Hcp1-loaded葡萄球菌疫苗预防急性类鼻疽囊泡膜gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

伯克举办gydF4y2Ba是一个危险的病原体导致类鼻疽,热带传染病的临床表现不同的局部脓肿全身败血症(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。人类类鼻疽阿尔弗雷德·惠特莫尔博士于1911年第一次描述了仰光,缅甸,这种疾病已被忽视,直到1985年泰国的传染病协会已经使人们认识到类鼻疽非凡的公共卫生问题(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。的全球分布gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba尤其是在热带地区如南美和加勒比地区,东南亚,澳大利亚北部,印度次大陆,结果165000年估计人类每年类鼻疽病例和53.9%的高死亡率(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba可以征服和侵袭身体的多个器官,包括大脑、肺、肝、肾、皮肤,和广泛的组织趋向性的gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba对类鼻疽的发展(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba由于变量)和复杂的诊断疾病的临床表现(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba本质上是耐多种抗生素(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),抗菌治疗不足会导致死亡率超过70% (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba被公认为B类生物制剂由美国疾病控制和预防中心(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。高患病率和潜在的生物的威胁gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba呼吁有效的疫苗。然而,商业疫苗类鼻疽仍然不可用。gydF4y2Ba

实质性的努力已经给近年来类鼻疽疫苗的开发。临床前研究表明,灭活全细胞(如paraformaldehyde-killedgydF4y2Bab .举办gydF4y2BaA2 (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba))和减毒活疫苗(如营养缺陷型的变异ΔgydF4y2BailvIgydF4y2Ba(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)疫苗可以防止20% - -80%的接种小鼠致命细菌的挑战。然而,消毒免疫力不是实现(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。相比之下,与一个或多个亚基疫苗抗原被认为是安全防护。因此,选择和评估潜在的候选抗原gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba吸引了科研界的关注。许多抗原,如脂蛋白导出系统组件LolC (gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),外膜蛋白OmpW (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),热休克蛋白GroEL (gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),三聚物的autotransporter adhesin PSL2063 (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)、BopA III型分泌蛋白(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),和VI型分泌系统(T6SS)相关hemolysin-coregulated蛋白质(Hcp;包括Hcp1、Hcp2 Hcp3, Hcp6) (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),已确定候选疫苗进行进一步调查。然而,这些亚基疫苗候选人没有先进的临床试验由于缺乏合适的运载系统。gydF4y2Ba

细菌膜囊泡(MVs)纳米结构自然分泌的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性(也称为外膜小泡,omv)在增长(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。MVs可以合并细菌蛋白质,有效刺激特定的体液和细胞免疫反应,格兰特和非凡的保护后续细菌感染(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。细菌的先天特点MVs支持候选疫苗,并提供优秀的疫苗运载系统(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。细菌MV疫苗成功的例子是两个许可脑膜炎球菌疫苗血清组B (MenB) MV指定为MenB-4C MenB-FHbp,可以防止所有14致病性脑膜炎球菌菌株引起的感染测试(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。一个安全的葡萄球菌已被删除之前构造整个平台gydF4y2BaagrgydF4y2Ba基因组的轨迹gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba应变RN4220, RN4220-Δ至少有四个主要组件gydF4y2BaagrgydF4y2Ba突变体能够交付MVs登革热病毒的抗原,可诱发特定抗体的所有四种血清型登革病毒(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

作为亚单位疫苗候选人对类鼻疽Hcp1是一种结构蛋白形成T6SS分泌管和一个重要的效应有关gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba发病机制(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。Anti-Hcp1特定的抗体,包括IgM和免疫球蛋白,存在于患者的血清类鼻疽,表明反对Hcp1体液反应的发展(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。在目前的研究中,gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba基因是基因在坐标系融合基因编码β亚基丙酮酸脱氢酶E1组件(PdhB),上述主要水泡组件之一gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba。的免疫BALB / c小鼠Hcp1-loaded MVs来自RN4220-ΔgydF4y2Baagr / pdhB-hcp1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs)产生特定抗体效价高,同时防止大约70%的接种小鼠急性腹腔内与致命的挑战gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba,强调技术进步在发展中类鼻疽疫苗。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

菌株质粒,其经济增长的条件gydF4y2Ba

在这项研究中使用的质粒和菌株中列出gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba菌株培养从冰箱股票和条纹在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB;英国Oxoid)琼脂16 h在37°C。细菌的菌落接种到2毫升的TSB和孵化16 h与搅拌在37°C。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株生长在Luria肉汤(磅)介质或镀磅琼脂16 h在37°C。gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba菌株培养从冰箱的股票和传播与200磅琼脂补充μM FeSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO为48小时37°C。细菌菌落接种到2毫升的磅肉汤和培养在37°C 16 h和风潮。在需要时,文化与100μg /毫升的补充卡那霉素(菅直人)或50μg /毫升的氨苄青霉素(Amp)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和10μg /毫升的氯霉素(Cm)gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba带有重组质粒。gydF4y2Ba

质粒pBT2和gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba太阳RN4220成员去宝华教授(中国科学技术大学)。gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba应变BPC006临床标本分离的一个病人在医院,海南人民医院(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),并请提供毛Xu-hu教授(军队医科大学)。gydF4y2Ba

建设gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba应变生产Hcp1-loaded MVsgydF4y2Ba

构建gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN4220-ΔgydF4y2Baagr / pdhB-hcp1gydF4y2Ba,gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba基因被放大gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba使用底漆对hcp1-F / R BPC006基因组DNA (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)。同源重组,左侧区域(Up-pdhB)和右区域(Down-pdhB)的终止密码子gydF4y2BapdhBgydF4y2Ba基因的gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba使用引物从基因组DNA扩增uppdhB-F R / R和downpdhB-F / (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba),分别。融合生成片段PCR重叠使用gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba基因片段,Up-pdhB, Down-pdhB模板。融合DNA消化了gydF4y2BaBamgydF4y2BaH I /gydF4y2Ba囊gydF4y2Ba我和结扎限制性内切酶热敏穿梭载体pBT2gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba吉布森装配主混合(美国内)。结果向量pBT2-hcp1首先转换成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α随后electroporatedgydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba应变RN4220-ΔgydF4y2Baagr。gydF4y2Ba无缝的gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba插入突变体指定为RN4220-ΔgydF4y2Baagr / pdhB-hcp1gydF4y2Ba如前所述(RN-Hcp1)筛选(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),通过PCR扩增、DNA测序证实。gydF4y2Ba

制备细菌MVsgydF4y2Ba

细菌MVs准备gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba文化上层清液如前所述(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。简单地说,一夜之间的文化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba感兴趣的菌株接种到1 L TSB(1:10 0)和孵化20 h在37°C摇(200 rpm)。文化上层清液离心收集的5000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟去除细菌细胞,然后透过0.45μm Millex注射器过滤器(Beyotime)来删除任何剩余的细胞碎片。滤液集中约60倍的超滤系统的拦截分子量100 kDa (Shenchen,中国)。文化上层清液然后在200000×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 3 h, MV丸resuspended在磷酸盐(PBS, pH值7.2)后两个洗PBS。MV样品的蛋白质含量是决定使用一个增强BCA蛋白质化验设备根据公司提供的指令(Beyotime)。在-80°C MVs被存储为整除。gydF4y2Ba

透射电子显微镜(TEM)观察gydF4y2Ba

的纯化Hcp1-loaded MVs被添加到230 -网格formvar铜/碳涂层网格(Zhongjingkeji科技,中国),和负面沾2% (m / v) uranylacetate标签,然后为30秒。电镜下观察Hcp1-loaded MVs 1:20稀释在《缓冲区(10毫米Tris-Cl, pH值7.0,100毫米氯化钠)和吸附到230 -网格formvar /镍碳涂层网格。5分钟后用TBS缓冲区(50毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,pH值7.5),3%的标本被(m / v)牛血清白蛋白(BSA)在TBS 45分钟。Mouse-anti-Hcp1抗体1:50 0稀释1% (m / v) BSA / TBS和应用于镍网格在室温下为1.0 h。与TBS洗了三次后,gold-conjugated goat-anti-mouse免疫球蛋白(美国σ)添加和孵化为1.0 h在室温下。接下来,网格和TBS洗两次,一次水,其次是负面沾2% (m / v) uranylacetate 15秒。电子显微图记录用JEM1011显微镜(日本JEOL) 100千伏加速电压。gydF4y2Ba

表达和纯化的重组Hcp1gydF4y2Ba

重组Hcp1 (rHcp1)表达和纯化与少量修改(如前所述gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。简单来讲,gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba基因从基因组DNA的放大gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006使用底漆对pET28a-F / R (gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba),克隆到表达载体pET28a生成pET28a -gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba应变BL21 (DE3)窝藏产生的质粒pET28a -gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba生长在1.0 L新鲜磅肉汤在37°C到0.5和0.5毫米IPTG诱导的OD600在37°C 6 h。蛋白质纯化,细菌细胞被离心收获5000×在4°C g 30分钟由声波降解法和细胞溶解在缓冲(Tris-HCl 50毫米和200毫米氯化钠,pH值8.0)。在16000×g离心后在4°C 30分钟去除细胞碎片,上层清液收集并再次离心机在10000 g×30分钟,一个0.22毫米过滤器过滤单元(Beyotime),并应用于一个Ni-NTA树脂列(美国通用电气)预平衡缓冲a .列与缓冲洗,紧随其后的是一个混合的缓冲区的线性梯度5% - -100% (v / v)缓冲B(缓冲区包含500毫米咪唑)删除是非绑定和洗提目标蛋白的蛋白质。蛋白纯度分析了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和包含目标蛋白质主要的分数被收集和透析对缓冲区删除咪唑的5倍。rHcp1蛋白质的浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯)。整除的蛋白质纯化rHcp1储存在-80°C。gydF4y2Ba

sds - page及免疫印迹gydF4y2Ba

蛋白质样品中可溶性5×sds - page示例缓冲和加热到100°C离心10分钟。之后,样本上层清液被加载和蛋白质12% sds - page分离。蛋白质是可视化gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba染色与Coomassie蓝色的r - 250。免疫印迹,页面上的蛋白质凝胶electrotransferred到PVDF膜(Beyotime)。膜被5%的脱脂牛奶在高盐Tris-buffered盐水(HS-TBS;20毫米三,500毫米氯化钠,pH值7.5)在室温下60分钟。然后,细胞膜是孵化一夜之间在4°C的1:10,000稀释gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaHcp1-specific多克隆抗体。与PBS-T洗五次后(PBS包含Tween-20 0.05%),膜是孵化为1.0 h在37°C的1:5,000 goat-anti-mouse IgG-horseradish过氧化物酶共轭(Solarbio)。污点是可视化使用皮尔斯ECL免疫印迹基质(热科学)和ChemiDoc XRS成像系统(Bio-Rad)。gydF4y2Ba

半数致死量(LD50)的决心gydF4y2Ba

雌性BALB / c小鼠(年龄在6 - 8周)从军队医科大学动物中心购买(第三军医大学)和ABLS-2更为接近gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba五天前实验室实验。所有老鼠热压处理过的颗粒饮食和无菌水在以下住房条件:23°,50%的湿度,半天光明/黑暗时期,以最小的干扰和安静的环境。实验过程中对动物进行按照规定管理事务有关实验动物经中国国务院批准。颈椎脱位是应用实验动物安乐死的方法。gydF4y2Ba

50 LD50测定,雌性老鼠通过与不同浓度的腹腔内路线的挑战gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba应变BPC006 (3.0×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba,6.0×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba,1.0×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba,3.0×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba和6.0×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba那么,gydF4y2BangydF4y2Ba每组)= 10。感染小鼠监控为生存超过21天,和LD50使用幸福方法计算了SPSS软件。gydF4y2Ba

小鼠免疫和感染gydF4y2Ba

麻醉BALB / c小鼠(即分组和多站点管理路线。,subcutaneous, intramuscular, and intraperitoneal) by three-dose vaccination regimens with (i) 100 µL PBS, (ii) 50 µg^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs(100年µL PBS)准备gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba(RN),(3) 50µggydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs来自gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba50µg RN-Hcp1 (iv)gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs弗氏佐剂乳化与50%(美国σ),和0.2 (v)µg rHcp1蛋白质(等于50µg Hcp1的数量gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs)在-30年,-20年和-10年prechallenge。第三提高后十天(0),接种疫苗的老鼠被感染gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba腹腔内的致命剂量(5×LD50)gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006。挑战老鼠监控行为变化和生存时间超过21天。gydF4y2Ba

检测gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba特定的抗体gydF4y2Ba

过程中鼠标疫苗接种,从免疫小鼠血清(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)去年接种后7天(第三天prechallenge)收集和抗体gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaHcp1测定酶联免疫吸附试验(ELISA)作为描述(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。短暂,96 - Maxisorp板块(Nunc)涂在一夜之间在4°C rHcp1 (50 ng / mL)可溶性碳酸盐缓冲(pH值9.6)。盘子被封锁在室温为1.0 h StartingBlock T20阻断缓冲区(皮尔斯)。阻塞后,盘子都洗了三次TBS-T (Tris-buffered盐水补充10% StartingBlock T20和0.05%的渐变20,pH值7.5)。然后,双重的稀释血清样本由TBS-T、井添加一式三份,孵化为2.0 h在37°C。与TBS-T洗了三次后,盘子是孵化为1.0 h与山羊在37°C anti-mouse IgG-horseradish过氧化物酶共轭(1:5,000稀释,Solarbio)。孵化后,盘子洗了三次TBS-T和开发的EL-ABTS显色试剂盒(Sangon生物技术)和阅读在405 nm通过使用FLUOstarω标(BMG Labtech)。稀释展示光学密度最高的倒数(OD)是2.1倍,相对于正常小鼠血清抗体的滴度水平被用来确定端点为个体接种疫苗的老鼠。gydF4y2Ba

检测炎症因子gydF4y2Ba

从个体接种小鼠血清样本收集后6 h '疫苗接种(-30天),-20天,-10年和3 prechallenge, 0.5天,1、2和5 postchallenge (gydF4y2BangydF4y2Ba每个时间点= 3)。然后,炎症因素TNF-α和il - 6水平与酶联免疫试剂盒测定血清样本根据制造商的指示(美国研发系统)。检查结果与ELISA读者Multiskan Mk3(热费希尔科学)450海里,和炎症因子水平根据标准曲线测定。gydF4y2Ba

细菌负担感染小鼠的器官gydF4y2Ba

器官,包括肺、肝脏和脾脏,收集从接种小鼠postchallenge 0.5和5天,并受集落形成单位(CFU)枚举平板稀释法。简单地说,接种小鼠(gydF4y2BangydF4y2BaPBS组= 50,gydF4y2BangydF4y2Ba= 25 /其他组)被感染gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba腹腔内的致命剂量(5×LD50)gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006天0。十二个感染小鼠器官细菌计数(0.5天牺牲了gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)和组织学评价(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)。仍在第五天postchallenge老鼠牺牲。细菌计数,老鼠的器官是收获,重,均质在PBS运用Covidien精密组织研磨器(费舍尔科学)。组织匀浆在PBS稀释10倍,镀在磅琼脂,培养48 h在37°C。殖民地被数。gydF4y2Ba

老鼠的器官的组织学评价gydF4y2Ba

肺部、肝脏和脾脏收集从接种小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)0.5和5天postchallenge用于组织学评价。各个器官正常缓冲福尔马林固定的10%。内的固定组织石蜡和分段染色之前hematoxylin-eosin(他)。组织切片在显微镜下观察(日本奥林巴斯BX53)和拍照。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有实验至少三次。使用GraphPad Prism 8.0执行统计分析软件。单向方差分析(方差分析),或双向方差分析方法用于比较的方法从多个组织和评估统计学意义。所有的值被表示为平均值±标准派生(SD)或标准错误的手段(SEM)。显著差异表达为*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,或者* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

建设gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba应变生产Hcp1-loaded膜囊泡gydF4y2Ba

的gydF4y2Bahcp1gydF4y2Ba基因的gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba应变BPC006放大PCR和基因融合的3′末端gydF4y2BapdhBgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba突变RN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba(RN) Hcp1加载到葡萄球菌MVs。在坐标系融合的目标基因PCR扩增、DNA测序验证了(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba),被指定为RN4220-Δ合成压力gydF4y2BaagrgydF4y2Ba/gydF4y2BapdhB-hcp1gydF4y2Ba(RN-Hcp1)。gydF4y2Ba

产生的MVs工程化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN-Hcp1 (gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs)准备和免疫印迹显示成功的融合蛋白的存在与分子量约为57 kDa的总细胞溶解产物RN-Hcp1和gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}通过使用PdhB MVs多克隆抗体作为探针。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN基因突变及其派生的gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs提出了野生型PdhB低分子量(37 kDa,gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。当多克隆抗体Hcp1被使用,只有感兴趣的蛋白质总细胞溶解产物RN-Hcp1和检测gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}RN MVs而不是突变gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。TEM显示不同大小的纯化MVs (gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba),immuno-electron显微镜显示,膜的位置Hcp1蛋白(gydF4y2Ba补充图3 b, CgydF4y2Ba)。这些数据表明,工程gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN-Hcp1可以成功产生Hcp1-loaded MVs。gydF4y2Ba

总体表现和Hcp1-loaded MV免疫后小鼠的体液免疫反应gydF4y2Ba

与PBS BALB / c小鼠免疫,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助和重组Hcp1 (rHcp1gydF4y2BangydF4y2Ba每组)= 10 three-dose方案每隔10天gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba(即多个路线。,subcutaneous, intramuscular, and intraperitoneal) to assess the effects of Hcp1-loaded MVs on tested animals (图2一个gydF4y2Ba)。MVs——或者rHcp1-challenged老鼠的身体重量显示在免疫过程中没有区别与PBS-challenged老鼠相比(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。所有接种疫苗的老鼠表现出良好的精神状态,光滑的皮毛,正常的食物和水的摄入,营养正常的姿势和步态,可比。从接种小鼠血清(gydF4y2BangydF4y2Ba每组)= 3天3 prechallenge被用来确定rHcp1利用间接ELISA抗体反应。结果显示,总血清免疫球蛋白抗体的效价gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-immunized老鼠在所有组中最高(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。小鼠的血清收到了'和两促进gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs疫苗接种证明高免疫球蛋白浓度比rHcp1,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs-vaccinated老鼠(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba),建议部分葡萄球菌MVs的佐剂效应。gydF4y2Ba

炎症因子Hcp1-loaded MV免疫后生产gydF4y2Ba

炎症因子的水平生产呈现系统性炎症引起的身体细菌或毒素(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。然而,某些抗原或佐剂可以激活免疫细胞分泌细胞因子,如TNF-α、il - 6、il - 12,参与促进Th1免疫反应(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。血清与PBS BALB / c小鼠接种疫苗,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助和rHcp1 (gydF4y2BangydF4y2Ba每个时间点= 3)收集后6 h '疫苗接种(-30天),-20天,-10年和3 preinfection,并受量化的il - 6用ELISA和TNF-α水平。所示gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba老鼠,il - 6水平'疫苗接种后6 h(-30天)gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助与PBS和rHcp1-vaccinated相比显著增加小鼠(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。TNF-α水平免疫小鼠后6 h '的疫苗接种gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助和gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs显著增加相对于PBS-challenged老鼠,而可比TNF-α水平观察老鼠的疫苗接种后6 hgydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs rHcp1。此外,il - 6和TNF-α水平gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助-,rHcp1-injected集团在-20天,-10年,3较低和可比性与PBS-injected集团(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。这些数据表明,Hcp1-loaded MV疫苗是安全的,只有引起炎性因子增加生产期间的早期阶段主要的免疫接种。gydF4y2Ba

保护Hcp1-loaded MV疫苗的能力gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

半数致死量(LD50)决心评估Hcp1-loaded MV的保护性的曲目gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba挑战。雌性BALB / c小鼠腹腔内各种剂量的挑战gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006 (3.0×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba,6.0×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba,1.0×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba,3.0×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba和6.0×10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU)。鼠标生存是21天postinfection监控和SPSS软件的幸福的方法表明,LD50为5.75×10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU (gydF4y2Ba补充图4gydF4y2Ba)。与PBS BALB / c小鼠接种疫苗,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助或rHcp1 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 10 /组)由three-dose方案每隔10天,然后感染了致命剂量的gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006后10天(5×LD50)最终推动评估MV疫苗的保护能力。所有被感染的老鼠接受pbs组迅速死于致命的挑战gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006(< 7天)。gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs——或者rHcp1-vaccinated老鼠存活后不到20天gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba感染。相比之下,免疫接种gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs和gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助保护小鼠的60%和70%,分别从致命的细菌挑战生存时间超过21天(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在接种疫苗后小鼠炎性细胞因子生产gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

接种小鼠的血清样本0.5天,1、2和5 postinfectiongydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006收集并受炎性细胞因子水平的决心。所示gydF4y2Ba图5gydF4y2BaTNF-α和il - 6的水平接受pbs老鼠五天后致命细菌暴露比其他组明显升高,随着时间的增加。相比之下,TNF-α和il - 6水平gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-immunized小鼠5天postchallenge不断下降后0.5天的感染(TNF-α除外)。值得注意的是,炎性细胞因子水平gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-vaccinated小鼠显著增加0.5天的接触后,迅速下降,然后保持在低水平。在后早期炎性细胞因子水平的增加gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba暴露可能导致细菌清除率(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

细菌接种小鼠负担后细菌的挑战gydF4y2Ba

强大的疫苗导致细菌清除率gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。与PBS BALB / c小鼠接种疫苗,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助或rHcp1 (gydF4y2BangydF4y2Ba每组)= 9,组织样本的肺,肝脏,脾脏免疫小鼠获得0.5和5天postchallenge致命gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba。细菌枚举显示可行的细菌收集的器官gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-immunized老鼠0.5天postchallenge下降比其他组(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助-免疫小鼠的证明无法觉察的可行的细菌的三天组织5 postinfection (gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。结果还表明,所有老鼠免疫gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs或gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助表现出没有检测到细菌在组织5 postinfection(天gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。这些数据表明,Hcp1-loaded MV疫苗是一种很有前途的候选人gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba间隙,防止急性类鼻疽。gydF4y2Ba

组织病理学分析受感染的老鼠组织gydF4y2Ba

肺部、肝脏和脾脏的老鼠注射了PBS,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助或rHcp1 (gydF4y2BangydF4y2Ba收集每组)= 2 0.5天,1、2和5 postchallengegydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006,进行组织病理学分析。在毛看来,肝脏的正常形态,脾脏,肺中维护gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-vaccinated小鼠感染后5天。然而,白色的小脓肿形成的肝脏、脾脏、肺PBS-immunized小鼠5天postinfection和肝脏肿大和肺表面粘液性分泌物也观察到(gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

组织部分,包括肺、肝脏和脾脏,准备,苏木精和伊红染色(他),并分析了由病理学家盲目的方式。组织病理学分析显示,肺部、肝脏和脾脏gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-immunized小鼠5天postinfection展出正常组织架构(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。相比之下,肺部、肝脏和脾脏的动物接种疫苗gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs几乎是正常的,除了一些地区温和的间质炎症。在肺的bronchovascular炎症入渗的观察gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs——或者rHcp1-vaccinated老鼠表示天postchallenge (gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba)。Bronchovascular渗透是一个普遍的特征与PBS小鼠的肺中接种疫苗。此外,频繁的间质炎症和多核巨细胞浸润PBS-vaccinated小鼠的脾脏也观察到细菌的挑战(五天后gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。总的来说,这些数据证明的vaccinogenic潜力Hcp1-loaded葡萄球菌MVs。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

尽管许可疫苗是不可用,许多对类鼻疽候选疫苗,包括灭活全细胞(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)、减毒活疫苗(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),亚基(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),glycoconjugate (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),DNA (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)和病毒基于矢量(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)疫苗,近年来被研究过。然而,这些疫苗可能是因为只有部分保护gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba是一种细胞内的有机物在巨噬细胞,中性粒细胞,单核细胞,这样就避免了诱导保护性免疫反应(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。Nieves等人准备MVs自然来自gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba菌株1026 b (gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)和显示,疫苗接种BALB / c小鼠MVs提供相当大的防止感染性(100%)和肺(60%)类鼻疽(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。然而,自然MVs通常富含毒性因素,如脂多糖(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),MVs由野生型的应用gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba菌株引起安全问题。在先前的研究中,一个基因位点删除gydF4y2BaagrgydF4y2Ba系统是用来生成一个gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba应变RN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。从RN4220-Δagr MVs准备(gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs)显著减弱,PdhB是最丰富的组件中gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs,适用于异构抗原从细菌分泌MVs。这个安全的基础上蛋白质交付平台,的基因gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaHcp1保护性抗原基因融合gydF4y2BapdhBgydF4y2Ba在gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba,所产生的保护性免疫反应gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs接种急性类鼻疽是本研究评估。gydF4y2Ba

最近的研究显示,抗体应答反应中发挥重要作用的保护减毒活疫苗vaccine-vaccinated老鼠gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba感染,bacterium-specific细胞反应做出微小的贡献(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。在这项研究中,与rHcp1蛋白质无佐剂疫苗接种three-dose方案产生了抗体水平与PBS所用控制(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba),表明免疫佐剂的要求,如弗氏佐剂(gydF4y2Ba47gydF4y2Baσ),辅助系统(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),CpG DNA (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),在亚单位疫苗免疫接种。相比之下,疫苗接种的小鼠Hcp1-loaded MVs (gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs)在缺乏佐剂产生相当大的体液反应(血清免疫球蛋白效价> 1:400)与小鼠的免疫接种gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}不封装的MVs Hcp1 (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba),表明葡萄球菌的佐剂效应gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs Hcp1。然而,的佐剂效应gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs仍部分因为老鼠的免疫接种的配方gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /佐剂诱发高特定的抗体(免疫球蛋白浓度测定> 1:51,200,gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。MVs的self-adjuvant活动可能是由于其为病原体vesicle-related的分子模式的存在(pamp),它可以识别病原体先天免疫细胞上的受体结合增强抗原递呈功能(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。MV辅助活动非常相关的类型和数量pamp纳入囊泡(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。作为异构MVsgydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba在葡萄球菌Hcp1, pamp及其功能gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs值得进一步调查。gydF4y2Ba

亚单位疫苗,rHcp1之前准备用σ佐剂混合,和BALB / c小鼠接种三种接种10µg rHcp1间隔2周和感染的蛋白质gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaK96243应变三周后最后的提振。结果表明,rHcp1 /辅助可以防止50%的小鼠致死剂量的挑战但未能阻止慢性殖民(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。在这项研究中,无法防止急性类鼻疽是疫苗接种BALB / c小鼠后观察gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}只MVs或rHcp1蛋白(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。值得注意的是,类似post-challenge rHcp1——之间的生存模式观察gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs——免疫小鼠。疫苗接种无佐剂的rHcp1配方可以提高post-challenge BALB / c小鼠的生存gydF4y2Ba举办。金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba派生的gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs没有特定的抗原gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba然而,gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs可以表现出内在的辅助活动(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。pamp参与gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs可能激活先天免疫细胞,如树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞,在病原体提供某些角色失活(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。相比之下,工程gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs保护60%的BALB / c小鼠免受致命的挑战与BPC006和制定gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助保护70%的小鼠急性类鼻疽。相比rHcp1蛋白质/辅助制定(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),防护能力的提升gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs可能归因于内在adjuvanticity葡萄球菌MVs。pamp封装在细菌MVs也可以激活免疫细胞分泌细胞因子,促进Th1免疫反应(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。一致,小鼠血清TNF-α和il - 6水平'疫苗接种后6 h(-30天)gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /辅助与PBS对照组相比明显增加。接种小鼠的血清TNF-α和il - 6水平gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs也显著增加,然后逐渐降低到正常水平在-20天,-10年,3 prechallenge (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。这个结果和发现在前面的研究是一致的gydF4y2Ba^{ΔagrgydF4y2Ba}MVs接种诱发炎症因子生产水平低于MVs源自于野生型gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba应变(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。然而,炎性细胞因子的水平,尤其是TNF-α,的gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs / adjuvant-vaccinated小鼠后0.5天明显增加gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba接触(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。增加炎症细胞因子水平在早期感染后可能导致细菌清除率(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),这是部分证实了细菌计数从受感染的老鼠器官(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。相比之下,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs-vaccinated动物血清TNF-α和il - 6水平较低整个实验周期。这一现象背后的原因尚不清楚,和之间的关系gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MV-stimulated炎性因子水平及其保护潜在的利益是值得进一步研究。gydF4y2Ba

一个重大的挑战在发展中疫苗由兼性胞内病原体引起的疾病是主机的能力达到消毒免疫(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。重要的是,接种gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs或gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /佐剂可以达到消毒的免疫力。可耕种的细菌不确定肺、肝脏和脾脏gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs——或者gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}在第五天postinfection MVs / adjuvant-vaccinated老鼠gydF4y2Bab .举办gydF4y2BaBPC006,而大多数PBS-inoculated老鼠(66.7%)有细菌负担他们的器官(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。此外,后接种小鼠的器官组织组织病理学与挑战gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba评估,数据显示减少组织病理学变化,减少间质炎症病灶,并拒绝多核巨细胞数字吗gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs /佐剂接种小鼠与PBS-injected老鼠相比(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。这些离散器官细菌负担和组织病理学观察表明,疫苗接种的Hcp1-loaded MVs有助于特定免疫反应的诱导,达到控制感染和防止传播类鼻疽病在不同的器官。我们的观察关联与先前发现病原体间隙中观察到gydF4y2Bab . malleigydF4y2Ba减毒活疫苗vaccine-vaccinated老鼠与细菌挑战后间隙(88%)(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总之,我们的数据表明,Hcp1,管组件和T6SS分泌效应gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba是一种有效的候选疫苗,工程化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaRN4220-ΔgydF4y2BaagrgydF4y2Ba/gydF4y2BapdhB-hcp1gydF4y2Ba能成功地生产gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs,保护电位gydF4y2Bab .举办gydF4y2Ba急性感染。我们已经到了一个有趣的部分葡萄球菌MVs的辅助活动。添加佐剂gydF4y2Ba^{hcp1gydF4y2Ba}MVs将进一步提高保护能力,刺激一个增强杀菌豁免权完整的细菌清除率。总体而言,我们的研究结果提供一个新方法开发类鼻疽疫苗的发展,并提供有价值的见解抗原性上定义,安全,有效的MV疫苗。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba。进一步调查可以直接到相应的作者。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

动物研究是由第三军医大学进行审核和批准。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

XR, RZ和ML设计实验,修订后的手稿。KZ, GL, MZ, XP和JL进行实验和解释数据。KZ, GL和年调查数据和数据。XR和年编辑的手稿。所有作者回顾了草稿和批准提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了国家自然科学基金(82071857和82071857)。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢Xu-hu毛泽东和成龙拉奥(临床微生物学和免疫学、医学学院实验室,军队医科大学)对动物实验的性能。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1089225/full补充材料gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba