反式DNA裂解活性Cas12a没有提供对的质粒或噬菌体可检测的免疫力gydF4y2Ba
Shunhang刘gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba
__gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Xichen饶gydF4y2Ba1、2gydF4y2Ba
__gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
Ruiliang赵gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba
北京汉gydF4y2Ba
1gydF4y2Ba*gydF4y2Ba- 1gydF4y2Ba农业微生物学国家重点实验室和生命科学与技术学院,湖北红山实验室,华中农业大学,武汉,中国gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba蛋白质和植物基因研究的国家重点实验室,生命科学学院,北京大学,北京,中国gydF4y2Ba
Cas12a是一种v a CRISPR-Cas RNA-guided核酸内切酶。它劈开dsDNA在特定的网站,然后在反式激活为非特异性ssDNA乳沟gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。反式的免疫功能活动仍然是未知的。为了解决这个问题,我们构建了一个Cas12a瞄准系统gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,Cas12a裂解高仿目标质粒释放的反式ssDNA分裂活动。然后,我们分析了影响Cas12a目标的非目标质粒和ssDNA噬菌体。结果表明,Cas12a有效消除目标质粒但没有施加影响的维护非目标质粒或鼠疫噬菌体的生成效率。此外,two-spacer CRISPR数组,促进目标质粒损耗,仍然没有对非目标探测影响的质粒或噬菌体。在一起,数据表明,反式ssDNA乳沟Cas12a并不导致免疫力gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
,以前被称为Cpf1 Cas12a效应类型的v a CRISPR-Cas免疫系统(gydF4y2BaZetsche et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba保罗和蒙托亚,2020年gydF4y2Ba)。其过程CRISPR (cr) RNA和由crRNA识别和裂开的目标dsDNA PAM-dependent方式(gydF4y2BaZetsche et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaFonfara et al ., 2016gydF4y2Ba),从而提供免疫力dsDNA噬菌体和质粒。这个特性还赋予Cas12a多重基因编辑能力(gydF4y2BaZetsche et al ., 2017gydF4y2Ba)。dsDNA乳沟活动激活之间的杂交crRNA dsDNA和目标链,导致构象变化和RuvC催化的网站(gydF4y2Ba斯沃茨et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaStella et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯沃茨Jinek, 2019gydF4y2Ba)。然后,RuvC先后劈开dsDNA的非目标链和目标链。dsDNA劈理后,Cas12a仍然结合互补链和保留非特异性ssDNA劈理的活动状态反式(gydF4y2Ba李et al ., 2018 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2018gydF4y2Ba)。活动导致的发展Cas12a-based核酸检测工具(gydF4y2Ba李et al ., 2018 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2018gydF4y2Ba)。然而,反式的免疫功能活动gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba没有被调查。入侵的DNA质粒、噬菌体等,可以提供从他们的复制叉ssDNA和转录泡沫。质粒、噬菌体进行ssDNA阶段在复制周期。因此,反式活动可能降低ssDNA和提供immunoprotection等。另一方面,反式活动也可能裂开ssDNA从基因组DNA,从而导致当Cas12a脱靶效应应用于基因组编辑。为了解决问题,我们编程Cas12a目标高仿质粒和评估Cas12a非目标质粒、噬菌体的影响。我们揭示Cas12a目标对非目标的质粒或噬菌体不提供免疫力。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
细菌菌株和M13噬菌体gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2BaDH5α被用来构建质粒用于这项研究。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaMG1655和JM109用作主机分析质粒分别维护和M13感染。的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株生长在溶原性肉汤(磅)介质在37°C或30°C。在需要时,抗生素,其中包括100μg /毫升氨苄青霉素(Amp)和/或25μg /毫升氯霉素(背影),被补充到媒介。包含pCas12a质粒的转化株生长在磅含有0.2%葡萄糖抑制蛋白表达除非Cas12a诱导。当表示,5毫克/毫升gydF4y2BalgydF4y2Ba树胶醛醣(L-ara), 80 ng / ml anhydrotetracycline (aTc)和1毫米isopropylthio-β-galactoside (IPTG)补充到培养基中诱导蛋白和/或crRNA表达式。从施教授陈M13噬菌体是一份礼物。gydF4y2Ba
pCas12 pCas9质粒和建设gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株gydF4y2Ba
用于构建的质粒Cas12a瞄准和Cas9目标包括pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-2S pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas9和pTarget (pUC19) (gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba)。使用p46Cpf1 pCas12质粒的构建(Addgene: # 98592) (gydF4y2BaAo et al ., 2018gydF4y2Ba)和合成CRISPR数组。CRISPR数组包含两个重复空间由两个SapI网站(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba)在一个pCOLADuet向量合成骨干(Tingke,北京),即pArray (gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba)。我们首先生成的间隔序列退火1 S-F和1因此,和间隔序列插入CRISPR数组之间的两个SapI网站获得针对pTarget CRISPR数组。然后,CRISPR数组和p46Cpf1骨干放大使用Array-F / R和p46Cpf1-F / R底漆集,消化XmaI和XhoI和结扎获得pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S。gydF4y2Ba
生成pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12质粒,野生型pSC101 pSB4k5质粒的复制子是放大使用TR-F / R引物,而pCas12a碎片损耗的起源和rep101序列从p被放大gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S。然后,片段组装使用ClonExpress II一步克隆工具(Vazyme,南京,中国)、获得质粒。gydF4y2Ba
pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-2S和pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT构造以类似的方式。最初的CRISPR阵列和两个SapI网站是用作新(NT)数组。我们确认间隔不匹配任何序列gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba基因组或pTarget使用爆炸分析。金门two-spacer数组生成的装配策略(gydF4y2Ba李et al ., 2020gydF4y2Ba使用中列出的四个寡核苷酸)gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba。然后,数组是放大和结扎p46Cpf1骨干如上所述。gydF4y2Ba
pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas9从pCas构建质粒(Addgene: # 62225) (gydF4y2Ba江et al ., 2015gydF4y2Ba),它表示一个sgRNA针对pMB1 pTarget的起源。具体地说,两个基因模块从pCas放大使用相应的引物,包括module1: replicon-lacI-PgydF4y2Ba曾经gydF4y2Ba-sgRNA, module2: tracrRNA-cas9。此外,从p46Cpf1 Chl-resistant基因被放大。三个片段组装使用ClonExpress II一步克隆工具(Vazyme、南京、中国)获得pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas9。gydF4y2Ba
每个pCas12或pCas9质粒转化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba一起pTarget生成菌株进行进一步分析。压力包括MG1655: pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S + pTarget MG1655: pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas9 + pTarget MG1655: pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S + pTarget MG1655: pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-2S + pTarget MG1655: pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT + pTarget JM109: pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S + pTarget JM109: pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-2S + pTarget JM109: pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT + pTarget (gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
所有的引物用于构建质粒中列出gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
质粒的维护分析gydF4y2Ba
接种菌株的甘油股票5毫升磅中包含相应的抗生素。一夜之间在37°C的文化发展、(质粒)或30°C(热敏质粒),其中10μL转移到10毫升新鲜antibiotics-free介质与诱导物。具体来说,Cas12a被5毫克/毫升L-ara诱导,crRNA被80 ng / mL aTc诱导,而转录的sgRNA pgydF4y2BaTSgydF4y2BaIPTG Cas9由1毫米。在表示时间感应后,细胞连续稀释,放到盘子包含100μg /毫升Amp或25μg /毫升的背影,以及antibiotics-free盘子。盘子被孵化的37°C或30°C一夜之间,和菌落数。相对集落形成单位(CFU)计算使用CFU antibiotics-free板作为参考。gydF4y2Ba
qPCRgydF4y2Ba
包含p的细胞gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S和pTarget生长在中L-ara和aTc (Cas12a定位)或只有L-ara(控制)没有任何抗生素在30°C。在6小时后感应,文化被稀释1000倍的水,加热10分钟的95°C。加热细胞悬液直接用作qPCR分析模板使用Hieff UNICON普遍蓝色qPCR SYBR绿色主人混合后(Yeasen生物科技、上海、中国)协议提供的制造。循环阈值(Ct)的值被用来定义每个质粒与丰富的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba16 s rDNA参考基因。质粒相对丰度计算的丰度pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S和pTarget Cas12a针对文化(L-ara和aTc)规范化的控制文化(只有L-ara)。列出qPCR的引物gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
噬菌体空斑形成实验gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2BaJM109菌株从单个菌落接种到5毫升磅中包含相应的抗生素。一夜之间文化种植的37°C,其中50μL转入5毫升antibiotics-free介质和进一步发展为4 h。然后在37°C, 200μL文化是与4毫升的0.7%上层琼脂混合和扩散在LB-agar盘子。上层琼脂和LB-agar板包含5毫克/毫升L-ara和80 ng / mL aTc发起Cas12a瞄准。盘子被凝固后,连续稀释M13噬菌体解决方案了盘子。板块在37°C孵化36 h,然后如图所示。gydF4y2Ba
噬菌体复制试验gydF4y2Ba
500μLgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaJM109文化后一夜之间增长转移到50毫升新鲜媒介没有抗生素和1 h。然后进一步增长,文化被稀释∼1×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba细胞/毫升和冰上冷却。M13噬菌体被补充到文化的感染复数(MOI)约为0.1。由此产生的混合物在4°C孵化为5分钟,然后离心收集的细胞在3000gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,上层的移除。细胞被50毫升resuspended预热新鲜介质含5毫克/毫升L-ara 80 ng / ml aTc和生长在37°C。30、60、90、120分钟感应,整除的文化被取样,细胞被离心分离,上层清液中病毒滴度计算空斑形成实验如上所述。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
我们选择gydF4y2Ba弗朗西斯氏菌属novicidagydF4y2BaCas12a分析Cas12a反式活动的免疫功能,已被证明能够打通ssDNA反式gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba李et al ., 2018 agydF4y2Ba),广泛应用于细菌和真核生物基因组编辑(gydF4y2BaEndo et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba江et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba图et al ., 2017gydF4y2Ba)。为此,我们构建了一个Cas12a瞄准系统gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaMG1655 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)。该系统包含两个质粒。pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S质粒表达Cas12a蛋白质使用ara启动子(PgydF4y2BaaragydF4y2Ba),crRNA春节启动子(PgydF4y2Ba春节gydF4y2Ba)。crRNA目标的gydF4y2BaampgydF4y2BapUC19的基因,这是目标质粒(pTarget)。在添加诱导物(L-ara和aTc), Cas12a crRNA表达和形成一个分裂pTarget核糖核蛋白复杂,生成Cas12a-crRNA-target DNA复杂,这对反式ssDNA乳沟是活跃的。活动的复杂可能降低pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S,非目标质粒;因此,我们可以通过测量评估Cas12a瞄准的反式作用p的稳定性gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S。值得注意的是,副本数量的pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S和pTarget∼5和500 - 700年,分别。丰富的pTarget质粒应该提供足够的衬底产生高水平的Cas12a-crRNA-target DNA复杂gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。Cas12a反式活动不提供免疫力的质粒或噬菌体gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba的插图的设计研究。pCas12a质粒表达Cas12a复杂,是由crRNA pTarget灭亡。乳沟生成Cas12a-crRNA-target DNA复杂,在pCas12a或M13噬菌体的影响进行了分析gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba质粒的维护pTarget (Amp-resistant)和pgydF4y2BaTSgydF4y2Ba启动Cas12a瞄准后Cas12a-1S (Chl-resistant)。规范化CFU计算使用antibiotics-free盘子上的CFU作为参考gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaqPCR pTarget和p的相对丰度的分析gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S后启动Cas12a定位gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba质粒pTarget和p的维护gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S后启动Cas12a针对37°CgydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba瘟疫M13的形成分析。十倍系列稀释M13是掉到了细菌包含p的草坪gydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S或pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NTgydF4y2Ba(F)gydF4y2BaM13浓度后感染细胞含有pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S或pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NTgydF4y2Ba(G)gydF4y2Ba质粒的维护pTarget (Amp-resistant)和pCas12a质粒(Chl-resistant)细胞中含有pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-2S pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S和pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT分别gydF4y2Ba(H)gydF4y2Ba瘟疫M13的形成分析。十倍系列稀释M13是掉到了细菌包含p的草坪gydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-2S pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S和pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT分别gydF4y2Ba(我)gydF4y2BaM13浓度后感染细胞含有pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S或pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT。所有的量化数据显示为三个独立复制的方法。误差线表示标准偏差。的gydF4y2BapgydF4y2Ba值的计算是通过单尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。*:gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,* *:gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *:gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001。gydF4y2Ba
我们在antibiotics-free Cas12a发起针对介质通过补充L-ara和aTc,而文化只有与L-ara补充,以避免crRNA表达式设置为控制。然后,质粒的维护进行了分析通过测量集落形成单位(CFU)板块包含相应的抗生素。相对CFU antibiotics-free板块的规范化。结果表明,Cas12a针对Amp-resistant CFU减少了∼10倍从4到6 h后归纳,表明pTarget损耗,而p的维护gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S (Chl-resistant)并不影响期间(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba)。此外,CFU耐Amp和排名大幅减少了10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba折叠分别为6和8 h后感应。调查这一现象是否与Cas12a反式活动,我们构造一个Cas9瞄准系统和分析其影响质粒维护。Cas9介导dsDNA瞄准,但没有反式ssDNA劈理(gydF4y2BaJinek et al ., 2012gydF4y2Ba)。结果表明,Cas9 CFU目标也导致显著减少抵抗抗生素,以及温和的亏损pTarget (Amp-resistant) (gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba)。Cas9系统和Cas12a系统的相似性能表明Amp-resistant殖民地可以自发的结果p的损失gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S或pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas9,而不是反式质粒的乳沟,等于证明了p的稳定gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S和pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas9质粒在两个目标系统。gydF4y2Ba
调查Cas12a的反式活动是否会减少非目标质粒的拷贝数,我们分析了p的相对丰度gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S启动后并使用qPCR pTarget Cas12a定位。我们设置了大量的pTarget和pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S控制文化为1。结果表明,Cas12a针对pTarget丰度减少了约7倍,但没有施加影响pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S丰度(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
排除,质粒的复制可能损害Cas12a反式活动的影响,我们发起Cas12a针对37°C,在温度热敏复制子无法复制的质粒。37°C的速度增长导致pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S损耗∼40%细胞控制文化(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba与复制抑制),在协议。然而,Cas12a瞄准没有导致进一步的pgydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S损耗。相比之下,Cas12a针对pTarget-containing细胞减少了∼2.6折(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。pTarget低损耗效率快可能是由于自发p的损失gydF4y2BaTSgydF4y2BaCas12a-1S在37°C。gydF4y2Ba
接下来,我们想分析Cas12a的反式活动是否会对ssDNA噬菌体M13授予豁免权。为此,我们构造、两个质粒:pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S和pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-NT,后者表达crRNA pTarget或不匹配任何序列gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba基因组,并设置为控制。质粒转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba分别JM109 pTarget一起。比较产生的菌株的质粒维护表明Cas12a针对导致损耗pTarget不是pgydF4y2BaTRgydF4y2BaCas12a-1S (gydF4y2Ba补充图S4AgydF4y2Ba),符合MG1655的分析。然后,我们分析的敏感性菌株M13使用瘟疫形成单位(PFU)测定。试验没有透露任何区别这两个菌株。进一步分析的影响Cas12a M13传播目标,我们感染菌株在液体培养和Cas12a发起针对补充同时诱导物。自Cas12a目标主要是消除pTarget 2 h后感应(gydF4y2Ba补充图S4BgydF4y2Ba),我们测量了噬菌体滴度。数据显示相同的两个菌株的M13浓度,表明Cas12a目标施加不影响M13传播(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
经过乳沟的目标dsDNA Cas12a复杂还附加到目标链。我们假设附件可能会限制Cas12a复杂的流动,从而限制反式分裂活动。释放Cas12a-crRNA-target DNA复杂,我们设计了一个two-spacer CRISPR阵列(gydF4y2Ba补充图印地gydF4y2Ba)。pTarget的两个间隔器匹配两个相邻protospacers,因此劈理的一份pTarget将生成两个活动Cas12a复合物,其中一个只有结合短片段的DNA和目标应该是更多的移动。我们比较维护pTarget与非目标质粒(pCas12质粒)细胞包含一个垫片(1)、两个间距器(2)和一个非目标间隔,分别。结果表明,Cas12a诱导pTarget损耗的存在一个和两个间隔器,和2 S系统更有效地消除pTarget比1 S系统。然而,无论是2 S还是1 S系统维护pCas12a影响(gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba)。此外,我们分析了M13的易感性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaJM109细胞包含2 S系统和M13传播包含2 S的细胞系统。再一次,结果表明,2 S系统没有产生任何减少M13 PFU或M13浓度控制文化相比,(gydF4y2Ba图1 h,我gydF4y2Ba)。集体,数据表明Cas12a,当激活目标dsDNA劈理,对非目标的质粒或噬菌体不能提供免疫力。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这项研究中,我们构建了一个Cas12a定位系统通过编程目标的高仿质粒gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。所表示的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究(gydF4y2Ba李et al ., 2018 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2018gydF4y2Ba),目标质粒的乳沟触发反式非特异性ssDNA Cas12a的分裂活动。然而,我们的数据表明,反式活动不发挥检测针对的质粒或噬菌体免疫功能。这种现象可能是由于以下几个原因。首先,丰富ssDNA结合蛋白gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba可以防止ssDNA Cas12a活跃。第二,活跃Cas12a可以通过更换迅速复位crRNA-target DNA混合新crRNAs (gydF4y2BaStella et al ., 2018gydF4y2Ba)。此外,在这项研究中,使用的主机gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba可能缺乏必要的因素,需要Cas12a实现完整的功能。因此,我们不能否认的反式活动Cas12a可能发挥免疫和/或其他函数在其本地主机。gydF4y2Ba
Cas12a已经被广泛地应用于基因组编辑工具。其应用的主要问题是潜在的非标靶。先前的报道表明Cas12a高特异性的哺乳动物(gydF4y2Ba金正日et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaKleinstiver et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba魏et al ., 2021gydF4y2Ba)。在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,我们表明,即便是在500 - 700份的存在目标和两个间隔器,Cas12a没有造成明显的反式乳沟。最近,一个独立的Lachnospiraceae研究gydF4y2Ba细菌gydF4y2Ba(磅)Cas12a也揭示了反式劈理不会起到检测作用免疫(gydF4y2Ba马里诺et al ., 2022gydF4y2Ba)。在一起,数据表明Cas12a是一个精确的核酸酶用于基因编辑时,质粒消除和anti-phage细菌。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以针对相应的作者。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
SL, XR, RZ进行了实验。XR, WH实验设计。WH监督这个项目。WH和SL写了初稿。所有作者审查和编辑。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项研究是由国家重点支持研究和发展项目的中国(2019 yfa0906400),国家科学基金会(批准号31970545),中央大学基础研究基金(批准号2662020 skpy001),湖北红山的基础实验室(2021号hszd022)和华中农业大学科学和技术自主创新的基础。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢华中农业大学生物工程实验教学中心的技术支持。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.929929/full补充材料gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2BaCRISPR-cas系统,Cas12a (Cpf1),反式分裂活动,目标质粒,anti-phage活动gydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba刘,饶X,赵R和汉族W(2022)的变性DNA分裂活动Cas12a没有提供对的质粒或噬菌体可检测的免疫力。gydF4y2Ba前面。基因组。gydF4y2Ba4:929929。doi: 10.3389 / fgeed.2022.929929gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2022年4月27日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba08年7月2022;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2022年7月26日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
斯科特•贝利gydF4y2Ba美国约翰霍普金斯大学,gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2022刘,饶,赵和汉族。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)。gydF4y2Ba使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba北京汉,gydF4y2Bahanwenyuan@mail.hzau.edu.cngydF4y2Ba
__gydF4y2Ba这些作者贡献了同样的工作gydF4y2Ba