优化CRISPR / Cas9编辑重复的单核苷酸变异
印加开创
曾Ligammari1
艾米丽赫本
富勒姆·康诺利
露西娅Cottone- 1病理学系(研究),伦敦大学癌症研究所,伦敦大学学院,伦敦,英国
- 2血液学、伦敦大学癌症研究所,伦敦大学学院,伦敦,英国
- 3伦敦大学医学院,伦敦大学学院,伦敦,英国
- 4癌症和基因组科学研究所,伯明翰大学,英国伯明翰
- 5组织病理学、伦敦、英国皇家国立骨科医院
CRISPR / Cas9基地编辑和'编辑组成现代基因组编辑工具箱。许多研究优化使用CRISPR / Cas9,与原始CRISPR基因组编辑系统,用单核苷酸的同源性定向修复(HDR),尽管这仍然是一种挑战。研究描述的修改,提高编辑效率达不到分离克隆细胞系或没有被验证具有挑战性的位点或细胞模型。我们目前的数据从95年使用集落形成和永生化细胞系转染比较供体模板修改,编辑效率的影响浓度的组件,HDR提高代理和冷休克。我们发现在网上指导差withactivity RNA效率相关的预测细胞。使用门店和ddPCR我们发现编辑效率的5 - 12%转染人口下降到1%在克隆细胞株隔离。我们的数据演示CRISPR效率的变化通过细胞模型,目标轨迹和其他因素。成功的基因组编辑需要比较系统和开发的最佳协议修改细胞模型和轨迹。我们描述这个过程的流程图中的步骤着手基因组编辑使用任何系统和包含验证对于那些使用CRISPR / Cas9 HDR-boosting修改。
1介绍
CRISPR-associated蛋白9 (Cas9)基因组编辑系统革新了生物研究。能力目标和修改基因位点提供了潜在的调查功能变体的后果发现通过全基因组关联研究(加拉格尔和Chen-Plotkin, 2018;陈et al ., 2022)和纠正> 75000个已知人类致病性变异在Clinvar上市(它和Kattman, 2018)。原始CRISPR / Cas9系统已经可用了十多年并广泛研究了CRISPR / Cas9如何工作和如何优化的最大效率,它拥有超过18000的出版物相关的术语“CRISPR”PubMed上市。CRISPR / Cas9组件被广泛商用组件和重组质粒。可以实现高达80%的效率在人类细胞利用CRISPR / Cas9破坏DNA序列和生成基因淘汰赛(郭et al ., 2018)。然而,当使用CRISPR / Cas9代替核苷酸(敲入),效率低得多,通常在1%左右,尽管效率高达∼50%报告后协议修改(Paquet et al ., 2016;Kwart et al ., 2017;郭et al ., 2018;Okamoto et al ., 2019;Maurissen Woltjen, 2020)(了刘et al ., 2019 a)。最近,在酵母,retron-based CRISPR / Cas9可以提高多路复用敲入实验,可能引发新的人类细胞(赵et al ., 2022)。然而核苷酸替换CRISPR / Cas9依赖于非惯用DNA修复途径,同源性定向修复(HDR)。CRISPR / Cas9对DNA损伤修复的依赖限制核苷酸替换的效率,可以引入非目标突变。
'编辑(PE)出现在2019年解决敲入效率低和倾向的脱靶效应CRISPR / Cas9和可用在其最新的迭代和PE4 5 (Anzalone et al ., 2019;陈et al ., 2021)。PE利用导游RNA-directed“搜索”CRISPR / Cas9但能力建立在“替换”能力的准确性,避免双链断裂和依赖细胞DNA修复。基本编辑代表另一个替代CRISPR / Cas9单核苷酸替换,但受限于他们的编辑旁观者核苷酸使他们不适合重复的核苷酸(里斯和刘,2018年)。CRISPR / Cas9、PE和基础编辑组成的主要基因组编辑工具箱用于当代研究者。
基因组编辑的效率随目标轨迹,距离protospacer相邻主题(PAM)和错配修复细胞的能力模型(陈et al ., 2021;费雷拉da Silva et al ., 2022)。例如,编辑效率CRISPR PAM / Cas9瀑布距离增加和干细胞显示相对电阻相比,转染永生化细胞系(马德森和出身低微的,2019)。体育节目提高效率和减少非目标变化CRISPR / Cas9相比,然而体育需要交付作为一个质粒,多个组件的设计(pegRNA垫片、扩展和ngRNA PE3b)和更广泛的优化与CRISPR / Cas9相比。PE效率是高度可变的(高达50倍的差异)取决于细胞的遗传背景模型和组件设计(Anzalone et al ., 2019)。这些因素使它可能CRISPR / Cas9-mediated HDR仍将用于重复目标位点或细胞模型不适合PE、质粒交付不可取或者CRISPR / Cas9-mediated HDR的速度足够高,以避免需要广泛的设计和优化过程。选择正确的一个实验系统将取决于目标轨迹,目的是替换和细胞模型。
在这项研究中我们编辑三个单核苷酸位点与肉瘤使用CRISPR / Cas9系统的开发。这些位点具有挑战性的编辑,因为他们是重复的,阻碍了基地的使用编辑器,并远离PAM(> 15核苷酸),让编辑CRISPR / Cas9或其他ca酶具有挑战性。我们应用几个之前报道优化修改在95转染诱导多能干细胞(iPSC),代表一个集落形成模型,和粘附细胞模型来验证他们的效用在编辑这些具有挑战性的位点。编辑结果使用现代技术特征在每个阶段。虽然体育当时没有我们的实验,我们已经解决了如何把它的使用。最后,我们合成一个流程图,可以适应任何后续CRISPR基因组编辑系统。
2材料和方法
2.1诱导多能干细胞
2.1.1细胞培养
人类的游离的诱导多能干细胞(A18945 Gibco;热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,妈,美国)是维护在feeder-free文化Geltrex (A1413202表达载体,热费希尔科学)和基本8 Flex (E8 Flex)介质(A28585 Gibco,热费希尔科学)补充0.5%的青霉素(10000 U /毫升)。细胞培养在37°C调湿大气中5%的二氧化碳。细胞被孵化的一段5分钟在37°C与杜尔贝科的磷酸缓冲盐(DPBS) edta 0.5毫米pH值8.00(表达载体,热费希尔科学,14190250和15575020)。
2.1.2 CRISPR / Cas9 iPSC的编辑
所有CRISPR / Cas9组件都在踊跃购买。单链oligodeoxynucleotides (ssODN)被命令Alt-R™HDR捐赠寡核苷酸。
1。准备了gRNA复式Alt-R®CRISPR-Cas9 crRNA和Alt-R®CRISPR-Cas9 tracrRNA (IDT, 1072532)。
2。核糖核蛋白(RNP)使用0.78成立μl Alt-R®CRISPR-Cas9 gRNA, 1.02μl Alt-R®s p。Cas9核酸酶V3 (IDT, 1081058)和1.2μl PBS(总共3μl)。
3所示。细胞分离、清点和转染使用Lonza™P3原电池4 d-nucleofector™X (Lonza v4xp - 3024)和电穿孔CA137程序。
4所示。准备电穿孔混合物,0.5×106细胞被resuspended 20μl Lonza电穿孔缓冲区,1μl RNP复杂和0.5μl Alt-R™HDR捐赠益生元。
5。转染后细胞恢复:(i)在37°C, (ii)在32°C 24 h在37°C, (iii) Alt-R®CRISPR-Cas9 HDR增强器(IDT, 1081072)在E8 Flex没有抗生素24 h, (iv)在1% DMSO E8 Flex没有抗生素24 h。
2.1.3殖民地挑选
所有压力的步骤,如单细胞分离和殖民地采摘,E8 Flex介质与RevitaCell™用于2 h,直到殖民地形成。在所有其他步骤E8 Flex使用没有RevitaCell™。
细胞分离与Accutase®(圣地亚哥创新细胞技术公司CA AT104),计算每道菜和700 - 1000细胞被镀。使用P200吸管中型殖民地了。吸气殖民地被转移到96板和磨碎的10倍。当细胞汇合的50 - 70%他们分裂1:2,一半被播种一半基因组DNA提取和亚文化或冻结。
2.1.4镜板冻结和DNA提取
殖民地在96年扩大盘子洗了100μl DPBS和分离30μl Accutase®。冻结的镜板制备含有50μl 2 x的冷冻剂(E8 Flex + 20% DMSO)。收集细胞70μl E8 Flex和50μl在−转移到镜板和存储80°C。剩下的50μl悬挂一直进行DNA提取:板旋转在1950 RCF 30分钟在4°C,介质被,板储存在−80°C。解冻后,30 - 50的μl强光油灯QuickExtract™DNA提取解决方案(英国LGC,米德尔塞克斯QE09050)补充道,然后磨碎和加热在65°C 6分钟98°C型2分钟,直接使用。
2.2 U-CH1脊索瘤细胞系
2.2.1细胞培养
人类U-CH1脊索瘤细胞系(写明ATCC®crl - 3217™,www.chordomafoundation.org如前所述)生长(Scheipl et al ., 2016)。细胞验证定期由短串联重复序列指纹(英国英格兰文化收藏、公共卫生)(补充表2)。
2.2.2 CRISPR / Cas9编辑
1。准备了gRNA复式Alt-R®CRISPR-Cas9 crRNA和Alt-R®CRISPR-Cas9 tracrRNA (IDT, 1072532)。
2。3.9μl Alt-R®CRISPR-Cas9 gRNA 5.1μl 10毫克/毫升(或10μg /μl = 50μg = 300 pmol) Alt-R®s p。Cas9核酸酶V3 (IDT, 1081058)和5.9μl无菌DPBS(共15μl) RNP相结合。
3所示。细胞分离、统计和转染使用Lonza Amaxa®细胞系Nucleofector®工具V(瑞士巴塞尔Lonza, vca - 1003)使用电穿孔程序故事本来。准备电穿孔混合物,2×106细胞在60μl resuspended Lonza电穿孔缓冲区,以10μl RNP复杂的(最终Cas9浓度∼100 pmol)和3μl改性Alt-R™HDR捐赠益生元。
4所示。转染后的细胞恢复介质没有抗生素。
2.2.3分析编辑结果使用数字液滴聚合酶链反应(ddPCR)
每个等位基因一套通用引物和探针设计:一个hexachlorofluorescein(十六进制)调查父母等位基因(A / T)和荧光素amidite (FAM)探针的编辑等位基因(G / C)。使用primer3plus ddPCR化验设计(Untergasser et al ., 2007)和BioRad滴数字™PCR应用指南。ddPCR实验进行了使用BioRad QX200 ddPCR supermix探针(没有dUTP)工作流,自动化的液滴发生器,BioRad自动液滴生成石油探测(BioRad,赫拉克勒斯,加州,美国;# 1864110),埃普多夫vapo。保护thermocycler和QX200自动滴读者。结果分析了使用BioRad QuantaSoft™分析Pro软件使用稀有事件检测。
2.2.4流式细胞术激活细胞排序(流式细胞仪)
转染U-CH1细胞恢复了36 h在单细胞分选collagen-coated之前96孔板使用BD流式细胞仪咏叹调融合细胞分选仪™(Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西,美国)运行FACSDiva软件版本6。细胞培养与TOPRO3 + (加维et al ., 2016)排序,使死细胞的排斥和10%的阿- 550阳性细胞。
2.2.5镜板进行DNA提取
细胞被洗100μl DPBS和分离50μl Accutase®(创新的电池技术,AT104) 37°C 10 - 15分钟50μl中添加50μl被基因组DNA提取使用强光油灯QuickExtract™(LGC QE09050),而其他50μl山肩亚文化。
2.3技术常见的两种细胞模型
定期测试进行排除支原体使用EZ-PCR污染支原体测试套件(k1 - 0210, Geneflow,利奇菲尔德,斯塔福德郡,英国)。
2.3.1使用pcr Illumina公司MiSeq™下一代测序(门店)
使用Zymo列提取DNA提取(Zymo研究,美国加州欧文市美国D3024)(对于大部分转染)或强光油灯QuickExtract™DNA提取解决方案(殖民地)。PCR进行与Kapa Hifi HotStart聚合酶(< 500碱基对的产品)(Kapa生物系统公司、罗氏分子系统、公司,而加州,美国,KR0370): 12.5μl 2 x Kapa Hifi HotStart ReadyMix, 0.75μl 10μM正向引物(与MiSeq™适配器,补充表S3),0.75μl 10μM反向引物(MiSeq™适配器),2μl DNA和25μl PCR-grade水。3μl强光油灯的DNA提取用于PCR。使用QIAquick PCR产品纯化PCR净化设备(试剂盒有限公司,曼彻斯特,英格兰)。内部执行MiSeq™。
2.3.2分析编辑结果使用MiSeq™数据
分析了FASTQ文件使用Cas分析仪(公园et al ., 2017)使用以下参数:type =单一核酸酶,核酸酶比较范围(R) = 40岁的最低频率(n)= 1,没有可选的野生型标记。未经编辑和编辑结果(NHEJ±替换和HDR)计算读取包含结果的数量/读取的总数。Indels是序列与参考序列长度的变化。
我们定义结果如下:
•野生型/未经编辑(90 - 100%的阅读与参考序列)
•(纯合子)淘汰赛(90 - 100%的读取显示indels)
•杂合的敲入(40 - 60%的阅读与参考和40 - 60%显示敲入)
•纯合子敲入(90 - 100%的读取显示敲入)
•结合杂修复(40 - 60%的读取显示indels和40 - 60%匹配序列或显示敲入的引用)。
2.3.3利用Sanger测序基因分型
PCR进行:12.5μl AmpliTaq黄金™360主混合(热费希尔科学,4398881),0.5μl 10μM正反向混合底漆(补充表S3),10μl水+ 2μl强光油灯QuickExtract™DNA。PCR产品清洗使用ExoSAP-IT™表达PCR产品清洁试剂(应用生物系统公司,热费希尔科学,15563677)和发送Sanger测序(源生物科学,诺丁汉,英国)。
2.3.4使用pcr TaqMan™qPCR
TaqMan™rs2305089进行了基因分型(应用生物系统公司,4351379):5μl TaqMan™mastermix做基因分型,0.5μl TaqMan™底漆/探针组合(C__11223433_10), 3.5μl水,1μl DNA。使用基因分型结果分析应用在热费希尔™连接云。
2.4数据分析
所有的分析和统计进行使用R版本你(2021-03-31)和GraphPad棱镜版本8.0.0窗口(GraphPad软件,圣地亚哥,美国加州,www.graphpad.com)。漫画被创建Biorender.com。
3的结果
3.1编辑的TP53SNVs在iPSC或其他集落形成细胞模型
我们测试的能力CRISPR / Cas9修改介绍生殖系致病G245D R248Q变异TP53躺在距离,远离PAM和重复序列,在iPSC (图1一个)。容忍转染和单细胞分选差的细胞则是昂贵的维护文化使它重要特征编辑在工作流的早期结果(图1 b)。TP53表示在染色质则使它有可能将允许访问开放RNP (刘et al ., 2019 b)。
图1。工作流的大部分人群的早期特征MiSeq紧随其后克隆选择线隔离的殖民地。(一)CRISPR / Cas9组件的设计。五ssODN设计进行比较。*:phosphorothioate债券。绿色“T”表明PAM修改防止乳沟的捐献者。(B)被转染的细胞则在不同的实验条件下,经过MiSeq挥动的筛选。人口率最高的HDR选择被选为殖民地。个别殖民地由MiSeq被扩展为显示准确的修复同基因的线。
3.2细胞模型的初步检查
积累基因改变在细胞培养的细胞则包括SNVs G245D, R248Q和其他位点TP53(安培et al ., 2011;Merkle et al ., 2017;刘et al ., 2019 b)。因此我们首先确保人口基因纯,免费的TP53SNVs,被选择用于转染20克隆不同等级的从父母的iPSC行;检查5桑格测序被发现是免费的SNVs周围地区G245D R248Q位点。其中一个不同等级被选为转染(补充图S1)。
3.3组件的设计目标TP53在万能
我们设计了6指导rna (gRNAs) CRISPR / Cas9 E-CRISP使用在线工具Heigwer et al ., 2014,CHOPCHOPLabun et al ., 2019和IDT Alt-R™CRISPR HDR设计工具(https://eu.idtdna.com/pages/tools/alt-r-crispr-hdr-design-tool)(补充图开通)。gRNAs都是类似的——和脱靶效应评估的可能性在网上。在细胞实验中,只有一个gRNA生成一个双链断裂Sanger测序(双边带)(补充图S2C和图1一个),所以在> 15核苷酸gRNA SNVs限制了我们的选择和编辑效率(Paquet et al ., 2016;Kwart et al ., 2017)(图1一个和补充图开通)。
PE组件设计比较复杂。PegRNA设计是一个主要因素决定编辑效率和几个引物结合位点(PBS)和逆转录酶(RT)模板组合在设计PegRNA但只有一小部分这些将达到最优效率(Anzalone et al ., 2019)。各种工具已经开发援助设计包括PEGfinder (Chow et al ., 2020),PE-designer (黄et al ., 2021)和PrimeDesign (许et al ., 2021)。G245D轨迹的TP53,19 pegRNA设计生成使用PrimeDesign可结合> 10 PE gRNAs (许et al ., 2021)(数据未显示)。然而,低公差的iPSC多个转染气馁体育系统的使用。
3.4优化HDR CRISPR / Cas9万能干细胞的效率
HDR-enhancing修改CRISPR / Cas9协议都进行了广泛的调查(补充表S1)。我们不能修改cut-to-mutation距离,我们测试了,如果修改ssODN设计或post-transfection实验条件会改善HDR。我们进行了75个人转染的细胞则(图1 a, B)(补充表S1),容忍电穿孔转染后40 - 50%的生存能力,和比较编辑结果大部分人群使用MiSeq(综述Sledzinski et al ., 2020)。
编辑效率变量,从0到12%没有indels敲入(准确的HDR) (图2 a, B)。我们证实了先前的报道(理查森et al ., 2016;梁et al ., 2017;O ' brien et al ., 2019),不对称的同源性武器提高准确HDR(范围1 - 5%,平均2.0%,10个样本)一样的phosphorothioated核苷酸(范围1 - 4%,平均2.3%,4)样品(Papaioannou et al ., 2009;Gutierrez-Triana et al ., 2018)和手臂长度相等(范围2 - 3%,平均2.5%,2样品)(图2一个)。引入PAM的沉默突变(Paquet et al ., 2016;Okamoto et al ., 2019),或者反补(RC)的不对称设计(理查森et al ., 2016)(图1一个,补充表S1和补充表S3)没有提高HDR效率(图2一个),但是只对这些条件进行了两个实验。
图2。比较HDR效率与大部分人口级别的协议修改和编辑结果克隆。(a - b)比例的读取显示准确的修复HDR散装人口DNA转染(一)不同的ssODNs (p值< 0.45,克鲁斯卡尔-沃利斯)和测试(B)不同的实验条件(p值< 0.01,克鲁斯卡尔-沃利斯检验)。不对称PAM:不对称捐赠者没有阻止PAM的突变。不对称PT:除了不对称ssODN phosphorothioate核苷酸。不对称RC:反补的不对称ssODN。HDR:添加Alt-R™HDR转染后增强剂。转染后DMSO:添加DMSO溶液。转染后NoHDR:没有HDR增强剂或DMSO溶液。(C)编辑100年殖民地从两个转染结果显示人口HDR的11个和12%。
接下来,使用非对称ssODN,我们继续修改post-transfection条件通过添加1%二甲亚砜(DMSO)或IDT Alt-R™HDR增强器(Stratigopoulos et al ., 2018)和培养细胞在32°C(冷休克)(郭et al ., 2018)(补充表S1)。最有效的协议包括冷休克和Alt-R™HDR增强剂,发现与之前的研究一致(矽卡岩et al ., 2019;Di Stazio et al ., 2021)(图2 b)。我们证实,DMSO HDR增加,使之成为一个具有成本效益的替代商业HDR增强剂(Stratigopoulos et al ., 2018)(图2 b)。
3.5隔离细胞系减少编辑效率观察到门店的大部分人口
我们选择两种转染数量显示有前途的准确HDR(11 12%)为单一细胞行隔离(图1 b和图2 c)。挑选和扩张殖民地后,大多数殖民地被NHEJ修复(77/100,77%)或显示一个混合修复(13/100,13%)。最后编辑的效率是1%,尽管最初承诺的HDR的大部分人口。
最后,质量保证克隆的行进行评估/同质性纯洁的人口。使用MiSeq我们建立克隆线是纯人口免费∼200个碱基对的非目标改变周围的变体。没有预测的非目标网站gRNA设计工具。
我们的数据表明,在网上预测gRNA iPSC效率差和相关活动。HDR不同转染率,可以提高非对称捐赠者,有或没有PT修改,HDR-enhancing修改。克隆细胞系的隔离大部分人口导致HDR效率的一个重要摩擦。
3.6编辑的TBXT在U-CH1永生的癌症细胞系
许多细胞模型成长为附着文化容忍单细胞排序和文化相对便宜。这些模型的重点是高通量基因分型结果生成和细胞系。U-CH1是一个罕见的骨癌的细胞模型,脊索瘤,与G177D SNVTBXT。我们采用U-CH1脊索瘤细胞系,表达TBXT在高水平,常染色质可能调查的功能影响G177D SNV (凯利et al ., 2010;皮莱et al ., 2012)。
3.7设计CRISPR / Cas9组件U-CH1脊索瘤细胞系
我们保证一个纯人口免费SNVs在该地区周围的G177D变体使用MiSeq避免单一细胞所花费的时间排序(补充图S4A)。
四个候选人gRNAs设计和评估使用IDT CRISPR-Cas9指南RNA设计检查。的四个gRNAs预测是有效的在网上,两个引起了双边带当测试细胞(图3 a, B和补充图S4B-C)。
图3。工作流早期单细胞基因分型结果排序和高吞吐量。(一)CRISPR / Cas9组件设计针对G177D SNVTBXT。(B)转染后,U-CH1大部分人口被ddPCR筛选。数量显示HDR(2 - 10%)是单细胞排序使用流式细胞仪。DNA提取扩展克隆细胞群通过建立“镜像板”和直接用于pcr TaqMan™qPCR或ddPCR(C)酒吧的读取显示比例准确HDR当CRISPR浓度/ Cas9组件是多种多样的。(D)点图显示的控制策略分类U-CH1细胞基于TOPRO3和阿- 550荧光。
我们测试是否不同Cas9(2.05μl (17 pmol最终浓度)和10.2μl (404 pmol最终浓度)),捐赠模板浓度或结合gRNAs提高编辑效率以MiSeq (林et al ., 2014)。我们建立了单个gRNA RNP包裹着,在推荐的浓度,显示最佳性能(图3 c)。
3.8筛选转染大部分人群使用数字滴PCR
转染后,我们筛选了大部分人口为HDR使用数字滴PCR (ddPCR)更快的替代MiSeq单细胞排序在继续之前,让我们来维持细胞在文化筛选U-CH1细胞生长缓慢(图3 b)。ddPCR分区技术使稀有敲入事件的检测频率低至0.1% (Miyaoka et al ., 2014,Miyaoka et al ., 2018)。10转染人群的筛查ddPCR显示编辑2 - 10%的效率。转染细胞容忍单细胞排序通过流式细胞仪24-36 h转染后(图3 b),那么需要3 - 5周扩大足够亚文化型“镜子”板块。强光油灯一步DNA提取协议是利用,允许直接输入DNA进入TaqMan™qPCR或ddPCR高通量基因分型。
3.9高通量筛选的数百U-CH1克隆
我们筛选∼500转染克隆免费线和孤立的七个细胞系indels:四个野生型、杂合的两个敲入一个纯合子敲入,给一个总体HDR效率0.6% (图3 d)。
HDR效率和cut-to-mutation距离之间的关系(Paquet et al ., 2016;Kwart et al ., 2017)再次观察:沉默的阻断突变引入ssODN成功编辑更频繁地比G177D SNV和纯合的方式,与G177D SNV只有编辑在一个等位基因。
最后,我们检查了孤立的克隆测序1000 bp的网站编辑Sanger测序:我们证实了编辑的存在,确保没有不相干的变化(补充图S6)。没有预测的其他偏离目标网站设计工具。
总之,我们的结果显示筛选成百上千的潜力编辑使用高通量技术克隆但突出显著消耗效率之间的大部分人口和单细胞线隔离。不同浓度的CRISPR / Cas9组件没有U-CH1提高编辑效率。
4讨论
在规划一个基因组编辑实验中,科学家使用的方法在过去的十年里大幅扩大。每个系统,CRISPR / Cas9基础编辑和PE、提供解决方案引入不同的变化:CRISPR / Cas9淘汰赛和敲入,基本编辑非重复性的核苷酸的替换和PE替换,颠换和indels。随着基因组编辑系统要求日益复杂的组件和修改系统出现,初步实验通知最终的实验设计变得越来越重要(Anzalone et al ., 2019)。我们提出一个包含关键步骤的流程图和工具使用在每个阶段编辑克隆形成细胞或粘附细胞行(图4)。
图4。提出了综合流程图编辑干细胞或使用CRISPR / Cas9永生化细胞系。* (Heigwer et al ., 2014;Labun et al ., 2019;Sledzinski Nowaczyk Olejniczak, 2020)和(舒伯特et al ., 2021)HDR-specific ssODN设计。
生物信息学平台CRISPR / Cas9组件的设计是不可或缺的,但预测的准确性可以影响染色质的组织目标轨迹和不同的细胞模型。这证实了我们的研究结果表明在网上预测gRNAs效率并没有显示在细胞相同的性能。即使实验是重复有多方面的HDR效率的变化,可能相关的因素,如遗传变异性和细胞周期阶段,突出的重要性,描述单细胞系分离之前大部分人群。
Cut-to-mutation距离是一个重要的因素在决定CRISPR / Cas9 HDR的效率和接合性产生的编辑(Paquet et al ., 2016;Kwart et al ., 2017)。这是我们的实验证实的频繁的纯合敲入沉默PAM突变,接近削减网站,目标轨迹的杂合的敲入相比,遥远的网站。这可能占成功的纯合子敲入在U-CH1突变是接近减少站点而不是万能。如果需要一个纯合子敲入,gRNAs削减接近目标轨迹是必需的。如果这些gRNAs不是有效的初步测试,值得考虑Cas9核酸酶不同PAM需求或使用PE。我们能够验证非对称捐赠者的有益作用,HDR增强剂和冷休克的结合,增加了基线HDR效率低几倍。不对称的捐助者被认为影响退火和释放链被修理(O ' brien et al ., 2019),而HDR增强子块NHEJ(花生、Maurissen了比肖夫)喜欢HDR和冷休克被认为影响G2 / M过渡或持久性的RNP(郭,Maurissen)。ssODNs可能被使用的工具,辅助优化设计(O ' brien et al ., 2019;舒伯特et al ., 2021)。
尽管这些优化提高HDR效率的承诺意味着11.5%的大部分人口,一个细胞系转染细胞则隔绝U-CH1类似的图片。这可能是与整体编辑效率低、重复转染一致,相比以前的优化研究。尽管一些研究显示令人印象深刻的HDR,重要的是要注意,他们利用了一个批量以人群为基础的读出不孤立细胞系(Zhang et al ., 2017;矽卡岩et al ., 2019;Di Stazio et al ., 2021),或者他们更健壮的HEK293细胞模型(编辑理查森et al ., 2016;梁et al ., 2017;Di Stazio et al ., 2021)。编辑效率的显著的磨损是一个重要的考虑当温和编辑效率。
PE的效率影响因素的描述不太先进但初步研究表明优化PBS的熔化温度,使用双pegRNA策略(林et al ., 2021错配修复通路的作用)和干扰(费雷拉da Silva et al ., 2022)。PE使用MiSeq数据结果的分析是一个新的概念和工具可用,PE-Analyzer,有可能效仿(黄et al ., 2021)。桑格序列代表一个廉价的选择批量编辑组成的分析结果。工具包括Synthego的冰(推理CRISPR编辑)(Hsiau et al ., 2019)和跟踪Indels分解(潮流)(Brinkman et al ., 2014)。桑格测序工具用于CRISPR / Cas9已经应用于PE实验强调他们的多功能性(费雷拉da Silva et al ., 2022)。
给编辑的挑战我们的工作描述的位点,一个更复杂的系统,如体育可能会在将来的研究中值得探索。PE可以相比CRISPR / Cas9用描述的方法来确定相对简单之间的权衡CRISPR / Cas9平衡提高效率。广泛描述CRISPR / Cas9相比,体育是一个增长领域的优化。一个重大进步在PE(错配修复通路的操作陈et al ., 2021;费雷拉da Silva et al ., 2022)。目前的主要决定因素是pegRNA设计PE效率(Anzalone et al ., 2019)。找到最效率PBS和RT初步设计是一个重要的步骤。
对于那些将HDR CRISPR / Cas9根据其相对简单,鲁棒性CRISPR / Cas9重组组件与聚乙烯相比,如果一个可接受的效率达到克隆隔离后,修改我们可以用来提高效率进行验证。
5的结论
为SNVs削减网站可以在生成< 15个核苷酸,它可能更简单和更快的使用CRISPR / Cas9协议修改实现HDR。更具挑战性的位点,如那些在这项研究中,提出体育可以考虑,但需要更广泛的优化。为所有基因组编辑系统效率随细胞模型和目标轨迹在其他因素。初步测试将通知系统的选择和协议的修改。我们建议流程图可用于指导规划CRISPR /编辑SNVs Cas9实验(图4)。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到https://www.ebi.ac.uk/ena与加入PRJEB52736数量。
作者的贡献
概念化、IU SA GB、房颤和信用证;方法论、IU、SA、会和信用证;正式的分析,IU,嗯,CC;调查,IU,会和信用证;原创作品草稿准备、IU和信用证;writing-review和编辑,将SA,呃,CC,房颤,和信用证;可视化、IU和信用证;监督,LC和房颤;融资收购,IU, GB,房颤,LC。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。
资金
这项工作是由汤姆王子信托(AF)、大不列颠和爱尔兰的病态社会(批准号TSGS041903) (IU和AF),英国癌症研究中心(伦敦大学学院(CRUK UCL)中心奖C416 / A25145) (AF、LC、和GB)、英国皇家国立骨科医院NHS信托研发部门,骨癌研究信任,脊索瘤的基础。房颤是国立卫生研究所的支持下,伦敦大学学院医院生物医学研究中心,伦敦大学学院和英国癌症研究实验癌症医学中心。国际单位是由英国脊索瘤。SA是哈代Keinan奖学金的支持。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
我们承认Sunniyat拉赫曼,撒母耳周,丹尼尔•Wetterskog Yang Li Iben Lyskjaer和Florian Merkle宝贵的建议在建立我们的协议。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.932434/full补充材料
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关键词:CRISPR CRISPR / Cas9,基因组编辑、编辑、同源性定向修复(HDR),细胞,干细胞
引用:引领我,Ligammari L, Ahrabi年代,赫本E, Connolly C、债券GL,弗拉纳根和Cottone L(2022)优化CRISPR / Cas9编辑重复的单核苷酸变异。前面。基因组。4:932434。doi: 10.3389 / fgeed.2022.932434
收到:2022年4月29日;接受:2022年5月31日;
发表:2022年7月5日。
编辑:
华湘、微生物学研究所中科院、中国版权©2022亚瑟,Ligammari Ahrabi,赫本,Connolly,债券,Flanagan和Cottone。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
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