡DMi8显微镜(徕卡微系统)配备GFP和TXR过滤器来可视化Mpx +和Mpeg +细胞,分别。细胞数与斐济软件(28)。

2.10。统计分析

图表和统计分析使用GraphPad棱镜软件8.0.1 (GraphPad、钙、美国)。生存数据分析与kaplan meier生存曲线,统计上显著的差异决定了log-rank曼特尔(−Cox)测试。基因表达的结果以图形方式表示为平均值±标准误差(SEM)的生物复制。幼虫细胞计数表示为均值±SEM。确定显著差异,数据分析与学生的t检验。显著差异被定义为* * * * * (0.0001 < p < 0.001), (0.001 < p < 0.01)或(0.01 < p < 0.05)。

3所示。结果

3.1。抗生素暴露改变肠道微生物概要文件和肾脏

细菌和真菌的概要文件在不同小肠和肾脏样本显示出倾向更高的读取从细菌(绝对丰度图1一个)和真菌(图1 b在小肠和肾脏的鱼暴露于抗生素。证实了较高的总细菌的丰度qPCR 16 s rRNA的分析(图1 c)。正如所料,总丰度在肠道的细菌是高于肾(图1 c)。

相对丰富的分析显示不同模式的细菌(图2一个)和真菌(图2 b)类之间的肠鱼使用抗生素治疗和那些暴露在车辆。DMSO-treated肠道的生物,最丰富的细菌类Flavobacteriia (21.7±14.73%), Gammaproteobacteria (16.43±11.31), Fusobacteriia (10.89±9.85%), Alphaproteobacteria(9.85±8.17%)和梭状芽胞杆菌(8.94±5.08%),而最丰富的类鱼暴露在SMX + CLA Alphaproteobacteria(53.18±27.44%),其次是Flavobacteriia (14.72±16.06%), Fusobacteriia(9.79±10.56%)、梭状芽胞杆菌(5.47±7.18%)和Betaproteobacteria (4.33±4.49%) (图2一个)。5细菌类显示之间的微分丰富DMSO antibiotic-treated斑马鱼,包括Chloroflexia Alphaproteobacteria,显示更高的丰度在斑马鱼暴露在SMX + CLA的肠,和Actinomycetia杆菌和Gammaproteobacteria显示较低的相对丰度(补充文件S1)。Alphaproteobacteria丰度高的肠antibiotic-treated鱼主要与红螺菌目。

关于肠道真菌、最丰富的类仅在斑马鱼暴露在DMSO溶液是Sordariomycetes (19.94±9.76%), Saccharomycetes (18.29±3.56%), Eurotiomycetes (12.47±3.01%), Dothideomycetes(7.68±2.25%)和Lecanoromycetes (6.81±4.97%);在鱼类暴露在抗生素、最丰富的真菌类Sordariomycetes (56.79±28.66%), Eurotiomycetes (7.6±2.12%), Saccharomycetes (5.9±4.87%), Lecanoromycetes(5.36±7.21%)和Dothideomycetes (3.82±3.15%) (图2 b)。六类真菌表现出明显不同的丰富的肠子DMSO antibiotic-treated斑马鱼,其中包括五类抗生素暴露后的相对丰度较低(Dothideomycetes、Eurotiomycetes Leotiomycetes, Saccharomycetes和Exobasidiomycetes),和一个类,Sordariomycetes,丰度较高的鱼处理SMX +班(补充文件S2)。

没有观察到显著差异的相对丰度肾脏样本中细菌和真菌类DMSO和antibiotic-treated鱼(补充图S1;补充文件S1和S2)。主要类的细菌在DMSO溶液的肾脏和antibiotic-treated鱼Flavobacteriia(分别为44.07±18.02%和47.12±15.68%),梭状芽胞杆菌(分别为17.06±3.82%和17.12±4.92%),Alphaproteobacteria(分别为12.18±10.62%和5.71±4.05%),Gammaproteobacteria(分别为8.95±5.65%和6.88±3%)和Actinomycetia(分别为5.17±2.24%和8.29±6.69%)(补充图S1);类真菌,主要在肾Sordariomycetes(分别为12.7±3.23%和14.95±4.74%),Eurotiomycetes(分别为12.54±4.64%和9.99±3.71%),Lecanoromycetes(分别为12.06±6.55%和13.85±6.1%),Saccharomycetes(分别为8.7±4.3%和6±3.16%)和Dothideomycetes(分别为6.89±1.66%和6.21±1.38)(补充图S1)。

α多样性指数没有显示显著差异在细菌在肠道或肾(图2 c;补充图S1)。真菌,较低的α多样性在鱼的肠道暴露在SMX + CLA,根据香农和费舍尔α多样性指数(图2 d)。

3.2。成年斑马鱼暴露于磺胺甲恶唑和克拉霉素更容易SVCV

成年斑马鱼暴露时为14天0.01 mg / L SMX CLA然后感染一次致死量SVCV,鱼暴露在车辆单独(0.2% DMSO)显示的存活率为100%,而动物暴露于抗生素的组合显示显著降低生存(65%)(图3一)。此外,感染一个高度致死剂量导致DMSO-SVCV集团的存活率为33.33%,这个比例下降Antibiotics-SVCV斑马鱼的10% (图3 b)。

SVCV复制分析小肠和肾脏的现病史5被感染的鱼从每组24,虽然观察没有明显的统计学差异,但鱼暴露在环境相关浓度的磺胺甲恶唑,克拉霉素表现出倾向更高SVCV复制(图3 c)。

3.3。RNA-Seq和微分表达式分析斑马鱼暴露于抗生素的小肠和肾脏或车辆本身没有的亚致死的SVCV感染。

更好地阐明转录组的改变反应由于慢性暴露于0.01 mg / L SMX + CLA,高通量转录组测序和RNA-Seq分析进行了24 hpi与未感染和SVCV-infected鱼。四个人被采样对于每个实验条件,虽然只有三个人测序DMSO-control和antibiotics-SVCV团体由于低质量和/或数量的RNA。

284485932生从肠道中读取得到的样品测序14个人,平均每个样本值20320424读;总生的读取,超过99.99%成功通过了质量控制和显示,平均长度的145.01个基点。从这些高质量的阅读,96.92%的意思是成功地映射到斑马鱼的基因组,和3.08%的读取仍未映射。肾脏的样本,共计281052036生读得到,平均每个样本值20075145读;总数的读取,超过99.99%成功通过了质量控制和显示,平均长度的144.4个基点。从这些高质量的阅读,96.66%的意思是成功地映射到斑马鱼的基因组,和3.35%的读取仍未映射。单个样本统计所示补充表S2。

3.3.1。RNA-Seq和微分表达式分析斑马鱼暴露于抗生素的小肠和肾脏或车辆本身没有的亚致死的SVCV感染

使用TPM值从RNA-Seq获得分析、主成分分析进行确定样本分布在未受感染的鱼,只考虑抗生素的影响。PCA区域,而肠样品之间表现出明显的差异化分布DMSO和antibiotic-treated鱼(图4一),这种模式没有观察到肾脏标本,更随机分布(图4 b)。这证据显示更强的抗生素治疗对肠道的影响比肾,由微分表达式分析证实。肠,antibiotic-control的比较与DMSO-control显示764度(284调节和480个表达下调),而相同的统计参数,只获得了94度肾脏(79个调节和15表达下调的基因)(图4 c)。度的全部曲目中提供补充表S3。此外,抗生素一般只有12度调制的小肠和肾脏(图4 d)。

3.3.2。暴露在抗生素大大改变了应对病毒

响应的分析在24 hpi SVCV鱼暴露SMX-CLA (antibiotics-SVCV比antibiotics-control)单独或车辆(DMSO-SVCV比DMSO-control)揭示了一个完全不同的表达模式。动物暴露在DMSO,总共有587度显著调节肠道(375调节和262个表达下调的基因),而病毒的挑战诱导的影响较低反应鱼暴露于抗生素的度,266度(145调节和121个表达下调基因)(图5一个)。此外,只有17基因通常在两组肠(调制图5 b在相反的方面),和5调制。在肾脏,数度更高,302年,在斑马鱼暴露于抗生素后SVCV挑战,这主要是表达下调(128调节和204度使之抑制);这个模式没有被观察到的动物暴露在DMSO,显示198度,与大多数调节(调节和31个表达下调基因167)(图5一个)。发生在小肠,低数量的度是一般调制后SVCV肾脏感染,只有7种常见度(图5 b),其中两个被调制在相反的方面。充分体验度的比较DMSO-SVCV与DMSO-control和antibiotics-SVCV vs antibiotics-control中提供补充表S4和S5,分别。

3.4。去KEGG富集分析

去KEGG浓缩进行了分析,阐明主要的生物过程暴露于抗生素的影响。没有生物过程(BPs)或KEGG途径大大丰富了肾脏与选定的过滤器。然而,几个基点是大大丰富了肠,补体激活”是最丰富的英国石油公司(图6)。其他进程密切相关的补充数据中也过多,如细胞溶解、止血和凝血。关于KEGG途径,术语“单纯疱疹病毒感染1”大大丰富和包括,其中,属于补体级联度(图6 b)。这强烈的互补调制,coagulation-related基因也明显地反映在一个字符串蛋白质交互网络构建的基因调制后的肠道接触抗生素(图6 c)。补充和凝固基因形成最强的集群网络。

关于应对SVCV在DMSO——或者antibiotic-treated斑马鱼,某些条款明显富集在肠(补充图S2)和肾(补充图S3在抗生素的存在与否)。有趣的是,“补体激活”一词只是明显的肾脏浓缩鱼处理车辆DMSO溶液。

3.5。抗生素暴露明显受损的肠内补充组件的转录和有限的upregulation SVCV后肾脏感染

蛋白质−蛋白质相互作用网络分析的蛋白质编码基因表达下调的肠的鱼暴露SMX-CLA透露,最强的集群的蛋白质是由大量的补充,凝固和血红蛋白synthesis-related分子(图6 b)。通过不同的整合素成员(这主要集群是相互联系的itgb2,itgb1b,itgav和itgae.2)与第二个集群高纯度在基因的作用在不同方面的免疫反应,包括趋化性(erbb2,ptpn11b),b细胞的成熟和激活(麦克米兰,blnk),调节炎症(socs1b,socs5a)、病原体识别受体(tlr5a)和macrophage-specific抗菌蛋白(mpeg1.1,mpeg1.2),等等。

以来的主要生物过程暴露于抗生素的影响补体在肠道,这也是一个主要过程诱导后的肾脏感染SVCV鱼暴露在DMSO溶液,但不是在那些鱼暴露于SMX-CLA,我们详细分析了这种免疫机制。热图代表的意思是表达水平(在log2 (TPM))的不同补组件在小肠通过不同的试验治疗显示大部分的补充组件显示较低表达在antibiotics-control和antibiotics-SVCV组相比DMSO-control和DMSO-SVCV组(图7)。这些补充组件(12c1,c3a.1,c3a.3,c3a.6,c4,c5,c7b,c8a,制备过程,masp1,cfi,cfhl4,cfhl5显著下调antibiotic-treated DMSO-treated相比控制鱼(用星号*,图7;补充表S3)。补充肠道样本中基因的PCA未显示很好的分离antibiotic-treated鱼仅从那些暴露在汽车(图7 c)。另一方面,而没有观察到显著差异之间的肾补组件DMSO-control和antibiotic-control (图7 b, D;补充表S3),热图显示全面补充基因的高表达DMSO-SVCV鱼(图7 b)。7这些基因(c3a.2c3a.6,c3b.1,c3b.2,c5,cfhl3,cfhl1)显著调节24 hpi DMSO-SVCV组相比DMSO-control组(用一个哈希#,图7 b),而没有补充基因调制在那些鱼暴露于抗生素后SVCV感染(补充表S4和S5)。

肠,TPM的度值的表示补体参与,血液凝固和血红蛋白合成中所示图8。虽然这些基因的水平高出一般在动物暴露在DMSO溶液相比暴露在抗生素、独立的感染,其中一些被下调SVCV挑战DMSO-treated鱼(c4,serpina1,serpina1l,serpinf2a,组织),而他们没有显著受到感染鱼暴露于抗生素(图8)。观察小肠相反,某些补充基因调节后的肾脏感染SVCV DMSO-exposed鱼,但这种反应完全压抑在动物对待SMX-CLA (图9)。在这个组织中,一个重要的影响血液凝固和血红蛋白synthesis-related基因没有被观察到由于抗生素治疗和/或SVCV感染。

来证实这些结果,我们qPCR分析进行一些补充,凝固,血红蛋白synthesis-related基因抑制肠道抗生素暴露后使用不同的比这批样品用于RNA-Seq分析。我们确认所有的基因测试显示较低表达动物的肠道接触SMX-CLA比单独处理车辆,甚至是差别显著对这些观察到的一些基因(c1,c3a.1,c5,c8a,制备过程,cp,组织)(补充图S4)。

3.6。抗生素暴露显著减少巨噬细胞和中性粒细胞在斑马鱼的数量

Double-transgenicTg (mpeg: mCherry / mpx: GFP)幼虫暴露在DMSO溶液或7天SMX-CLA被荧光显微镜分析以确定是否暴露于抗生素会影响巨噬细胞和中性粒细胞总数。研究结果表明,SMX + CLA的数量显著降低免疫细胞类型和单独的幼虫暴露在汽车相比(图10 a, B)。qPCR分析巨噬细胞标记马可和mpeg1.1和中性粒细胞标记mpx还显示显著降低这些基因的转录幼虫暴露于抗生素(图10 c)。当这些标记分析了成人小肠和肾脏的鱼,我们发现水平显著降低mpx和一个倾向较低的检测mpeg1.1成绩单在小肠(图10 d)。然而,RNA-Seq结果显示显著抑制mpeg1.1和肠的mpeg1.2鱼暴露在SMX +班。没有观察到的差异在肾脏DMSO -和antibiotic-treated斑马鱼(补充图S5)。

4所示。讨论

全球药品消费在过去的几十年里有了长足的进步。因此,化合物活性化合物在不同水体的存在也从医院上升由于废水,制药厂商、家庭、畜牧和水产养殖农场等(29日)。抗生素废水中最经常发现药物原料,加上止痛剂,抗生素,psychoactives,降压药anticholesteremics和兴奋剂(30.,31日)。不幸的是,污水处理厂(WWTPs)无法完全消除药物由于其化学和物理性质(31日)。这些化合物是活跃在非常低的浓度,制药污染是特别关注的问题。饮用水中抗生素的存在已经被报道在世界各地的国家(32- - - - - -39)。因此,抗生素的影响对人类,动物和环境卫生需要分析,以更好地了解这种类型的污染物的后果。因为磺胺甲恶唑(SMX)和克拉霉素(CLA)是最经常观察抗生素在欧洲内陆地表水和被发现在更高浓度(15),这些化合物被选来确定环境相关浓度的影响(0.01 mg / L)的微生物群和免疫状态模式生物斑马鱼。

关于肠道和肾脏微生物群,我们发现斑马鱼暴露SMX-CLA 2周没有显示显著的变化在肾脏中的微生物群组成,虽然总观察细菌丰度更高。另一方面,一个明显的失调在小肠被发现antibiotic-treated鱼比控制。然而,相反可以预期,细菌alpha-diversity没有明显影响,甚至更高的总细菌的丰度是鱼的肠道中观察到暴露于抗生素相比,控制。细菌鉴定的主要类的肠道斑马鱼在我们的研究也主要用于其他肠道微生物群落的宏基因组分析斑马鱼(40- - - - - -45)。然而,斑马鱼肠道菌群可以显示变化根据发展阶段的不同,生命的历史,饮食和当地环境(40,41)。metatranscriptome分析中,我们发现鱼暴露于抗生素有显著提高的类Chloroflexia Alphaproteobacteria和减少Actinomycetia杆菌和Gammaproteobacteria Alphaproteobacteria变化和Gammaproteobacteria更强。Alphaproteobacteria的相对丰度的增加肠道的斑马鱼暴露于抗生素之前报道了土霉素(OTC) (44)。在门级,这种抗生素减少了大量的变形菌门,尽管SMX没有观察到的差异(43)。mycobiota, DMSO-treated鱼表现出更高的Sordariomycetes丰富和Saccharomycetes,其次是Eurotiomycetes Dothideomycetes Lecanoromycetes。此外,饮食和饲养环境都影响斑马鱼的肠道真菌组成。Siriyappagouder等人发现wild-caught-laboratory-kept (Uttara、印度)斑马鱼Dothideomycetes显示出优势,而实验培育同行(Bodø、挪威)显示Saccharomycetes的优势(46)。我们的分析表明,真菌往往显示增加意味着抗生素治疗后的总丰度但α多样性较低。类的丰富Sordariomycetes SMX + CLA曝光后显著增加,但类Saccharomycetes Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Leotiomycetes和Exobasidiomycetes相对丰度有所下降。综上所述,我们可以得出结论,斑马鱼暴露在SMX + CLA在环境相关浓度在两周内显示一个明显的改变他们的肠道菌群。此外,肾脏也影响在某种程度上,从一个更高的总观察细菌的丰度。

虽然临床接触抗生素减少细菌丰度,亚临床暴露在环境浓度的抗生素可以有利于细菌的增殖血统遗传多样性和自适应可塑性高(14)。细菌引起的SOS反应的激活低水平的抗生素可能导致增加突变率和更高水平之间的遗传物质转移细菌,进而增加了表型变化(14)。这与我们的研究结果是一致的,更高的原材料丰富的细菌在鱼暴露在SMX + CLA,这似乎是由于某些类的扩散。某些细菌也产生代谢产物,如乳酸、丁酸盐或tryptophan-derived代谢物(芳基碳氢化合物受体配体),抑制或限制某些真菌(殖民和/或发展47)。因此,改变细菌群落组成影响mycobiota成分和丰富,在这工作。

目前,广为人知的是微生物起着关键作用的宿主免疫系统的发育和功能,免疫系统控制宿主共生。因此,微生物群和免疫支持复杂的双向沟通(48)。不同的微生物组成,如细菌脂多糖(LPS),鞭毛蛋白、肽聚糖或lipoteichoic酸(48),和真菌细胞壁成分,如β-glucans和几丁质(47),与宿主免疫受体(prrs)称为模式识别受体,引起多种免疫影响宿主细胞(47,48)。同时,细菌和真菌的生产商多种次生代谢物的能力可能促使肠道内腔通过循环系统不同的器官或组织,引起组织免疫反应与反或promicrobial效果(48)。众所周知,微生物生态失调参与多种免疫性疾病(49),还可以增加对机会主义病毒病原体(细菌或真菌以及50)。

之前报道,鱼暴露于抗生素更容易受到某些传染病。这是成年斑马鱼暴露在SMX和场外,更容易受到细菌病原体气单胞菌属hydrophila和显示一些免疫参数(碱性磷酸酶活性,细胞因子的表达和抗氧化活性的影响在小肠(43)。在这项工作中,我们发现,斑马鱼暴露在SMX + CLA更容易SVCV。甚至一次致死量antibiotic-treated SVCV诱导特定死亡率的鱼。众多的研究表明,一个正常的胃肠道微生物群是一个正常的抗病毒反应所需,失调影响抗病毒免疫(50)。健康的微生物群有助于保持一个最佳的粘膜屏障,包含细菌能分泌杀病毒的抗菌肽,抑制病毒对宿主细胞和调节抗病毒先天和适应性免疫过程(50)。老鼠口头处理数组的抗生素对病毒感染抗病毒免疫反应和较低的病毒清除受损,导致更多的主机损伤和更高的死亡率(51- - - - - -54)。此外,产妇抗生素治疗改变了新生儿微生物群的正常发展,影响了后代的抗病毒免疫(55)。然而,某些immune-suppressive活动由抗生素可能是由于抗生素的一种有毒的直接影响,因为它已被证明,鱼使用抗生素治疗通过药用饲料和浴治疗在临床剂量可以表现出肝毒性和几个组织病理学的影响在不同的组织,主要是由于增加氧化应激(56)。

的转录组分析斑马鱼暴露于环境浓度SMX + CLA显示显著改变的几个在肠道免疫基因的转录,显著抑制的多种基因属于补充系统及其通路密切相关,血液凝固。免疫功能受损和增加炎症以前发表在其他鱼类暴露于抗生素的临床或环境浓度在56(修订)。此外,改变或某些补充参数之前报道在不同鱼类暴露于不同的抗生素。鲤鱼(鲤属carpio暴露于环境浓度的甲硝哒唑30天显示补充活动的减少,以及其他影响免疫功能(57)。斑马鱼幼体暴露于六种β-diketone抗生素从6 dpf 30 dpf表现出较低的补充检测组件C3 (58)。瓜迪奥拉等人补充活动和评估c3基因表达水平在乌颊鱼海鲷(黄aurata)美联储场外交易;其他酶的活动和免疫基因,他们发现补充活动显著降低血清中c3表达式是降低肠道的OTC-treated鱼(59)。相反的观察,一些出版物报道补充组件内容的增加。他等人发现杂交罗非鱼美联储florfenicol显示更高数量的补充组件C3和C4 (60)。此外,急性口服新霉素鲫鱼(Carassius auratus gibelio)显示血液中增加补体C3含量(61年)。有趣的是,尽管我们没有观察到一个抑制肾脏的补充和凝固组件鱼暴露于SMX-CLA在没有感染的情况下,这些动物显示能力的降低增加补充组件的转录后SVCV挑战。这些结果似乎表明,鱼类的主要免疫和造血的组织,肾脏,有一个有限的应对病原体,可以在应对SVCV解释死亡率越高。

因为它被描述,抗生素可以改变鱼的白细胞计数,通常通过减少他们的数量,尽管异常(62年),我们想阐明SMX + CLA含量是否在这个实验中使用会影响免疫细胞的数量。近年来,它已经表明,肠道微生物群中起着举足轻重的作用在造血作用的规定(63年- - - - - -67年),肠道失调被发现与血液学的异常在人类和小鼠(修订68年)。此外,免疫细胞数量的减少可以解释下补基因的转录。7天我们发现斑马鱼幼体暴露在抗生素都显示较低数量的巨噬细胞和中性粒细胞,由qPCR分析证实了巨噬细胞和中性粒细胞细胞标记。另一方面,当这些标记进行分析从成年斑马鱼肠道和肾脏,只有一个显著减少中性粒细胞的标记mpx肠道中可观察到,虽然mpeg1.1和mpeg1.2被发现在RNA-Seq抑制分析。因此,我们不能排除这样一种可能性,即较低的补充和凝固的基因转录肠和某些补充的没有感应基因在肾脏感染SVCV在那些鱼暴露于抗生素是由于免疫细胞数量减少。免疫基因的差别不过,一个巨大的对这些没有被观察到在暴露于抗生素,尤其是肾脏,也可以表示的调制mpx,mpeg1.1和mpeg1.2在肠道基因表达而不影响成年斑马鱼的巨噬细胞和中性粒细胞的数量。

微生物之间的直接关系和补体已被报道。Chehoud等人观察到传统长大的老鼠表现出更高的表达多种补充组件的皮肤比无菌鼠同行(69年)。然而,尽管造血作用并不是评估工作,作者发现抑制补体系统的重要组成部分,补充组件C5a受体(C5aR),导致皮肤微生物群组成和多样性的改变,降低细胞渗透和抑制皮肤免疫基因的转录。补充和微生物群似乎有双向关系,微生物群改变补瀑布和补改变了微生物群(69年)。之间的紧密关系C5a / C5aR hyperactivation或压迫和小鼠的肠道微生物群也被报道(70年)。C3 KO小鼠还显示改变粪便微生物群,可以参与经常便秘的表型观察到这些老鼠(71年)。补也与牙周生态失调和炎症(72年)。因此,我们不能排除这样一种可能性,即补充系统的改变在斑马鱼暴露在SMX +班可能是微生物群之间的直接相互作用的结果和补充。

总之,我们的结果表明,斑马鱼暴露在环境相关浓度的两个最常见的抗生素在欧洲内陆地表水,磺胺甲恶唑(SMX)和克拉霉素(CLA),两周显示易受病毒病原体SVCV高于vehicle-treated同行。转录组分析小肠和肾脏显示SMX + CLA暴露显著调节多个基因,特别是在肠道。补充和血液凝固,两个紧密相连的过程,受影响最大的是过程,几种差别与一个强大的对这些基因。这些过程没有明显的影响肾脏。此外,SMX的转录组分析+ CLA-treated和控制鱼在24次致死量的hpi SVCV实验群体表现出完全不同的反应。鱼未暴露于抗生素显示更典型的抗病毒反应,但斑马鱼暴露在SMX + CLA对感染的反应受损免疫反应,表现为无法补充基因过表达在肾脏。Metatrascriptome分析显示一个改变肠道内的微生物群,根据文献,可以解释降低补体反应。此外,这种缺乏补充反应在SMX + CLA-treated鱼也可能由于减少了免疫细胞的数量的动物暴露于抗生素。由于微生物群变化与造血作用受损,这三个因素(微生物、造血作用和补信号)可能是相互联系的,可以解释更高的易受病毒感染后的斑马鱼暴露在SMX +班。更多的研究需要充分了解抗生素作为环境污染物的免疫抑制作用。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在这里找到:PRJNA893568 (SRA)。

道德声明

动物研究是进行审核和批准由CSIC国家生物伦理学委员会批准文号ES360570202001/21 / FUN.01 INM06 / BNG01。

作者的贡献

PP:方法、生物信息学分析、验证;写初稿。c先生:生物信息学分析,写作-审查和编辑。房颤:生物信息学分析,写作-审查和编辑。BN:概念化、收购资金、监督;写作——审查和编辑。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是由项目pid2020 - 119532 - rb -西班牙Ministerio i00 de Ciencia e Innovacion。PP的博士后合同(Juan de la Cierva Incorporacion;ijc2020 - 042682 - i)是由西班牙Ministerio de Ciencia e Innovacion (MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033)和欧盟“NextGenerationEU / PRTR”。

确认

我们要感谢IIM-CSIC水族馆的工作人员,露西娅·桑切斯(IIM-CSIC显微镜和图像分析服务)和Judit卡斯特罗的技术援助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

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引用