层蛋白B受体复发性中度骨骼发育不良的产前诊断
交给沈
李之1
__，
Minyue董
音)风扇- 1湖州市妇幼保健院产前诊断中心，湖州市
- 2浙江大学医学院附属妇女医院，中国杭州
- 3.生殖遗传学教育部重点实验室(浙江大学)，杭州
膜蛋白B受体(LBR)基因位于染色体1q42.12，编码层蛋白B受体，一种与层蛋白B结合的细胞内蛋白质。LBR突变与广泛的表型谱相关，从非致命性到致命性骨骼发育不良。典型的表型包括Pelger−Huet异常(PHA)和胚胎致死性格林伯格发育不良(GRBGD)。随着对该基因的进一步研究，在不同个体中发现了其他表型。这项回顾性研究分析了中国胎儿的周期性产前中度骨骼发育不良。胎儿核型和芯片均未检测到畸形，而全外显子组测序鉴定出纯合子变体(NM_002296.4:c.1757G> a，NP_002287.2p.Arg586His)的第14外显子LBR两个胎儿都有基因。经Sanger测序，对父母的突变分析证实c.1757G>A为杂合。密集的生物信息学分析和家族共分离分析表明，该基因存在纯合子变异LBR基因是这种周期性的产前中度骨骼发育不良的原因。此外，中度骨骼发育不良不同于典型的GRBGD表型。我们的发现是基于DNA碱基检测和骨骼发育不良的产前诊断，这有助于正确的表型，有助于更好地理解表型和基因型之间的相关性。
简介
的LBR双功能蛋白是由基因编码的吗LBR．它具有影响中性粒细胞核分裂和甾醇还原酶活性的双重作用。这个基因的突变可以影响一系列的表型。变异可能会影响固醇还原酶活性，导致胆固醇合成失败和固醇代谢物胆固醇- 8,14 -dien-3-ol水平升高(在GRBGD胎儿中累积)，导致发育中的胎儿特定骨骼异常和致命的围产期发育不良。它还可引起中性粒细胞分化缺陷，其特征是核碎片数量减少(哑铃形双孔核)和核染色质粗聚集，导致Pelger - Huet异常(PHA)和Reynolds综合征。也有轻度骨骼发育不良，Pelger - Huet异常伴轻度骨骼发育不良(PHASK)。相关研究报道了11例格林伯格发育不良胎儿的临床特征，其中双等位致病变异体已在文献中被鉴定LBR在七宗个案中(格林伯格等人，1988年；Chitayat等人，1993；霍恩等人，2000年；Waterham et al.， 2003；Konstantinidou等人，2008年；克莱顿等人，2010；乔治等人，2019年)．其余4例临床表现与格林伯格发育不良相似，均由固醇代谢障碍引起(Gregersen等人，2020年)．在Carty的报告中描述了两个胎儿的斑点状骨干发育不良(Carty等人，1989年)， Astley和Kendall的报告中描述了另外两个胎儿的Astley - Kendall发育不良(阿斯特利和肯德尔，1980年)和三个中间表型胎儿在Elçioglu的研究中描述(Elçioglu和Hall, 1998)．因此，格林伯格发育不良具有骨骼发育不良的多重特征，其严重程度各不相同。
在本研究中，两名患有中度骨骼发育不良的胎儿伴有c.1757G >a纯合变异LBR对基因进行研究，以扩大表型谱，进一步指导本病的产前诊断。
患者与方法
案例展示
25岁初产妇(Ⅲ2，图1)在孕25+1周时因超声检查异常转至本研究医院产前诊断中心。胎儿系统超声提示胎儿肢体长骨小于2 ~ 4个标准差，胸廓小于正常(Ⅳ1，图2)．第一次妊娠终止后，该妇女在1年后再次怀孕。第二个胎儿(Ⅳ2)在妊娠17+3周诱导后，产前超声诊断为致命的骨骼发育不良，x线仅诊断为轻度的虫蛀性骨骼发育不良(图3)．引产后超声均未发现胎儿积液。病人没有做核磁共振，也拒绝对胎儿进行尸检。父母的外周血中没有核分叶，只留下未检查的胎儿。该女子否认在怀孕前或怀孕期间接触过致畸化学物质、辐射、尼古丁或酒精。家族先天遗传的相关性也被否认。本研究经湖州市妇幼保健院伦理委员会批准。胎儿检查的知情同意书由父母签署，其他所有参与者都是这样做的。
图1．胎儿的血统。
图2．第一个胎儿的x线特征(妊娠25+1周)。(一)肱骨缩小4.4 SD(箭头)。(B)股骨缩小4.7 SD(箭头)。(C)胸部面积明显缩小(箭头)。(D)心胸比增大(箭头)。
图3．第二个胎儿的产前和产后图像(妊娠17+3周)。(一)肱骨缩小2.9 SD(箭头)。(B)股骨缩小2.4 SD(箭头)。(C−E)诱导后第二个胎儿的特征。(C)脊柱侧位片显示每个椎体变平，骨骺发育不良。(D)肘关节长骨端错位。四肢长骨末端的多重密度不均匀，边缘不规则。两侧肱骨远端和股骨可见轻度虫蛀性骨骼发育不良(箭头)。(E)引产后胎儿面部照片中，未见明显特殊面部。
羊水的采集
在护理中，分别在妊娠25+1周和17+3周的无菌条件下，通过超声引导穿刺获得投影羊水。采集羊水30ml，其中15ml用于细胞培养染色体核型制备，15ml用于DNA提取，供后续实验使用。
核型分析
羊水中胎儿脱落上皮细胞在适当的培养基(BIO-AMF)中制备TM-2)，然后在37°C和5% CO条件下培养2一个星期。传代后不久，通过0.1 mg/ml秋水仙碱处理和低渗(柠檬酸三钠10%)固定(冰醋酸:甲醇= 1:3)，在400带水平进行g带化，并在显微镜条件下分析。根据国际人类细胞基因组命名法(International System for Human Cytogenomic Nomenclature, 2016)，测定了20条染色体的年代，同时分析了5种核型。
染色体微阵列分析
从羊水中提取250 mg胎儿DNA，并使用CytoScan™HD全基因组SNP阵列(Affymetrix，美国)进行分析，包括750,000个SNP探针和1,950,000个CNV探针。实验内容包括质控、酶切、PCR、纯化、标记、杂交、扫描。所有数据均根据厂家说明书的条件，采用染色体分析软件4.2进行分析。
全外显子组测序和Sanger测序
从两个胎儿的羊水和父母的外周血中提取基因组DNA，用于全外显子组测序。使用SureSelect Human All Exon V4试剂盒(Agilent Technologies, Santa Clara, CA，美国)进行外显子组捕获，随后使用Illumina NovaSeq 6000系统(Illumina, San Diego, CA，美国)进行测序。在测序和筛选低质量reads后，使用Sentieon BWA (Sentieon，美国)采用MEM对齐方法将高质量reads与GRCh37/hg19参考人类基因组进行比较，并保留位于编码序列中作为唯一剪接位点区域的唯一变体。使用基因组分析工具包(GATK v4.0)进行变异调用。然后，根据特定数据库(包括人类基因突变数据库(HGMD)、ClinVar数据库、1000基因组计划、外显子组聚合联盟(ExAC)、外显子组测序项目(ESP6500)、单核苷酸多态性数据库(dbSNP)和基因组聚合数据库(gnomAD))的频率筛选候选变体，包括单核苷酸变体(SNVs)和indels。排除突变位点，即多态位点，保留等位基因频率≤1%的变异。在这里，可以预测，变体的效果受到SIFT, MutationTaster和provvian的影响。预测编码蛋白的3d折叠结构，并通过AlphaFold预测突变的影响(https://alphafold.ebi.ac.uk/)．序列变异的解释是根据美国医学遗传学和基因组学(ACMG)进行的。在线Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)用于分析物种间(人类、大猩猩、狗、老鼠、大象、犰狳、鸡、X-tropicalis和斑马鱼)的进化保守序列。最终，通过Sanger测序和潜在突变序列扩增证实了这些变异。引物序列(表1)由Primer3 (http://primer3.ut.ee/)．PCR产物用ABI 3500DX测序，用DNASTAR 5.0软件进一步分析(范等，2022年)．
表1．引物序列用于简化LBR基因组片段。
结果
c.1757G>A的鉴定及生物信息学预测LBR
核型和CMA分析均未见异常。随后，我们的小组执行了全外显子组序列，以检测任何突变的存在。利用捕获高通量芯片技术，在人类基因组中检测到近2万个基因进行测序。结果表明，该基因为纯合突变体LBR(chr1:225591096NM_002296.4: c.1757G >,NP_002287.2:p.Arg586His)两个胎儿都是遗传自父母的;基因编码序列1757位核苷酸G引起的错义突变变为a，导致586位精氨酸变为组氨酸。Sanger测序证实了该变异，并表明LBR该家族的变异与本病的共分离一致(图4一)．
图4．在这些病例中发现了遗传变异。(一)在两个胎儿和父母中检测到变异。(B)在不同物种(人类、大猩猩、狗、老鼠、大象、犰狳、鸡、X-tropicalis和斑马鱼)中保存突变氨基酸(Pro586)。
在GnomAD和ExAC数据库中，该突变在普通人群和东亚人群中的频率均小于1%。1000个基因组数据库显示，一般人群的变异频率< 1%，东亚人群的变异频率为1%。本研究报告了两名携带杂合变异c. 1757G> a的骨发育不良胎儿。该突变记录在HGMD数据库(CM136799)中。在ClinVar数据库中，只有一条记录显示该突变具有致病性，另一条记录意义不确定。据报道，该基因中存在一个杂合型c.1757G>ALBR基因检测的患者有双叶中性粒细胞核和轻度骨骼发育不良表型;另一种杂合变异LBR在反位检测到基因(Borovik等人，2013)．多个物种的氨基酸序列比对证实该突变是100%保守的(图4 b)．根据AlphaFold，我们确认Arg586位于3-β-羟基甾醇δ14-还原酶三维折叠的一个保守位点，并发现Arg586位于α-螺旋(图5一个)．它还与ASP450和GLU208结合，作为氢键的供体(图5 b) (pLDDT得分:88.50)。然而，我们还没有通过DeepMind管道对这种突变进行评分，因为目前AlphScore的实现存在一些限制。利用SIFT、provvian和MutationTaster工具对变异进行功能预测的结果如图所示表2．根据美国医学遗传学和基因组学学院(ACMG)序列变异解释指南，我们认为该变异可能具有致病性(PM2_Supporting + PP3_Moderate + PM3_Strong + PP4)。
图5．三维蛋白质模拟3- β -羟基甾醇δ 14-还原酶编码LBR在AlphaFold。(一)三维蛋白质模拟整体结构及突变氨基酸定位(红色箭头，Pro586为置信度)(模型置信度:深蓝色非常高，pLDDT>90;浅蓝色代表自信，90 > pLDDT>70;黄色低，70 > pLDDT>50;橙色非常低，pLDDT<50)。(B)突变氨基酸(Pro586，红色箭头)的分子结构放大图。(C)层蛋白B受体作为核膜中的一种蛋白质和已确定突变的位置的示意图。错义突变p.R586H位于第8跨膜结构域(固醇还原酶结构域)附近。
表2．在网上分析LBR变体c.1757G >。
产前诊断和遗传咨询
基于的效果LBR通过对该家族的基因突变和共分离分析，推测该家族的纯合子突变可能是导致该家族产前致死性骨发育不良的原因。最终，这对夫妇经过深思熟虑后决定终止妊娠，并计划使用着床前产前诊断来拥有一个健康的婴儿。
讨论
的LBR该基因由Schulerin于1994年首次报道。它的大小为35kb，编码一个有615个氨基酸残基的层蛋白B受体。的LBR是一种核膜蛋白，功能为3- β -羟基甾醇δ 14-还原酶，属于ERG4/ERG24家族。
外显子2 - 5编码n端核质结构域，这些核质结构域直接或间接地与染色质、层、异染色质蛋白、组蛋白和其他核成分相互作用，以维持层网络的结构完整性并固定核膜内的异染色质。PHA的致病性异常位于核质结构域或全基因。外显子6-14编码8个c端疏水跨膜结构域，属于固醇还原酶家族，通过固醇c14还原酶活性参与胆固醇合成，实现胆固醇的代谢功能LBR．在跨膜区域的致病变异LBR可能影响固醇还原酶活性，导致胆固醇合成失败，从而增加和积累固醇代谢物胆固醇- 8,14 -二烯-3-醇在活的有机体内，导致发育中的胎儿出现特定的骨骼异常，以及围产期致命的骨骼发育不良(Borovik等人，2013)．据报道，在一些骨骼发育不良的病例中，病原体的异常位于疏水跨膜区域(Nikolakaki等，2017)．到目前为止，有38种疾病相关LBR的基因变异，但只有5例GRBGD的报告(表3；图5 c)．
表3．致病性变异LBR5例报告的GRBGD患者的基因。
克莱顿等人，2010收集临床特征相同的GRBGD胎儿3例，均表现为胸椎管狭窄、全身性胎水、异位钙化中心、宫内生长迟缓、长骨严重缩短、虫蛀骨，以及无义或错义变异LBR基因(克莱顿等人，2010)．伊丽莎·汤普森et al。首次报道2例骨骼发育不良的中度严重程度并自发持续改善的患者，临床表型为身材矮小和脊柱干骺端发育不良(汤普森等人，2019年)．由此可见，GRBGD是由LBR基因变异具有广泛的表型异质性，尤其是骨骼异常。关于外显子14的报道LBR基因在文献中非常罕见，包括仅有5例缺陷(贝斯特等，2003年；Mchugh等人，2011；克莱顿等人，2010；Borovik等人，2013；汤普森等人，2019年) (表4)．临床表现从孤立性PHA到轻度骨发育不良PHA再到格林伯格骨发育不良。
表4．报告的个案LBR基因外显子14突变。
参考多项研究(Sobreira Net al.， 2015;M.D.F. Carvalhoet al.， 2017;Waterham et al.， 2003)的缺陷LBR基因被发现与轻度骨骼表型相关，包括错义、无义或移码变异，这些缺陷分布在蛋白质的核质和跨膜区域。此外，两种致病变异之一涉及外显子12、13和14。
在我们的研究中首次在两个胎儿中报道了纯合子变异(c.1757G>A(p.Arg586His))。由于有共同的祖先，血缘亲本所生先验者纯合致病性变异更为常见。在家族中，我们报告了纯合致病变异来自不相关的父母，这可以用隐性血缘来解释。在未来的研究中，我们可以尝试探索这个谜团。虽然，产前长骨测量属于致命的骨骼发育不良的两个胎儿。根据产前USG和x光检查结果，两个胎儿似乎都有中度骨骼发育不良，与文献报道的相似汤普森等．
虽然产前长骨测量对于胎儿骨骼发育不良是致命的，但根据产前USG和x线检查的结果，两个胎儿似乎都有中度骨骼发育不良，这与Thompson等人报道的情况相似。
标准化、系统的超声检查是产前发现骨骼发育不良的基础。虽然产前超声检查致死性骨骼发育不良不是一项困难的任务，但不同类型的致死性和非致死性骨骼发育不良的超声成像结果有重叠。因此，在严格使用标准测量方法的基础上，使用USG预测和诊断产前致死性和非致死性骨骼发育不良仍有一定的局限性。根据AlphaFold，我们可以确认Arg586位于3-β-羟基甾醇δ14-还原酶三维折叠的一个保守残基上。我们不仅发现Arg586位于α-螺旋中，还发现它作为氢键的供体与ASP450和GLU208连接(pLDDT评分:88.5)。
尽管如此，我们还没有通过DeepMind管道对这种突变进行评分，因为目前AlphScore的实现仍有一些限制。实际上，我们确实对齐了突变和引用之间的结构。Arg586残基中α-螺旋没有显著性，但对下一个α-螺旋有影响。使用AlphaFold构建预测的突变蛋白结构，并使用PyMOL (https://colab.research.google.com/github/ sokrypton / ColabFold /团/主/ AlphaFold2.ipynb # scrollTo = UGUBLzB3C6WN)．根据上述分析，Arg586对下一个α-螺旋的影响可能与该中国家族中两个胎儿的中度骨骼发育不良有关。
总之，位于跨膜结构域8末端的c.1757G>A(p.Arg586His)变体导致中度骨骼发育不良表型。由于超声诊断的局限性，全外显子组测序可以帮助临床，特别是在遗传咨询中进行更科学的表型分析，扩大疾病的表型谱。
数据可用性声明
本研究中提供的数据存放在Sequence Read Archive (SRA)知识库中，登录号为SUB12035353，https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/SUB12035353．
作者的贡献
LF设计了该研究并审阅了手稿。XS负责数据的分析。之后，LF写了手稿。SZ和MD参与临床分析和遗传咨询。JY和GS进行实验并收集数据。ZL和XP对放射结果进行分析。所有作者均已阅读并确认稿件。
资金
浙江省医疗卫生科技计划项目(2023KY323)资助。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
参考文献
贝斯特，S.， Salvati, F.， Kallo, J.，加纳，C.， Height, S.， Thein, S. L.等(2003)。Lamin b受体突变Pelger-Huët异常。Br。j . Haematol。123(3)， 542-544。doi: 10.1046 / j.1365-2141.2003.04621.x
Borovik, L.， Modaff, P.， Waterham, H. R.， Krentz, A. D.和Pauli, R. M.(2013)。Pelger-huet异常和轻度骨骼表型继发于突变LBR．点。J.医学热内。一个161a(8)， 2066-2073。doi: 10.1002 / ajmg.a.36019
奇塔亚特，D.，格鲁伯，H.，马伦，B. J.，鲍兹纳，D.，科斯塔，T.，拉赫曼，R.等人(1993)。积水-异位钙化-虫蛀性骨骼发育不良(格林伯格发育不良):一种罕见遗传疾病的产前诊断和进一步描述。点。J.医学热内。47(2)， 272-277。doi: 10.1002 / ajmg.1320470226
克莱顿，P.，费舍尔，B.，曼恩，A.，曼苏尔，S.，罗西尔，E.，维恩，M.等人(2010)。引起格林伯格发育不良而不是Pelger异常的突变使酶与核膜蛋白的结构功能分离。核1(4)， 354-366。doi: 10.4161 / nucl.1.4.12435
Elçioglu, N.和霍尔，C. M.(1998)。以点状软骨发育不良和成骨不全为特征的致命骨骼发育不良:astley-kendall发育不良的一个例子。进一步描述了一种罕见的遗传疾病。J.医学热内。35(6)， 505-507。doi: 10.1136 / jmg.35.6.505
范玲，金鹏，钱勇，沈广，沈X，董敏(2022)。病例报告:产前诊断轴后多指与双等位基因变异在平滑(SMO)。前面。麝猫。13日,887082年。doi: 10.3389 / fgene.2022.887082
Giorgio, E.， Sirchia, F.， Bosco, M.， Sobreira, N. L. M.， Grosso, E.， Brussino, A.等人(2019)。1例新型格林伯格发育不良及基因型-表型相关分析LBR致病变异:一个基因-多表型的指导性例子。点。J.医学热内。一个179(2)， 306-311。doi: 10.1002 / ajmg.a.61000
Greenberg, c.r.， Rimoin, d.l.， Gruber, h.e.， DeSa, d.j.， Reed, M.和Lachman, r.s.(1988)。一种新的常染色体隐性致死性软骨营养不良伴先天性积液。点。J.医学热内。29(3)， 623-632。doi: 10.1002 / ajmg.1320290321
Gregersen, p.a.， McKay, V, Walsh, M, Brown, E, McGillivray, G, and Savarirayan, R.(2020)。新发一例格林伯格发育不良并文献复习提示格林伯格发育不良、斑纹干骺端发育不良、Astley-Kendall发育不良均为等位基因异常。摩尔,麝猫。基因组医学。8 (6)， e1173。doi: 10.1002 / mgg3.1173
霍恩，L. C.，费伯，R.，迈纳，A.，皮斯卡塞克，U.，斯普兰格，J.和皮斯卡塞克，U.(2000)。格林伯格发育不良:第一例报告病例，附加非骨骼畸形和无血缘关系。Prenat。成岩作用。20(12)， 1008-1011。doi: 10.1002 / 1097 - 0223 (200012) 20:12 < 1008: aid-pd954 > 3.0.co; 2 s
Konstantinidou, A.， Karadimas, C.， Waterham, H. R.， Superti-Furga, A.， Kaminopetros, P.， Grigoriadou, M.等人(2008)。三名诊断为HEM/Greenberg骨骼发育不良的胎儿的病理、x线和分子表现。Prenat。成岩作用。28(4)， 309-312。doi: 10.1002 / pd.1976
Mchugh, D.， Cameron, C. A.， Abdenur, J. E.， Abdulrahman, M.， Adair, O.和Al Nuaimi, S. A.(2011)。医学遗传学:美国医学遗传学学院的官方杂志．柏林,德国:自然出版集团．
Nikolakaki, E.， Mylonis, I.和Giannakouros, T.(2017)。层蛋白B受体:结构、功能和定位之间的相互作用。细胞6(3)， 28。doi: 10.3390 / cells6030028
Thompson, E.， Abdalla, E.， Superti-Furga, A.， McAlister, W.， Kratz, L.， Unger, S.等人(2019)。纤层蛋白B受体相关障碍与一系列骨骼发育不良表型相关。骨120年,354 - 363。doi: 10.1016 / j.bone.2018.11.006
关键词:产前中度骨骼发育不良，层蛋白B受体，NM_002296.4:c。1757 g > A, NP_002287.2: p。一个rg586His, whole-exome sequencing, genetic counseling
引用:沈晓霞，李忠，潘霞，姚军，沈刚，董敏，范玲(2023)复发性中度骨骼发育不良的产前诊断。前面。麝猫。13:1020475。doi: 10.3389 / fgene.2022.1020475
收到:2022年8月16日;接受:2022年11月28日;
发表:2023年1月13日。
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