减少细菌基因组:工具、应用程序和挑战
妮可勒布朗
特雷弗·c·查尔斯- 1滑铁卢大学生物学系,滑铁卢,加拿大
- 2Metagenom生物生命科学公司,滑铁卢,加拿大
细菌细胞被广泛用于生产附加值产品由于其通用性,易于操纵,和大量的基因组工程工具。然而,生产这些所需的生物分子的效率往往是阻碍了细胞的新陈代谢,遗传不稳定,和产品的毒性。为了克服这些挑战,降低基因组已经执行,使菌株与担任底盘为下游应用的潜力。这里我们回顾当前的设计和施工技术,使这种reduced-genome细菌以及限制他们的挑战,组装和适用性。虽然基因减少显示改善许多细胞特征,构建的一个主要挑战仍然存在这些细胞有效和快速。计算工具一直在尝试创建最小化设计这些生物体所需的时间,但在造型这些减少差距依然存在在网上。基因的减少是一个大有前途的途径提高附加值的生产产品,构建底盘细胞,发现细胞功能,但目前有限的耗时的施工方法。改善和创造新颖的基因组编辑工具在网上模型,这些方法可以加快这个过程和创造更多的精简和高效的电池工厂。
1介绍
从研究疾病到生产各种材料适用于无数的行业包括食物、药品、和纺织品,细菌扩大了什么是可能的,导致了难以置信的进步。所反映出的这是工业用的细菌自然产生增值产品,如抗生素、氨基酸、治疗产品,生物燃料,为纺织品和医疗设备和材料等等(Quillaguaman et al ., 2005;Wendisch et al ., 2006;Olano et al ., 2008;De Eugenio et al ., 2010;崔和李,2013年;施et al ., 2014;江et al ., 2018;Samrot et al ., 2021)。然而,这些过程的依赖,在大多数情况下,生物体在自然进化,并不为这些工业过程创建。因此,他们有很多无关紧要的细胞功能所需的应用程序,它限制了生产效率目标最终产品(崔书记et al ., 2016;Weiser et al ., 2019)。DNA合成,测序技术的突破和不断增加的代谢途径使数据的创建新方法工程师优化细菌更有效率和收益率较高生产大量的应用程序。
计算单元内的最大挑战,限制其适用性是复杂性和缺乏可预见性。所有细菌细胞是由一系列和多样性的分子相互作用的复杂网络无数细胞功能(视野中时et al ., 2007)。这是进一步复杂化随机突变,其中一些造成移动元素,导致不可预测的细胞行为。应对这些问题,基因减少执行删除可有可无的基因从基因组。基因组测序和基因功能分析显示必要的那些负责核心生存,那些参与工业相关的流程,和不必要的基因导致基因组不稳定和多余的或未知的细胞功能(视野中时et al ., 2007;公园et al ., 2014)。当使用一个细胞产生一个特定的生物分子在定义的环境中,许多基因的功能不会导致预期的过程可以适合去除。这将允许创建定制的细胞工厂改善生理特性的特定的应用程序。这也可以更广义创建一个底盘只有细胞生存和proliferent生长所需的基因,可以进一步为下游应用程序设计。
2减少细胞基因组的好处
之前出版的第一个完整细菌基因组、基因组的减少大肠杆菌提出了基于基因的存在不必要的增长在定义的条件下(Koob et al ., 1994)。此外,使用支原体菌株作为最小基因组建设提出的模型由于其自然基因组最小化(Morowitz 1984)。现在,随着无数构造减少基因菌株,这些较小的基因组的好处是显而易见的。首先,减少细胞内的基因数量和功能减少了生物体的复杂性,使造型的代谢和功能预测简单得多(崔书记et al ., 2016)。接下来,基因组稳定性大大提高基因组减少压力。凸显了这个改进的生长特性包括基因组稳定后删除的生物合成的集群链霉菌属chattanoogensis(Bu et al ., 2019)。也在大肠杆菌删除出错的DNA聚合酶,在SOS反应和表达与诱导诱变,导致自发突变下降率50%,改进的遗传稳定性(Csorgo et al ., 2012)。另一个优势是细胞需要更少的能量复制的可能性较小的基因组以及转录和转译成本低。这种相关性尚未全面调查但许多减少基因菌株显示更快的增长和更高的细胞密度,可以归因于这些因素(Kolisnychenko et al ., 2002;沟口健二et al ., 2007;朱et al ., 2017;乔et al ., 2022)。例如,的基因组Lactococcus lactisN8基因组岛被删除噬菌体原减少了6.9%,导致时间缩短一代17% (乔et al ., 2022)。其他观察好处genome-reduced菌株包括增加生产所需的产品,和提高转换效率(Bu et al ., 2019)。最后,易于遗传操作是一个最大的优势降低基因组的压力。用改进的生长特性,简单新陈代谢,和更少的功能在细胞内进行,有可能用它来许多下游应用程序如外源基因表达和生产生物分子使用定制的代谢途径。
3基因组减少发生在自然
减少细菌基因组的想法来改善生理特点和创建优化主机源于这一过程发生的自然进化。细胞进化在强大的选择性压力下对环境变化保持体内平衡。这迫使细胞代谢和信号通路冗余扩展到更加强劲,已导致增加基因组大小(Kurasawa et al ., 2020)。因此,当细胞生长在实验室控制条件下,这成为不必要的冗余,从而能够大大降低基因组的大小。这是显示在专性共生细菌基因组已发生了显著减少通过进化(崔书记et al ., 2016)。例如,Buchnerasp,昆虫内共生体和相对的大肠杆菌基因组(4.5 Mb)基因组大小为450 kb (Wernegreen 2002;视野中时et al ., 2007),大约10的大小大肠杆菌不相关的亲戚(联系)。已经观察到类似的削减其他专性共生有机体细菌类包括Gammaproteobacteria成员(Buchnera aphidicola, Wigglesworthia,Blochmannia)和螺旋体属(包柔氏螺旋体burgdorferi)(弗雷泽et al ., 1995;Andersson et al ., 1998)。在这些专共生体,较小的基因组是有可能的,因为这些细菌从他们的主机访问功能和代谢产物,无需编码在自己的基因组,而独立生存的细菌的亲戚。当一个独立生存的细菌变得局限于主机,进化基因组削减的过程开始于大型和小型删除不再需要的基因,通常伴随着染色体重组(莫兰,丧心病狂的2012;Bobay Ochman, 2017)。这进一步发展与长期预留共生体的病原体失去许多假基因和几乎所有移动元素,导致一个更稳定的染色体(Bobay Ochman, 2017)。达到这些tiny-genome共生体中,有一个正在进行的基因损失随着生物的发展生存在给定的条件(Bobay Ochman, 2017)。最小的独立生存的细菌相比,支原体genetalium基因组的580 kb, genome-reduced共生细菌基因组等小两到四倍Candidatus Tremblaya首要的,一个betaproteobacteria 138 kb的基因组,Candidatus Sulcia muelleri、拟杆菌基因组的245 kbCandidatus Hodgkinia cicadicola的alphaproteobacteria 143 kb的基因组(莫兰,丧心病狂的2012)。
尽管基因组削减是第一次观察到专性共生细菌,研究比较基因组数据显示,在独立生存的细菌基因组(他们也普遍狼和Koonin, 2013年;Albalat Canestro, 2016)。基因组进化发生通过水平基因转移扩张和重复事件,从大规模的基因缺失和减少通过基因组(托马斯和尼尔森,2005年;林奇,2006)。有趣的是,细菌基因组偏向删除事件在扩张事件和这些大规模删除可以发生在相对较短的进化时间框架,突出了实验进化研究(米拉et al ., 2001;Kunin Ouzounis, 2003;尼尔森et al ., 2005;Koskiniemi et al ., 2012;李和马克思,2012)。需要考虑的另一个重要方面是有害影响大规模基因组减少对细胞和组织的基因组需要防止这个(视野中时et al ., 2007)。通过计算分析55细菌物种基因组规模的新陈代谢,是阐明细菌基因组组织等方式提高鲁棒性的代谢基因的删除相邻基因(Hosseini瓦格纳,2018)。这是种族隔离的结果必需和非必需的代谢基因簇和合成致死基因的分离对。自适应的力量支持这个组织尽管基因转座子等元素导致随机基因组重组已确定通过计算建模降低了细菌细胞。(Hosseini瓦格纳,2018)。
4设计reduced-genome细菌
4.1确定基因的重要性
之前减少一个有机体的基因组,研究常常用于确定哪些基因是至关重要的。重要性是完全依赖于细胞生长的环境和他们所需的应用程序。基因会被视为重要的种植在最小的媒体有限的营养补充,如氨基酸合成基因,未必会是必不可少的,当生长在营养丰富复杂的媒体(巴巴et al ., 2006;帕特里克et al ., 2007)。频繁,已经有目标基因,可以确定删除,如基因在竞争代谢途径试图产生一个特定的生物分子。但当想要显著降低,基因组是非常重要的评估需要哪些基因在给定的条件下生存。虽然本文的重点是基因的应用重要性确定构造reduced-genome菌株的研究,还有其他应用程序的数据值的注意。识别重要的基因生物体的生存将推动整体理解生命的基本原则(莫亚et al ., 2009;朱厄特福斯特,2010;juha et al ., 2011;Commichau et al ., 2013)。同时,基因是必不可少的一种细菌的生存可能小说抗菌发展目标(Bumann 2008;juha et al ., 2012 a,2012 b)。三种方法通常被确定在细菌基因的重要性:比较基因组学、大规模基因失活的研究,在网上造型。所有这三个路线有不同的优点和缺点,重要基因的基因组设计和决心从每种方法通常需要结合数据。
以下4.4.1重要性决定通过比较基因组学
首先,比较基因组学的方法比较了目标物种的基因组密切和远亲生物体的基因组来确定一组核心的重要基因。比较远亲细菌的基因组,发现了262个基因共享其中(Mushegian Koonin, 1996)。当更多的物种被添加到这个比较,基因的集合收缩到63年共同核心基因,主要是所有相关的基因表达和复制的基本组件,发现在细菌和真核生物域(Koonin 2003)。这可以给一个好主意生活所需的基因在所有物种中,但这些单独不会充分的生存。附件所需的基因和代谢基因也生存在给定的环境(Tarnopol et al ., 2019)。此外,蛋白质具有相似函数未必有序列的相似之处(莱利和serre, 2000年)。因此,最小基因集合的大小可能被低估只有那些证明是守恒的所有物种测试将被视为“基本”,这还不包括环境依赖的基因(视野中时et al ., 2007)。
4.1.2重要性确定的基因失活
大规模基因失活的研究中,可以利用转座子突变等。这些类型的分析能够得分突变体的生存能力。随着技术进步,将已知的重要基因总是不断变化的。凸显了这个信息枯草芽孢杆菌最初的一组271 orf认为十分必要,在2003年,进一步减少到253年的2014人(小林et al ., 2003;juha et al ., 2014)。转座子序列(秩序,Inseq TnSeq)是一种很常见的工具用来识别关键基因的基因组区域,已经应用于许多不同的物种和不同的生长条件(古德曼et al ., 2009;兰格里奇et al ., 2009;黄et al ., 2016;德et al ., 2017;希金斯et al ., 2017;婴儿et al ., 2018;de真理正义之神et al ., 2020;Johnson et al ., 2020;Matern et al ., 2020)。这包括创建一个饱和转座子图书馆,每个基因组区域被中断,理论上由转座子(灭活图1)。通过培养这个库在不同生长条件下,细胞包含一个转座子插入必不可少的基因组区域将无法生存。剩余的转座子的位置决定使用排序,识别的基因是不必要的。这可以被分配一个健身一步得分基于转座子插入频率在每一个基因。这有助于阐明非必需基因和quasi-essential基因,导致细胞生长但不生存的关键。虽然这个方法可以迅速识别成千上万的不必要的基因在整个基因组,它只显示了单基因突变和基因淘汰赛对生存能力的影响。这个基因组中未能捕获上位相互作用等多个删除时合成致命的双或删除组合可能会阻碍细胞快速增长的能力Yu et al ., 2002,2006年)。同时,单个基因的丧失会影响或控制其他基因的重要性。学习时m .肺炎和支原体agalactiae的基因参与生产必不可少的代谢物的代谢途径是必要的(Montero-Blay et al ., 2020)。然而,有两个途径,产生相同的基本代谢物,这些基因被列为健康基因和不重要,显示都可以删除,但在现实中,其中一个是必要的(Montero-Blay et al ., 2020)。相反的这就是至关重要的基因也可以不必要的响应呈现不同的基因组中基因的删除。基因组内的上位相互作用和冗余问题可以解决通过执行多次Tn-Seq基因组后删除但这是耗费时间和劳动密集型(和记黄埔et al ., 2016)。同时,这并不考虑基因不作为网络的一部分。
图1。原理图的构建基因组细胞减少。基因识别的基本使用实验和计算方法,减少基因通过自上而下的基因缺失或自底向上的合成方法,并评价修改的压力。
补充识别个人不必要的基因,一个方法结合Tn-Seq和Cre-LoxP名叫LoxTnSeq开发强调大基因组区域不必要的(肖et al ., 2020)。通过修改转座子也携带液态氧网站,两个lox网站可以随机插入到基因组创建和删除随机大小通过激活Cre重组酶,导致重组两个lox网站面向同一方向。这些缺失突变体可以在不同的条件和排序,筛选Tn-Seq一样。LoxTnSeq是应用于肺炎支原体产生的突变体285独特的删除从50个基点至28日kb(总基因组的21%)(肖et al ., 2020)。删除后,一个陷阱在以前的方法是删除突变体的选择依赖于筛查抗生素耐药性的损失(Tsuge et al ., 2007;Leprince et al ., 2012)。LoxTnSeq旨在解决这个问题通过形成一个不活跃的lox72网站删除后无法行动的Cre (肖et al ., 2020)。Cre重组酶表达的结构上是致命的m . pneuomiaeloxP网站的活跃,杀死细胞,没有删除(肖et al ., 2020)。
确定基因重要性的另一个方法是CRISPR干扰测序(CRISPRi-Seq),雇佣了一个催化地死突变的Cas9沉默基因表达而不是导致双链断裂(图1)(Rousset et al ., 2018;刘et al ., 2021 a)。通过一个超过90000 sgRNAs池,目标随机基因位点大肠杆菌以前,21%的带注释的重要基因被认为是不必要的。最初,有毒性问题当dCas9结合一些具体PAM-proximal sgRNAs序列(崔et al ., 2018)。分析构造sgRNA图书馆内的指导后,池过滤下来∼23000 sgRNAs。像Tn-Seq sgRNA图书馆集成后,沉默至关重要的基因将耗尽,那些不必要的地区镇压才能生存。因此,测序后,读取从剩下的细胞的数量可以比作初始池来确定基因的重要性。另一个类似的研究是使用约60000指南在运行大肠杆菌尽管有3倍的数量指南在图书馆,这两项研究取得了类似的结果(王et al ., 2018)。改善sgRNA设计方法和减少图书馆规模最终将使更多的实验同时运行,降低DNA测序和合成的成本。比较使用CRISPRi-Seq和TnSeq确定可以找到基因的重要性表1。这种方法的一个优点Tn-Seq是研究基因组中重复区域的能力。gRNAs将目标基于同源的基因组中特定区域周围的PAM网站,所以同样的基因区域的多个副本给相同的序列可以被压抑的同时,提供一个更准确的表示基因镇压。另一方面,TnSeq,转座子将随机整合到一个基因组区域,而不是特定序列如果有相同基因的副本,即使其本质,它可能解读为不重要的由于其他副本的互补。此外,镇压水平可以通过修改gRNA有些监管目标或序列同源性,转座子插入和中断一个基因没有任何级别的控制的影响这样的插入。最后,CRISPRi-Seq可以有更广泛的应用,针对特定的基因通过简单地改变gRNA池位置转座子集成随机没有特异性。这种方法已经被应用于创建一个图书馆gRNAs目标的核心基本基因组18大肠杆菌菌株比较基因本质在不同遗传背景(Rousset et al ., 2021)。类似的方法也被应用链球菌引起的肺炎,弧菌natriegens,集胞藻属sp。PCC 6803 (李et al ., 2019;姚明et al ., 2020;刘et al ., 2021 a)。
表1。对比TnSeq和CRISPRiSeq方法来确定基因的重要性。
4.1.3重要性确定的计算方法
计算程序和模型已经开发补充和填补一些空白的耗时和昂贵的实验方法确定必要的基因。利用计算生物学协助重要基因预测并不是什么新鲜事。比较基因组学,上面所讨论的,自1996年以来一直使用和机器学习模型来预测蛋白质可分配是在2005年(Mushegian Koonin, 1996;陈和徐,2005年)。随着技术进步,这些模型和项目最近变得更加成熟和计算方法来解决一些挑战。最大的挑战之一是基因的最小集最小化代谢网络在细胞环境中可能不是可行的和/或不活动的可行性。因此,这被认为是在开发一个程序来模拟时所有阶段至关重要的基因预测。主要特点是在计算模型包括表达水平、序列组成、进化的保护,域信息和网络拓扑结构(董et al ., 2018)。这些特性深入了董et al ., 2018但下面的简要描述。首先,至关重要的基因的表达水平通常高于不必要的基因(劳埃德et al ., 2015)。这个特性可以用来补充其他重要性的预测功能,但不是作为一个方法自行评估由于这发生的变化。接下来,序列组合可以作为有差异分析必要的和不必要的基因的氨基酸序列。重要性的决心,但这是一个新方法适用于所有测序基因组不需要蛋白质的功能数据(张、张,1994;Sarangi et al ., 2013;Ning et al ., 2014)。进化的保护是常用的作为重要性的标志和基于基因的概念存在对负选择通过进化可能参与细胞内的基本功能(约旦et al ., 2002;Bergmiller et al ., 2012)。像进化保护域信息的蛋白质的特殊保护地区的蛋白质执行类似的功能。同时,必要的基因编码的蛋白质会各种领域发现很少在其他蛋白质,使这些函数的替换困难(陈et al ., 2015;彭et al ., 2015)。第一个应用程序域信息从2011年开始,此后被使用在不同的研究中,但不像进化常用的保护(邓et al ., 2011;程et al ., 2013;林et al ., 2019)。最后,网络拓扑结构是指蛋白质在细胞内与互动的方式至关重要的基因更频繁地发现复杂的蛋白质相互作用网络的中心Yu et al ., 2004;王et al ., 2012)。这也适用于代谢、基因co-expression和转录网络(Acencio Lemke, 2009;da Silva et al ., 2008)。在大多数情况下,重要性研究结合等这些特性的拓扑网络结合基因表达谱(Plaimas et al ., 2008,2010年;邓et al ., 2011)。
根据实验数据和计算模型,在线数据库的基本创建了不同物种的基因。首先,重要基因的数据库(度)已经基本基因列表66年菌株基于实验数据和不断更新这个列表(Zhang et al ., 2004;罗et al ., 2021)。这个数据库是应用最广泛的由于其同源性搜索等实用工具使用嵌入式防爆工具,因为它包含重要的遗传元素以外的蛋白质编码基因非编码rna,监管序列,和必要的启动子(彭et al ., 2017)。相关资源,预测重要基因的数据库(pDEG),建于2011年在度相同的格式包含预测不同的关键基因支原体但没有被更新之后包括基因组其他物种或品种(林和张,2011年)。两个数据库基本成千上万的物种基因最近公布,ePath和NetGenes (香港et al ., 2019;Senthamizhan et al ., 2021)。ePath,于2019年发布,对超过4000个细菌(包含必要的基因预测香港et al ., 2019)。它的预测是基于KEGG直接同源(KO)生物功能注释,从而限制这个程序与KO基因数据可用。例如,一个链球菌应变有819 2270个基因注释的KO所以只能评估这些基因的重要性。这可以绕过通过使用内置KEGG程序,BlastKOALA计算分配KO数字,但明显的问题是,这是一个估计,而不是从实验数据(Kanehisa et al ., 2016)。ePath的输出包括重要性分数基于实验数据(E-score)和基因的参与至关重要的细胞过程(P-score)预测精度为75 - 91% (香港et al ., 2019)。NetGenes在2021年发布,预测了2700细菌物种,包括必要的基因信息重要性分数和特征向量(Senthamizhan et al ., 2021)。重要性的预测依赖于蛋白质交互网络特性从数据库的字符串中描述的深度在最初出版从2018年(Azhagesan et al ., 2018)。该数据库提供了一个强大的基本模型和不必要的基因分类但未能捕捉不重要但健康基因需要强劲的增长态势。因此,尽管这个数据是很重要的,这个模型还没有建立独立设计一个使用强大的最小基因组细胞增长。其他数据库包括弯曲(在线基因本质数据库),鸡蛋(重要基因在基因组范围内),CEG基本基因(数据库集群)简要描述表2。
表2。至关重要的基因数据库和计算程序来预测基因和基因删除设计至关重要。
除了必要的基因上的所有数据库,创建了开放获取程序运行至关重要的基因预测,总结表2。Geptop预测细菌重要基因发展史的基础上,评估物种进化距离使用组成向量方法,和orthology,寻找相似的蛋白质在基因组最好使用相互冲击方法(魏et al ., 2013)。这个程序中,最初成立于2013年,最近被更新以包含更本质的数据,增加从19岁到37个物种,并提高计算速度(温家宝et al ., 2019)。Geptop 2.0是简单的使用一个接口输入DNA或蛋白质序列和接收概率的预测重要性基因或蛋白质,但只能使用完全测序的生物(温家宝et al ., 2019)。CEG_Match, CEG数据库扩展,预测基于函数(重要基因你们et al ., 2013)。更具体地说,它匹配的带注释的基因名称与集群基因名称CEG数据库内,避免与爆炸问题搜索通过消除误分类的基因与不同的序列,但类似的功能(你们et al ., 2013;彭et al ., 2017)。这里,最明显的限制是,这种预测方法仅适用于基因与已知函数和名字。
机器学习也是一个越来越受欢迎的路线确定基因的重要性,回顾了广泛(刘et al ., 2020 b,2021 b;Aromolaran et al ., 2021)。短暂,机器学习的能力是一个计算机系统来“改善”和“学习”使用输入数据进行预测,尽管没有被编程准确(Aromolaran et al ., 2021)。数据模型生物至关重要的和不必要的基因是用来训练分类器,然后应用于预测基因本质相同的或不同的有机体。创建了许多机器学习模型来分析蛋白质和基因组功能现在已被应用于重要基因测定(彭et al ., 2017)。这些模型被训练使用派生特征描述和特征序列(程et al ., 2013;Ning et al ., 2014)。序列派生功能包括各种因素如GC含量,密码子使用情况,蛋白质长度(更大型和小型蛋白质相比,中等大小的蛋白质编码通过必要的基因),链偏差等等(Lipman et al ., 2002;龚et al ., 2008;彭et al ., 2017)。上下文相关的功能包括那些以前讨论像蛋白质域属性,蛋白质相互作用网络、蛋白质定位和基因表达(Jansen et al ., 2002;Seringhaus et al ., 2006;Acencio Lemke, 2009;邓et al ., 2011;彭,2014高,)。机器学习方法来预测基本基因改进相比,同源性映射时,因为他们可以使用更多的功能构建预测模型(邓et al ., 2011;陆et al ., 2014)。基于机器学习方法的重要性预测称为基本基因预测出路)自由访问和只需要核苷酸序列输入(Ning et al ., 2014)。出路使用氨基酸密码子,核苷酸的使用以及密码子功能独立构建预测模型。这是通过使用训练数据集来自16个基因与已知的重要基因(Ning et al ., 2014)。它已经成功地用于识别基因在许多生物体包括至关重要鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌(Plaimas et al ., 2010;邓et al ., 2012)。但是功能和组合的选择可能会影响性能的预测和没有明确的方法,选择合适的特征不同的生物体(Mobegi et al ., 2017)。准确性也,低于一些新方法由于有限的参考物种和参数用于估计(彭et al ., 2017)。一般来说,机器学习模型的一个限制是由于无法预测quasi-essential基因。此外,缺乏完整和正确的实验数据和计算研究影响至关重要的基因预测的准确性在机器学习模型。
机器学习的一个子集,深度学习网络,可以使用标记或者非结构化数据无监督学习。DeeplyEssential深层神经网络,利用这种学习模型来预测基本基因通过只使用序列信息(哈桑和Lonardi, 2020)。这个模型能够达到较高的灵敏度和精度相对于集群和down-sampled之前使用数据集(刘et al ., 2017;哈桑和Lonardi, 2020)。DeeplyEssential以来无数应用程序只需要有机体的基因组序列与其他模型相比,要求拓扑或结构性数据可能不可用。重要性的另一个深刻的学习模型预测了采取不同的方法使用一个框架,自动学习生物特性没有先验信息的要求(曾庆红等人。,2021年)。这个网络使用基因表达的信息,亚细胞定位、学习和蛋白质相互作用网络的拓扑特性(曾庆红等人。,2021年)。深度学习模型的一个主要缺点是高计算成本时训练网络(Aromolaran et al ., 2021)。当使用专门为预测至关重要的基因,他们需要训练和大数据优于传统的机器学习算法和高复杂性与调优参数深度学习模型(Aromolaran et al ., 2021)。这种方法的最大优点是能够从生物模型训练算法与数据和用它来预测基本基因注释的有机体。但是,正如前面提到的,这是无法预测和quasi-essential基因条件必不可少的。一般而言,至关重要的基因预测的计算方法是伟大的工具来补充实验方法,但需要进一步改进作为一个独立的工具。
4.2战略构建reduced-genome细菌细胞
一旦发现的重要基因结合上述计算和实验方法,下一步是减少基因组。这可以使用自底向上方法,化学合成的最小基因组,或自顶向下的方法,删除不必要的基因从基因组(图2)。自底向上的方法与测序技术的进步,使基因合成和组装技术。这种方法也提供了独特的机会,不仅创建带有一个较小的基因组的细胞,但也重组基因组生物技术的应用程序。然而,自上而下的施工方法更受欢迎,已经利用更多遗传信息(因为他们不需要完成唱et al ., 2016)。此外,各种各样的删除方法,其中许多针对特定物种,使几乎所有的菌株中使用这种方法。因为这次审查的重点是基因组最小化的方法用于制造大型删除或多个顺序删除将讨论,并总结了图3。之前进行删除,删除,以便使他们需要确定。
图2。实验方法的确定基因的重要性。TnSeq随机基因失去活性通过随机插入一个转座子从一个向量。通过插入两个转座子LoxTnSeq删除一个随机的基因组区域包含LoxP Cre网站和激活重组。CRISPRi-Seq随机基因失去活性的表达一个随机gRNA和dCas9绑定和压抑的表情。为所有三个突变体将汇集并受各种条件后跟测序确定剩余的转座子位置或指导RNA。
图3。删除方法用于制造大型基因组减少。(一)特定场地重组删除方法使用两个复合站点(RS),由重组酶起作用导致重组和删除的目标。(B)λ红recombineering I-SceI使用线性DNA片段I-SceI削减网站(S)与重组导致双链断裂之间的同源区域(人力资源)来修复,结果产生染色体的缺失。(C)同源重组介导删除使用counterselectable标记(CS)选择第二复合事件导致删除或野生型的回归。(D)CRISPR-based删除用人Cas9导致双链断裂,迫使细胞修复利用同源重组,导致删除。
4.2.1计算基因组的设计准备减少
随着更多的是了解细菌基因组,决定哪些基因移除的过程以及如何消除这些基因变得越来越复杂。类似于使用计算工具来预测基因的重要性,一些项目开发协助删除选择和基因组的设计。定制的设计细胞工厂生产关键生物分子或底盘为下游应用程序由分割阻碍我们的知识的性质。即使如何构建合成基因组的知识和工具自下而上,很少的构造和报告由于设计这样的基因组的困难(和记黄埔et al ., 2016;理查森et al ., 2017;Fredens et al ., 2019)。这源于小基因组设计原则的理解由于过度目标生物体的复杂性。还有一个缺乏能力的分析和评估基因组设计和压倒性的数量可能与小基因组(即使对细菌基因组配置Matteau et al ., 2020)。即使把最小的生物,比如m . genetalium共有525个基因,有2525年可能公司设计,从而无法评估所有这些设计在活的有机体内。因此,计算全细胞模型(wcm)开发了模拟细胞的动力学,但目前主要局限于生物模型由于缺乏基因组注释(卡尔et al ., 2012;Chalkley et al ., 2019;Munzner et al ., 2019;Norsigian et al ., 2020)。这些算法可以模拟大型基因组缺失的影响生长速度和代谢实验前测试和协助设计基因组基因的最小集合在一个最优的配置。
三个算法目前存在运行这些基因组减少模拟;MinGenome、扫雷艇和伽马(猜/添加/伴侣算法)(表2)(王Maranas, 2018;Rees-Garbutt et al ., 2020)。MinGenome强调长地区的不必要的基因,通过融合生物知识与基因组基因的位置和重要性等代谢模型(王Maranas, 2018)。也评估大型基因组区域,可以删除甚至包括区域包含一个或两个重要基因后,可以重新。这个算法被应用到大肠杆菌MG1655基因组和显示出类似的实验研究结果以及选择删除尚未试图在细胞的组合。扫雷艇采用的方式略有不同,它对所有的基因都可以同时从基因组中删除,导致多个不同的基因组结构自删除的顺序是非常重要的Rees-Garbutt et al ., 2020)。首先删除基因组然后移动删除单个基因。该算法是基于基因敲除模拟来确定必要的和不必要的基因。伽马,发达的同时扫雷,首先认为不必要的基因缺失在猜/添加阶段之前添加在最后伴侣阶段至关重要的基因(Rees-Garbutt et al ., 2020)。在猜测阶段,所有不必要的基因从输入(这是一个预处理阶段确定不必要的基因)分为四组用于制造大约400的基因子集组合的基因删除,确定是否会发生细胞分裂与删除。这些可行集来添加阶段,在删除集从之前的组结合成一个更大的删除组。大约3000的这些组合删除集测试和生产的一个可行的细胞也是有等级的,服用50最小基因组的交配期。在这个阶段,两个50的最小基因组与随机交配淘汰赛和从池中敲入的蛋白质编码基因。1000模拟交配执行和更新后的应变传递回另一轮的池,这是持续了100代。伽马非常需要大量计算能力的模拟,使用400年和3000年之间的cpu,接管两个月处理标准的超级计算机来生成最小基因组的大小减少。因此,之前开发的基因组设计套件用来实现伽马(Chalkley et al ., 2019)。完整的细胞模型被用来模拟10集的最小基因的文学m . genetalium在网上,发现这些细胞不能分裂和复制基于该算法(Rees-Garbutt et al ., 2021)。这些基因集删除重要基因,即使是那些被编译TnSeq基因敲除研究。后重新26个基因被认为是至关重要的,“低至关重要”,这些基因集可能再次分裂在网上。这凸显了脱节可用最小基因数据集和开发的各种压力在活的有机体内研究。而新菌株开发从这个模型没有测试实验,这表明这些模型的潜力来改善现有的菌株和创建新的基因组压力降低。
最后,另一个程序叫做DELEAT(删除设计重要性分析工具)创建相结合在网上大规模基因本质预测和自动删除所有细菌基因组的设计(索拉纳et al ., 2021)。估计基因本质,基因被分配一个重要性得分从0到1基于6基因特性不依赖于功能注释或实验数据。删除设计是基于两个参数,所需的最小长度(L)和删除重要性评分(E),手动修改删除后,该项目将提供一个总结与各种因素包括删除大小,删除,删除订单。一个额外的功能将设计引物用于使基于megapriming删除构造。这是用来强调35删除,可以制造的巴尔通氏体属昆塔纳减少29%的基因组(索拉纳et al ., 2021)。虽然这个程序尚未充分测试,它提供了前景的洞察快速设计减少细胞。这是第一个项目,使删除设计,从删除的删除顺序和引物的设计。
4.2.2特有的复合删除方法
搬到基因缺失,特定站点可由于他们经常使用删除效率高和功能跨多个菌株。经常使用的两种方法和功能同样是隔爆/ FRT和Cre / loxP导致之间的重组FRT或loxP网站由隔爆和Cre可分别。当这些网站是面向同一方向,重组将导致该地区的切除两个站点之间的两个站点之间的重组面临着相反的方向反演结果。所以,两个向量包含FRT的loxP网站可以通过同源重组,引入基因组一个上游和一个下游的删除目标(图3一)。重组酶的介绍后,删除目标是切除的基因组只留下一个FRT或loxP网站。这种方法已经用于制造非常大的删除效率高但剩饭重组网站,顺序删除不能没有把剩下的站点(小松et al ., 2010)。改进Cre / loxP利用已经绕过这个问题loxP突变呈现剩饭loxP网站功能。这使得新功能loxP网站重新引入到应变随后删除。这是应用杆菌、利用突变lox71和lox66网站导致双突变体lox72网站后重组Cre亲和力非常低(关et al ., 2017)。这允许多个删除,但仍有许多lox72网站在整个基因组构建reduced-genome底盘应变时并不理想。另一个垮台与特定场地复合删除方法是单调乏味的缺失突变体的选择过程。每一个向量与复合插入网站会有一个可选择的抗生素抗性基因标记选择双集成。细胞将筛查对选择的抗生素敏感区分那些删除和反演。这可以避免在一些物种因为Cre的本构活动活跃loxP网站是有毒的,喜欢的m .肺炎,但这并不是适用于所有细菌。还有Flp修改/ FRT系统包括counter-selectable标记,使缺失突变体的选择(石川Hori, 2013)。
4.2.3同源重组删除方法
应对突出的一些问题之前,使用替代方法包括markerless同源recombination-mediated counter-selectable删除。这包括同源区域的插入删除和下游的目标变成自杀向量包含一个可选择的抗生素抗性标记和counter-selectable标记(图3 b)。常见的counter-selectable标记系统包括蔗糖(sacB),fusaric酸(tetAR)、链霉素(rpsL)和5 -氟尿嘧啶(upp)(Reyrat et al ., 1998;Fabret et al ., 2002;康et al ., 2002;Kristich et al ., 2005;吴作栋et al ., 2009;凯勒et al ., 2009)。第一个重组事件(向量插入基因组)可以选择抗生素板和第二复合事件从基因组(切除)可以counter-selected在上述物质之一。如果向量仍然存在,counter-selectable标志将导致细胞死亡。这种方法被广泛使用,因为它是一个“无疤”删除方法基因组中,不留痕迹。赤字的方法包括删除特定站点删除方法相比效率越低。在第二个重组删除事件,有50%的可能性只切除的质粒基因组,保留删除目标。在实践中,这50%的效率缺失很少用一个更实际的效率从10 - 40% (伯爵和Altenbuchner, 2011)。也,效率下降迅速增加删除的大小。例如,删除26和64 kb实现效率分别为40 - 20% (伯爵和Altenbuchner, 2011)。可以做出非常大的删除删除1.4 Mbp所示链霉菌属,但是需要广泛的筛选分离细胞正确的删除(小松et al ., 2010)。这个删除由Cre-LoxP实现删除效率为100% (小松et al ., 2010)。因此,尽管这是一个无疤与counterselection删除方法,筛选需要隔离野生型和删除突变体多个删除时这是非常耗时的。
为了避免耗时的筛选,已经采取了两种途径,使得并发删除后,结合成一个应变和小说发展的删除方法。删除方法结合λ红recombineering和I-SceI介导的双链断裂修复应用假单胞菌顺序基因删除(陈et al ., 2016)。λ红色recombineering雇佣了三个酶催化同源重组的线性DNA和染色体DNA双链,避免了需要做任何组装步骤以外的细胞(Yu et al ., 2000)。所以,线性基质DNA包含一个抗生素抗性基因两侧是两个I-SceI识别网站(S)和500个碱基对同源区域,加删除目标(图3 c)。电穿孔后,I-SceI复合抗生素耐药性消除了磁带,和细胞修复双链断裂使用RecA-mediated同源重组(陈et al ., 2016)。类似的方法已应用于其他物种等棒状杆菌属glutamicum和大肠杆菌(Vernyik et al ., 2020;吴et al ., 2020)。在大肠杆菌一种方法使用一个包含I-SceI Tn5转座子连续,无疤基因组中删除在随机的位置(Vernyik et al ., 2020)。这导致压力减少高达2.5%的基因组与改进的生长特性包括生物质产量。有趣的是,60的基因组测序,删除被观察到在相同的12个区域(Vernyik et al ., 2020)。第二种方法用于避免耗费时间顺序删除员工使用噬菌体转导独立基因删除合并成一个应变(Posfai et al ., 2006;Umenhoffer et al ., 2017;Saragliadis et al ., 2018)。这允许多个删除,同时,降低所需的总时间。这也是用于删除一个应变制造转移到一个不同的菌株,应用广泛大肠杆菌(Umenhoffer et al ., 2017)。这是噬菌体的宿主范围的限制与多个转导噬菌体的存在,但有许多菌株兼容这种方法删除的组合(康et al ., 2002;李et al ., 2004;Saragliadis et al ., 2018)。
4.2.4 CRISPR / Cas删除方法
最受欢迎的基因组编辑工具在真核生物域CRISPR-Cas系统的成员。尽管是成功的在某些细菌的模式菌株,CRISPR技术没有广泛应用于其它细菌与真核生物有机体的增加使用(Dicarlo et al ., 2013;江et al ., 2013;马里et al ., 2013)。CRISPR-Cas系统分为两类;类1组成的多亚基的复合物和二班大,多域蛋白质组成的一个单元(Makarova et al ., 2020)。二班系统已经大部分用于细菌,包括Cas9 Cas12,通常涉及的创建在DNA双链断裂修复信号通过同源重组或异源加入结束。Cas核酸酶由gRNAs可以针对一个特定的位置,将秉持互补DNA两侧protospacer相邻的主题(PAM) (Gasiunas et al ., 2012;Jinek et al ., 2012)。经常在细菌中,DNA乳沟和这些大型核酸酶是致命的过度表达,限制他们的使用使基因删除(Vento et al ., 2019;Arroyo-Olarte et al ., 2021)。
关于减少大规模基因组,CRISPR-Cas系统已经应用在两个方面,counterselect成功删除突变体,删除。由中科院杀伤力展出的DNA断裂核酸酶可用于counterselection。乳沟时防止PAM网站是通过基因缺失和那些没有删除将有一个双链断裂,导致细胞死亡(哦,和van Pijkeren, 2014;Banno et al ., 2018;Penewit et al ., 2018;Wirth et al ., 2020)。这是一个有用的方法选择效率高的小缺失,与较大的删除(但这效率明显下降Aparicio et al ., 2018)。
此外,CRISPR-Cas基因删除成功和快速开发的系统在不同的细菌种类(黄et al ., 2015;所以et al ., 2017;李k . et al ., 2018;Zhang et al ., 2019)。这些方法通常会导致删除后解理二班Cas核酸酶和DNA同源重组修复(图3 d)。这个使用外源重组酶或依赖于内源性同源重组机械。使用本机复合机械简化整个过程,因为它只需要一个或两个向量窝藏CIRSPR-Cas元素和编辑模板,但这机器可能缺乏一些细菌。例如,基因簇链霉菌属coelicolor21到82 kb被用Cas9删除效率38 - 100% (黄et al ., 2015)。此外,这些基因簇与效率29至54%同时被删除,实现删除的总时间减少3倍而Cre-LoxP等其他方法。这包括接合大肠杆菌窝藏组成型表达的质粒Cas9和gRNA以及下游地区同源删除目标。乳沟和两个交叉事件后,只有细胞与同源重组修复才能生存。另一个删除的质粒可以治愈。类似的方法使用Cas9应用枯草芽孢杆菌实现删除单个基因效率100%左右和80%左右38-kb区域(所以et al ., 2017)。这里,双链断裂引起的删除与同源地区区域协调two-plasmid系统修复。
所有这些CRISR-Cas9-based编辑方法,利用recombineering要么使用线性DNA或环状DNA作为编辑模板,各有其优势和劣势(江et al ., 2013;黄et al ., 2015;冯et al ., 2018)。环状DNA具有较高的编辑和复合效率,因为它可以复制以及质粒复制和不是DNA核酸外切酶的攻击,但有可能是整个基因组质粒将被纳入,导致假阳性率高(黄et al ., 2020)。线性DNA另一方面与基因组整合没有问题所以积极率更高,但它可以通过核酸外切酶降解。这些挑战面对将元素的循环和线性DNA目标成一个模型。通过添加删除模板质粒两侧的目标序列,Cas9乳沟可以释放这个片段的质粒。这在转换过程中保护它免受降解,达到积极率高的删除利用线性DNA编辑模板。这种方法被用来删除187 kb的DNA区域大肠杆菌基因组与编辑效率和积极的利率远高于其他CRISPR-basedλ-Red recombineering方法(黄et al ., 2020)。这是采取进一步使12顺序删除总计370 Kb大肠杆菌(黄et al ., 2020)。
其它障碍使用CRISPR-Cas9删除方法是细菌的细胞毒性观察从Cas9表达,即使在其催化地死去的形式(李l . et al ., 2018;曹et al ., 2018)。即使在菌株能够耐受Cas9,编辑效率降低,因为生存的细胞数量较低(徐et al ., 2015;李问:et al ., 2016;歌et al ., 2017)。这是提高控制Cas9与诱导启动子的表达,但仍可能导致漏水的表达毒性(Reisch和普莱瑟,2015;Wasels et al ., 2017;Vento et al ., 2019)。其他方法包括light-inducible系统,没有试图在细菌中,在高温下,细胞的生长,防止Cas9函数,这是不活跃的42°C以上,但这需要细菌可以忍受这个温度(Polstein Gersbach, 2015;Mougiakos et al ., 2017;Nihongaki et al ., 2018;周et al ., 2018)。使用替代ca酶或突变Cas9变异是一个选项来规避这个细胞毒性等的使用Cas9n有突变,防止双链断裂,只允许酶尼克一个DNA链(Jinek et al ., 2012;Standage-Beier et al ., 2015)。大删除一些不同物种已经通过使用这种方法(Standage-Beier et al ., 2015;李k . et al ., 2018)。然而,Cas9n突变编辑效率较低,尤其是在低表达的酶(歌et al ., 2017;Malzahn et al ., 2019)。这是一个可行的路线去探索一个更稳定和通用CRISPR-based删除方法但是首先需要加强。
另一个前景看好的路线是探索其他Cas核酸酶的优点和局限性。一项研究表明,Cas12a核酸酶能够实现高效的编辑和转换棒状杆菌属glutamicum虽然Cas9和Cas9n不能(江et al ., 2017)。Cas12a已经应用艰难梭状芽胞杆菌做大49 kb和多路复用删除,删除链霉菌属让单引号和双基因缺失与效率在95%到75之间,包括和其他物种大肠杆菌和分枝杆菌smegmatis(燕et al ., 2017;李l . et al ., 2018;香港et al ., 2018)。虽然这些有一些成功的例子,Cas12a仍然是一个类2核酸酶,这意味着它是一个大型multi-subunit蛋白过表达时可引起细胞毒性。
最近的努力一直在使用类1核酸酶是由多个亚基(徐et al ., 2020)。一个使用这些包括“建造”基因组编辑使用内生CRISPR-Cas编码系统。这涉及到内CRISPR-Cas系统存在的识别感兴趣的应变和组装一个包含最小目标质粒CRISPR数组来瞄准特定基因组区域。删除是由解理其次是homology-directed DNA修复(徐et al ., 2020)。单删除已经成功地在不同的菌株包括效率高c . saccharoperbutylacetonicum(100%),c . pasteurianium(100%),c . tyrobutyricum(100%),梭状芽孢杆菌(30 - 100%),l . crispatus(100%),铜绿假单胞菌(50%)和z mobilis(100%)(Pyne et al ., 2016;Zhang et al ., 2018;Atmadjaja et al ., 2019;Hidalgo-Cantabrana et al ., 2019;Maikova et al ., 2019;徐et al ., 2019;郑et al ., 2019)。多路复用基因缺失也被同时执行删除2基因c . tyrobutyricum有100%的效率和3基因z mobilis18.75%的效率(Zhang et al ., 2018;郑et al ., 2019)。类1核酸酶的另一个例子是使用Cas3使非特异性删除内生从7到424 kb铜绿假单胞菌以及不同的效率达到100%大肠杆菌和假单胞菌两没有修复的模板(Csorgőet al ., 2020)。尽管Cas3没有特定的目标,它很有可能使删除与更高的效率远远大于Cas9使基因组大幅减少。修改的功能Cas3,核酸酶突变删除其解旋酶活性,酶转化为一个nickase (nCas3),尼克单链DNA (郝et al ., 2022)。因此,两个crRNAs被要求同时目标两个基因位点双轻伤。这种方法是应用z mobilis生成一个删除9 kb效率93.75%,同时删除两个地区的效率75% (郝et al ., 2022)。其他改进包括创建类1 CRISPR-Cas系统可用于不同的主机。可转让系统采用typeI-F级联是创建和使用删除21个kb假单胞菌种虫害与提高效率相比Cas9系统(徐et al ., 2021)。这也是进一步修改将λ-red用于菌株与anti-CRISPRs同源重组和细胞较差(徐et al ., 2021)。尽管所有这些类1 CRISPR-Cas工具不是用来构造一个基因组细胞减少,他们仍然显示承诺开发一个系统,使基因减少紧张和没有本地CRISPR系统大规模。
大多数研究使用CRISPR-based方法使基因删除只强调它的使用使几个删除在一个压力。很少有研究强调策略,可以使用多个菌株和一些,比较不同方法的相同的删除。一个例子是一个策略采用矩形重组酶和Cas12a不同棒状杆菌属glutamicum压力,但不是很适用于大型删除由于低效率(江et al ., 2017)。另一个是使用各种typeI-F级联假单胞菌压力,但也只在小测试,单删除(徐et al ., 2021)。因此,CRISPR-based方法,没有一个流行的方法,删除策略需要根据应变,基因组大小,删除位置和数量的缺失。
总的来说,CRISPR-based删除方法显示了两个改进counterselection方法的有前景的结果和删除用同源重组,但有大量的研究仍然缺乏提高该系统的效率在很多细菌的遗传背景。没有删除的方法适用于跨多个物种和多个删除目标,这项技术是非常有限的比其他更普遍的方法。许多二班核酸酶包括Cas9和中科院12也只被应用在各种生物模型高转换效率,所以还不能直接适用于许多物种。类1核酸酶包括Cas3显示重大承诺改善基因组大小的细胞毒性和删除但尚未广泛用于降低基因组的大小或多个基因缺失。综上所述,减少细胞毒性,增加删除效率,持续探索替代Cas核酸酶,和测试大基因组减少需要处理,使这些技术更适用于大规模删除在范围广泛的细菌。
5 reduced-genome细菌菌株的应用
5.1基因缺失进行调查研究
最早的报告基因删除应用调查的影响细胞内的各种基因的删除它们的基因组。这通常涉及删除一次只有一个基因的基因组。例如,大量研究调查的缺失的影响recA在各种压力。在牛结核分枝杆菌波士顿咨询公司,recA删除显示细胞更容易dna有害(桑德et al ., 2001)。在大肠杆菌,一个recA删除增加转换效率和改善在活的有机体内噬菌体包装(寇尼特1989)。基因的删除也可以做出一些意想不到的发现。在链球菌引起的肺炎锌吸收脂蛋白的删除,adcAII透露,一个出乎意料的关系胶囊厚度(Durmort et al ., 2020)。胶囊的主要毒力因子,但机制参与其厚度的规定不是很好理解。的部分删除adcAII导致膜厚度增加,这使得hypervirulent和抗中性粒细胞在小鼠模型(Durmort et al ., 2020)。小说的另一个发现功能在以前带注释的基因区域Sinorhizobium meliloti当删除几乎一半的基因(diCenzo et al ., 2016;Milunovic et al ., 2014)。的基因组美国meliloti分为三个部分,一个圆形3.7 Mb的染色体,chromid 1.7 Mb,和1.3 Mb的megaplasmid。减少chromid megaplasmid被移除,重要基因chromid携带移动的染色体发现四个意想不到的必不可少的毒素/抗毒素基因,显示第一个报告,其中两个偶函数作为毒素/抗毒素系统(Milunovic et al ., 2014)。
此外,删除也进行调查研究细菌基因在人类发病机理中的作用。再次在美国pneuomiae删除一些基因位于Entner-Doudoroff途径导致中耳炎的钦奇利亚毒性和死亡率增加模型(耳朵感染)(胡锦涛等人。,2019年)。总的来说,本研究确定了各种代谢基因毒性和致病性的角色包括葡萄糖脱氢酶、Entner-Doudoroff通路,ketogluconate降解基因(胡锦涛等人。,2019年)。这些基因如何删除的一些例子可以用来研究各种基因的作用在大量的过程中突出了其重要性在基因组和功能的发现。
5.2基因减少生产改善生物分子
由于细菌广泛应用于工业过程产生各种生物分子,强劲的压力,能够在艰苦的条件下生存,自然有能力生产特定产品入围使用工业规模。这些包括菌株的链霉菌属sp。,假单胞菌sp。,枯草芽孢杆菌,大肠杆菌(Kolisnychenko et al ., 2002;Commichau et al ., 2013;贝尔达et al ., 2016;Calero Nikel, 2019)。通过进一步修改这些生物合成产品更有效,其适用性的扩张,并降低了生产成本。技术来改善生物分子生产包括增加前体供应,通过特定的生物合成途径,提高流量,减少副产物的形成从替代途径(高et al ., 2010)。基因的减少可以针对这三个领域如做大基因组删除删除不必要的能源和资源消耗函数或通过有针对性的竞争途径的缺失。一些感兴趣的生物分子和菌株基因组减少下面突出显示改善生产和总结表3。
表3。以前的菌株基因组减少。
一个感兴趣的领域是增加生产polyhydroxyalkanoates (pha)。pha是由各种自然生物聚合物合成细菌作为一个有限的营养环境中储存的碳源和碳源的高可用性(肯纳先生和斯利瓦斯塔瓦,2005年)。他们是一个可行的替代对环境有害的,以石油为原料的塑料制品是采用但的障碍的高生产成本(肯纳先生和斯利瓦斯塔瓦,2005年;Mozejko-Ciesielska et al ., 2019)。因此,减少基因组策略来提高PHA生产被调查。一株高利息由于其代谢多样性和鲁棒性,假单胞菌alloputidaKT2440,这种减少的目标(Mozejko-Ciesielska et al ., 2019)。直观地说,删除PHA解聚酶,编码phaZ,结果在PHA的增加其亲代菌株相比收益率38% (Poblete-Castro et al ., 2014)。扩大,另一项研究构造的应变phaZ删除,删除在竞争中两种酶代谢途径,fadB和fadA,这导致PHA的收益率增加13%的使用另一种碳源时,木质生物质(Salvachua et al ., 2020)。接下来,删除基因组岛占大约4%的基因组也改善了细胞干重26.4%和PHA收益率39.32% (梁et al ., 2020)。基因组减少其他PHA生产菌株也表明强烈的改善生产。通过减少假单胞菌mendocina基因组7.7% 14顺序删除,创建NKU421 ATP / ADP比率提高了11倍,PHA生产亲代菌株(相比提高114.8%风扇et al ., 2020)。另一个关键的生物工程师改善生物分子生产高利息枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌被广泛用于生产酶和其他化学品工业规模(李y . et al ., 2016)。删除总计814 kb枯草芽孢杆菌168年发现,转换效率和增长速度略有下降,但当这一毒株工程生产鸟苷和胸苷通过overexpressing一些基因,分别增加了4.4和5.2倍(积累李y . et al ., 2016)。所以,尽管有些生长特性影响,生物分子产量显著提高。这是观察到在另一个最小化枯草芽孢杆菌应变PG10基因组减少(36%Reußet al ., 2017)。尽管增长速度下降,这一毒株能够产生困难的蛋白质,不能由其他枯草芽孢杆菌株葡萄球菌抗原(Reußet al ., 2017;苏亚雷斯et al ., 2019)。基因组最小化也执行non-model生物体产生各种生物分子。例如,Magnetospirillum gryphiswaldense是一个关键的生物磁小体的生物合成和生产(Zwiener et al ., 2021)。发展前景作为磁传感器和生物功能有强壮的生物医学和生物技术的应用程序作为磁性纳米颗粒在磁性成像,运营商磁性药物靶向和高热的应用程序。因为大规模生产是限制其适用性,的基因组m . gryphiswaldense已经减少了5.5%,简化磁小体的新陈代谢和致力于底盘生产(Zwiener et al ., 2021)。这个应变显示类似的增长率和磁小体的生物合成亲代菌株,但增加了遗传稳定性和弹性(Zwiener et al ., 2021)。总的来说,通过减少基因组大小,可以改善生产生物分子释放更多的资源。这通常是由于改进的生长特性但有生物分子产量增加的情况下,和其他因素恶化。
5.3基因减少改善生长特性
许多删除以上则提高生长特性和生物分子增产。这些因素包括基因组稳定、质粒维护、生长速率、外源基因表达,等等。研究也有助于创建任何下游应用程序优化的底盘菌株。这些底盘设计更多的快速增长,提高稳定性和提高外源基因表达。这些菌株可以进一步改造等使用生产特定的产品,否则无法由生物或利用替代碳源。
看的最好的例子大肠杆菌人们进行了无数次研究,以改善其生理特征。的基因组大肠杆菌K12 MG1655,一个共同的实验室压力,降低了14.3%通过删除插入序列导致电穿孔效率提高和增长速度类似于亲代菌株(Posfai et al ., 2006)。在同一应变,后来减少了23%的基因组研究通过删除插入序列(ISs),有限合伙人K-islands,鞭毛基因,和一些合成基因(公园et al ., 2014)。这些缺失导致更快的增长1.6倍最小的媒体和提高基因组稳定性的消除是换位(公园et al ., 2014)。
远离E。杆菌,枯草芽孢杆菌168年减少,创造MBG74,通过删除874 kb的不必要的基因组区域,或20%的基因组(森本晃司et al ., 2008)。这一毒株在外源基因表达有显著改善提高纤维素酶的产量(1.7倍)和蛋白酶(2.5倍)(森本晃司et al ., 2008)。在芽孢杆菌amyloquefaciens,4.18%的基因组被删除,使应变GR167,提高转换效率,增长率和外源基因表达(Zhang et al ., 2020)。这些增长特征强调这种菌株在合适的底盘为进一步的基因改造和工业应用。作为一个概念证明,GR167工程生产surfactin两个缺失和引入强启动子在本机表面活性剂产生基因。这些修改,使应变GR167IDS,导致增加10.4倍surfactin GR167(相比Zhang et al ., 2020)。这突显出易于操纵降低基因组应变以及结合这些削减的利益与其他的修改来提高本地或外源基因的表达。
菌株显示承诺增长特征的改进可以利用作为下游工程底盘。通过结合这些更加稳定和快速增长的菌株与各种生物分子的集成生产磁带或通过引入更具针对性的缺失,他们可以作为分子生产工厂。例如,在b . amyloliquefaciens,三肽聚糖水解酶基因的缺失导致α淀粉酶的产量增加了48%,增加细胞活力,因为减少细胞溶菌作用(张j . et al ., 2021)。阿尔法的未来一步评估进一步改进生产可以结合这三种删除到最小化m . amyloliquefaciensGR167压力。或类似的,减少了基因组大肠杆菌应变,删除fadR,fabR,iclR曾被证明能增加吗l苏氨酸生产和可以引入一个基因组,为进一步优化(的压力减小了杨et al ., 2019)。
5.4最小基因组的后果
减少一个基因组时,总是有可能消除基因可能不是必要的生存或生物分子生产但健壮的细胞生长的重要因素。这是最小基因组所反映出的菌株只包含细胞生存所需的基因。构建时的初始焦点最小基因组大肠杆菌与第一株建于2002年。的基因组大肠杆菌k - 12 MG1655降低了6.8%以313.1 Kb删除包含287开放阅读框架和179未知基因,产生压力大肠杆菌CDΔ3456没有改善增长特征(Yu et al ., 2002)。建设这一毒株发现基因的删除某对个人不必要的导致细胞死亡,称为合成致命的配对。另一个大肠杆菌最小基因组的压力在2005年出版的删除MG1655基因组导致菌株的29.7%大肠杆菌Δ16 (桥本et al ., 2005)。这些区域的缺失导致增长放缓亲代菌株相比几乎倍增时间的两倍。细胞也观察到有异常细胞形态和每个细胞染色体数目的增加(桥本et al ., 2005)。这是第一次建议最小基因组可能不是最终目标的底盘应变的下游应用程序和其他基因与细胞生存应该被包括在最终的应变。
最小基因组的一个最显著的例子是支原体mycoides应变JCVI-syn3A (布鲁尔et al ., 2019)。在使用全基因组化学合成结合装配和酵母克隆,m . mycoides合成基因组移植到山羊支原体,使其成为第一个由合成基因组控制的细胞,jcvi - syn1.0 (吉布森et al ., 2010;看到2010)。这株的基因组是进一步减少到531 Kb和473个基因,略低于50%的大小亲代菌株(和记黄埔et al ., 2016)。JCVI-syn3.0命名,这一毒株是一个自主复制细胞基因组最小的记录(和记黄埔et al ., 2016)。然而,这种应变显示增长速度慢得多,比父母少2到3倍m . mycoides应变和有一些改变形态特征。虽然这种细胞可以存活和复制,消除所有不必要的基因阻止它使用所以最后的修订和重新引入这一毒株发生20个基因将JCVI-syn3A共有543 kb和493个基因(布鲁尔et al ., 2019)。这包括quasi-essential基因,不需要为生存,但与149年强劲增长所需的蛋白质编码基因没有已知函数(51)。这强调这样一个事实:尽管的工具和技术来构建一个合成最小基因组,还有那么多未知的什么功能使生活和强劲的增长至关重要。一些研究应变建设看着关联函数后未经蛋白质。通过各种方法包括基于注释,二级结构匹配和multi-pipeline方法66蛋白质的未知函数在JCVI-syn3.0分配函数(Danchin方,2016;和记黄埔et al ., 2016;杨和徐,2018年;布鲁尔et al ., 2019)。最近的一项研究注释与未知功能蛋白质的50%,比现有的9倍UniProt注释,通过应用一种新型管道计算预测蛋白质结构通过直接模拟紧随其后示例函数注释和预测蛋白质间交互作用(张c . et al ., 2021)。
最初有强烈关注创建最小基因组菌株作为底盘对于下游应用程序,但是在看到对细胞的影响,如降低增长率和细胞形态学改变,有一个转向只减少一个基因组的生物可以仍有强劲的增长。无论如何,这些最小基因组为研究目的有巨大价值和发现细菌生命所需的核心基因。最小基因组的建设也阐明基因组的许多方面,如特定基因或基因组的功能和重要性等交互合成致命的配对。
6的讨论
总的来说,基因组削减是一个大有前途的途径揭示基因功能,提高创建底盘的生产有价值的生物分子和菌株,可以作为生物模型来构建应用程序。结合实验和计算方法很可能是最强大的确定基因的重要性。使定义的缺失,许多方法存在,许多人定制和设计为特定的物种和菌株CRISPR成为一个受欢迎的工具Eukaryal生物体,有趣的是它在细菌滞后的适用性,可能是因为强大的方法在细菌基因组操纵存在了许多年。尽管如此,最近的研究设计和实现CRISPR-based方法进行删除和持续使用替代进程ca酶,减少类的毒性2核酸酶,并改善删除效率,这些努力可能导致改进方法对大规模删除。
最小基因组的构想以来,基因组的目标削减已经从最小的基因组可能使幸存细胞减少基因使细胞功能好,不受损。尤其强调了许多研究显示减少细胞中的生长特性与极端的减少。因此,尽管最小的细胞是有价值的视角获得的知识的细胞功能和生存的必需品,减少基因细胞,改善了生长特性可以用于许多应用程序和目标。背后最大的驱动力之一的建设genome-reduced主机是经济重要的增加需求提高生产bio-metabolites从稳定、健壮、可靠的菌株。越来越多的基因组压力减少,更多的研究集中在改善的方法来识别关键基因,并删除实验和计算,减少大规模基因组的面积是克服许多挑战。在未来的几年里,我们可以看到这些reduced-genome替代品作为底盘为范围广泛的应用程序。
作者的贡献
问构思、写和编辑了手稿。太极拳审查和编辑的手稿。
资金
提供的资金是Bioproducts AgSci研究集群支持加拿大和加拿大农业及农业食品部资助通过加拿大农业合作AgriScience项目(项目ASC-03)。问被CGS-M奖学金支持从加拿大自然科学和工程研究委员会。
的利益冲突
太极拳是一种Metagenom生物生命科学公司的主要股东。
其余作者宣称,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
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收到:2022年5月30日;接受:2022年7月29日;
发表:2022年8月31日。
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*通信:妮可·勒布朗,n6leblan@uwaterloo.ca
__ORCID:妮可·勒布朗,http://orcid.org/0000 - 0003 - 2082 - 769 x;特雷弗·c·查尔斯,http://orcid.org/0000 - 0002 - 0344 - 5932