检测细胞周期依赖性的胞嘧啶和腺嘌呤基编辑器
卡梅伦a·伯内特
阿什利·t·黄
卡洛斯·a·Vasquez
科琳·a·麦克休1
亚历克西斯c Komor- 1化学和生物化学、加州大学圣地亚哥分校拉霍亚,CA,美国
- 2基因组医学研究所,加州大学圣地亚哥分校拉霍亚,CA,美国
- 3细胞和分子医学部门,加州大学圣地亚哥分校拉霍亚,CA,美国
基本编辑器(BEs)基因组编辑代理安装点突变效率高和特异性。由于他们依赖尿嘧啶和肌苷DNA损伤中间体(而不是DNA双链断裂,或双边带),被假定BEs依赖于无处不在的DNA修复途径比DSB-reliant基因组编辑方法,这需要过程,只是活跃在细胞周期的特定阶段。我们在这里报告的第一个系统研究细胞cycle-dependence基础编辑使用细胞同步实验。我们发现nickase-derived BEs(介绍DNA支柱裂纹对面尿嘧啶或肌苷基地)功能独立于细胞周期,而non-nicking BEs高度依赖于s阶段(DNA合成阶段)。我们发现同步在G1(发展阶段)过程中胞嘧啶基地编辑导致显著增加C•G•T“副产品”介绍率,可用于发现新的策略精确C•G•T基础编辑。我们观察到内源性表达水平的DNA损伤修复途径是充分的基本编辑中间体加工成所需的编辑结果,和基地的过程编辑不明显扰乱转录水平。总体而言,我们的研究提供了机械的数据展示的健壮性nickase-derived BEs执行基因组编辑在整个细胞周期。
介绍
基本编辑“非传统”基因组编辑方法,利用CRISPR-Cas9的可编程性,但避免使用DNA双链断裂(双边带)引入单核苷酸变异(SNVs)在活细胞的基因组(Komor et al ., 2016;Gaudelli et al ., 2017)。这些工具包括单链DNA (ssDNA)融合的特殊脱氨酶酶催化地灭活或受损的ca蛋白(dCas9 dCas12,或Cas9n) (李et al ., 2018)。ssDNA由于酶”的要求,脱氨基作用的目标碱基是局限于一个小的(∼5核苷酸)窗口内Cas9: gRNA: DNA R-loop (图1一个)。两个主要类别的基本编辑器开发:胞嘧啶基地编辑(cbe) (Komor et al ., 2016;Nishida et al ., 2016),它采用胞嘧啶核苷脱氨酶酶转换主要是T•C•G碱基对一个结果通过uracil-containing中间体和腺嘌呤基编辑器(?),它采用进化腺苷脱氨酶酶将G•C•T碱基对通过inosine-containing中间体(Gaudelli et al ., 2017)(图1一个)。利用要么完全催化地不活跃的dCas9谱仪(在这种情况下,只有DNA修饰修改基础的引入,图1一个),或者Cas9n,在这种情况下,链修改基地对面带切口的操纵DNA修复过程优先取代这个链,使用修改后的基地作为模板(图1一个)。值得注意的是,胞嘧啶基地编辑可以导致C•G non-T•编辑结果在某些网站通过一个机制目前不是很好理解,但包括切除尿嘧啶中间的尿嘧啶N-glycosylase ()) (Komor et al ., 2017)。这些结果可以抑制,通过融合到建筑称为尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)的多肽,它不可逆转地结合在蛋白质)。相比之下,?产生更精确的编辑结果,以最小的一个non-G•T•C转换。“传统”基因组编辑由野生型(wt) CRISPR-Cas9,另一方面,依赖于初始引入双边带,其次是DNA修复操作实现精确编辑结果(曹et al ., 2013;丛et al ., 2013;Jinek et al ., 2013;马里et al ., 2013)。两种主要途径竞争过程Cas-mediated双边带:异源端加入(NHEJ),插入和删除(indel)产品介绍在争端解决机构网站,而homology-directed修复(HDR)使用一个exogenously-supplied供体DNA模板引入精确修改站点附近的争端解决机构(毛et al ., 2008)。传统的主要限制,DSB-mediated基因组编辑是双边带通常由比HDR NHEJ更有效地修复。此外,细胞循环依赖的表达HDR机械(主要表达在DNA合成阶段,或S期细胞周期)的有限精度HDR-mediated基因组编辑工具的使用细胞增殖活跃的(Shrivastav et al ., 2008)。各种策略涉及双边带调制修复因素已经发展提高的比率HDR NHEJ结果由于我们详细了解底层的DNA修复机制参与DSB-mediated基因组编辑(楚et al ., 2015;Riesenberg Maricic, 2018;刘et al ., 2019)。相比之下,DNA修复机制这一过程基本编辑中间体不清楚。
图1。(一)基本编辑的概述。基本编辑器由一个ssDNA修改(蓝色)共价酶系催化地不活跃或受损Cas9 (dCas9或Cas9n)蛋白质(灰色)。基本编辑器绑定到一个感兴趣的基因位点通过protospacer相邻主题(PAM,紫色所示)识别和Watson-Crick-Franklin gRNA和protospacer之间的碱基配对。当地变性的DNA在R-loop形成公开∼5核苷酸(protospacer职位4 - 8)ssDNA修饰酶,将脱氨基目标基地你或者我中间。修改的永久基地会转换为规范碱基对在损伤后细胞复制或修复。(B)细胞周期的各个阶段的概述。精密基因组编辑使用野生型Cas9使用同源修复,这是高度依赖细胞周期(灰色弧),通常容易出错的异源端加入通路淘汰出局。基本编辑已经证明是有效的在终末分化细胞,表明依赖non-cell-cycle-dependent DNA修复途径。本研究中使用的化学同步代理(诺考达唑、mimosine和胸苷)所示黑盒与抑制细胞周期的箭头指向阶段他们逮捕的细胞。此外,同步代理洛伐他汀,用于初始同步试验,但是不能在基本编辑实验中,在一个黑色虚线框表示。(C)建筑结构的使用。所有结构采用酿脓链球菌(Sp) Cas9同族体。热?都是单一多肽链组成的三个融合蛋白组件野生型大肠杆菌(大肠杆菌)高(tRNA-specific腺苷脱氨酶),实验室进化大肠杆菌高(高*)催化脱氧腺苷脱氨基作用,和一个受损(Cas9n)或不活跃(dCas9) Cas9。CBE都是单个蛋白质融合组成的河鼠APOBEC胞嘧啶核苷脱氨酶酶(APOBEC1)拴在Cas9n或dCas9,紧随其后的是两份尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)——除了在CBE∆UGI结构。(D)Protospacers和PAM(紫色)序列基因位点的研究,与目标Cs(蓝色)和(鲑鱼)基地内编辑窗口(protospacer职位4 - 8人,浅蓝色)表示。
修复DNA损伤是由几个不同的修复途径,是活跃在不同程度在细胞周期的不同阶段(Branzei Foiani, 2008)。例如,HDR机械主要表达在后期合成(S)和细胞周期的差距2 (G2)阶段(Branzei Foiani, 2008;林et al ., 2014)(图1 b)。事实上,一个策略来改善HDR NHEJ比率在DSB-reliant基因组编辑实验涉及pre-synchronizing细胞之前交付Cas9: sgRNA核糖核蛋白复杂和捐助模板协调的初始“破裂”基因组编辑活动和S -和/或G2 / M期(林et al ., 2014)。基本编辑,相比之下,一直假设依赖错配修复(MMR)和/或基本切除修复(BER)通路,这被认为是不那么大大受到比HDR细胞周期的各个阶段。支持这一点,几项研究已经报道成功的基本编辑post-mitotic,核武器、细胞类型(叶et al ., 2018;Lim et al ., 2020)。然而,没有系统性的调查编辑进行了细胞cycle-dependence基地。详细了解基本的编辑结果可以改变对细胞周期会通知我们细胞类型最适合高效和精确的基本编辑,揭示新策略来增强某些基本编辑结果,并提供更多的信息关于这些工具的DNA修复机制运作。
这里,我们利用化学同步逮捕人类胚胎肾293 t (HEK293T)和人类erythroleukemic (K562)细胞G1和G2 / M和量化的变化基本编辑效率和精度ABE7.10, BE4,和BE4∆UGI,以及相应的构造与dCas9 Cas9n(见图1 a, C),以下简称为安倍,CBE, CBE∆UGI,安倍(dCas9), CBE (dCas9)和CBE∆UGI (dCas9),分别。我们在三个不同的量化效率和精度的变化每构建基因组位点,代表编码和非编码区域(图1 d)。我们观察微小变化(CBE不到25%,小于45%为安倍)整体基础编辑效率对细胞周期同步的Cas9n-derived喜神贝斯(DNA缺口支柱安装在对面的链尿嘧啶或肌苷中间),并大幅减少(减少对安倍和∼∼70%减排80% CBE)在整体基本编辑效率dCas9-derived BEs的同步条件。从根本上来说,这些数据表明,不同的DNA修复机制进程所需的不同的中间体到编辑结果,带切口的中间体依赖更多的无处不在的通路,non-nicked中间体依赖年代phase-dependent通路被加工成所需的结果。另外,我们观察到大量增加相对C•G•T利率由CBE∆UGI(缺乏UGI CBE的组件,因此允许高水平的切除尿嘧啶的中间体)在同步G1。可以利用这一发现来确定精确的新策略C•G•T基础编辑,最近类似的方法使用cbe精确C•G, G•C基础编辑(陈et al ., 2021;库尔特et al ., 2021;赵et al ., 2021)。与这些结果在DNA修复途径的背景下,我们另外执行批量RNA表达分析实验和分析超过20000 RNA的表达水平的变化在基本编辑,但不遵守任何显著的统计上的显著变化。这表明内生转录水平的DNA损伤修复途径是充分的基本编辑中间体加工成所需的编辑结果,和基地的过程编辑不明显扰乱稳态mRNA水平。
结果
时间轴的基本编辑
确定最优实验条件,结合细胞同步化和量化的基本编辑结果,我们首先进行了一次课程实验观察编辑的动力学CBE, CBE∆UGI和安倍建立gRNAs (补充图S1)。我们用质粒转染HEK293T细胞编码以及gRNA并提取基因组DNA (gDNA) 12日,18日,24日,36岁,48岁,72和96 h post-transfection。感兴趣的基因位点被放大,进行高通量测序(高温超导)和分析基因组编辑效率使用CRISPResso2 (克莱门特et al ., 2019)。我们观察到一个渐进的、一致的提高编辑效率随着时间的推移,由安倍(补充图S1A在整个实验的过程中)。相比之下,编辑的CBE似乎达到36 h,后跟一个轻微的下降在48小时然后恢复,并通过实验的最后增加(补充图印地)。编辑CBEΔUGI达到48 h,然后通过实验的最后(减少补充图就是S1C)。当每个数据归一化到最高的编辑发现平均每个位点,然后为每一个构建在所有三个位点,24±10%,54±7%,40±12%的整体编辑由安倍在18 h(观察转染,CBE,分别和CBEΔUGI(平均数±标准差n= 3生物复制/网站,平均在三个不同的网站)。安倍之间的这些差异的时间编辑和CBE可能是由于蛋白表达的差异/稳定,固有的差异两个中间体的速度由各自的酶,或由于时间的差异如何处理这两个中间体的细胞。
化学抑制剂细胞治疗12小时后被捕
细胞可以被逮捕在特定阶段的细胞周期使用化学抑制剂如洛伐他汀(G1被捕),mimosine (G1 / S边界,在复制之前),胸苷(G1 / S边界,在复制之前)和诺考达唑(G2 / M) (Shrivastav et al ., 2008)(图1 b)。确定同步的时间为我们的实验中,我们对待HEK293T和K562细胞与这些化学抑制剂和监控同步的细胞在6、12、18 h的荧光通过检查固定和propidium iodide-stained细胞。我们使用流式细胞仪观察DNA内容和量化的分数在G1细胞人口,年代,G2 / M期后化学同步。
同步HEK293T细胞表现出平均43±1%的细胞在G1, 42±1%的细胞,和15±0.2%的细胞G2 / M(平均数±标准差n生物复制= 3,补充图S2)。我们观察到适度的增加同步的细胞后6 h诺考达唑治疗(28±3%的细胞G1, 26±1%的年代,细胞和46 G2 / M±1.5%的细胞,补充图S2),这大大增加了12 h后处理4±4%的细胞G1, 14±1.5%的细胞在年代,G2 / M(82±4%的细胞补充图S2)。温和的同步也观察到后6 h与胸苷治疗(60±6%的细胞G1, 40年代,±6%的细胞G2 / M和0.1±0.1%的细胞,补充图S2),但12 h的治疗能够逮捕细胞G1和S期早期,细胞G1 80±6%, 19±6%的年代,细胞G2 / M和0.7±0.5%的细胞(补充图S2)。Mimosine治疗同时逮捕了细胞G1 / S边境后12 h, 59±1%的细胞G1, 37±1%的年代,细胞和0.5±0.9%的细胞G2 / M。类似的K562细胞的治疗与这三种化学物质产生相似的结果(补充图S2)。相比之下,洛伐他汀没有影响HEK293T或K562细胞周期分布与18 h的治疗(补充图S2)。细胞同步举行超过48小时测定由锥虫蓝染色(不能存活补充图S3)。
延迟同步需要保持平等的基本编辑表达水平
我们进行了初步的实验稍微修改了协议(杰克曼和奥康纳,1998年;林et al ., 2014)。同步代理添加第一个HEK293T细胞,随后,gRNA质粒的转染后17 h。在24 h post-transfection,流式细胞仪是用来测量和比较绿色荧光蛋白(GFP)表达水平的同步采样的同步的样品(使用BE-P2A-GFP构造,和绿色荧光蛋白是转录在一起但翻译成单独的蛋白质)(刘et al ., 2017)。我们观察时表达水平细胞数量的急剧减少pre-synchronized诺考达唑或mimosine,最有可能由于转染效率或减少蛋白质翻译利率造成的同步(减少从平均60±5%的细胞表现出GFP荧光为异步32±1%被捕的G1细胞mimosine 24±2%由诺考达唑被捕的G2 / M细胞,GFP和胸苷在错误在57±3%,平均±标准差n生物复制= 3,补充图S3)。添加同步代理的时候转染GFP阳性细胞的比例改善mimosine 49±5% (G1被捕),43±5%诺考达唑治疗细胞(G2 / M逮捕),和胸苷治疗57±2%细胞在24 h post-transfection (G1逮捕)。然而,延迟添加同步代理直到转染后6 h决心是最好的平衡保护GFP(因此)表达水平,同时确保大部分的基本编辑活动(如由我们的时间进程实验)发生在细胞同步。具体来说,62±3%的mimosine治疗细胞(G1逮捕,没有统计上的显著差异),52±5%的诺考达唑治疗细胞(G2 / M逮捕,代表16±8%降低GFP荧光相比,异步细胞),和57±2%的胸苷治疗细胞(G1逮捕,没有统计上的显著差异)GFP荧光在24 h post-transfection展出。我们选择前进使用胸苷作为我们的G1同步代理由于其更完整的细胞G1的同步。通过延迟添加同步代理直到转染后6 h,细胞由18 h post-transfection完全同步,让我们观察编辑的效率和精度的变化发生在18岁到54 h post-transfection(表示补充图S1D与虚线框表示图2一个由于同步)。
图2。细胞周期同步化对安倍基本编辑效率和精度的影响,安倍(dCas9), CBE, CBE (dCas9) HEK293T细胞。(一)细胞转染+ gRNA (protospacer序列表示图1),同步代理添加6 h post-transfection(胸苷为G1同步或诺考达唑为G2 / M同步),细胞和细胞溶解在54 h。作为一个消极的控制,与gRNA细胞转染质粒(gRNA只样本)。基因组DNA提取和目标位点被放大通过PCR和受到高通量测序(高温超导)。基因组编辑效率(高温超导读取总额的百分比与目标转化为G•C•T基地安,安倍(dCas9),或高温超导读取总额的百分比与目标C•G基础转换成T•CBE和CBE (dCas9)]与CRISPResso2量化。基本编辑由安倍效率(B),CBE(C)安倍(dCas9)(D),CBE (dCas9)(E)绘制。值和误差反映了三个独立的手段和SD生物复制在不同的日子里进行。星号反映p值计算的未配对t测试中,一个跟踪(ns表示不显著,*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001)。
对腺嘌呤基编辑同步的影响
根据我们之前的实验,HEK293T细胞转染与安倍或安倍(dCas9)和gRNA,然后处理同步代理48 h开始6 h post-transfection。细胞细胞溶解、提取gDNA和感兴趣的基因位点被放大,受到高温超导,分析基因组编辑效率使用CRISPResso2 (图2)。我们证实,细胞转染后依然同步在18岁到54 h 48-well板格式(补充图S4)。这两个编辑器的区别在于安倍(dCas9)会产生一个中间缺乏尼克在肌苷链对面。而常用dCas9-derived BEs一般低于Cas9n同行由于其整体效率降低,我们感兴趣的观察,轻伤的未经编辑的影响链的细胞周期依赖性基础编辑。值得注意的是,我们没有观察到显著的变化在一个T G•C•安倍在任何编辑效率的三个站点(HEK2,希拉,PSMB2位点)在同步G1使用胸苷相对于异步人口(p> 0.05双尾学生的t以及,图2 b)。当细胞在G2 / M同步使用诺考达唑,我们观察到37±11%降低T•G•C编辑效率的HEK2网站,减少45±5%希拉的网站,没有减少PSMB2网站(图2 b)。我们重复这些实验在K562细胞和观察到的相同的总体趋势,展示这些数据的通用性(补充图S5A)。直接对比,T•G•C编辑效率由安倍(dCas9),显著降低HEK293T细胞在所有三个地点与同步的条件。当同步在G1胸苷,T•G•C编辑下降了63±7%HEK2网站,67±15%希拉网站,64±16%PSMB2网站(平均数±标准差n= 3生物复制)。当同步诺考达唑在G2 / M T•G•C编辑下降了70±4%HEK2网站,68±9%希拉网站,68±12%PSMB2网站(图2 d)。这些实验也重复K562细胞和我们观察到同样的大幅减少T•G•C编辑效率由安倍(dCas9)的两个三个基因位点(补充图S6A)。这些数据显示明显差异的机制这两个处理编辑的中间体。此外,nickase-derived安倍(这是更常用dCas9-derived安因其更高的效率)显示最小的细胞周期依赖,直接与DSB-reliant基因组编辑方法。
同步对胞嘧啶基地编辑器编辑效率的影响
我们重复这些实验与CBE CBE (dCas9)。CBE编辑的产生主要是C•G T•编辑产品(产品纯度,百分比的编辑读目标C•T•G是编辑,> 80%,报这三个网站,补充图S7A),因此我们只分析这些结果。在G1同步使用胸苷,平均C•G T•CBE的编辑效率有所下降在所有三个网站(图2 c),但这些减少未达到统计上的显著水平(p> 0.05双尾学生的t以及)。在G2 / M同步使用诺考达唑、编辑下降了27±7%HEK2网站,26±5%HEK3网站,5±3%RNF2网站(图2 c,平均数±标准差n= 3生物复制)。然而,这些减少可能是归因于的减少是由于同步如前所述表达水平下降(16±8% GFP表达水平与诺考达唑同步后)。类似的实验K562细胞再次取得了类似的结果(补充图S5B)。C•G T•编辑效率的CBE (dCas9)大大减少了两三个站点的同步条件(图2 e);当同步在G1胸苷编辑下降了67±9%HEK2网站和96±18%HEK3网站,当同步在G2 / M诺考达唑编辑下降了77±14%HEK2网站和81±17%HEK3网站。C•G T•编辑效率的CBE (dCas9)RNF2轨迹在异步细胞很低(5±0.4%),但我们观察到72±12%减少同步在G2 / M诺考达唑并没有显著降低同步在G1胸苷。我们再次重复这些实验在K562细胞和观察到的相同的总体趋势(补充图S6B)。结合安倍同步结果,这些数据表明,这两种类型的dCas9-derived BEs严重依赖S-phase-dependent通路将各自的点突变,而Cas9n-derived BEs细胞周期依赖相比要小得多。
同步影响CBEΔUGI产品纯度和编辑效率
最后,我们重复这些实验和CBEΔUGI CBEΔUGI (dCas9)。因为这些构造缺乏尿嘧啶糖基化酶抑制剂组件,切除的尿嘧啶中间相当有效,导致高水平的C•G non-T•一个结果在使用这些结构。这反过来让我们观察的变化基本编辑精度对细胞周期同步。我们分析了整体编辑效率(高温超导读取率与目标T•C•G编辑,G•C,或•T)和产品分布(编辑的相关部分测序读的目标C•T•G是编辑,G•C,或•T)每个样本的处理CBE∆UGI (图3 a, B)。与先前的研究一致(Komor et al ., 2017),我们观察到高C•G, G•C编辑在异步的细胞,尤其是在HEK2网站,允许观察这些相对效率的变化同步。令我们吃惊的是,在G1细胞同步使用胸苷表现出显著增加的相对分数编辑读与C•G•T突变(19±1.9倍的增加HEK2网站9在±0.8倍HEK3网站,和7±0.4倍RNF2网站,图3 b),一篇相对减少C•G, G•C结果(下降了1.6±0.0倍HEK2网站,5在±0.10倍HEK3网站,和2.9±0.0倍RNF2网站,图3 b),最小的变化相对分数对T C•G•编辑(是等效的HEK2网站,下降了1.9±0.2倍HEK3网站,是等效的RNF2网站,图3 b)。除了相对量,绝对C•G•T点突变效率也增加了在G1逮捕在所有三个网站(补充数据S7C-E;绝对C•G•T效率增加17±3重HEK2网站,6在±2倍HEK3网站,和3±1倍RNF2网站)。进一步证实这种现象急剧增加的C•G•T编辑活动在G1同步,这些实验被重复三个额外的网站。在所有三个网站测试,有一个大幅增加绝对和部分C•G•T编辑(补充数据S8A-D)。这些结果表明,使用G1同步代理可以作为一个可行的选择有针对性的C•G•T基本编辑。在G2 / M同步,绝对C•G•T点突变效率是错误的异步细胞内HEK2网站,和稍微下降HEK3和RNF2网站(1.7±0.5,1.4±0.3倍下降,分别补充数据S7C-E)。绝对的C•G, G•C异步细胞中引入效率最高,其次是G2 / M同步(减少了36±4%HEK2网站,56±6%HEK3网站,44±7%RNF2网站与异步细胞相比,补充数据S7C-E)和最低G1细胞同步(下降了46±6%HEK2网站,84±10%HEK3网站,83±10%RNF2网站相比,异步细胞)。这些结果也观察到在我们的K562实验(补充数据S5C-E),尽管相对变化不剧烈,可能由于整体水平较低的编辑在这个细胞系。控制的变化,可能是由于化学同步代理,我们重复这些实验使用mimosine同步的细胞G1和观察到的相同的增加相对C•G•T率(补充图S9)。我们会注意,我们观察到大幅降低整体编辑效率通过CBE∆UGI在G1同步mimosine没有观察到在G1和胸苷同步。我们认为这两种化合物的同步机制的差异;mimosine功能通过螯合铁,许多DNA修复蛋白折叠和功能要求的。
图3。细胞周期同步化影响基础编辑效率CBEΔUGI和CBE∆UGI (dCas9) HEK293T细胞。细胞转染CBEΔUGI或CBEΔUGI (dCas9) + gRNA (protospacer序列表示图1),同步代理添加6 h post-transfection(胸苷为G1同步或诺考达唑为G2 / M同步),细胞和细胞溶解在54 h。基因组DNA提取和目标位点被放大通过PCR和受到高温超导。基因组编辑效率(高温超导读取总额的百分比与目标转化为T•C•G基地,G•C•T)与CRISPResso2量化。基地由CBEΔUGI编辑效率(一)和CBEΔUGI (dCas9)(C)在同步绘制。(B, D)产品分布,定义为相对的部分编辑测序读(读的目标C•T•G是突变,•T,或G•C)已编辑的显示结果,是CBEΔUGI绘制(B)和CBEΔUGI (dCas9)(D)。值和误差反映了三个独立的手段和SD生物复制在不同的日子里进行。星号反映p值计算的未配对t测试中,一个跟踪(ns表示不显著,*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001,p < 0.0001) * * * *。
整体编辑百分比的CBE∆UGI (dCas9)大幅下降与同步的条件下,这三个地点的安倍(dCas9)和CBE (dCas9)结果(编辑下降了78±7%HEK2网站,78±13%HEK3网站,80±9%RNF2网站在G1细胞同步胸苷,79±8%HEK2网站,85±16%HEK3网站,92±11%RNF2网站由诺考达唑在G2 / M细胞同步,图3 c)。虽然整体编辑效率低于5%在所有三个网站上同步,我们还观察到同样的趋势在non-T C•G•编辑结果在同步(显著增加C•G•T介绍效率在G1同步,并显著减少C•G, G•C编辑效率在G1和G2 / M同步,较高的绝对C•G, G•C编辑效率在G2 / M同步细胞G1同步的细胞相比,图3 d和补充图S10)。再一次,这些实验被重复在K562细胞和可比的结果(补充图S6C)。
Indel变化序列的分析,引入效率Cas9n-Derived胞嘧啶基地编辑后同步
我们另外分析indel形成BEs在异步和同步的细胞。Indel安倍利率和dCas9-derived BEs通常是1%以下三个网站在所有条件,与先前的报道一致(图4 a, C;补充数据S11A-D)(里斯和刘,2018年)。Indel利率CBE被安倍高于,但仍普遍不到1%除了HEK2网站(补充数据S11A, C)。然而,indel利率CBE∆UGI平均10±3重高于CBE在完全相同的地点,相同的条件下,表明)参与CBE-induced indels (图4 a, B)。此外,indel利率CBE∆UGI 11 -至100倍高于CBE∆UGI (dCas9)在相同的地点,在同等条件下(图4 b, C),建议的参与攻击的未经审查的链CBE-induced indels。由于利率升高indel形成的CBE∆UGI,我们集中更多分析indels介绍构造。
图4。在HEK293T细胞Indel分析cbe。与CBE HEK293T细胞转染(一),CBEΔUGI(B)或CBEΔUGI (dCas9)(C)加上gRNA (protospacer序列表示图1),同步代理添加6 h post-transfection(胸苷为G1同步或诺考达唑为G2 / M同步),细胞和细胞溶解在54 h。基因组DNA提取和目标位点被放大通过PCR和受到高温超导。总indel介绍CBE的效率(一),CBEΔUGI(B),CBEΔUGI (dCas9)(C)计算的百分比读取与插入或删除(确定吗通过CRISPResso分析)除以总数量的高温超导读取测序。(两者)同步的影响在G1和G2 / M indel引入效率。(D-F)最常见的(定义为序列组成大于0.1%的总读至少三分之二的异步、G1-synchronized,和G2 / M-synchronized样本)indel序列显示关于protospacer(大胆的轮廓),潜在的编辑胞核嘧啶(用红色表示),尼克站点(红色三角形),帕姆(用蓝色表示)HEK2(C),HEK3(D),RNF2(E)网站。相对的部分总与每个特定indel indel读取顺序列在左边紫色对同步条件(注意这不是绝对indel介绍效率)。值和误差反映了三个独立的手段和SD生物复制在不同的日子里进行。星号反映p值计算的未配对t测试中,一个跟踪(ns表示不显著,*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001)。
我们观察到的不一致的变化绝对indel利率CBE∆UGI在同步与代理(在同步G1胸苷,绝对indel利率CBE∆UGI 2.4±0.5倍的增加HEK2网站,但是并没有改变HEK3网站或RNF2网站,并同步在G2 / M×诺考达唑,绝对indel利率CBE∆UGI是等效的HEK2网站,减少1.4±0.1倍HEK3网站,增加了1.4±0.1倍RNF2网站,图4 b)。这可能表明差异的非编码DNA修复和编码的基因组区域,特别是对糖基化酶的可访问性。我们分析个别indel序列和发现,最常见的序列(那些代表>读取总额的0.1%的三分之二的异步、G1-synchronized, G2 / M同步样本,显示在图4 d-f),删除序列仅限于胞嘧啶脱氨基之间的地区目标(s)和Cas9n-induced尼克的位置在所有三个网站。我们观察到没有插入序列中最常见的indel序列。这是直接与DSB-mediated indels,围绕Cas9减少站点。有趣的是,在同步G1和G2 / M,每个indel序列的相对含量变化显著(图4 d-f),这表明某些indel序列优先在细胞周期的不同阶段产生的。综上所述,这些观察结果表明一个本质上不同的机制相比indel介绍cbe DSB-reliant技术。
我们另外HEK293T细胞治疗BEs优化减少RNA不相干的活动(金正日et al ., 2017;周et al ., 2019)(BE4-W90Y-R126E BE4-W90Y-R126E-ΔUGI ABE7.10-F148A,称为CBE-YE1, CBEΔUGI-YE1, ABE-F148,分别补充图S11E)核糖核酸测序实验结果(请参见下一部分)以及催化地灭活的脱氨酶同行称为CBE-E63A-YE1 (Doman et al ., 2020)、CBEΔUGI-E63A-YE1和ABE-E59A-F148A (金正日et al ., 2006),分别补充图S11E)和分析indel形成目标时的利率HEK2网站。我们再次看到一个12±indel利率增加三倍CBE∆UGI-YE1治疗细胞相比CBE-YE1治疗细胞(补充数据S11G-H)。当比较每个催化地活跃的CBE变体各自催化地活动,我们观察到一个3±1.8倍下降indel CBE-YE1引入效率(补充图S11G),21±5倍降低indel CBEΔUGI-YE1引入效率(补充图S11H),这表明轻伤indel形成是不够的,但是需要尿嘧啶的介绍。我们很惊讶地看到indel介绍由安倍效率增加了7±1-fold在催化地灭活脱氨酶(补充图S11F)。这些数据表明ABE-mediated indel介绍可能通过一个inosine-independent机制,尽管额外的点需要证实了这一点。
由于基地编辑转录动力学
确定蛋白质编码和非编码RNA的转录组景观由通过基地将SNVs编辑的过程中,我们进行了大量HEK293T细胞的RNA序列(RNAseq)过程中基本编辑。如果内生的DNA修复蛋白水平不足以将中间体到各自的结果,相应的rna可能成为调节过程中基本编辑。如前所述,我们使用nCas9-derived安和CBE变异最小化非标靶RNA编辑活动(CBE-YE1 ABE-F148A,所示补充图S11E),以避免任何RNA mutation-induced RNA转录水平的变化。CBE-YE1变体也已被证明诱导显著降低gRNA-independent脱靶DNA编辑(Doman et al ., 2020)。综上所述,这些构造的表达会导致尿嘧啶或仅在目标肌苷的介绍,或者低gRNA-dependent脱靶,网站(s)的基因组DNA。我们也使用的催化地不活跃的脱氨酶版本CBE-YE1和ABE-F148A (CBE——E63A-YE1和ABE-E59A-F148A,所示补充图S11E)控制样品一样重要。与CBE-YE1 HEK293T细胞转染、ABE-F148A CBE-E63A-YE1,或ABE-E59A-F148A,要么gRNA针对HEK2轨迹(H2-gRNA)或新gRNA (nt-gRNA)。编辑各自目标的基地内HEK2 protospacer量化通过高温超导48 h post-transfection:整体基础编辑效率这个时候CBE-YE1 + H2-gRNA 43±1%和43 ABE-F148A + H2-gRNA±2% (图5一个),表明细胞的过程中尿嘧啶和肌苷中间体转换成所需的编辑结果(平均数±标准差n= 3生物复制)。所有细胞治疗nt-gRNA或催化地不活跃的脱氨酶编辑器显示编辑效率水平的摘要控制HEK2轨迹(图5一个)。此外,propidium碘染色的细胞在48 h post-transfection显示细胞健康和可行的(补充图S12A),流式细胞仪分析显示转染效率≥60% (补充图S12B)。
图5。微分表达式分析HEK293T细胞接受基本的编辑HEK2(H2)基因位点RNA不相干的优化结构。(一)HEK293T细胞转染ABE-F148A reduced-RNA编辑变异或CBE-YE1,或者催化地灭活的脱氨酶同行ABE-E59A-F148A CBE-E63A-YE1, CBE∆UGI-E63A-YE1,要么HEK2-targeting gRNA (H2-gRNA)或新gRNA (nt-gRNA)。在48 h post-transfection细胞细胞溶解,基因组DNA提取和目标位点被放大通过PCR和受到高温超导。基因组编辑效率(高温超导读取总额的百分比与目标转化为G•C•T基地安倍变异,或高温超导读取总额的百分比与目标C•G基础转换成T•CBE变异)与CRISPResso2量化。显示所有样本总体基础编辑效率。(中)处理HEK293T细胞完全相同的,但是在48 h post-transfection, RNA提取。编码RNA的转录组库丰富,受到高温超导。(B)微分表达式CBE-YE1 H2-gRNA与CBE-YE1 nt-gRNA。(C)微分表达式CBE-YE1 H2-gRNA与CBE-E63A-YE1 H2-gRNA。(D)微分表达式ABE-F148A H2-gRNA与ABE-F148A nt-gRNA。(E)微分表达式ABE-F148A H2-gRNA与ABE-E59A-F148A H2-gRNA。统计上显著差异表达基因标记与基因的名字,用蓝色和DNA损伤修复基因是彩色的。统计上显著差异表达基因被定义为基因的绝对值log2(褶皱变化)> 1和调整p值≤0.01。
并行,一式三份样品每个条件的细胞溶解48 h post-transfection和RNA提取。编码RNA的转录组库丰富,受到高温超导。我们比较细胞的转录组积极对待,H2-gRNA或nt-gRNA CBE-YE1和ABE-F148A和微分表达式进行分析的基础上,利用负二项分布DESeq2(爱et al ., 2014)包。这些样本之间的转录水平的差异可能是由于R-loop形成DNA轻伤,和/或尿嘧啶或肌苷介绍目标轨迹。我们观察到的一个统计上显著的大规模转录组变化发生过程中腺嘌呤基编辑(> 23000测序rna,图5 d和补充图向),这表明稳态mRNA水平足以腺嘌呤基编辑过程中间体到期望的结果,和腺嘌呤碱过程中编辑不扰乱转录组[log2褶皱变化的绝对值> 1和Wald test-attained Benjamini-Hochberg修正调整p价值(错误发现率,富兰克林·德兰诺·罗斯福)≤0.01)。我们发现很少RNA(表达有差异n= 1调节,n= 5表达下调,> 20000测序rna,图5 b和补充图向)由于胞嘧啶基地编辑,表明腺嘌呤,胞嘧啶的机制基本编辑中间体可能本质上不同的处理。基因本体论分析这些数据的使用fgsea(包快pre-ranked基因集富集分析)显示,这些RNA并没有给予相关的。因此,我们执行一个自定义的基因集富集分析来确定如果基因的DNA修复途径被浓缩或耗尽。我们列出了∼220 DNA修复基因和分类根据其DNA修复途径(Milanowska et al ., 2011;Olivieri et al ., 2020)(补充表S1)。我们发现没有DNA修复途径显著富集或贫化CBE或安分析(图5蓝色的点)。
然后执行之间的微分表达式分析样品处理活动是H2-gRNA和那些接受活动是H2-gRNA CBE-YE1和ABE-F148A。不活跃的表达是+ H2-gRNA将导致R-loop HEK2轨迹形成和DNA轻伤,没有引入尿嘧啶和肌苷。这些样本之间的差异转录水平将因此仅仅是由于尿嘧啶或肌苷的介绍和处理。我们再观察一个大规模转录组变化发生在安倍样品(> 24000测序rna,图5 e和补充图向)和两个差异表达的rna(∼20000测序rna,图5 c和补充图向在CBE样本。基因本体分析表明,这些RNA没有本体相关的,和一个定制的基因集富集各种DNA修复途径的分析显示,没有显著富集或贫化(图5蓝点)。所有基因发现的完整列表,或抑制在比较中列出补充图向。
关键结果的总结
简而言之,我们在这项工作报告四个关键的发现。首先,我们建立的机制Cas9n-derived喜神贝斯(函数产生的DNA链相反修改基地)的功能不同于那些dCas9-derived BEs函数。第二,我们发现Cas9n-derived BEs功能相当独立的细胞周期,而dCas9-derived BEs高度依赖于s阶段。这对研究人员观察有大量的影响表现在非区分细胞基因组编辑实验。第三,我们发现的C•G•T基础编辑由cbe在G1期显著增加。最后,我们的大部分mRNAseq数据表明基本编辑的过程并不明显扰乱稳态mRNA水平,这对确定基础编辑在治疗的安全设置。
讨论
我们在这里报告的第一个系统研究细胞周期依赖性腺嘌呤,胞嘧啶喜神贝斯。值得注意的是,我们观察到极端的差异的机制Cas9n-derived BEs dCas9-derived BEs函数。Cas9n-derived BEs(最常用的变体)显示最小总体变化点突变引入效率在G1上同步,用小(CBE不到25%,小于45%为安倍)减少效率在同步G2 / M。dCas9-derived BEs都表现出大幅削减各自的点突变引入效率在两G1(∼65%减少为安倍和CBE削减超过70%)和G2 / M(减少对安倍和∼∼70%减排80% CBE)同步。这些数据表明Cas9n-derived BEs依赖于无处不在的DNA修复途径比dCas9-derived BEs和DSB-reliant技术。最小,减少在CBE和安倍编辑效率在同步发生G1尤其值得注意,因为这是强烈的机械确认BEs可以函数:细胞。编辑效率的显著下降dCas9-derived BEs在G1和G2 / M同步显示,这些工具的中间体是高度依赖于s阶段过程转换为所需的编辑结果。我们建议,这些工具可能严重依赖于DNA合成中间体在各自的基地安装点突变。事实上,某些策略已经被DSB-reliant用来改善HDR-mediated编辑工具可以有效地提高编辑效率dCas9-derived喜神贝斯。这些包括融合联会蛋白s阶段期间该编辑器来增强其表达水平(Gutschner et al ., 2016),或融合的DNA聚合酶D3(参与基因组复制)的编辑器(Reint et al ., 2021)。
有趣的是,我们观察到急剧增加C•G•T编辑效率由CBEΔUGI G1同步多个细胞系和使用不同的G1同步代理。C•G non-T•编辑的cbe被假设发生,从translesion合成(TLS)聚合酶处理基本网站产生尿嘧啶切除)。结合我们的观察可能是由于细胞随周期变动)和TLS聚合酶表达水平的变化,但还需要附加的实验进一步调查这一发现。而一般CBE架构最近被重新设定精度C•G, G•C基础编辑通过操纵DNA修复因子(陈et al ., 2021),策略精度C•G•T基础编辑当前在哺乳动物细胞不存在。使用G1同步代理可以作为一个起点,产生更多的专业和精确的操纵DNA修复策略生成哺乳动物细胞C•G•T基础编辑。
我们另外执行机械的研究基地editor-induced indels。考试indel介绍利率和indel序列引入的CBE变异表明,引入indels CBE的依赖),DNA轻伤,脱氨酶催化地活跃。具体来说,删除UGI,突变的H840A Cas9(转换Cas9n dCas9),或突变的E58A rAPOBEC1(催化地使脱氨酶失去活性)都是独立足以减少indel介绍利率10倍。indel序列的分析与这些观察是一致的;CBE-induced indels被发现都是删除序列(没有插入观察,直接与DSB-reliant基因组编辑工具)。删除序列要么是删除一个基地(目标胞嘧啶)或删除,尼克和脱氨基胞嘧啶之间的地区。综上所述,这些数据表明CBE-induced indel序列可能造成situ-generated交错双边带,即推定地UNG-generated处理后形成的步行不能的网站通过内切酶如APEX1/2(分裂DNA骨干步行不能的地点)。
总之,我们在这里进行了编辑的第一机械的研究基地。我们有量化变化编辑效率和精度都腺嘌呤,胞嘧啶基地编辑对细胞周期同步,从而提供关键的见解基本编辑中间体的DNA处理机制。基本编辑效率的变化对细胞周期同步显示轻伤BEs依赖于无处不在的DNA修复途径比DSB-reliant技术引入各自的点突变,而non-nicking BEs高度依赖于s阶段。这些结果将指导未来的策略来提高基础编辑效率和/或精度的鲁棒性和提供更多的机械细节非传统基因组编辑代理。
材料和方法
结构和分子克隆
所有克隆质粒是由用户(兰et al ., 2016)与pCMV ABEmax_P2A_GFP (Addgene # 112101)和pCMV_AncBE4max_P2A_GFP (Addgene # 112100)质粒为模板,利用Phusion U热态启动聚合酶(ThermoFisher科学)。所有sgRNA表达质粒用钝端克隆生成pFYF1230 (Addgene质粒# 47511)作为模板,利用Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)。所有DNA矢量放大进行了使用内10-β主管细胞生物学实验室(新英格兰)。质粒都是使用ZymoPURE II质粒纯化Midiprep工具包(Zymo研究D4200)。
细胞培养
HEK293T细胞(写明ATCC crl - 3216)保持在高葡萄糖DMEM媒体补充GlutaMAX (ThermoFisher科学),10% (v / v)胎牛血清(ThermoFisher科学),和100µ/毫升Penicillin-Streptomycin (ThermoFisher科学),在37°C公司为5%2。K562细胞(写明ATCC crl - 3344)保持在RPMI媒体(生命科学)补充如上所述。
转染
HEK293T细胞转染,250年100000个HEK293T细胞µl DMEM媒体没有Penicillin-Streptomycin添加每好48-well VWR多井细胞培养板上lipofectamine /质粒的混合物。K562细胞转染,250年50000个K562细胞µl RPMI媒体没有Penicillin-Streptomycin添加每好48-well VWR多井细胞培养板上lipofectamine /质粒mixturestransfected密度50000细胞/在250µl RPMI没有Penicillin-Streptomycin媒体。lipofectamine /由1000 ng的质粒,质粒混合物250 ng sgRNA质粒,和1.5µl lipofectamine 2000 (ThermoFisher科学)25µl的总量,通过Opti-MEM (Gibco # 31985 - 070)。添加了化学抑制剂转染后6 h从股票的解决方案(在下面描述)导致的最终浓度5毫米(胸苷),800年μM (Mimosine),或200 ng / ml(诺考达唑)。
制备同步代理
诺考达唑(σ)是准备在DMSO股票20毫克/毫升的溶液浓度。这只股票的解决方案是稀释之前立即50μg /毫升细胞之外,和1.1µl稀释股票的解决方案是添加到275µl的媒体,最终200 ng / ml的浓度。
胸苷(σ)准备在1 x PBS原液浓度的50 mM。30µl这支股票的解决方案是添加到275µl的媒体,最终浓度为5毫米。
Mimosine(σ)准备在1 x PBS原液浓度的10毫米。24µl这支股票的解决方案是添加到275µl的媒体,800年最终浓度μM。
洛伐他汀(σ)准备在95%乙醇原液浓度的70毫米pH值为7.5。这是稀释400μM,那么30.5µl这支股票的解决方案是添加到275µl 40μM媒体最终的浓度。
流式细胞术分析细胞同步
3×105HEK293T或镀K562细胞T25烧瓶在5毫升的媒体和同步代理被添加到最终浓度为上述6、12或18 h。细胞被洗10 ml PBS,分离为2毫升TrypLE(仅HEK293T细胞),和收集的离心10分钟400 g。细胞被resuspended 1×106细胞/毫升1毫升冷PBS, 70%乙醇添加到9毫升冷,和存储至少4 h−20°C。乙醇固定后,细胞离心重400克,用PBS 10毫升冷洗,然后沾400µlπ溶液(0.1% Triton x - 100(σ),0.2毫克/毫升核糖核酸酶(σ),0.02毫克/毫升π(σ)在PBS)。在37°C细胞孵化15分钟前分析。细胞被封闭的排除紧身衣和不可行的细胞。从PI染色荧光信号进行了分析通过直方图在BLDSRFortessa或BioRad S3e细胞分选仪。
绿色荧光蛋白的荧光流式细胞术分析
GFP荧光测量,1×106细胞在流式细胞仪resuspended缓冲区(1%的边后卫,50µM EDTA pH值8.0,2μg /毫升π(σ)],并透过cell-strainer。被淘汰不能存活细胞和对比通过控制参数。流式细胞术进行BioFortessa或S3e细胞分选仪(Bio-Rad)。
转染效率量化
确定转染效率通过流式细胞术分析细胞24小时post-transfection。化学抑制剂添加HEK293T细胞−17日0,6 h相对,gRNA转染质粒(如上所述)。与PBS 24 h post-transfection,细胞被洗,分离从板50µl Accutase(创新细胞技术),250年resuspendedµl流式细胞仪缓冲区,通过流式细胞术和分析如上所述。细胞的百分比与GFP荧光进行了分析通过Flowjo。
高通量DNA测序的基因组DNA
转染细胞冲洗150µl PBS (ThermoFisher科学)转染后在指定的时间点。细胞细胞溶解在板的100µl裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,0.1% SDS和25μg /毫升蛋白酶K)。在37°C细胞溶解细胞然后加热1 h,紧随其后的是20分钟80°C。感兴趣的基因位点与Phusion高保真PCR扩增DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)根据制造商的协议,与引物轴承相同目标站点和相关Illumina公司正向和反向适配器(补充表S2),1µl基因组DNA混合物作为模板,和26个或更少的放大。独特的正向和反向的Illumina公司适配器组合序列然后附加了一个额外的回合Phusion高保真的PCR扩增DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)根据制造商的协议,使用1µl第一轮PCR混合物作为模板和15轮放大。产品从2%琼脂糖凝胶凝胶纯化QIAquick凝胶萃取工具包(试剂盒)和量化使用NEBNext超二世DNA库准备工具包CFX96系统上(内)(BioRad)。样品被测序的Illumina公司MiniSeq根据制造商的协议。
高通量DNA测序和Indel分析有针对性的扩增子测序读
分析Illumina公司进行了高温超导测序读出CRISPRessov2 (Komor et al ., 2016;克莱门特et al ., 2019)。具体来说,对于这些分析,fastq文件进行了分析通过分析了读取脚本运行在码头工人,对整个扩增子,与输出引导RNA和基本编辑器(——guide_seq和-base_editor_output)。产品分布CBE变异是由个人的分数•T, T G•C•读和除以之和。CRISPResso也用于验证编辑百分比和分析indel频率,indel读取的总数在哪里从indel直方图获得输出和表达为读与indel总读的分数。indel序列的分析,具体读构成>总数的4% indels CRISPResso的编译。
信使核糖核酸测序实验
信使核糖核酸测序实验,细胞转染48-well板块在150000细胞/安倍与7.10 F148A,安倍7.10 F148A E59A, BE4-W90Y-R126E, BE4-W90Y-R126E-E63A, BE4-W90Y-R126E-ΔUGI或BE4-W90Y-R126E-E63A-ΔUGI,连同质粒表达HEK2或新gRNA。样本在48 h post-transfection细胞溶解。gDNA和总RNA提取单独复制样品。基因组DNA提取如前所述。
RNA分离和净化
总RNA是孤立的通过Zymo RNA提取工具包(Zymo R1054),按照制造商的协议。细胞细胞溶解与300年µl RNA裂解缓冲之前添加300µl 100%乙醇。混合物是离心机Zymo-Spin IC列在16000 rcf 30年代。DNase治疗后与400年通过洗涤µl RNA清洗缓冲和处理5µl DNase 1(1µ/µl)和35µl DNA消化缓冲区在室温下15分钟。400年µl RNA预科缓冲区添加到列,离心机,洗2 x与RNA洗前缓冲收集50µl DNase / RNase-Free水。RNA是储存在−前20°C库的准备。
RNA-Sequencing
HEK293T细胞线,总RNA质量评估使用安捷伦Tapestation 4200,和与RNA样本完整数量(RIN)大于8.0用于生成RNA序列库使用TruSeq滞留信使RNA样本准备装备以TruSeq独特的双索引(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。样本处理制造商的指示后,从500 ng的RNA, RNA剪切修改时间5分钟。生成的库是由安捷伦Tapestation 4200年评估质量,完全和库被多路复用和测序100 (bp)配对终端读取(PE100)每个样本的深度约2500万读Illumina公司NovaSeq 6000。样本使用bcl2fastq demuxltiplexed v2.20转换软件(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。
RNA-Sequencing分析
使用Trimmomatic fastq所有文件被剪掉(https://github.com/usadellab/Trimmomatic使用Illumina公司PE适配器)。修剪读取与FastQC评估(https://github.com/s-andrews/FastQC),然后通过以下分析管道:成绩单pseudoalignment和量化了鲑鱼(https://github.com/COMBINE-lab/salmon)使用一个索引生成GENCODE版32转录组使用标准参数,减少读取对齐到一个智人基因组组装GRCh38 (hg38)使用明星(https://github.com/alexdobin/STAR)使用先前描述2-pass与默认参数的方法。鲑鱼输出导入使用tximport DESeq对象和微分表达式分析DESeq2使用标准参数。差异表达基因被称为FDR-corrected p (p-adj)≤0.01和褶皱变化> 2短裤,和结果可视化R。
基因集富集分析
中差异表达基因决定DESeq2输出排名[评分指标=罪(log2FoldChange) *−日志(p使用R值)和加工方案fgsea结合基因设置文件从MSigDB使用下载包msgdbr。额外的代码是写给选择DNA损伤修复基因的可视化。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
作者的贡献
CB导致调查研究项目的数据管理方法的发展,分析数据,撰写的手稿。AW导致研究项目的调查,分析数据,数据管理,和写作的手稿。简历导致调查的研究项目。CM导致分析数据和监督的工作。GY导致分析数据和监督的工作。正义与发展党导致概念化的研究项目,分析数据,监督工作,收购的资金。所有作者稿件的撰写和编辑。
资金
这项工作由NSF资助部分(奖# mcb - 2048207)和赞助与梁疗法研究协议(UCSD ID # 20192833),公司可能从研究结果中获益。简历欣然承认金融支持由福特基金会博士前的奖学金由美国科学院、工程和医学。
的利益冲突
正义与发展党属于SAB成对植物,是一种股权持有人成对植物和梁疗法,并接收从成对植物版税,梁疗法,通过专利授权的哈佛大学和Editas医学。GY联合创始人、董事会成员,SAB、股权持有人,和支付顾问Locana和Eclipse世界先导。GY是新加坡国立大学的客座教授。AK和GY的利益已经评审并批准加州大学圣地亚哥的符合其利益冲突的政策。
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.923718/full补充材料
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关键词:基因组编辑、DNA修复、基础编辑、细胞周期、基因组编辑和工程
引用:伯内特,黄,Vasquez CA,麦克休CA,杨GW和Komor AC(2022)检查细胞周期依赖性的胞嘧啶和嘌呤基础编辑。前面。基因组。4:923718。doi: 10.3389 / fgeed.2022.923718
收到:2022年4月19日;接受:2022年6月21日;
发表:2022年7月14日。
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