长非编码rna的异常表达在PCOS患者卵泡液液gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女常见的生殖内分泌疾病,占70 - 80%的患者排卵的障碍,并扮演着重要的角色在不孕症的病因(gydF4y2Ba埃尔曼,2005gydF4y2Ba)。PCOS的病理变化包括卵泡颗粒细胞异常增生和凋亡,雄激素过多症,排卵障碍。同时,PCOS的特点是其显性异质性,患者常常表现出不同的症状,如月经紊乱,闭经,毛发生长异常,或脱发以及肥胖(gydF4y2BaJaliseh et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaBlagojevićet al ., 2018gydF4y2Ba)。PCOS患者的症状加上其他代谢紊乱和不孕可能导致社会和家庭生活的干扰。因此,它是至关重要的披露规范PCOS的潜在机制。以前的科学数据已经敦促遗传和环境因素的结合探索PCOS患者体内的分子机制(gydF4y2Ba陈et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaRutkowska Diamanti-Kandarakis, 2016gydF4y2Ba)。虽然鹿特丹标准适用于临床诊断,病人的临床表现是高度异构由于地区的差异和种族。PCOS患者的早期诊断和治疗是可取的。鉴于以上考虑,我们认为重要的是屏幕和识别特定的标记与PCOS的发病机制有关。gydF4y2Ba

卵泡液是直接在卵泡卵母细胞发展的内部环境,它直接影响卵母细胞质量和临床辅助生殖患者的妊娠结局。它还扮演着一个重要的角色在生殖功能(gydF4y2Ba罗德里格斯et al ., 2010gydF4y2Ba)。研究表明,各种脂类,蛋白质,细胞因子,在卵泡液和其他分子发现卵泡发展是密切相关的,胚胎质量,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba受精结果,和女性生殖系统疾病(gydF4y2Ba李东旭et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaJaliseh et al ., 2017gydF4y2Ba)。例如,一个全基因组测序研究gydF4y2Ba唱et al . (2013)gydF4y2Ba显示,有许多microrna卵泡液中,其中一些在类固醇生成中发挥作用。此外,gydF4y2Ba纳吉·et al。(2017)gydF4y2Ba筛选差异表达microrna在人类卵泡液,发现他们与PCOS患者体内的激素水平显著相关。他们也有很好的预测价值确定的多囊卵巢综合征的发病机理。在这个项目的早期阶段,长非编码rna (lncRNAs)生育年龄的PCOS患者卵泡液的收集,并进行高通量lncRNA测序分析。结果与序列相比lncRNAs non-PCOS患者。测序的结果导致了1253年的识别调节和613年下调lncRNAs 1866检测到的候选人。这项研究表明,卵泡液中携带的信息是一个重要的切入点研究PCOS-induced卵泡发育不良和排卵障碍,可能是一个重要的研究课题为筛选特定PCOS-associated标记。gydF4y2Ba

液开杯形球状或囊泡与双层膜与直径约为30 - 100海里。研究表明,它们普遍存在于血液、乳液、胎盘和羊水。它们也可以独立于腹膜积液和卵泡液(gydF4y2BaVlassov et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba王et al ., 2019 agydF4y2Ba)。液可以释放生物活性物质,如mRNA, microrna的,和lncRNA可以参与免疫和细胞间通讯的发展,细胞增殖,细胞迁移,细胞分化和代谢疾病(gydF4y2Ba李et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2BaDa对峙et al . (2012)gydF4y2Ba第一次发现猪follicle-derived液含有microrna和蛋白质,发现卵巢颗粒细胞能吸收液从卵泡液中提取。研究还证实,mir - 181 a, mir - 375,和其他microrna表达显示降低母马随着年龄的增长,从而证明microrna由液与年龄相关。后续提取大量的microrna牛卵泡液液显示的高表达mir - 654 - 5 - p和mir - 640在卵泡生长,和高表达mir - 373在成熟卵泡液液表明从卵泡液中提取液促进卵泡的生长发育(gydF4y2Ba唱et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba挂et al ., 2015gydF4y2Ba)。具有重要意义的液检测特定的RNA表达卵泡液协助PCOS患者的早期诊断。gydF4y2Ba

越来越多的证据表明,表观遗传调控密切相关生殖系统疾病的发展。lncRNA是一个没有编码转录的RNA分子,它拥有超过200个核苷酸,是许多生物过程的关键调节器,如基因组印记,DNA代谢、x染色体失活,转录激活和染色质的修改(gydF4y2Ba萨勃拉曼尼亚et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2016gydF4y2Ba)。研究表明,特定lncRNAs宫颈癌的发病机制中发挥重要作用,子宫内膜癌和卵巢癌(gydF4y2Ba太阳et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba吴et al ., 2019gydF4y2Ba)。据报道,的表达水平lncRNA ILF3-AS1的阶段和分化与宫颈癌(gydF4y2Ba吴et al ., 2019gydF4y2Ba)。的lncRNA LRRC8C-DT在子宫内膜癌的发展中扮演着重要角色(gydF4y2Ba陈et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba太阳et al ., 2017gydF4y2Ba)。因此,我们推测lncRNAs可能是重要的卵泡发育。然而,没有研究调查lncRNAs是否也与多囊卵巢综合征的发病机理。因此,我们相信lncRNAs及其调节机制的深入研究在PCOS的发展将极大地促进多囊卵巢综合征的诊断和治疗。gydF4y2Ba

在这项研究中,生物信息学分析是用来比较的差异lncRNA表达式在non-PCOS不孕症患者卵泡液液和PCOS不孕症患者。我们的研究结果表明,内吞作用,河马信号通路,MAPK信号通路,htlv 1感染可以通过微分lncRNAs和目标导致PCOS发病机理。这项研究提供了有用的指导进一步深入研究各种基因和通路,为PCOS的开发和发展作出贡献。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

组研究对象gydF4y2Ba

我们收集产生的卵泡液在体外受精周期在江苏北部人民医院从1月1日到2017年5月30日。所有的病人都未满34岁。入选标准为PCOS组2003年修订的标准(三分之二的):罕见的排卵或停止排卵;临床和/或生化雄激素过多症的迹象;和超声检查卵巢的第3,第5天月经周期或出血后孕激素撤退后显示下面的卵巢多囊改变:单边或双边卵巢的卵泡直径2 - 9毫米≥12和/或一个卵巢体积≥10毫升。此外,排除其他疾病导致雄激素过多和/或低gonadotropin-induced停止排卵,卵巢功能早衰。对照组的入选标准是正常的卵巢功能,正常月经周期(26 - 32天),正常基底生殖激素水平,正常数量的基础卵泡(单边亚足联= 6 - 10)。所有选定的患者被诊断为输卵管因素不孕或不育男性因素。常见的排除标准:女性年龄超过34年,卵巢囊肿,卵巢肿瘤,卵巢手术的历史,历史的卵巢放疗,化疗,子宫内膜异位、甲状腺机能亢进、甲状腺功能减退、高泌乳素血症,内分泌疾病,染色体异常。这项研究是临床研究伦理委员会批准的江苏省苏北人民医院,和人体组织获得知情同意。gydF4y2Ba

卵泡液液的收集和处理gydF4y2Ba

在这项研究中,六不孕症患者卵泡液收集与辅助生殖技术治疗期间。站了30分钟后在室温下,液体是离心机在3000 r / min 10分钟在4°C。然后,上层清液转移到干净的Amicon超30 K离心装置(微孔,贝德福德,MA)和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。此外,上层清液混合0.2卷总外来体隔离的试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。然后,由此产生的混合物在室温下孵化了30分钟之前离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。最后,上层清液被丢弃,颗粒在磷酸盐resuspended 1.5毫升微型离心机管最终体积相当于一个第四集中的外来体样品的解决方案。立即获得的外来体样本用于下一个实验。gydF4y2Ba

高通量测序lncRNAgydF4y2Ba

卵泡液液提取的RNA(批号:151012397、试剂盒、美国),和总RNA纯度和浓度测量。通过总RNA质量测试后,核糖体RNA(批号:7 e010h6、南京Vazyme有限公司有限公司)被移除,RNA是支离破碎(批号:0006358486、安捷伦、美国)。那时的cDNA使用分散dsRNA作为模板合成,最后测序图书馆通过PCR扩增。质量检验后,图书馆使用Illumina公司HiSeq 2500测序(Illumina公司、美国),和测序读长2×150个基点(双头)(PEl50)。清洁从每个样本数据集的大小至少10 g . HISAT + StringTie +舞会礼服分析软件(美国约翰霍普金斯大学生物运算中心)使RNA-Seq读取的高效对齐,尤其是跨多个外显子。完整的lncRNA测序数据可以显示在NCBI GEO数据库地理:GSE159466。示例包括在本研究测序三次,和所有测试程序进行严格按照设备指令和仪器规格。gydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)gydF4y2Ba

根据制造商的指示,在卵泡液液提取的总RNA,采用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)。随后,提取的总RNA reverse-transcribed进cDNA根据指令的逆转录工具包RT-qPCR(豆类,大连,中国)。引物序列所示gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。热循环条件如下:30年代在95°C,然后40周期的5 s在95°C和35 s 60°C。gydF4y2Ba

功能富集分析gydF4y2Ba

探索相关的函数和途径差异表达lncRNAs,我们进行基因本体论(去)gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba术语和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba通路分析通过使用大卫生物信息学工具(版本6.8)gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba。阈值被设置为一个gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

统计产品和服务解决方案(SPSS) 20.0是用于所有统计分析。lncRNA差异表达谱之间的PCOS组和non-PCOS组使用学生的进行了分析gydF4y2BatgydF4y2Ba以及,所有RT-qPCR放大进行了一式三份。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

比较两组患者之间的一般临床资料gydF4y2Ba

为了保证研究结果的可靠性,本研究选择的样本是根据鹿特丹标准严格筛选(2003)。有两组(PCOS患者non-PCOS病人= 3 = 3)的病人,和他们的卵泡液外来体样本作为研究对象。所有报名参与者被诊断为原发性不孕和接收相同的诱导排卵治疗项目;他们24岁至28年不孕的时间与一个介于1和4年。结果表明,之间没有显著差异non-PCOS病人的PCOS患者和身体质量指数(BMI)、空腹血糖(FBG)水平。LH、T水平明显不同的两组之间。此外,促黄体激素(LH)、雌二醇(EgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)、睾酮(T)、血清泌乳素(PRL),和她们血液中的抗苗勒氏管激素(抗苗勒氏管激素)水平明显调节PCOS患者,患者有LH / FSH > 2 PCOS组。两组患者的一般临床资料显示在gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

lncRNA筛选和鉴定gydF4y2Ba

lncRNAs被分为两种类型:基因间lncRNAs和基因内lncRNAs。确定lncRNAs显示长度分布在900年至13000年之间英国石油公司(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),所有的分布lncRNAs根据显示了外显子的数量gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba,这表明大部分lncRNAs包含不超过两个外显子。lncRNAs源自non-PCOS病人显示更高的密度值比不育PCOS中发现个人(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。总的来说,lncRNAs被证明是大量存在于所有染色体(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。值得注意的是,lncRNAs PCOS患者中发现和控制表现出高度相似的染色体分布模式(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

的微分表达式分析Exosomal lncRNAs两组gydF4y2Ba

有1866个差异表达在卵泡液液lncRNAs PCOS组和non-PCOS组,其中调节lncRNAs的数量是1253,表达下调lncRNAs是613 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。进一步验证我们的lncRNA分析结果和确定的生物功能lncRNAs在PCOS的发展,九lncRNAs (lncRNA-H19、lncRNA-POP4 lncRNA-DICER1, lncRNA-PTEN, lncRNA-AKT3, lncRNA-HDAC6, lncRNA-NF1, lncRNAMUM1,和lncRNA-LINC00173)被RT-qPCR根据初步筛选lncRNA微分多个值> 10和表达式gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001在卵泡液液从25个随机选择的PCOS患者和25 non-PCOS病人。根据RT-qPCR结果,所有lncRNAs PCOS卵泡液中高度表达的外来体样品比non-PCOS卵泡液外来体样品(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。因此,所有的表达趋势lncRNAs由RT-qPCR与那些来自RNA序列(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

的功能注释和识别差异表达lncRNAsgydF4y2Ba

去进行浓缩和KEGG通路分析洞察lncRNAs的生物学特性。内吞作用通路相关,河马信号通路,MAPK信号通路,通路与htlv 1感染检查。同时,有五个基因,CRK CDC25B, AKT2, ELK4, TGFBR1,显示可能与高浓缩MAPK信号通路连接的分数。这表明,这些途径可以导致PCOS发病机理。完整的信息所示gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

lncRNA-miRNA-mRNA网络建设gydF4y2Ba

随后,Gephi被用来构造一个lncRNA-miRNA交互网络基于验证lncRNA候选人。进一步探讨差异表达之间的互联lncRNAs microrna参与PCOS,皮尔逊相关系数应用使用以下两个标准。首先,相关系数的绝对值大于0.99,第二,gydF4y2BaPgydF4y2Ba值小于0.001;这些都是用来确定的阈值之间的相关性lncRNAs和microrna并画出网络图。coexpression网络表明一个lncRNA可以与许多的编码基因,反之,一个编码基因也可以与多个lncRNAs;因此,我们推测,有一个相关性microrna的表达谱和lncRNAs参与PCOS。因此,网络包含五个验证lncRNAs (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。lncRNA-H19代表最大的节点,并预测可能会与15目标microrna。gydF4y2Ba

每个连接的厚度和相对强度代表潜在的结合位点的数量和产生的自由能量释放lncRNA-miRNA交互,分别。我们旨在识别影响的关键基因和microrna的微分表达式lncRNAs参与PCOS的发生通过构造lncRNA-miRNA-mRNA网络。mir - 4651可能参与炎症通过白细胞transendothelial迁移通过调节目标基因(gydF4y2Ba王et al ., 2019 bgydF4y2Ba)。此外,upregulation mir - 1915抑制扩散,入侵和迁移gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba针对愤怒来华的胃癌细胞(gydF4y2Ba徐et al ., 2019gydF4y2Ba)。这些发现可能表明新的研究方向和构成突破PCOS的发病机制的研究。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

多囊卵巢综合征是最常见的一种异构生殖和代谢疾病,影响全世界约有5 - 10%的育龄妇女(gydF4y2Ba埃尔曼,2005gydF4y2Ba)。综合症的临床表现是高度变量,包括雄激素过多症、月经不调、多囊卵巢形态。患多囊卵巢综合征的妇女往往不育,肥胖,多毛的和有胰岛素抵抗(IR)和血脂异常。此外,子宫内膜癌的风险,2型糖尿病和心血管疾病增加。然而,PCOS的确切的病理生理机制仍不清楚。目前,临床治疗主要是基于保守治疗包括调整月经周期,促进排卵,改善生活习惯,长期并发症的预防。lncRNAs已被证明是关键管理因素在许多生物过程,如基因组印记调控、DNA代谢,X染色体失活,转录激活,染色质修饰。研究表明,差异表达lncRNAs参与多种人类疾病,如癌症和心血管疾病,神经系统,生殖系统,但具体机制尚不清楚。lncRNAs特异表达及其功能的探索相关疾病已经吸引了越来越多的关注,并可能有助于发现新的诊断标志物和治疗PCOS的目标。gydF4y2Ba

外来体微小膜泡沫可以被大多数细胞分泌。它有一个脂双分子层膜结构,其中包含特异性蛋白质,脂类和核酸。它作为信号分子,可以迁移到其他细胞改变其功能(gydF4y2BaDe la Torre戈麦斯et al ., 2018gydF4y2Ba)。在这项研究中,在卵泡液液体的lncRNA表达谱获得PCOS患者和non-PCOS病人选择全面分析lncRNAs在PCOS的潜在作用。卵泡液液中有1866个差异表达lncRNAs PCOS组和non-PCOS组,其中调节lncRNAs的数量是1253,表达下调lncRNAs根据RNA序列是613。此外,结果九lncRNAs (lncRNA-LINC00173、lncRNA-H19 lncRNA-HDAC6, lncRNA-POP4, lncRNA-PTEN, lncRNAAKT3, lncRNA-DICER1, lncRNA-NF1,和lncRNA-MUM1)与重大的改变被RT-qPCR验证,所有这些lncRNAs更PCOS卵泡液中高度表达的外来体样品比non-PCOS卵泡液外来体样本。此外,表达趋势从RNA序列是相同的。因此,进行生物信息学分析洞察lncRNAs的生物学特性。内吞作用相关的通路,河马信号、MAPK信号传导,htlv 1感染检查。通过构造lncRNA-miRNA-mRNA网络,我们表明,mir - 146 a - 5 - p, mir - 4632, mir - 92 - 5 - p是PCOS的发生密切相关。壁人类初级卵泡颗粒细胞和积云细胞被孤立在健康女性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba受精(IVF), microrna的表达谱测序是由安德烈et al。他们的研究结果表明,有显著差异的表达mir - 146 - 5 - p和mir - 149 - 5 - p积云和壁画从人类排卵期前的卵泡颗粒细胞(gydF4y2Ba安德烈et al ., 2018gydF4y2Ba)。其他研究表明,mir - 4632起着重要的作用在调节HPASMC增殖和凋亡抑制cJUN,从而提供一个新颖的microrna的候选治疗肺血管重建治疗疾病(gydF4y2Ba钱et al ., 2017gydF4y2Ba)。此外,荧光素酶活性测定表明,mir - 92 b可以直接绑定到lncRNA-PWRN2和在卵母细胞成熟在PCOS(扮演重要角色gydF4y2Ba黄et al ., 2018gydF4y2Ba)。我们的研究结果提供了新的信息,阐明PCOS的发病机理。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

总之,我们当前的研究分析了差异表达lncRNAs PCOS患者卵泡液中通过RNA测序和生物信息学。我们验证了他们与内吞作用密切相关,河马信号通路,MAPK信号通路,htlv 1感染。这些结果可以为进一步深入研究提供有用的指导的各种基因和通路为PCOS的开发和发展作出贡献。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

RNA序列数据已经沉积地理(加入:GSE159466)。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

涉及人类受试者的研究回顾和江苏北部人民医院伦理委员会批准。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。动物研究回顾和批准临床研究伦理委员会江苏北部的人民医院,和人体组织获得知情同意。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

HC和XZ构思的想法。LW、HC和XZ写的手稿。高频和YZ编辑和修改了手稿。QY和XH分析数据。我和CZ收集数据。所有作者列出了一大笔,直接和知识贡献的工作,批准发布。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项研究是由中国国家自然科学基金(82001512),江苏省妇幼健康研究项目(没有。F201945),吉林省科技发展计划项目(20200404169号QY, 20180101140 XC)。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们非常感谢阿尔伯特Kaimin魏博士的贡献这个手稿的修改的语言(Albert Kaimin魏博士,医学博士,艺术性试管婴儿中心,1808 W。美国林肯大道阿纳海姆,92801)。我们感谢KEGENE生物技术有限公司为他们的帮助与生物信息学分析。我们感谢所有宝贵的贡献的研究医生协调员病人招聘和数据收集。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.608178/full补充材料gydF4y2Ba

脚注gydF4y2Ba

1. ^gydF4y2Bahttp://geneontology.org/gydF4y2Ba
2. ^gydF4y2Bahttp://www.genome.jp/kegg/gydF4y2Ba
3. ^gydF4y2Bahttps://david.nciferf.gov/home.jspgydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba