实用方法淘汰赛基因编辑在猪身上
劳拉Daniela拉特纳
加斯顿埃米利奥拉莫塔
城Briski
丹尼尔·菲利普Salamone
拉斐尔Fernandez-Martin- 1Laboratorio Biotecnologia动物(拉巴)Departamento de Produccion动物,Facultad de Agronomia布宜诺斯艾利斯大学,布宜诺斯艾利斯,阿根廷
- 2皇家研究院Investigaciones en Produccion动物(INPA) CONICET-Universidad de布宜诺斯艾利斯布宜诺斯艾利斯,阿根廷
猪是一种很重要的资源,肉类生产和作为人类疾病模型。由于其对人类生理和解剖上的相似性,这些动物可以概括人类疾病的症状,为生物医学研究成为一个有效的模型。虽然在过去的猪还没有广泛使用的部分因为基因改造的困难;如今,新的革命性技术的可编程的核酸酶,并从根本上CRISPR-Cas9系统,有可能首次精确修改猪基因组,这在以前是从来没有过的。到这个目的,有必要引入系统早期阶段受精卵或编辑细胞体细胞核转移紧随其后。综述,几个猪淘汰赛基因编辑策略,使用CRISPR-Cas9系统,将总结,以及基因分型方法和不同的交付技术这些工具引入到胚胎。最后,最好的方法来产生均匀,biallelic编辑动物将讨论。
介绍
在过去的几年里,对猪生物技术发展有巨大的影响,证明了许多猪在这短的时间内建立的模型。几个评论发表关于基因编辑在猪身上,从生物医学和农业的角度(Burkard et al ., 2018;杨、吴,2018年;李et al ., 2019)。在这方面,模型来概括人类疾病,如动脉硬化(王et al ., 2020)、糖尿病(雷纳et al ., 2020)或测试新的癌症疗法(卡拉et al ., 2020)已经开发出来。此外,基因编辑将更可能使用猪作为患者的器官捐赠者器官移植等待名单(陆et al ., 2020)。
很长一段时间,引入一个精确的转基因猪的能力是有限的可用工具。如今,可以诱导猪单体型的点突变,约2.5×109核苷酸长,通过反向遗传机制。的进化基因改造工具已经走了很长的路。它最初仅限于老鼠,后来找到了一个解决办法简单细菌的免疫机制,CRISPR-Cas系统。这些新的分子工具有开创性,标志着一个新时代的开始在遗传操作(Doudna和贝纳2014),将修改后的哺乳动物的一代的历史划分为“CRISPR前后”(BC和AC)。
进化的基因改造的工具
转基因动物模型的发展阻碍了在大多数物种因缺乏适当的技术。在公元前时期,传统的基因打靶的方法是基于同源重组(人力资源),极其稀少,其使用大多局限于小鼠模型的发展。随着CRISPR-Cas系统的交流时代开始,生产转基因动物模型提供新颖的机会。相关技术,使猪的基因编辑多年来将在本节中讨论。
转基因动物在公元前(CRISPR之前)
已经几次修改哺乳动物基因组在过去的几十年。第一个转基因哺乳动物被注射DNA片段生成到雄性原核(1981年戈登和代赭石;锤et al ., 1985;和修改后的克拉克,2002),外源DNA随机在现有集成双链断裂(双边带),精子DNA的极端压实的结果。不久之后,sperm-mediated基因转移在体外受精(IVF)也用于生成转基因哺乳动物(Lavitrano et al ., 1989);然而,这种技术不能复制其他组(Brinster et al ., 1989)。尽管这些争论的结果,后来表明sperm-mediated基因转移可能导致转基因哺乳动物生产精子直接注入时卵母细胞的细胞质胞浆内精子injection-mediated转基因技术(ICSI-MTG) (佩里et al ., 1999;Moreira et al ., 2007;Pereyra-Bonnet et al ., 2008)。然而,这种技术表现出局限性与ICSI生物变量(审核效率Garcia-Rosello et al ., 2009;Salamone et al ., 2017)。后来,据报道,有效的转座子的胞质注射导致转基因后代在啮齿动物,猪,和其他大型哺乳动物(Sumiyama et al ., 2010;盖伦et al ., 2011;Furushima et al ., 2012;Bevacqua et al ., 2017)。
虽然精确的基因修改由人力资源或特定轨迹集成,他们的频率通常是两个或三个数量级低于随机整合。因此,同源重组细胞克隆的隔离需要长和复杂协议的浓缩,独立于目标轨迹,基于结合积极的和消极的选择(托马斯和现年1987)。然而,这些协议实际上是局限于小鼠胚胎干细胞(ES)细胞(埃文斯和考夫曼,1981年)。注入囊胚细胞可以产生嵌合体与殖民生殖系(布拉德利et al ., 1984)。最后,通过交配这些嵌合体动物,可以获得均匀的转基因后代。这项技术在国内的应用种类是有限的,因为只有最近,从牛胚胎干细胞分离(Bogliotti et al ., 2018)和猪扩大潜在的干细胞的发展得益于一个详尽的努力的几组测试大约400个20小分子抑制剂的组合和细胞因子(高et al ., 2019);然而,到目前为止没有得到国内大型动物的全部或部分贡献任何类型的干细胞。
多莉的诞生(维尔莫特et al ., 1997)带来了关注体细胞核转移(SCNT)作为一种新的可能性产生转基因动物模型,如羊(Schnieke et al ., 1997)、牛(奇贝利et al ., 1998)和猪(馆et al ., 2000),因为胎儿或成年体细胞供者细胞可以转基因核移植前。尽管SCNT理论上也可允许淘汰赛动物模型的生成,生成特定的复杂选择协议集成导致很少基因猪淘汰赛由这种方法:两个monoallelic (戴et al ., 2002;赖et al ., 2002)和两个biallelic猪(罗杰斯et al ., 2008;普莱瑟et al ., 2013)已报告。
另一个策略提出了诱导基因改造涉及到使用的内切酶识别超过16基地和使一个削减每基因组(风险削减每416基地,大约。每4×109基地或1切/单倍体哺乳动物基因组)。第一个基因编辑策略是基于使用I-Sce我,一个酵母meganuclease识别网站的18个碱基对(Jacquier Dujon, 1985)。在这方面,Choulika et al。(1995)展示了人力资源在哺乳动物染色体的增加供体DNA同源区域在一个侧面内生I-SceI网站之前插入在小鼠基因组中。此外,显微镜下注射I-SceI连同转基因两侧meganuclease网站,增加了转基因整合效率牛胚胎(Bevacqua et al ., 2013)。最后,修改版本的meganuclease包含核本地化序列(NLS)是由胞质注射成功地用于生成转基因猪(王et al ., 2014)。
最近的事态发展已经导致的可编程的内切酶之间的融合Fok1(李et al ., 1992),如锌指DNA识别域(ZFN,金正日et al ., 1996)和转录activator-like效应(取得,基督教et al ., 2010)。最初,他们作为一个有效的改性方法获取编辑SCNT前体细胞(Hauschild et al ., 2011;卡尔森et al ., 2012),后来,ZFN和取得直接注入到受精卵mRNA (Lillico et al ., 2013;谭et al ., 2013)诱导特定基因修改允许淘汰赛猪模型的扩张。然而,之前这些高效的技术可能会蔓延整个科学界,一个更简单的技术开发。
转基因动物的交流(CRISPR之后)的时代
CRISPR-Cas系统最近可编程endonuclease-based基因工程工具发达,几乎垄断基因编辑字段,因为这些新系统更有效率,比以前更便宜、更简单的(诺特和Doudna, 2018)。2013年被认为是一个新时代的第一年,交流的时代。
尽管CRISPR的发现系统可以认为是偶然的,因为罕见的重复序列测序观察到细菌基因(Ishino et al ., 1987;Mojica et al ., 1993),CRISPR-Cas系统是经过十年的许多研究人员的共同努力下他们的知识转化为一种革命性的分子生物学工具,在许多科学领域产生巨大的影响(Mojica et al ., 2005;Barrangou et al ., 2007;Jinek et al ., 2012;丛et al ., 2013;看过的着陆器,2016)。
在几乎所有的原始细菌和细菌的一半,一个巨大的多样性CRISPR-Cas系统被发现、描述和分类(Makarova et al ., 2020)。的CRISPR-Cas9酿脓链球菌(SpCRISPR-Cas9)是最常用的工具之一(丛et al ., 2013;看过的Marraffini 2016),在原来的版本有两个RNA, CRISPR RNA和transactivating CRISPR RNA(分别crRNA和tracrRNA) (丛et al ., 2013)或只有一个RNA,称为single-guide RNA (sgRNA)之间的合成嵌合体crRNA和tracrRNA (Jinek et al ., 2012)。在CRISPR-Cas系统,使用一个单一的蛋白质,目标序列特异性是由存在于crRNA或sgRNA (20 bp长);因此,通过同时引入不同sgRNAs,几个位点可能在同一时间(修改丛et al ., 2013)。虽然其他CRISPR-Cas系统描述和使用(Kotani et al ., 2015),我们将关注SpCRISPR-Cas9,唯一的基因组序列的要求是存在一个NGG序列称为protospacer相邻主题(PAM),接近的网站。考虑CCN三合反平行的线,和一个随机分布的四个核苷酸,PAM将发现每8个核苷酸。
此外,人类基因组计划完成后(绿色et al ., 2015)加速发展下一代更便宜、更快的方法转换序列(上天)技术在标准工具对于许多应用程序在临床和性状的研究(凡戴克et al ., 2018)。随着巨大的可用性的序列,有很多在网上工具,使得物种之间的同源基因的识别(陈和科波拉,2018年)。
可用的序列数据支持的发展许多在线程序允许最方便的设计指南执行特定位点双链断裂,减少非目标的可能性或不受欢迎的断裂(崔et al ., 2018)。然而,大约10%的设计指南不能驱动一个精确的双边带在小鼠受精卵(元,胡,2017年)。这可以解释为一个更复杂的染色质DNA结构在哺乳动物比在细菌或噬菌体是天然核酸酶底物。因此,需要简单的筛查指南(如下所示)。
可编程的核酸内切酶还可以促进外源性的插入序列在一个特定的轨迹(马里et al ., 2013),生产转基因动物;然而,这种策略将不会在本文讨论。
获得一个编辑之路猪在新的交流的时代
CRISPR-Cas编辑工具的简单应用促进了许多动物模型的生成可能发展之前,如家畜,甚至,不幸的是,人类。然而,“更换”的原则,3 rs动物福利的原则之一,并建议寻找替代的方法,如使用在体外细胞培养或啮齿动物模型的生成,回答一些生物学问题。
然而,猪被认为是一个伟大的承诺在生物医学研究中,因为它们是有趣的人类疾病模型,最好的选择作为异种移植的器官供应。因此,gene-edited猪已经成为一个有效的和,在某些情况下,不可替代的工具。为了生产需要完成以下三个阶段:(a)的设计有效的可编程的核酸酶,(b)的生成编辑单细胞胚胎,和(c)后续编辑分析产生的小猪。
CRISPR-Cas9系统的效率
因为它已经提到的,特异性CRISPR-Cas9取决于crRNA sgRNA,和有一些出版物描述如何合成(et al ., 2013年;藤Ikawa, 2014;雅可比et al ., 2017)。在本节中,不同的策略来评估将讨论CRISPR-Cas9的效率。
最简单的分析是基于DNA质粒的使用,作为一个双星系统,分别编码为Cas9和sgRNA (马里et al ., 2013)。Mashiko et al。(2013)描述了一个量化的工具CRISPR-Cas9基于重建的效率绿色荧光蛋白双边带后游离质粒结构的功能。然而,为了模拟真实的条件下,编辑效率的分析应该在猪基因组进行,使用细胞系或在体外,产生胚胎在猪受精卵生产部分(见下文)。虽然有一些例外,使用CRISPR-Cas9质粒通常局限于体细胞文化(王k . et al ., 2015)。在胚胎中,由于转录逮捕直到第一次有丝分裂周期,使用rna或RNP(核糖核蛋白)复杂的优先(海et al ., 2014)。此外,CRISPR-Cas9在体外消化系统可以用作pre-validation诱导的双边带目标站点。这个试验只是适用于RNP格式,包括在体外组装Cas9蛋白质的在体外转录或化学形成sgRNA或crRNA: tracrRNA双工,其次是消化反应的片段包含目标站点(Mehravar et al ., 2019)。在细胞培养检测,一般选择标记由Cas9编码转换后质粒可以用丰富的文化转化细胞(周et al ., 2015;Bevacqua et al ., 2016;阴et al ., 2019)。分析这些结果,往往有高背景值,是复杂的,因为获得的细胞有不同的编辑事件。相反,在体外,产生的胚胎有少量的细胞(约50)源自几个编辑事件。这些结果往往是更清晰的,并允许研究的特性,比如镶嵌性或杂合性(樱井et al ., 2014;惠特沃思et al ., 2014;Bevacqua et al ., 2016)。动物或胚胎马赛克,不是所有的细胞有相同的基因型,而这发生在基因编辑在第一次胚胎发生有丝分裂分裂。在这些情况下,可以检测到两个以上的等位基因/位点。
在所有这些分析,由此产生的细胞的基因型鉴定启动编辑轨迹通过PCR的扩增反应。在设计引物时,应使他们旁边目标站点。自删除了双边带修复过程中可能涉及数百个核苷酸,引物设计足够远的目标网站建议,以确保正确的杂交,即使在大型删除事件。最佳引物退火目的至少200 nt.远离切削网站(Mianne et al ., 2017)。此外,嵌套PCR是一个很好的选择,当DNA样品的数量是有限的。第二步是分析放大DNA。虽然PCR扩增子可以直接筛选Sanger测序,一些间接策略开发允许大规模的和廉价的测试。时效率很低,这些分析是一个很好的替代方案排序之前Sanger测序样品。
使用两个侧翼sgRNA目标基因的一个至关重要的元素(辍学淘汰赛,陈et al ., 2014;低et al ., 2016)允许一个简单的评估sgRNA而设计的。在这种情况下,双剪诱发内部删除,可以验证了新较小的电泳迁移率的变化产生的扩增子。然而,这些测试低估非功能性等位基因形成的利率,因为单引号或双削减修复indels发生内部删除,因此,这种情况下,无法区分野生型琼脂糖凝胶电泳。
单削减(indels)也可以通过heteroduplex形成进行分析化验。这些技术区分扩增子从那些不携带突变。然而,这些方法没有提供的信息号码或等位基因的组成。Heteroduplex化验由变性、退火形成野生型和突变扩增子(或扩增子携带两个不同的突变),创建一个泡沫由于不匹配的链。Heteroduplex dna可以分析利用核酸酶如T7核酸内切酶1 (T7E1) (Mashal et al ., 1995从移动电话)或测量员核酸酶(酶核酸酶家族,邱et al ., 2004)。这些核酸酶识别网站不匹配,因此,打通两个DNA链。然后,酶消化的产品是通过琼脂糖凝胶电泳显示一个完整长度的扩增子来解决(由于同源双链的存在)和预期大小乳沟产品,如果Cas9解理发生生产indels (危害et al ., 2014)。Heteroduplex dna Heteroduplex流动性也可以分析的测定(协会)(Ota et al ., 2013,2014年)。heteroduplexes以来一个开放的长串周围配置不匹配的地区,他们可以从同源双链通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,因为在复杂的迁移模式的变化。在某些情况下,当一个很好地体现在一个诱发突变等位基因池,有必要引入一个野生型扩增子之前heteroduplex形成增加的准确性方法(Sentmanat et al ., 2018)。另一个indel检测分析是高分辨率分析融化(HMRA) (巴et al ., 2014)。HMRA使用不同熔化温度的野生型和突变扩增子来区分一个从另一个,用一个融化曲线分析时,会发出荧光明亮荧光染料专门绑定到双链DNA (Wittwer et al ., 2003)。
Indel扩增子的检测分析(IDAA)是一个敏感和准确的技术,提供了详细信息乳沟效率、规模和性质的等位变异生成(杨et al ., 2015)。这项技术是基于一个单步tri-primer PCR,在通用6-FAM 5-labeled底漆(FamF)设计目标正向引物在一个特定的扩展使用。这种技术会导致家人能被探测到的扩增子的标签使用标准DNA片段的毛细管电泳分析方法(安徒生et al ., 2003)。
定义核苷酸的变化或特定的点突变,额外的沉默突变,不改变编码蛋白质的氨基酸序列,可以包括在供体DNA创建新的限制性位点。通过这种方式,放大DNA在目标轨迹可以用相应的新的限制性内切酶消化探测点突变homology-directed维修(HDR)事件(王et al ., 2013)。然而,不完善的或不完整的HDR事件可能发生,导致不受欢迎的序列修改目标站点附近(Mianne et al ., 2017)。同样,如果选择sgRNA削减一个限制性内切酶网站indels生成时,限制站点可能会丢失。
最后,目标区域的等位基因的测序样品中获得一个完整的描述是必要的。色谱从直接Sanger测序PCR产品时可以很容易地分析样品只包含一个或两个可能的等位基因,克隆细胞培养和F1等动物。样本中可能包含两个以上的等位基因(镶嵌性),如F0动物,或多克隆细胞培养,往往很难确定等位基因的序列。在这方面,开发了不同的算法来帮助这些分析。跟踪的Indels分解(潮流)是一个分析的算法。桑格序列跟踪、识别的主要诱导突变在目标站点,并确定它们的频率在一个细胞群(Brinkman et al ., 2014;Ryczek et al ., 2020)。这是一个简单,快速和具有成本效益的方法相比,sub-cloning个人目标地区的扩增子和测序足够数量的indel谱的获得一个精确的描述,哪个更劳动密集型和昂贵的。潮的修改版本,跟踪的插入,删除,和重组事件(潮流),估计目标的频率小核苷酸变化引入的CRISPR结合HDR使用捐赠者的模板(Brinkman et al ., 2018)。
代的单细胞胚胎进行编辑
作出决定的第一代猪与特定的基因修改编辑体细胞是否用于克隆或直接CRISPR-Cas9组件引入到受精卵。这种新的基因组编辑技术的出现促进了使用这两种策略,一种的选择将取决于实验室能力。
SCNT
猪克隆的发展(馆et al ., 2000)打开的可能性与修改纳入体细胞产生均匀的动物(赖et al ., 2002)。此外,为了不依赖于特定的设备和能够增加重组胚胎,手工克隆(HMC)技术已经有用(Vajta et al ., 2001;杜et al ., 2007)。HMC的主要区别性特征是使用锋利的刀片zona-free二分的卵母细胞在立体显微镜而不是使用显微操纵器来阐明它们。
无论哪种方法,传统的克隆(TC)和HMC,获得的结果仍然表现出低效率生产克隆小猪(只有0.3 - -2%的胚胎发展转移到术语;杜et al ., 2007;Zhang et al ., 2012;刘t . et al ., 2015;Gadea et al ., 2020)。在这方面,三个zona-free重构提出了克隆胚胎的聚合策略来改善胚胎发展,质量(Buemo et al ., 2016)和交付(Siriboon et al ., 2014分别在TC和HMC。尽管这两种技术的局限性,它们是用于生成编辑与CRISPR / Cas9猪。体细胞,如胎儿成纤维细胞,与质粒编码转换Cas9 sgRNAs,连同一个报告基因和/或一种抗生素抗性基因;允许修改的筛选和/或选择细胞(任et al ., 2019)。一旦得到编辑的细胞,他们是用于生成创始人猪,这将提供一个可预测的基因型避免镶嵌性(陈et al ., 2015;王k . et al ., 2015;Kumbha et al ., 2020)。此外,多平台的能力CRISPR-Cas9系统允许同时编辑多个目标基因,所使用的一个特性妞妞et al。(2017)由SCNT生产猪逆转录病毒PERV-free猪,在62份逆转录病毒的编辑。
生成的另一个有趣的替代方法是获取胎儿CRISPR-Cas9交付到猪胎儿成纤维细胞受精卵和屏幕的特定的修改。这些选择的细胞将被用于执行SCNT携带所需的修改,避免马赛克动物生成和编辑的艰苦的浓缩和选择过程的细胞主要文化(康et al ., 2016)。
猪受精卵生产
新基因编辑工具现在这么高效,使受精卵直接修改。出于这个原因,除了克隆,其他胚胎生产技术,如体外受精或在活的有机体内受精卵检索,晋升为一代的转基因猪的好选择。不同的方法得到猪胚胎,以及交付选项引入CRISPR-Cas9系统,本节将进一步讨论。
孤雌生殖的胚胎的生产
孤雌生殖的激活是一个替代品在体外胚胎生产自囊胚胚胎能够发展,像受精的卵母细胞(Kure-Bayashi et al ., 1996由于精子),避免变化因子(古普塔et al ., 2008)。这些胚胎已经提出评估在体外基因编辑工具的效率(道et al ., 2016),尽管这些胚胎不是可行的产生后代。
卵母细胞激活可以通过模拟人工诱导精子产生的影响。常用的协议,这个过程是基于接触代理,促进增加的卵母细胞胞质水平的Ca 2 +。暴露在Ca 2 +诱导代理人后,卵母细胞通常与蛋白质合成抑制剂治疗(例如,环己酰亚胺- CHX)或激酶活动(例如,6-dimethylaminopurine - 6-DMAP)生成一个二倍体孤雌生殖的胚胎能够发展到胚泡阶段(Alberio et al ., 2001)。
电刺激是常用的猪卵母细胞激活,为了优化这个方法,电气和化学激活协议的结合提出了生产转基因胚胎(中描述了这些协议的更多细节刘s . et al ., 2015)。
孤雌生殖的胚胎的另一个重要应用是作为补充来源改善孕产妇识别、怀孕和植入的SCNT猪(De Sousa et al ., 2002;Kawarasaki et al ., 2009)。
体外受精(IVF)
尽管巨大的努力和进步,当前在体外施肥系统仍然是低效的结果低影响胚胎的发育,相比低质量的胚泡在体外系统与其他物种如牛或鼠标(审核通过吉尔et al ., 2010;Grupen 2014)。这主要是由于期间发生的多精入卵IVF的高发病率。在过去2年中,许多团体一直在努力找到一个方法来提高体外受精和减少多精入卵(审核Funahashi 2003;Romar et al ., 2016)。最近,李et al。(2018)表明,通过减少精子浓度的积云细胞,改善施肥(monospermy率和正常的原核的形成)和胚泡形成。此外,试管受精系统基于一些在活的有机体内条件,如高pH值,oviductal和卵泡液和积云细胞分泌物,减少多精入卵和增加最后胚胎生产(Soriano-Ubeda et al ., 2017)。这种改善的原因可能是由于细胞外的存在猪oviductal液囊泡(Alcantara-Neto et al ., 2020)。然而,一些基因编辑研究使用在体外派生的胚胎,因为它们是昂贵和耗时更少,和大量的卵母细胞可以从屠宰场卵巢中恢复过来。考虑精液过多的发生率,一个方法来隔离monospermic受精卵避免编辑和polyspermic胚胎转移是非常有用的。这可以通过识别正常原核的形成可视化的假定的受精卵。一个问题是,猪受精卵表现出大量的胞质脂滴。因此,受精卵体外受精后离心分离,提出了作为一个简单的非侵入性的方法来可视化pronuclei识别两个和poly-pronuclear受精卵(墙et al ., 1985)。这种技术允许吉尔et al。(2013)确定2原核的受精卵,怀孕提高囊胚质量和效率(每总转移胚胎活仔猪数)当这些胚胎转移到收件人金边债券non-centrifuged相比,非选择性受精卵的对照组。
体内受精卵生产
众所周知,发展在体外相比pre-implantable哺乳动物胚胎被破坏在活的有机体内,在胚泡发育延迟和更少的细胞在胚胎(Machaty et al ., 1998;河中沙洲et al ., 2002)。不幸的是,数据的有效性体内,派生的猪受精卵收集程序仍然有限。在这方面,一些关键方面考虑pronuclei的形成,它在3和5 h之间发生受精后,第一次有丝分裂发生14 - 16 h后(亨特,1974)。因此,编辑窗口的受精卵集合是非常狭窄。执行这个过程,有必要以前同步经产母猪发情和排卵。断奶是一种有效的生理方法,获得一个肥沃的发情断奶后3至5天。增加受精的卵母细胞的数量,可以诱发超排卵技术马绒毛膜促性腺激素(eCG)断奶后24 h后由人类绒毛膜促性腺激素(hCG)管理。然后,雌性提交后颈授精两次,6点,发情的发病后24小时。受精卵收集,母猪都提交给外科手术中麻醉,生殖道暴露通过mid-ventral剖腹手术,和受精卵最终检索冲洗输卵管。在这方面,马丁内斯et al。(2020)设法恢复受精卵的介于73.3%和69.0之间。然而,上述过程涉及到需要专业技术人员和兽医和适应设备和无菌手术室,这意味着一些组织预算限制。
在受精卵CRISPR-Cas交付方法
最初,传统的编辑工具程序交付到受精卵显微注射。几个科学家试图开发更新、更简单和更便宜的方法和一些这些发展在一定程度上取得了成功。最近的方法包括一个electroporation-based方法绕过显微镜下注射和有前途的众多组织的结果。在这两种情况下,最终目标是生产biallelic和均匀的动物和编辑,由于这个原因,时机CRISPR-Cas9系统动作,相对于受精卵的DNA复制,可能是最相关的事件要考虑减少或消除镶嵌性。最常用的方法将在本节相比。
胞浆内的显微镜下注射
这种技术是使用最广泛的一代不同的动物模型。它由编辑工具为假定的一个细胞显微注射的胚胎生产阶段在活的有机体内或者通过试管受精。此技术需要使用昂贵的精密控制设备和熟练的操作人员。此外,它是耗时的,为什么受精卵的数量每重复microinjected将是有限的。正如已经提到的,显微镜下注射的mRNA CRISPR-Cas9或者RNP比编辑猪受精卵(佐藤et al ., 2015;雅可比et al ., 2017;Lamas-Toranzo et al ., 2019;Tanihara et al ., 2019 b)。然而,质粒编码Cas9核酸酶和sgRNA也被用于此目的(彼得森et al ., 2016)。利用质粒DNA的主要问题是它持久的细胞内,可能增加非目标突变。
考虑到试管受精的局限性已经描述,一些组织更倾向于直接收集和microinject CRISPR-Cas9工具体内,产生的受精卵接近受精;和胚胎转移到输卵管显微镜下注射后立即提高生存能力和怀孕率很好的结果(海et al ., 2014;王y . et al ., 2015;Yu et al ., 2016)。
相结合的主要优势在体外,生产与显微镜下注射胚胎交付技术的选择,就有可能利用配子融合之间的狭窄的时间窗口和第一胚胎细胞分裂提供编辑工具。因此,为了减少镶嵌性而不影响胚胎生存能力,几项研究已经进行评估的最佳时机介绍CRISPR-Cas9整个系统在体外胚胎的生产过程。Tanihara et al。(2019 b)得出最优时机microinject CRISPR-Cas9组件作为RNP复杂到受精卵体外受精开始后6 h,当变异率最高的是在不影响胚胎获得生存能力。此外,更高的RNP复杂浓度被证明提高效率和biallelic突变(尽管仍然低:16.7%)产生的胚泡(Tanihara et al ., 2019 b)。另一组也得出了类似的结论与卵母细胞孤雌激活。他们观察到的最佳时刻microinject CRISPR-Cas9组件作为RNA是激活后6 h,囊胚和变异率情况。然而,没有观察到在这种情况下改善镶嵌性(佐藤et al ., 2018)。相比之下,道et al。(2016)显示更显著改善biallelic率的变异(93%)在胚胎CRISPR-Cas9 mRNA microinjected 8 h后孤雌生殖的激活。
此外,在最近的一项研究苏et al。(2019)的显微镜下注射CRISPR-Cas9组件作为RNA到胚泡猪卵母细胞作为解决方案提出了减少镶嵌性。这些卵母细胞被在体外成熟和孤雌激活或受精,试管受精。通过应用这一策略,获得高达83%的突变体胚胎non-mosaic,没有有害影响胚胎发育能力。另一个特定的方法是注入CRISPR-Cas9系统重组的受精卵(床单et al ., 2016)。在这种情况下,没有任何选择,6 6小猪biallelic修改。
尽管这种技术广泛应用于动物模型编辑的一代,它需要使用昂贵的精密控制设备和熟练的操作人员。此外,它是耗时的,为什么受精卵的数量每重复microinjected将是有限的。
胚胎电穿孔
最近,这对胚胎的技术开发,它变得越来越重要,比胚胎显微注射证明是更便宜、更简单的介绍indel突变,大型删除,小插入(金子和Mashimo, 2015;金子,2018)。最近的研究表明,透明带削弱没有必要实现猪受精卵通过电穿孔基因编辑;保护胚胎的完整性和可行性。主要有两种不同的electroporators取得了好的结果,CUY21EDIT II electroporator(咳嗽)(西et al ., 2018;Tanihara et al ., 2019 a,c)和NEPA21 electroporator。后者提出了减少损害胚胎通过三步电脉冲系统。第一个脉冲,研究脉冲,使小孔在透明带和卵膜的胚胎。第二个脉冲,脉冲转移,转移胚胎的内切酶进入细胞质。第三个脉冲,polarity-changed传输脉冲,增加内切酶引入到胚胎的机会(金子,2017)。
虽然这项技术还没有产生足够的数据,它已经显示出好的结果允许更快的基因编辑更大数量的卵母细胞或受精卵的同时,与IP显微镜下注射。大规模的胚胎生产的组合通过试管受精山绵羊(由Cas9蛋白质的电穿孔基因编辑)技术补偿穷人IVF结果与快速编辑通过电穿孔率。这允许转让200每接受胚胎,最终获得生活的后代与目的基因目标修改(Tanihara et al ., 2019 a,c)。
此外,该技术的成功在一定程度上是由于其结合Cas9蛋白质,自紧凑自然RNP复杂似乎很容易进入毛孔中产生受精卵与其他大型Cas9信使rna或编辑工具。
小猪基因编辑分析
除了编辑动物SCNT,镶嵌性不是问题,分析F0不是一个简单的任务(Teboul et al ., 2017;Mehravar et al ., 2019)。很可能F0个人可能是马赛克;因此,从理论上讲,他们是否正在编辑的结果可能取决于组织进行了分析。镶嵌性F0动物可以负责活检组织之间的差异及其生殖系;因此,生产后代F1没有预期的基因型。最明显的消极后果将non-edited后代繁殖。的第一个作品研究镶嵌性在小鼠,进行利用酪氨酸基因的损失函数生成白化表型(日圆et al ., 2014)。在酪氨酸使用CRISPR-Cas 9±与不同的外显子的突变杂合的受精卵,6/12的幼崽是白化病人(50%),4/12是色素马赛克(33%),和2/12完全着色(∼17%),并通过分析DNA尾活组织检查,超过两个不同的等位基因(5)被发现,即使在同质动物(日圆et al ., 2014)。纯合子的白化病人给的回交F1均匀白化动物三个马赛克表型的动物,和意外的表型均匀彩色动物(日圆et al ., 2014)。
由于这个原因,在老鼠身上,作者建议分析,由于基因型镶嵌性,尾巴和生殖系追踪假阳性或阴性,节省时间和金钱(奥利弗et al ., 2015)。然而,这些动物的生殖影响的风险减缓了性腺活检,尤其是女性。替代性腺的活组织检查,执行耳朵活检建议,结合潮流分析的序列(Brinkman et al ., 2014),或者与深度测序通过生成一个DNA测序库标记引物进行成千上万的读取每个轨迹(日圆et al ., 2014;魏et al ., 2018)。
创始人的良好表征动物可以节省金钱和时间,这是很重要的,为了促进动物十字架的决定获得正确的F1。育种两个F0编辑个人可以减少获得纯合的时间和均匀的动物;然而,分析可以更复杂。尽管描述,所有的F1型动物为预期的修改建议通过桑格目标位点的测序(Mianne et al ., 2017)。
结论和未来的观点
最近的基因组编辑技术的发展加速了生产转基因猪的不同的目的使用几种策略。虽然在猪基因编辑已取得显著进展,进一步改善仍有可能实现为了增加biallelic突变效率。此外,由于猪繁殖是高效,辅助生殖技术的应用不够发达,因此协议对卵母细胞在体外成熟、体外受精和胚胎文化仍然可以改善。由于这些原因,猪基因编辑策略继续挑战,每组应该找到自己的道路产生编辑猪考虑自己的长处。步骤,以获得一个编辑猪进行了总结图1。
图1所示。示意图工作流所需的不同步骤生成一个基因编辑猪。(一)效率分析突变引起CRISPR-Cas9系统。(B)不同的策略来生成一个细胞阶段猪胚胎进行编辑。(C)基因编辑分析的创始人猪(F0)和杂交产生的后代F0猪(F1)。
克隆可以获得均匀动物biallelic修改;然而,克隆小猪仍然较低的出生率。此外,成功的一代猪扩大潜在的干细胞开辟了新的可能性来简化未来策略的生成编辑猪。
直接合子基因编辑是一种广泛使用的方法,因为较高的健康仔猪,尽管其中有一些是马赛克。另一个选择是基因编辑在体外,生产由体外受精胚胎,结合电穿孔交付CRISPR-Cas9组件,似乎是一个好的和简单的策略,允许使用更多的胚胎,弥补这些受精卵的贫困发展利率。一个有前途的替代方法是获得在活的有机体内受精卵,表现出更高的生存能力比在体外胚胎,紧随其后的是电穿孔或显微镜下注射CRISPR-Cas9组件,以确保较高的可行的胚胎进行编辑。然而,这个过程涉及到供体动物有关的额外费用。
最近,当未来的角度来看,一些修改CRISPR-Cas9系统的新兴(审核通过Anzalone et al ., 2020)。新嵌合体Cas9蛋白质能够编辑核苷酸的转换没有双边带,也被用于编辑猪(谢et al ., 2019)。此外,表观遗传修饰现在可能通过使用dCas9 (徐et al ., 2020),提出了改善牛胚胎的可行性在体外(Savy et al ., 2020),可以被适用于猪胚胎生产的有效工具。最后,通过改善ICSI技术在猪,ICSI的基因编辑将是一个有趣的选项编辑生成的小猪,因为它表明,当CRISPR-Cas9系统的交付是在人类ICSI,镶嵌性减少由此产生的胚胎(马et al ., 2017)。
现在,简单的新编辑工具允许使用的民主化的一代编辑猪在世界各地的实验室。这些gene-edited动物不能从自发突变体分化,因为没有介绍了外源基因,他们不应受到管制,或者严格的监管应该少于转基因动物(范Eenennaam et al ., 2019)。然而,很少有国家监管机构区分转基因生物和生物编辑。这种区别可能极大地影响了编辑的动物研究,尤其是对农业的目的。
作者的贡献
LR和RF-M参加了手稿撰写和编辑。DS版参加了手稿。所有作者参加了概念化的审查。
资金
这项工作得到了科技部的ANPCyT阿根廷(皮克特人- 2016 - 4347)和布宜诺斯艾利斯大学的(ubacyt - 2018 - 20020170100669 - ba)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
确认
作者真诚地感谢Bevacqua RJ博士和狂人V评论的手稿。
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关键字:CRISPR-Cas9,淘汰赛,电穿孔,显微镜下注射猪受精卵,SCNT
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收到:2020年10月15日;接受:2020年12月30日;
发表:2021年3月05。
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*通信:拉斐尔•Fernandez-Martinmartinf@agro.uba.ar
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