单细胞转录组显示显著的异质性和功能组织的树突状细胞和单核细胞的牛肠系膜淋巴结

1介绍

树突状细胞(DC)被称为中央教师适应性免疫(1),这是在专业领域的次级淋巴组织(2)。人们普遍认为也促进单核细胞的细胞形状自适应免疫反应(3,4)。是大约十倍的频率比在外周血DC,单核细胞实现多种功能的感应和解决炎症(5),也一直在与抗原呈现淋巴结(6)。

善意的DCs可以从其他单核吞噬细胞表面表达的划定Flt3受体酪氨酸激酶,造血细胞因子受体基本DC分化(7- - - - - -11)。区别三个直流子集(cDC1 cDC2、pDC)是建立基于个体发生的差异,表达的关键基因,表型和功能(12- - - - - -14)。然而,正在讨论是否应该重新归为pDC先天淋巴细胞(15)。小鼠的研究表明,cDC1和cDC2专业诱导cd8 t细胞/ Th1反应和Th2 / Th17反应,分别为(16,17)。因此,小鼠cDC1被描述在cross-presentation(特别是高效18)。最近的研究结果加强了同样pDC参与t细胞刺激,尤其是后初始IFN-I生产(19)。识别non-mouse /非人类物种的直流子集(即猪、马和牛),我们以前分析关键基因的表达被发现在直流子集的进化,包括基本转录因子和FLT3(9- - - - - -11)。

跨物种,单核细胞子集定义良好和最有可能代表一个微分连续而不是发育不同的人群(20.)。然而,在人类和牛、模和中间单核细胞(不合格品和intM)可以区别于古典单核细胞(cM)基于CD14 / CD16和某些关键基因的表达等CCR2(厘米),NR4A1/CX3CR1(不合格品和intM) (11,21- - - - - -23)。值得注意的是,我们最近表明,牛单核细胞子集似乎非常类似于人类同行(23,24),转录组分析表明不合格品在抗病毒免疫中起到的作用和专业化的intM抗原。然而在组织,单核细胞的子集身份变得模糊,因为它们是区分对monocyte-derived直流(moDC)和monocyte-derived巨噬细胞,后者可以转录非常相似的长寿和自我更新tissue-resident胚胎来源的巨噬细胞(3,25,26)。

单细胞RNA序列(scRNA-seq)使一个相对公正的视图在复杂的组织(免疫细胞组成27,28),例如在人类cDC2相当大的异质性,包括炎症直流子集与moDC相似密切(29日- - - - - -32),导致最近发现的独立直流血统DC3——细胞称为表型和功能之间的中间体cDC2和单核细胞(33- - - - - -35)。

此外,scRNA-seq使高层比较免疫学non-model物种,通过深入分析前景令人兴奋的见解免疫细胞的基本和进化保存功能。此前执行详细的树突状细胞和单核细胞的转录组分析分离出的血牛,两者兼而有之体外和后体外刺激(11,23,36),这里我们提供第一个scRNA-seq分析牛单核吞噬细胞室的淋巴结。肠系膜淋巴结我们选择一个次级淋巴组织,预计报告将包含相当大的一部分激活免疫细胞在稳态条件下,给我们机会研究单核吞噬细胞系统最好的——抗原,T细胞得到指示,凋亡细胞处理。

2材料和方法

2.1隔离的牛mesenteric-lymph-node细胞

小肠肠系膜淋巴结(mesLN)排水收集从三头牛被屠杀在附近的屠杀在连续三周(MLN2306: RedHolstein, 3.5年;MLN3006:西门塔尔牛、8.5年;MLN0707:黑白花牛,四年),并立即放入冰冷的PBS包含1毫米EDTA(瑞士巴塞尔表达载体、ThermoFisher) (PBS-EDTA)。淋巴结切除后脂肪和结缔组织,被切成小块,碎使用gentleMACS分离器(Miltenyi研究瑞士AG)、门、瑞士)。与冷PBS-EDTA洗涤步骤之后(300 x g, 10分钟,4°C),这些细胞被孵化在PBS含0.1毫克/毫升DNase我(瑞士巴塞尔,BioConcept Worthington-Biochem),在室温下15分钟。此后,细胞被洗(300 x g, 10分钟,4°C),与5%的边后卫DMEM补充(瑞士巴塞尔Gibco、生活技术),和悬浮细胞是通过过滤器(70µm)。这个清洗步骤是重复,和细胞resuspended PBS-EDTA(室温)和分层上聚蔗糖Paque (1.077 g / mL;通用电气医疗集团欧洲GmbH)。离心后(800 x g, 25分钟,20°C),收集细胞在接口和洗两次冷PBS-EDTA (400 x g, 10分钟,4°C)。随后,细胞数和彩色fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)如下所述。

Flt3 2.2 Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)⁺和CD172a^高细胞

的孤立淋巴结细胞进行染色2 x 10⁸细胞在50毫升猎鹰管和包含三个孵化的步骤,每20分钟在4°C(孵化卷2毫升)。中间孵化步骤,细胞被洗(300 x g, 10分钟,4°C)与40毫升的BD细胞洗(BD生物科学、Allschwil、瑞士)。为了阻止Fc受体,细胞培养与纯化50µg /毫升牛免疫球蛋白(美国蒙哥马利Bethyl实验室),之前添加CD172a (CC149 mIgG2b;瑞士生物Rad,长满水芹的)和His-tagged Flt3L在随后的孵化的一步。牛His-tagged Flt3L (NCBI NM_181030.2)是如前所述8,10)。

在第三个和最后一个步骤中,细胞与anti-IgG2b-AF647孵化(瑞士巴塞尔分子探针、热费希尔),anti-His-PE (mIgG1) (Miltenyi研究瑞士AG)、门、瑞士),和生活/死™可以解决的近红外线染色(热费希尔科学、巴塞尔、瑞士)。最后洗步骤后,细胞在BD resuspended细胞洗和交付给流式细胞术和细胞分选设施(fcc)伯尔尼大学的1 x10⁵可行的细胞(Flt3⁺和/或CD172a^高)排序使用MoFlo Astrios EQ细胞分选仪配备5个激光(瑞士尼翁贝克曼库尔特Eurocenter SA)。排序后,细胞停止旋转(300 x g, 10分钟,4°C), 200年re-suspendedµl PBS含有0.4% BSA和可行性评估显微镜下用台盼蓝染色法。这三个样品被确认可以免费看到碎片和紧身衣和生存能力> 95%。后立即数,细胞被提交给下一代测序平台伯尔尼大学的生成10倍基因组测序的库和后续的测序。

2.3单细胞RNA序列(10倍基因组学)

图书馆准备在连续三周完成下一代测序(上天)伯尔尼大学的平台。这三个库是存储在- 80°C,汇集和测序之前运行。宝石代&条码、逆转录cDNA放大和3的基因表达都执行库生成步骤根据铬下宝石单细胞3 '试剂盒v3.1用户指南(10 x基因CG000204牧师D)与所有规定10倍基因组学试剂。具体来说,每个细胞悬液的33.0µL(500细胞/µL)和10.2µL nuclease-free水被用于靶向细胞复苏10的000个细胞。宝石代GEM-reverse转录孵化之后,清理步骤和11个周期的cDNA放大。由此产生的cDNA是数量和质量评估使用热费希尔科学量子位4.0荧光计的量子位dsDNA海关化验设备(热费希尔科学、Q32854)和一个先进的分析使用一个片段片段分析仪系统分析仪挥动片段工具包(安捷伦,dnf - 473),分别。此后,3′基因表达了库使用一个示例指数13 - 15的PCR一步周期。最终协议,额外的0.8 x bead-based库进行清理。生成的cDNA图书馆进行数量和质量检测使用氟量计和毛细管电泳如上所述。互补脱氧核糖核酸数据库池,测序加载浓度为300点,paired-end和single-indexed illumina公司NovaSeq 6000音序器共享NovaSeq 6000 S2试剂盒(100周期; illumina 20012862). The read set-up was as follows: read 1: 28 cycles, i7 index: 8 cycles, i5: 0 cycles and read 2: 91 cycles. The quality of the sequencing runs was assessed using illumina Sequencing Analysis Viewer (illumina version 2.4.7) and all base-call files were demultiplexed and converted into FASTQ files using illumina bcl2fastq conversion software v2.20. An average of 787,553,242 reads/library were obtained.

2.4 scRNA-seq数据的分析

映射和计数的umi使用细胞执行管理员(3.0.2版本,10 x基因组学)与参考基因组ARS-UCD1.2运用建立必要的索引文件。随后分析了R(版本4.0.2)(37)。拟声唱法包(1.14版)(38)是用来评估的比例核糖体、线粒体基因以及检测到基因的数量。细胞被认为是异常值,过滤掉如果线粒体基因表达的比例或数量的检测基因倾斜超过三位数绝对偏离中值在所有细胞。质量控制后,样本MLN2306保留6604个细胞,从MLN3006保留3956个细胞样本,样本MLN0707保留3649个细胞。标准化样本之间完成的反褶积方法Lun et al。39)使用包残渣(1.14版)(40)。样本与FindIntegrationAnchors集成功能包的修(版本3.1)基于第一个30主成分(电脑;修拉的默认选项)(41)。基于聚类完成的FindNeighbors和FindClusters功能修包使用40 pc从降维的第一步,由稻草人过程。Clustree包(0.4版)(42)是用来确定决议导致集群与假定细胞类型并存,这是1.2。为了识别——或衰减之间的基因簇,FindAllMarkers被应用于数据集。这个函数将返回所有的每个集群的差异表达基因。集群被手动标注的基础上,这些标记基因。轨迹分析使用R包Monocle 3 (43- - - - - -45)。降维后(UMAP)和鲁汶集群(k = 10最近的邻居)使用函数“cluster_cells”,使用函数的轨迹计算“learn_graph”。为了找到基因差异表达以及所选轨迹,函数“choose_cells”是应用函数“graph_test”紧随其后。除非另有声明默认的参数使用。

2.5数据的准备

数据准备使用FlowJo版本10 (FlowJo LLC、亚什兰或),R版本以下4.4.1,Inkscape (https://www.inkscape.org)。单细胞RNA-seq数据可视化功能块,点图,散点图,小提琴的阴谋,单细胞的热图使用R包“修”(默认参数,除非另有规定)和“ggplot2”。可视化的热图,之前数据子集集群的扩展和集中使用ScaleData修的函数。提高对比度的功能块,feature-specific对比水平计算基于分位数(非零的q10 q90)表达式。的代码可以从可视化一幕修包(https://www.satijalab.org/seurat/)。

3的结果

3.1不同集群的树突和单核细胞的细胞

从排序Flt3单细胞转录组了⁺和/或CD172a^高mesenteric-lymph-node细胞三个健康的奶牛(图1一个和补充文件1)和角度加工中材料和方法。综合数据集用于进一步分析。选择分辨率为1.2,导致24种不同集群(图1 b和补充文件1)。综合数据集分割样本,以及非集成数据集所示补充文件1。

当直流标记的可视化表达FLT3和单核细胞的标记CSF1R在UMAP情节(图1 c),我们发现大部分的24集群主要可以分为集群的假定的直流(c1、c3、c5、c6 c8,制备过程,c11、c12 c13、c15, c17,甜,c23)和假定的单核细胞的细胞(集群c0 c2, c4、c7、c10, c14, c19, c21)。值得注意的是,集群3和15,分配给直流,包含细胞表达的一个子集CSF1R和缺乏FLT3表达式。

集群缺乏FLT3和CSF1R表达,表达中被发现CD79B(c16和c18)或CD3E(c22),分别与其他B - t细胞标记。值得注意的是,使用c18可能包含浆细胞,显示的表达式IRF4,PRDM1(Blimp-1),JCHAIN和免疫球蛋白基因。这些等离子体的细胞表达CD27和TNFRSF17两个表面分子,可以针对流仪检测牛的浆细胞。

Cluster-defining标记基因,由秀兰的FindAllMarkers函数,列出补充文件2。每个集群的顶部标志基因的表达(p_val_adj最低,其次是最高avg_log2FC)在所有集群的dotplot可视化图1 d。

3.2 Subset-specific基因转录定义居民cDC1, cDC2和pDC

按照表型和转录组的善意的直流子集最近血牛(确认了11),不同的集群lymph-node-derived DC可以定义的表达式ANPEP(CD13),FCER1A和CD4(图2一个)。

所示图2 b集群的co-expression subset-specific关键基因显然证实1 cDC1 (ANPEP,XCR1,CLEC9A,BATF3,CADM15和9),集群cDC2 (FCER1A,CLEC10A,SIRPA)和集群17 pDC (CD4,SPIB,TCF4,BLNK,RUNX2)。前20名的热图(调整假定值)之间的差异表达基因集群(c1、c5 & c9 c17)所示图2 c。完整的基因列表中给出了补充文件3。除了上面提到的基因,包括subset-specific基因LGALS1,PSAP,DNASE1L3,CXCL10,LYZcDC1,NK2B,RUNX3,CX3CR1cDC2、LTB,出售,CLECL1和IL7RpDC。

这两个cDC2集群(c5和c9)在各种immune-relevant基因的表达不同(图2 d和补充文件4),如CST3,FCER1G,计算流体动力学,BATF3(高表达c5),克服各种,TNFRSF13C,PLA2G5,CD5和CD9在制备过程(明确表示,但几乎缺席c5)。值得注意的是,这种差异CD5和CD9转录应该评估适用性蛋白质水平的区分与流式细胞术牛cDC2子集。

选择subset-specific关键基因所示图2 b也完整数据集的可视化(补充文件5)。集群3、6、8、13、15、20和23缺乏记录这些subset-defining标记基因。在直流,c3只包含细胞表达MRC1和CD1A(图2 e)。集群11和12似乎同时包含cDC1 cDC2和突出的高表达的细胞周期基因等PCNA(c11),MKI67(c12)(图2 f)。事实上,c11、c12主要表达与G1-S阶段相关的基因和细胞周期的G2-M阶段,分别(补充文件2)。此外,随着在UMAP投影(图2一个)c13转达了引起c11、c12的印象,后来发散满足cDC1 (c1)和cDC2 (c9)。在集群13中,然而,我们没有检测记录与一个活跃的细胞周期有关。相反,c13站的高表达AATF(细胞循环控制)CD9,CD164L2,ANXA1,ANXA2,CLEC10A,独家的表达MUC1,RORC和SLC14A1其他基因(图2 f和补充文件2)。

最后,尽管他们缺乏DC-subset定义记录(补充文件5)集群6和8显示,迄今为止的最高水平FLT3表情,与独家的表达CCR7和FSCN1(图2 g)。事实上,他们的高水平的CCR7和FSCN1表达式表明,这些细胞组成迁徙直流最近从肠道组织迁移到肠系膜淋巴结。

3.3 CCR7的子集^高迁徙直流由趋化因子表达

细胞集群6、8、20和23个,显示一个孤立投影UMAP情节,突出表达高水平的各种激活,maturation-related基因(图3一和补充文件2)。超过1500个基因完全表达或显著调节(p_adj < 0.05)这些迁徙直流(c6和c8和甜& c23)对居民相比直流(c1和c5和c9 & c17)(补充文件6)。这包括基因参与细胞骨架调节(FSCN1,SAMSN1,MARCKSL1),t细胞和b细胞co-stimulation (CD83,TNFSF13B,CD40)和t细胞调节(IDO1,CD274,IL4I1)。

Subclusters内CCR7^高迁徙直流不同t细胞吸引趋化因子的表达和t细胞激活细胞因子(图3 b, C),这表明迁徙的直流子集之间的分工(完整的基因列表补充文件7)。

集群高6站在了t细胞的表达吸引CXCL9和CXCL10(46,47),与ISG15和MHC-I-associated基因。值得注意的是,还时候在c6明确表示,对硫氧还蛋白编码,已建议规范Th1 / Th2平衡,其他immuno-relevant效果(48)。此外,IL27和EBI3(IL-27B)明确表达subcluster c6。细胞集群8显然是丰富的成绩单CCL17和CCL22,大概吸引Th2和Th17细胞亚群(49),在IL15成绩单,促进T细胞和NK细胞的存活和增殖。值得注意的是,很小,但不同的集群23只显示的表达IL12A和TNFRSF11B。虽然记录对于大多数DC-lineage定义关键基因只有弱探测到在这些迁徙直流集群,整体基因表达建议cDC2浓缩在集群8,cDC1在c6丰富。也是相对较高的BATF3,流星锤和BOLA-NC1表达在集群6将指向cDC1,而高水平的RUNX2在集群23可能表明pDC的存在(图3 c和补充文件7)。

3.4 Co-clustering炎症cDC2、monocyte-derived直流和假定的DC3

定位中间cDC2 (c5、c9)和单核细胞(c2) UMAP投影,FLT3⁺树突细胞在集群3表达基因只与cDC2(如共享。F2RL2(如)或单核细胞的细胞。MRC1)。值得注意的是,相当大的一部分细胞集群3似乎co-express这些基因,包括FLT3和CSF1R(图4一)。

对所有其他集群相比,最显著的特征基因集群3包括在内PLBD1(与cDC1分享),CKB和VIM(补充文件2)。而PLBD1可能参与了代lipid-based炎症介质(50),CKB有牵连的immunometabolism细胞和波动的能源需求(高51,52)、波形蛋白(VIM)描述所需的激活NLRP3 inflammasome (53)。

当集群3与cDC2 (c5 & c9),抗菌和促炎症基因转录的c3变得更加明显,具有较高的表达LYZ(溶菌酶)和S100A11(一个alarmin),旁边XDH描述促进NLRP3 inflammasome激活(54)。(图4 b和补充文件8)。中最显著的基因表达较低的c3相比cDC2 (c5 & c9)RUNX3,NK2B,FCER1A和CSF3R。

很可能集群3代表炎症cDC2、最近老鼠中描述(31日)。虽然我们很难发现任何的表情FCER1A,我们发现高表达FCER1G在假定的炎症cDC2 (c3)。值得注意的是,FCER1G在集群5居民cDC2还表示,表达增加与c9吗通过对c3 c5。与RUNX3和CD5表达式缺席c3,这可能表明一个分化途径从c9 (RUNX3⁺CD5⁺FCER1G^昏暗的)通过c5 (RUNX3⁺CD5^{- - - - - -}FCER1G⁺对c3 (RUNX3)^{- - - - - -}CD5^{- - - - - -}FCER1G^高)(图4 c、F)。

单核细胞集群2相比,c3表达如较高。CST3和ID2下(图4 d)由直流集群,predominantely表示,高表达的基因编码分子mhc ii(补充文件8)。相比,c3基因表达较低为主题趋化因子单核细胞(c2)编码23日(ENSBTAG00000048980),一个granule-associated蛋白聚糖(SRGN)和CD107a (LAMP1),以及组织蛋白酶B (CTSB)、多种炎症相关蛋白和表面分子CD11a (ITGAL)和CD172a (SIRPA)(图4 d和补充文件8)。

此外,在所有细胞集群3表达高水平的BOLA-DRA,主要是细胞之间的桥接c3和c2表达中被发现CD1A,CD1B和CD1E(图4 e)的存在,表明monocyte-derived直流(moDC)专业集群3中脂类抗原表达。符合他们的血源性monocyte-origin,这些假定的moDC表示出售(CD62L)介导LN条目通过高内皮小静脉。

值得注意的是,虽然MS4A8被发现高度选择性地表达cDC2 (c5、c9)和公认的炎症cDC2 (c3,左部),这似乎是缺席假定的moDC (c3,右侧部分)。MSA48的功能是很差的特点,但它最近被发现在牛怀孕子宫内膜(高度调节55)和受感染的猪血(56)。

与炎症直流来自居民cDC2、moDC来自血源性单核细胞,细胞最近描述不同的直流血统DC3 (33,343)可能存在于集群。实际上,自行车的观察(PCNA表达)pre-DC (c11)分支向集群3(图2 a、F),将支持DC3作为集群3内发育不同的排列(图4 f)。符合DC3祖细胞中描述人类(34直流祖细胞表达的),这个独立的分支CLEC12A与ID2下。而且它没有检测到RUNX3表达式(黑色箭头所示图4 f)。当然,更详细的分析是保证理清什么似乎是转录组co-clustering炎症cDC2、monocyte-derived直流和DC3牛肠系膜淋巴结。

集群15日另一个集群定位中间直流和单核细胞UMAP情节,并没有显示任何特定的标记基因的表达(补充文件2)。相反,这些细胞站由一个低数量的umi检测和低数量的检测基因,而读的比例映射到核糖体和线粒体基因与其他集群(数据没有显示)。

3.5独立集群的单核细胞和巨噬细胞

像在人类血液中单核细胞牛分为古典和模单核细胞、中间部分,基于CD14和CD16表达式(11,22,23)。在牛淋巴结,CSF1R和SIRPA表达单核细胞的细胞似乎主要表达CD14(c4、c14)或FCGR3A(CD16;c7、c10)(图5一个)。

然而,的模式CD14/FCGR3A表达式不能反映观察单核细胞的集群分成两个主要岛屿UMAP投影:集群2 & 4 & 7和集群0和10 & 14 & 19和21。这两组之间差异基因表达集群,显示一组(2 4岁和7岁的时候)显然是富含与古典单核细胞相关的基因中发现血牛(23),如S100A11,S100A12和VIM,而另一组(0 &10&14&19&21)强烈丰富的基因通常与巨噬细胞有关的记录(APOE,TIMD4,CD68)(图5 b和补充文件9)。值得注意的是,假定的单核细胞只表达高水平的最近一个基因注释CCL23 (ENSBTAG00000048980)和高水平的表达TSPO和促炎IL1B,而假定的巨噬细胞表达RARRES2(Chemerin),IL18、抗炎PLA2G2D1(图5 b, C)。

3.6 pro和抗炎单核细胞集群

单核细胞集群(c2、c4 c7)不同基因的表达与炎症和抗原表达有关(图6和补充文件10)。顶级基因转录在集群4丰富让人联想到经典的单核细胞在炎性的血牛(图6)。当可视化这些基因功能的情节,表达与最高表达水平梯度变得明显S100A8,S100A12,VCAN,DEFB7右上角的集群4和tendentially更高的表达IL1B和IL1RN在集群的左上角4。另一个表达式模式可以观察到HIF1A和SLC2A3,减少表达式从上到下的集群4(图6 b和补充文件10)。集群2显著富集在成绩单等相关抗原表示CD1E,BOLA-DRA,CD1A,CD74,BOLA-DQA1(图6)。值得注意的是,的表达CD1E,CD1A和CD1B主要是在细胞集群2似乎发现桥对树突状细胞(即集群3,也看到图4 e)。此外,几个c型凝集素受体,最显著CLEC6A显示,增加集群2的细胞中表达(图6 c和补充文件10)。集群7显著富集基因转录与模单核细胞在牛血,等C1QA,C1QB,C1QC,FCGR3A,CX3CR1。值得注意的是,的表达MS4A7是2和7之间共享集群,几乎缺席炎性集群4(图6 d和补充文件10)。

3.7巨噬细胞集群

巨噬细胞聚集在一起的大多数集群0。虽然没有专门c0表达基因被发现,周围的集群c0显示明显差异基因表达的签名(图7)。值得注意的是,细胞集群10似乎独特的表达CD5L,SIGLEC1(CD169)和CD163(图7 a, B)。也吞噬受体基因编码MRC1(CD206)和CLEC4F(57)主要是表达c10,HMOX1、编码heme-degrading酶与抗炎作用(58)。此外,细胞c10 regakine-1表达水平显著增加(ENSBTAG00000010155),CC-chemokine发现既定的礼物在高浓度牛血浆,吸引中性粒细胞和淋巴细胞在体外(59)。

类似于集群2,单核细胞巨噬细胞在集群0更高水平的基因表达相关抗原表示(BOLA-DRA,BOLA-DMA,BOLA-DQA1,BLA-DQB,CD74)(图7 c和补充文件11)。高表达水平的DNASE1L3,MERTK和妳在集群0,指向efferocytosis这些巨噬细胞的重要角色。

加上炎性单核细胞,细胞集群14独特的表达ALOX5AP和DEFB4A(图7 d)。虽然ALOX5AP白三烯生物合成的关键,DEFB4A有抗菌和趋化现象的描述函数(60)。其他基因主要在集群中发现14个半胱氨酸蛋白酶抑制物F(编码CST7),据报道在monocyte-to-macrophage分化调节蛋白水解活性(61年),低密度脂蛋白受体(LDLR),脂肪酸结合蛋白5 (FABP5)。表达FABP5符合碳代表炎性巨噬细胞,这种脂肪酸结合蛋白被证明限制小鼠巨噬细胞的抗炎反应(62年)。

细胞集群21站等proliferation-associated基因的高表达TOP2A和MKI67(图7 e)。当c21对增殖直流集群11 & 12相比,明显的巨噬细胞的身份(如。CD68,CSF1R)c21(数据未显示)。巨噬细胞增殖的存在在当前数据集可能表明,巨噬细胞在淋巴结牛取而代之的是自我更新,报道善意tissue-resident巨噬细胞(26)。

细胞集群19与cDC2分享许多基因。此集群的细胞也连同cDC2和单核细胞位于UMAP投影。由于体积小集群19和广泛的细胞的定位,我们的结论是,c19可能代表一个产物并进行解释时应特别谨慎。

3.8基因感兴趣的

虽然微分表达式测试仅限于和限制了集群定义,基因功能的可视化情节提供无偏和cluster-independent信息,这是有价值的揭示隐藏在子集和表达模式聚类分析。除了上述微分表达式测试,我们检查了与重要的免疫功能相关的基因,如模式识别、黏附、迁移、抗原表达,以及基因编码细胞因子及其受体和其他immuno-relevant分子类,如溶质载体,tetraspanins, semaphorins,金属蛋白酶和purinergic受体。

非常有趣的基因表达模式显然不能详细描述在这里。选定的特征图所示图8。给出完整的功能块的集合补充文件12。当解释这些功能块,读者应该记住,辍学在单细胞数据可能导致低表达检测和明显缺乏。

成绩单pattern-recognition-receptor基因主要是检测单核细胞的细胞。除了为例TLR3记录,主要是在树突细胞发现,CLEC9A成绩单,专门在居民发现cDC1 (c1和c11、c12的一部分),也表达了高水平的CLEC12A与集群3(炎症cDC2)和单核细胞。有趣的是,NLRP3表情似乎仅限于单核细胞的细胞和cDC2(包括c3)NLRP1也是高度表达cDC1 (c1)。

看着Fc受体,我们发现FCER2主要表达在单核细胞和集群3(炎症cDC2),以及假定的迁徙cDC2 (c8)。值得注意的是,虽然FCER1G表达式中检测出CD5^{- - - - - -}cDC2 (c5),但不是CD5⁺cDC2 (c9)的表达FCRL3和FCRL4相反的模式,明确记录在CD5浓缩⁺cDC2 (c9)。

在记录编码purinergic受体,参与免疫调节感应细胞外核苷酸(63年),P2RY6成绩单显然是富含居民cDC1 (c1)。符合我们之前的结果与牛的血液细胞(11),P2RY1和P2RY10记录主要是检测单核细胞的树突细胞,分别。

趋化因子和趋化因子受体显示清晰的提供集群范围内的表达模式。最引人注目的是,CCR7表达DC可以分裂的根据CCL17/CCL22表达式(c8,它们假定的迁徙cDC2)和CXCL9/CXCL10表达式(c6,假定的迁徙cDC1)。除了c6,CXCL9和CXCL10也似乎中高度表达subcluster c1(居民cDC1),大概包含居民cDC1激活。值得注意的是,CX3CR1主要是表达的直流祖细胞,cDC2(包括c3)和单核细胞。除了CX3CR1和CCR5,我们几乎不可能发现任何记录编码在祖细胞趋化因子受体(c11、c12 c13) cDC2 (c5、c9)和集群3。卓越也的高表达CCR1和趋化因子受体CXCR4在炎性单核细胞(c4)。然而,尽管趋化因子受体CXCR4减少对消炎单核细胞和巨噬细胞表达,CCR1表达又发现在巨噬细胞高水平集群。此外,follicle-homing受体的表达CXCR5在假定的迁徙cDC2专门检测,表明这些细胞定位接近毛囊与B - t细胞,所述的小鼠系统(64年)。

在研究了整合蛋白,ITGAL(CD11a)由独家高表达站在居民cDC1 (c1)和单核细胞(c4 c2, c7)。和记录ITGAV(CD51)几乎只检测到炎性巨噬细胞(c14)。

此外,galectins显示特定的表达模式。尤其是Galectin-1 (LGALS1),这是居住和迁徙中高度表达cDC1 (c1, c6)和炎症和迁徙cDC2 (c3, c8)。Galectin-1表达表达监管直流(直流据报道,诱导IL-2765年)。记录为LGALS3和LGALS9分别被浓缩在巨噬细胞和单核细胞。

此外,基因相关抗原表达和t细胞调制显示有趣的提供集群范围内的模式。值得注意的是,集群6(假定的cDC1在迁徙DC),清楚地显示的最高水平流星锤,BOLA-NC1和IDO1,这表明这些细胞相互作用和调节CD8 T细胞。居民cDC1 (c1)显然是丰富的WDFY4成绩单,大概来显示他们的潜在的交叉表示。值得注意的是,虽然CD1A,CD1B和CD1E被公认的专门表达moDC (c2和c3)之间的桥梁,CD1D也是高度表达的居民cDC1 (c1)和(在较小程度上的cDC2 (c3、c5、c9)。

观察白细胞介素,我们发现IL1B主要是由单核细胞的细胞和表达cDC2(包括c3),而摘要意思的基因受体拮抗剂(IL1RN)主要是在炎性发现单核细胞(c4)。地震记录(IL18在巨噬细胞)显示一个著名的和具体的表达式。值得注意的是,subclusters迁徙DC明显不同的表达IL15(假定的迁徙cDC2 c8)EBI3(IL-27B) (c6,假定的迁徙cDC1)。中白介素受体基因,IL21R和IL13RA1通过专属的表情站在迁徙直流和单核细胞,分别。

基因编码TNF - TNF-receptor家族的成员也差异表达TNFSF13(4)和TNFSF10(小路)被发现主要在赞成和抗炎单核细胞(c4与c7),分别。值得注意的是,TNF-α成绩单(肿瘤坏死因子)只差检测,但肿瘤坏死因子受体基因的表达TNFRSF1A(TNFR1)和TNFRSF1B(TNFR2)检测在单核细胞的细胞(高水平TNFRSF1A / B)和迁徙的直流(TNFRSF1B)。此外,虽然TNFSF13B(金属)高度和几乎完全表达了迁徙,TNF受体基因的转录TNFRSF9和TNFRSF13C在假定的迁徙cDC1丰富(c6)和CD5表达居民cDC2 (c9) /假定的迁徙cDC2 (c8),分别。

还tetraspanins显示明显的特异性表达,例如macrophage-restricted表达式TSPAN4最近显示与Histamin H4受体(66年),或者高转录的TSPAN3在迁徙的特区,其中迁徙cDC1 (c6)也丰富CD151(TSPAN24)和的研究(TSPAN28)记录。包括其他tetraspanin基因高表达的迁徙直流TSPAN13,TSPAN17,TSPAN33,两个后者已知与ADAM10交互,一个金属蛋白酶调停ectodomain脱落(67年)。而ADAM10记录所有具有更高层次的集群中被发现单核细胞的细胞,其他金属蛋白酶显示更具体的表达模式。成绩单ADAM8和ADAM9浓缩在迁徙直流(c6、c8)和成绩单MMP9和MMP14几乎只在居民发现cDC2 (c5、c9)和巨噬细胞(c0, c10, c14, c21),分别。

在新陈代谢和之前报道的基因过表达在cM相比不合格品在牛血(23),KHK和SORD(果糖代谢)的选择性高表达在单核细胞的集群和居民cDC2 (c5、c9),分别。记录参与糖酵解显示惊人的异构表达模式,但大多是在单核细胞中发现和cDC2(包括c3)转录水平最高的一致HIF1A在这些集群。符合炎性签名c4的单核细胞,这些细胞转录的最高水平SLC2A3,高亲和性葡萄糖转运体。

SLC(溶质载体)基因表达的可视化显示有趣的模式,对人类也报道,像高SLCO2B1在巨噬细胞表达(68年)或高SLCO5A1成熟的树突状细胞表达(69年)。值得注意的是,铁转运体的记录SLC40A1只检测到某些cluster-independent地区在巨噬细胞内,和尿素运输车SLC14A1是专门在公认的早期发现直流祖细胞(c13)。此外我们发现迁徙直流专门表达高水平的SLC7A1,最近被描述为一个细胞受体牛白血病病毒(70年)。感染的迁徙直流牛白血病病毒可能对疾病的发病机制有重要意义。值得注意的是,牛白血病病毒最近也作为一个潜在的病原体引起了人们的关注在人类乳腺癌(71年)。

有趣的基因表达模式也明显相关补充系统。C1Q成绩单,感官组件启动C1的形成复杂的(C1Q + C1R + C1),在巨噬细胞和抗炎单核细胞只表达了。后者(c7)也表达了最高水平的C2,同时记录了C3只检测到,而炎性单核细胞(c4 c2)。相反,C3AR1转录似乎是选择性地缺席炎性单核细胞(c4)。值得注意的是,检测CD55记录仅限于单核细胞。补体因子D (计算流体动力学),CFP参与替代途径补体的激活,也在树突状细胞中发现,计算流体动力学最突出、祖细胞(c13),假定的迁徙cDC2 (c8),以及在CD5^{- - - - - -}居民cDC2 (c5)和集群3(炎症cDC2)。

在interferon-associated基因,ISG15和IFI6几乎完全和高表达站在假定的迁徙cDC1 (c6)和巨噬细胞,分别。

据报道,维甲酸(RA)印记肠道的T细胞(72年,73年)和-最近回顾了在B细胞(IgA控制开关74年)。在这些研究中报道,粘膜的子集髓细胞似乎是专门生产RA,反映在他们独特的表达所需的酶。值得注意的是,在我们的数据集,我们发现高表达ALDH1A1只在巨噬细胞和一些ALDH1A2表达在细胞中分配给居民cDC1和迁徙直流集群。我们还发现CD103 (ITGAE)表达在华盛顿,这被认为是一个标记为“RA-DC”老鼠,与视黄酸受体的表达RARA,RARB,RARG,RXRA,RXRB基因)。值得注意的是,RA-responsive基因RARRES1和RARRES2(Chemerin)主要是巨噬细胞表达,后者也在迁移cDC1。

最后,semaphorins基因(SEMA4A,SEMA4D,SEMA4F,SEMA7A)及其受体(plexins等PLXNB2和PLXNC1和neuropilins如NRP1显示独特的表达模式在树突和单核细胞的集群。值得注意的是,semaphorin信号被认为是高度保守的跨物种(75年)及其监管角色先天免疫只是开始阐明(76年)。

3.9轨迹和牛肠系膜淋巴结的议员异质性的来源

scRNA-seq分析单核吞噬细胞的牛肠系膜淋巴结显示集群的居民直流(祖细胞,cDC1 cDC2、pDC),以及迁徙直流(假定的cDC1和cDC2),和一个集群包含moDC和潜在的炎症cDC2 DC3(图9)。单核细胞的细胞可以清楚地分为单核细胞和巨噬细胞,两种聚类根据pro和抗炎基因表达,并包含一组巨噬细胞增殖,可能引起善意淋巴结常驻巨噬细胞。见图9 b单核吞噬细胞的异质性,牛淋巴结可能源自血源性祖细胞(S1)分化成居民cDC1 (T1a和T1b),居民cDC2 (T2)和居民DC3 (T3)。高度激活迁徙直流(S2)可以进入通过传入淋巴。此外,cDC2可能分化成炎症cDC2 (T4)。单核细胞的细胞可能源自厘米进入淋巴结(S3),分化成抗原递呈moDC (T5)或通过抗原递呈monoctyes(类似intM血液)对越来越多的抗炎单核细胞(类似不合格品的血液),进一步为巨噬细胞(T6)。巨噬细胞可能获得抗炎或炎性基因表达开掘在他们占领的利基。或者,他们可能获得随着时间的推移越来越炎性基因表达(T7)。最后,自我更新的组织巨噬细胞(S4)可能导致的巨噬细胞(T8),显示一个转录组的终末分化monocyte-derived巨噬细胞。

R包Monocle 3是用于分析表达模式以及选择感兴趣的轨迹(图9 c和补充文件13)。计算图不支持结论的类型或方向分化,生物过程或细胞个体发生。

差异表达基因的数量(q < 0.05)轨迹之间的明显不同(补充文件13),从101个基因(f, moDC) 2370个基因(a, DCprog)。选择基因是可视化图9 c例如,显示主要的表达CST3在假定的早期祖细胞的树突细胞(图9 c),逐渐增加BOLA-DRA和B2M表达式在发展中对cDC1祖细胞(b)。祖细胞发展向cDC2 (c)逐渐调节CD74和LITAF,后者编码一个LPS-induced转录因子(77年)据报道(合作)调节炎症细胞因子的生产(78年)。值得注意的是,IL1B和抗凋亡BCL2A1显然是调节对假定的DC3 (d),导致炎症和轨迹cDC2 (e)包含一个subcluster细胞表达高水平的基因通常与一个激活状态有关,包括表达CCL3,亚兰和监管NFKBI和IL1RN。单核细胞分化对moDC (f)似乎至少是暂时性的表达FCER1A和移植BOLA-DRA而表达下调流星锤。在单核细胞和巨噬细胞(g),共用轨道桥接群细胞表达高水平的CSF3R,S100A8和/或张。事实上,对于原始轨迹在祖细胞,大多数差异表达基因细胞循环基因得到表达下调。同样的观察巨噬细胞增殖(h)。此外,LGALS1高度表达的这个轨迹(prolMac h)。值得注意的是,ATP6V0D2、编码溶酶体腺苷三磷酸酶建议endosomal TLR信号有至关重要的作用(79年,80年)和抗病毒反应(81年),越来越调节沿着这个轨迹导致假定的善意的巨噬细胞。

4讨论

在目前的研究中,我们应用了10倍基因组学和Illumina公司测序破译的单核吞噬细胞单细胞转录组牛肠系膜淋巴结。

目前的数据集是一个特别有趣的地方迁徙的直流子集的单细胞转录组的集合,使一个公正的看法已激活直流及其深刻的转录重新编程。我们确定了两个subclusters迁徙直流显然有不同的趋化因子基因的表达,可能包含cDC1 (c6;CXCL9,CXCL10)和cDC2 (c8;CCL17,CCL22)。interferon-inducible基因的高表达CXCL9和CXCL10可能表明迁徙cDC1占领一个利基在那里与CXCR3-expressing Th1和CD8 T细胞。事实上,高表达流星锤(mhc i)和B2M将支持专业化向CD8-T-cell交互。值得注意的是,CXCR3记录中发现了居民cDC1旁边CXCL9和CXCL10记录,显示居民的常见利基和迁徙cDC1促进抗病毒反应。最近的一项研究在老鼠认为CXCL9和CXCL10是由空间不同的直流子集,创造独特的微环境和支持不同的效应和记忆t细胞命运(82年)。在我们的数据集,大部分迁徙直流包含成绩单CXCL9和CXCL10,使划分纯粹基于微分这两种趋化因子的表达,而不太可能,至少在牛系统。

主要的表达CCL17和CCL22假定的迁徙cDC2建议中发现这些细胞是专门在吸引CCR4-expressing Th2 / Th17细胞亚群(49),可能创建一个利基支持这些细胞的生存和增殖IL-15表达式。此外,这些假定的迁徙cDC2被浓缩CXCR5成绩单,这表明他们定位接近b细胞支持卵泡卵泡辅助细胞分化(四氢呋喃)(2)。在这方面,生产可溶性CD25的直流已被建议作为一种手段支持四氢呋喃分化(83年)。CD25成绩单(IL2RA)发现在当前数据集很差,但主要是在集群与cDC2有关,包括集群8。我们之前报道明显upregulation 4小时后表面CD25表达体外刺激牛直流子集(36),使膜结合的表达和/或可溶性CD25可能通过激活直流机制来控制四氢呋喃分化也在牛淋巴结。

除了激活在外围,一些CCR7⁺直流也可能从居民DC分化,在淋巴结和调节激活CCR7为了表达对t细胞区迁移,老鼠最近描述(4)。事实上,一些细胞邻近居民cDC1也表达了CCR7,并显示一个更激活转录组。此外,耐受性和迁徙中可能存在免疫原性DC DC集群,作为分子变化已被证明是高度相似的激活状态(84年)。沿着这条线,最近mregDC描述(85年)可能包括,等著名的调控基因的表达CD274(PDL-1),PDCD1LG2(PDL-2),FAS,SOCS2在CCR7表达。

最近发现的DC3作为一个独立的直流血统(33,34)促使我们注意这些细胞在当前数据集。看着直流祖细胞的分支模式,不难想象,一些细胞集群3构成DC3,然而我们无法找到一个清晰的分离从公认的炎症cDC2和monocyte-derived直流。当然,看似收敛分化途径的几个细胞类型可能表示细胞的转录组构成的关键角色——它还有待决定如果这些炎症细胞在不同细分市场的微妙差异专门化的淋巴结,或如果有明显的冗余系统中,因为他们完成的任务对免疫系统的正常运转至关重要,因此生存。

高比例的单核细胞的细胞牛肠系膜淋巴结,据说也在小鼠和人类淋巴结(6,86年- - - - - -88年关于它们的功能角色),提出了几个问题,他们的起源和命运。树突的想法和单核细胞的细胞在淋巴结合作,优化自适应免疫反应,支持最近发现在老鼠身上,在炎症性单核细胞从血液进入淋巴结通过高内皮小静脉(HEV)和积聚在t细胞区,在那里他们提供优化效应t细胞分化(两极分化的细胞因子4)。符合这一点,我们发现牛mesLN单核细胞的细胞表达高水平的出售(CD62L)与CXCL16,吸引激活T细胞(89年为t细胞调节因子),并记录,如IL-16 IL-12B / IL-23A和IL-27 / IL-27B (EBI3)。古典单核细胞也描述前往淋巴结通过tissue-draining淋巴,炎症和稳态条件下(90年)。因此,小鼠moDC CCR7 upregulation能够被报道在活的有机体内(91年)。目前还不清楚如果牛单核细胞可以上调CCR7在活的有机体内。至少体外激活TLR-ligands并未导致CCR7转录和蛋白表达增加牛厘米(36)。此外,在目前的研究中我们没有发现任何CCR7成绩单在淋巴结派生的单核细胞的细胞。

我们最近scRNA-seq分析牛血单核细胞子集的支持不断分化从cM的想法通过intM钴锰(23)。还有待决定如果古典炎性单核细胞进入淋巴结可以区分两种细胞像intM外周血中发现牛,或者如果intM两种分化自己血液中可以进入淋巴结。几乎没有完整的从牛intM CD62L表达式(mRNA和蛋白)和不合格品的血液(23),将反对他们获得通过戊肝病毒,或者至少表明微分调节LN条目。

tissue-resident巨噬细胞生物学的描述是由四个不同的因素:1)起源(胚胎比monocyte-derived), 2)组织环境(如肺和肝),3)炎性环境,和(四)时间组织(92年)。与巨噬细胞的功能描述一致,我们的数据表明之间的分工,而抗炎巨噬细胞参与efferocytosis,与抗菌活性和巨噬细胞炎性概要文件。此外,循环检测巨噬细胞在当前数据集显然支持胚胎起源的假设自我更新的巨噬细胞存在于牛淋巴结。这些善意的巨噬细胞不分离作为一个单独的集群在我们的数据集,符合monocyte-derived巨噬细胞,通过niche-specific信号接受教育,获得非常相似,因此无特征的转录组。的表达TIMD4有关长期居留在稳态条件下,因此随着时间的推移在monocyte-derived调节巨噬细胞(26)。在当前数据集,不断增加的TIMD4表达在巨噬细胞集群因此可能表明monocyte-derived巨噬细胞分化的路径。的表达APOE也遵循了同样的模式,这表明APOE可能作为时间巨噬细胞分化的标志。

有人建议,组织分化的单核细胞巨噬细胞可以分成两个阶段(92年):快速分化,指导细胞留在组织利基(“在这里”信号)和第二阶段,monocyte-derived巨噬细胞能适应他们的环境集成信息组织类型和炎症状态(“学会”信号)。是有趣的推测,这第一个快速分化阶段可见UMAP数据集的投影,单核细胞和巨噬细胞与细胞的窄桥。过渡细胞的低频率将符合快速分化。同样,分化对moDC似乎是一个快速的过程,导致一个狭窄的细胞单核细胞和集群3在我们的数据集之间的桥梁。

进一步介绍了巨噬细胞异质性壁龛在同一个组织和间质和免疫细胞。淋巴结,描述了几种niche-specific子集的巨噬细胞(93年),比如被膜下的巨噬细胞和髓窦,捕捉lymph-borne抗原(94年,95年),巨噬细胞在淋巴结薄壁组织等在生发中心和髓索,和最近描述efferocytotic t细胞区巨噬细胞(96年)。我们的数据显示提供集群范围内的异质性等趋化因子受体基因的表达CCR1,CCR5,趋化因子受体CXCR4和CX3CR1,大概指导单核细胞的细胞“利基的住所”,进一步分化也取决于可用空间在利基(97年)。

当前研究的不足之处是,pDC只检测到一个非常小的集群(c17)。事实上,流仪分析表明在牛mesLN pDC的频率大大高于建议由我们scRNA-seq数据集(未发表的数据)。与控制策略用于单核吞噬细胞在目前的研究我们旨在减少污染和淋巴细胞,但与此同时我们排除了大多数pDC Flt3表达相对较低的水平。未来研究将不得不解决pDC淋巴结和调查例如如果pDC存在于一个特殊的cDC2-like子集激活状态,作为人类和小鼠的描述过渡直流19,29日,98年- - - - - -101年)。表明这些过渡DC在当前数据集可能是一小部分细胞空间聚类与pDC (c17)被分配给一个cDC2集群(c9)。一般来说,作者不能排除,浓缩细胞的流式细胞仪可能特别排除特定数量的直流或单核细胞/巨噬细胞。此外,有一个足够大的样本容量和/或集成多个样本进行结论至关重要复杂的细胞成分和轨迹,包括罕见的移行细胞状态,从比较明显的个别样品回去给我们的集成数据集。

与目前的研究我们提供第一次深入的单细胞分析牛单核吞噬细胞室的淋巴结。轨迹的区别,很可能反映出一般原则淋巴结跨物种的议员动力学。他们中的一些人之前报道,如居民DC的分化血源性祖细胞在淋巴结(102年,103年),其他的还不清楚,如单核细胞的细胞的起源和分化途径和善意的巨噬细胞在次级淋巴组织,或炎性直流子集的看似收敛功能(包括DC3)和monocyte-derived直流。

生成的假设在这个手稿对更好的理解是一个重要贡献的单核吞噬细胞间淋巴结,特别是当承认基本DC和单核细胞生物学在哺乳动物似乎基本上是守恒的。空间分析在未来的研究应该帮助定义niche-specific转录组巨噬细胞和树突细胞微环境特征,单核细胞和t细胞形状自适应免疫反应——交互基本见解议员生物学,人类和兽医都将受益。

数据可用性声明

给出的数据存入ENA库的研究中,加入PRJEB57581数量(https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB57581)。

道德声明

伦理审查和批准没有动物所需的研究因为淋巴结收集在一个屠宰场屠宰的副产品。

作者的贡献

GB执行实验室工作、分析数据,并写了初稿的手稿。圣执行数据分析准备数据,写了最后的手稿。可和RB进行生物信息学分析。圣,设计并监督整个项目。所有作者的文章和批准提交的版本。

确认

我们感谢科琳拥抱(新)生产重组牛Flt3L斯特凡•穆勒(fcc,伯尔尼大学)排序,帕梅拉·尼科尔森、Catia Coito Tosso里氏从捷平台伯尔尼大学的单细胞RNA序列。前一个版本的手稿可以在预印本服务器bioRxiv (104年)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1099357/full补充材料

引用