CRISPR-Cas9-Based技术研究肠病毒感染
俊基Hirano
北岛康介本人村上
Tsuyoshi Hayashi- 病毒学II、国家传染病研究所的,日本东京
肠病毒,包括许多启动肠道感染的病毒,被认为是重要的代理,引起人类疾病的广泛,根据病毒类型。主要通过粪口途径传播与几个向量等受污染的水或食物。由肠病毒感染,如诺瓦克病毒和轮状病毒,经常造成广泛的急性肠胃炎,导致重大的健康和经济负担,因此仍然是一个公共卫生问题。像其他病毒、肠道病毒“劫持”特定的宿主因素(所谓的pro-viral因素)在感染细胞的复制,而逃避宿主防御系统得罪宿主抗病毒因子。识别(s)这些因素需要更好地了解病毒复制和致病性的分子机制,将援助的发展有效的抗病毒策略。最近,基因编辑技术的进步,特别是定期聚集空间短回文重复(CRISPR) -Cas9系统,多次沉淀在病毒学领域的突破,包括肠病毒的研究。例如,无偏全基因组筛查采用CRISPR-Cas9系统已经成功找到了许多以前从未发现过的主机与临床相关的肠病毒感染的相关因素。在本文中,我们简要介绍CRISPR-Cas9系统的共同技术应用于病毒学研究的主要发现使用这个系统并讨论研究肠病毒感染。
介绍
急性胃肠炎(年龄)是一种疾病,症状包括呕吐、腹泻、胃痛和脱水,并经常引起的肠道感染致病性细菌、病毒或寄生虫(坟墓,2013;Banyai et al ., 2018;Santos-Ferreira et al ., 2021)。在这些代理,肠病毒,尤其是杯状病毒(例如,诺瓦克病毒和sapovirus),轮状病毒,astrovirus疾病和肠道腺病毒负责病毒年龄(主教和柯克伍德,2008年;Makimaa et al ., 2020)。此外,肠道病毒(EVs),通常表达他们在其他器官的毒性,经常腹泻粪便中发现,被认为是积极的与年龄有关。在健康个体通常self-resolving病毒性肠胃炎,而弱势群体,包括婴儿、老年人和免疫缺陷或免疫功能不全的人有慢性肠胃炎和严重的并发症的风险伴随着长期病毒脱落(Santos-Ferreira et al ., 2021)。尽管他们的临床相关性,只有少数疫苗(如轮状病毒疫苗)是可用的。此外,没有抗病毒药物预防或治疗病毒性肠胃炎已经发展到目前为止(Santos-Ferreira et al ., 2021)。
类似于其他病毒、肠道病毒依靠宿主感染细胞成功地繁殖。viral-host交互的描述必须获得一个清晰的视图的感染和复制机制,这将有助于发展host-directed药物对致病性病毒。全基因组遗传筛查是其中一个最强大的和快速的工具来发现新的见解病毒生命周期通过全面搜索主机与病毒感染相关的因素(Puschnik et al ., 2017;林et al ., 2021)。最近,一种新型的技术,称为定期聚集空间短回文重复(CRISPR) -Cas9系统突破了筛选方法。在本文中,我们介绍了CRISPR-Cas9系统的基础知识和常用技术,然后描述该系统有助于扩大肠病毒感染的知识。
CRISPR-Cas9系统的概述
CRISPR-Cas9系统最初是作为一种自适应免疫系统发现利用细菌和古生菌感染噬菌体和质粒(图1)(Ishino et al ., 2018;Ghorbani et al ., 2021)。该系统包括三个步骤:1)收购,2)表达式,和3)干扰,在Cas9核酸酶和两个短的RNA,叫做CRISPR-RNA (crRNA)和transactivating RNA (tracrRNA),分别作为剪刀和指导,协调功能。1)在收购步骤中,基因组DNA片段来自入侵噬菌体和质粒整合到细菌基因组的CRISPR位点作为一个新的“垫片”被重复序列。这个间隔序列,保护入侵者的基因组的一部分,作为免疫记忆。2)crRNA从相应的转录间隔CRISPR位点。tracrRNA和Cas9核酸酶,其他关键球员在这个宿主防御机制,也表达了CRISPR位点。crRNA和tracrRNA混合形式,所谓指导RNA (gRNA),通过结合互补的重复序列,形成一个与Cas9复杂。3)gRNA-Cas9复杂目标互补序列某外部势力的再次入侵病原体的基因组DNA,并导致建立一个双链断裂(双边带)RNA-guided基因组目标元素,导致其消除。Cas9-mediated解理发生只有当protospacer相邻主题(PAM)序列(例如,NGG酿脓链球菌Cas9)位于上游的目标核苷酸,它授予特定乳沟的异己分子DNA (Puschnik et al ., 2017;Ishino et al ., 2018;林et al ., 2021)。
图1。细菌CRISPR-Cas9系统。(一)CRISPR-Cas9系统作为宿主防御系统。当一个入侵者(例如,噬菌体)感染细菌细胞,spacer-sized来自入侵者的基因组dna整合到细菌基因组的CRISPR位点。在随后的感染,gRNA-Cas9复杂的识别和劈开某外部势力的目标基因序列再次入侵病原体并保护细菌免受致命的感染。(B)gRNA-Cas9复杂的结构(蛋白质数据银行在欧洲,5 f9r)被吸引1.8.6.0使用开源PyMOL分子图形系统版本。
在过去的十年里,这个CRISPR-Cas9系统已经成功地采用哺乳动物细胞,目前遍布的常用技术生成基因敲除哺乳动物细胞(丛et al ., 2013;Jinek et al ., 2013;马里et al ., 2013)。Cas9人类codon-optimized和熔核本地化信号直接核。表达式的修改Cas9 gRNA一起组成的合成crRNA和tracrRNA序列目标特定的基因(s),允许建立一个双边带RNA-guided哺乳动物细胞的基因序列。争端解决机构由nonhomologous随后修理结束加入(NHEJ)通路,这常常使转移目标基因的突变,从而导致翻译的截断或非功能性蛋白质,导致基因敲除。
CRISPR-Cas9系统已经转移到基因超表达作为CRISPR-catalytically死Cas (dca)激活系统(Brezgin et al ., 2019;Chong et al ., 2020)。dca可以绑定目标核苷酸gRNA引导,而无法创建双边带进DNA由于核酸酶的突变域(Brezgin et al ., 2019;Chong et al ., 2020)。在此系统中,dca是融合转录激活物,如单纯疱疹病毒VP16激活域(VP64)。dCas9-VP64-gRNA复杂激活RNA guided-promoter序列,从而上调哺乳动物细胞内源性基因的表达的兴趣,与异位超表达外国cDNA介绍。
CRISPR-Cas9作为病毒学研究的全基因组遗传筛查工具
无偏全基因组遗传筛查是一个黄金标准的方法,全面识别限制或促进病毒感染的宿主因素(Puschnik et al ., 2017;Chulanov et al ., 2021)。有两种类型的遗传屏幕,功能丧失和屏幕。屏幕功能丧失,是迄今为止进行的,基于瞬态(siRNA)或稳定的基因表达(成分)击倒,或完整的基因敲除,但只适用于单倍体和near-haploid细胞。相比之下,丧失屏幕采用CRISPR-Cas9使完整的基因敲除各种各样的细胞,从而提供一个强大的优势相比,RNAi核或成分)或haploid-based屏幕(Puschnik et al ., 2017;Chulanov et al ., 2021)。介绍功能筛选依赖于异位超表达的cDNA图书馆。sgRNA图书馆结合dca可以用于功能获得的屏幕,称为CRISPR激活屏幕,需要更少的努力比传统cDNA文库它需要大量的个体人类基因克隆到事先一个向量(Puschnik et al ., 2017;Chulanov et al ., 2021)。
一个全基因组的典型实验流CRISPR-Cas9屏幕所示图2。慢病毒携带一个全基因组的细胞转导CRISPR击倒或激活库每个基因敲除或激活公司,分别。各种类型的预制CRISPR sgRNA库旨在基因敲除或激活是商用。汇集诱变处理的细胞群被病毒感染细胞病变。随后,幸存的细胞,这将赋予抵抗病毒感染由于某些基因的敲除或超表达(s)是收获。sgRNA序列的浓缩(s)相比,存活细胞和未感染控制细胞全面使用新一代测序之后通过生物信息学分析发现基因与表型相关(s)变化。应该注意的是,并不是所有的病毒都能诱导细胞毒性敏感细胞。在这种情况下,流cytometry-based选择可以适用于筛选。细胞感染病毒,记者如绿色荧光蛋白(GFP)表达病毒和病毒基因在细胞表达高或低水平丰富了流式细胞术之后,下一代测序。另外,受感染的细胞可以与荧光标记病毒抗体染色,然后受到流cytometry-based选择。
图2。通用工作流全基因组CRISPR-Cas9屏幕。CRISPR-Cas9(一)或CRISPR-dCas系统(B)是用来进行功能丧失(一)或功能(B)屏幕上,分别。(C)慢病毒的细胞转导包含一个CRISPR淘汰赛sgRNA图书馆(一)或者一个激活sgRNA库(B),紧随其后的是病毒感染细胞病变。幸存的细胞将赋予抵抗致命的感染由于特定的基因敲除或收集超表达。sgRNA丰富的幸存细胞和未感染控制细胞是由下一代测序来缩小与表型相关的基因(s)的变化。或者,细胞是一个记者病毒感染(如GFP或mCherry)和细胞表达高或低水平的病毒基因排序使用流式细胞仪,紧随其后的是下一代测序。
用于筛选的细胞类型可以选择根据实验设计和/或可用资源(Puschnik et al ., 2017)。例如,淘汰赛屏幕使用细胞容易引起细胞病变的病毒,感染情况几乎所有病毒感染后细胞(> 99%)死亡,其次是幸存的细胞是有偏见的分析有利于识别pro-viral因子(s),包括进入受体(s)。使用相同的组病毒和细胞,但一个条件,大约一半的细胞与病毒感染死亡,赞成和抗病毒因子潜在目标。激活屏幕使用non-susceptible细胞随后分析病毒呈阳性的细胞身上最有可能导致识别pro-viral因子(s)。一般来说,pro-viral或抗病毒宿主因素,促进或限制病毒生命周期的任何阶段(条目,例如,病毒RNA复制,蛋白质翻译、组装、或病毒出口),可以确定在一个CRISPR-Cas9屏幕。pro-viral标识的潜在因素(s),目标包括病毒进入细胞受体病毒(例如,CD4人类免疫缺陷病毒)或其刺激器,而预期抗病毒因子(s)针对病毒条目包括宿主蛋白(s)绑定到抑制的病毒粒子进入细胞或病毒进入受体表达下调。
在下面几节中,我们总结重要的发现每个肠病毒感染有关,主要关注见解获得全基因组CRISPR-Cas9遗传屏幕。
诺瓦克病毒
诺瓦克病毒属于属诺瓦克病毒(家庭Caliciviridae)和包含一个积极意义,单链RNA基因组(Robilotti et al ., 2015;格拉夫et al ., 2016)。人类诺瓦克病毒(HuNoV)是一种高传染性病原体和急性胃肠炎的主要原因和食源性疾病在世界范围内,影响所有年龄组(Banyai et al ., 2018)。尽管HuNoV感染引起的胃肠炎是自限性的,几天到一周的时间在健康个体,免疫系统受损或削弱的人可能患上慢性肠胃炎由于持久HuNoV感染,可能会持续几周,几个月,甚至几年(绿色,2014;Santos-Ferreira et al ., 2021)。
尽管临床重要性的理解HuNoV生物学一直受限于缺乏一个在体外直到最近HuNoV培养系统。因此,小鼠诺瓦克病毒(MNV)属于同一属HuNoV,已经被用来作为替代病毒了解底层HuNoV感染的分子机制。MNV可以增长强劲RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞系细胞病变效应。使用这个MNV-culture系统,无偏全基因组CRISPR-Cas9淘汰赛屏幕成功识别CD300lf和CD300ld功能条目MNV受体(哈加et al ., 2016;果园et al ., 2016)。后来报道,人类CD300直接同源(CD300lf)不作为HuNoV受体的条目,表明HuNoV和MNV似乎对宿主细胞条目(使用不同的机制Graziano et al ., 2020)。
除了一个条目受体的识别,CRISPR-Cas9淘汰赛屏幕也有助于识别小说pro-MNV宿主因素;压力G3BP1颗粒组件,提高病毒VPg-dependent翻译(Hosmillo et al ., 2019)。此外,果园et al。进行了全基因组CRISPR激活使用海拉细胞表达CD300lf筛查,发现49基因限制MNV复制在人类细胞过表达(果园et al ., 2019)。这些包括已知的抗病毒基因(例如,mx₁和IFITM1),以及之前未与抗病毒活性的基因。一个这样的基因,发现TRIM7抑制MNV复制通过瞄准一个事后报关的步骤。目前还不清楚是否这些在HuNoV感染宿主因素也发挥了作用。
最近,连续几个HuNoV栽培系统开发(琼斯等人。,2014年;Ettayebi et al ., 2016;佐藤et al ., 2019;范Dycke et al ., 2019),其中一个是一个文化系统采用组织人类肠肠状的干细胞(麻疹)(Ettayebi et al ., 2016;Ettayebi et al ., 2021)。鉴于上述关于MNV生物学的进步,毫无疑问,CRISPR-Cas9系统也可以成为学习的好武器HuNoV感染。的确,使用这个系统,林et al .,最近开发了淘汰赛赶快行与先天免疫相关的基因(例如,STAT1或干扰素受体)通过CRISPR-Cas9系统,发现干扰素通路控制GII.3人类诺瓦克病毒感染麻疹(林et al ., 2020;林et al ., 2022)。HuNoV研究使用新创感染系统仍处于初级阶段,它是安全的假设许多宿主因素相关HuNoV感染仍有待确定。将值得调查之前确认是否赞成和anti-MNV因素,包括上面提到的,参与HuNoV感染。进一步候选人的方法(例如,pro -或anti-MNV因素)和无偏基因组宽屏幕利用CRISPR-Cas9系统应该高度鼓励关于进一步洞察HuNoV感染机制。
轮状病毒
轮状病毒属于属轮状病毒(家庭的一种)和非包膜RNA病毒的基因组包含11分段双链RNA。人类轮状病毒(HRV)主要感染5岁以下儿童,常常引起严重的肠胃炎和脱水(克劳福德et al ., 2017;Banyai et al ., 2018)。轮状病毒疫苗(其一®和Rotarix®)介绍了全球超过十年前,在预防rotavirus-related疾病表现出高功效。然而,HRV-associated肠胃炎仍然导致>每年200000人死亡,大部分是在低收入国家,可能是因为更少的轮状病毒疫苗和脱水疗法和疫苗的效力低于那些在高收入国家(Banyai et al ., 2018;Santos-Ferreira et al ., 2021)。
在体外viral-host相互作用的研究已经进行了主要使用动物轮状病毒(如猴轮状病毒),在改变了哺乳动物细胞系强劲增长,包括猴子细胞系(例如,MA104和州立)和人类肠道上皮细胞系(例如,Caco-2和HT-29)。先前的基因组核宽屏幕识别多个调节轮状病毒感染的宿主因素(Silva-Ayala et al ., 2013;绿色和Pelkmans 2016)。例如,endosomal排序所需的复杂交通复杂(ESCRT)已被确定为pro-rotavirus主机轮状病毒细胞因子参与条目(Silva-Ayala et al ., 2013)。最近,全基因组CRISPR-Cas9淘汰赛屏幕识别STAG2 cohesin复杂的一个组成部分,作为一个小说pro-rotavirus因子(丁et al ., 2018)。STAG2作者表明,损耗的基因呈现通过激活宿主细胞对病毒感染的宿主干扰素反应,由注册会计师/刺通路(丁et al ., 2018)。自从CRISPR-Cas9系统完全能够破坏目标基因,CRISPR-Cas9屏幕有可能揭示小说宿主因素调节病毒感染,甚至对于良好的病毒(es)。
肠病毒
肠道病毒(EVs)属于引起家人和一群高度多样化的积极意义,单链RNA病毒,包括许多人类病原体如脊髓灰质炎病毒,EV-A71, EV-D68和鼻病毒。电动汽车通过粪口传播或呼吸系统路线,导致各种各样的疾病,包括感冒、小儿麻痹症,一方面,手足口病(手足口病)流行胸膜痛,心肌炎,疱疹性咽峡炎、脑炎、急性弛缓性麻痹(AFP),这取决于病毒类型(范德林登et al ., 2015;卢戈Krogstad, 2016)。
CRISPR-Cas9屏幕造成了识别宿主因素调节EV感染。Diepet al。确定了肌动蛋白组氨酸甲基转移酶组域包含3 (SETD3)作为小说宿主因素控制多种肠道病毒,包括鼻病毒、EV-D68和EV-A71 (Diep et al ., 2019)。有趣的是,SETD3 2与病毒蛋白酶不管其蛋白酶活性,这些交互所需的病毒复制,这表明2蛋白酶有以前非法pro-viral角色与蛋白酶活动无关(Diep et al ., 2019)。此外,CRISPR-Cas9屏幕识别OLFML3支持通过抑制鼻病毒复制的干扰素反应和多宿主蛋白质(如MGAT5和COG1)所需EV-D68感染(金正日et al ., 2017;梅et al ., 2021)。
值得一提的是,CRISPR-Cas9工具也可以用来确定先前确定的精确作用细胞为病毒感染宿主因素。Acyl-coenzyme绑定域包含3 (ACBD3)蛋白最初报道与电动汽车3 A蛋白,新兵PI4KB成病毒复制细胞器的EV复制(Greninger et al ., 2012;Dorobantu et al ., 2014)。使用的siRNA可拆卸的方法,实质已经努力评估的角色ACBD3 PI4KB招聘和EV复制,但也有发表的研究之间的差异的结论。一项研究发现,ACBD3击倒抑制脊髓灰质炎病毒复制(Greninger et al ., 2012),而其他的研究发现无论是复制的电动汽车,包括脊髓灰质炎病毒、抑制和PI4KB招聘(Teoule et al ., 2013;Dorobantu et al ., 2014;Dorobantu et al ., 2015)。一个可能的解释之间的差异研究是不完整的和多样的可拆卸的效率ACBD3核。为了解决这个问题,Lyoo et al .,开发了一个ACBD3基因敲除细胞系使用CRISPR-Cas9系统,发现ACBD3淘汰赛抑制复制的临床相关的电动汽车,包括EV-A71、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、受损PI4KB招聘(Lyoo et al ., 2019)。这个结果意味着剩余数量的剩余ACBD3击倒后可能足以支持电动汽车复制。
冠状病毒
冠状病毒(x),这属于冠状病毒属Coronaviridae(家庭)的积极意义,不分RNA病毒拥有一个大型基因组(大约30 kb) (Fung和刘,2019年)。已报告总共七冠状病毒能够感染人类。其中,四个季节,相对低致病性病毒(人类CoV-NL63 (HCoV-NL63) HCoV-OC43, hcov - 229 e和HCoV-HKU1),而其他三个高致病性病毒(冠、MERS-CoV SARS-CoV-2)导致严重急性呼吸系统综合症。人们普遍认为呼吸道是人类x和复制的主要目标,造成轻度或中度(例如,发烧和咳嗽)严重的呼吸道症状(如肺支气管炎和肺炎)。有趣的是,感染所有七浸常常伴有胃肠道症状,如腹泻和呕吐,这意味着胃肠感染(罗et al ., 2020;Synowiec et al ., 2021)。ACE2,一个条目为HCoV-NL63受体,冠,SARS-CoV-2是人类肠道中高度表达。此外,最近的报告表明,SARS-CoV-2 COVID-19病人的肠道中检测(肖et al ., 2020),就能复制体外人类肠道培养细胞和肠道瀑样(拉默斯先生et al ., 2020;Synowiec et al ., 2021)。
根据正在进行的2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行,目前正在深入研究全球理解为host-directed药物SARS-CoV-2致病性和发现新的目标。CRISPR-Cas9技术已被广泛用于确定viral-host交互。事实上,据我们所知,利用全基因组研究成果CRISPR-Cas9淘汰赛屏幕已经发表的六个独立团体自COVID-19的出现(Baggen et al ., 2021;Daniloski et al ., 2021;施耐德et al ., 2021;王et al ., 2021;魏et al ., 2021;朱et al ., 2021)。正如预期的那样,ACE2, SARS-CoV-2受体条目,包括在大多数发表的筛选研究。通过这些屏幕,许多宿主基因相关SARS-CoV-2感染已确定。有趣的是,这些基因是pro-viral因素参与病毒进入,影响ACE2表达或本地化。HMGB1的损失减少ACE表达可能由于后生镇压ACE2的轨迹(魏et al ., 2021),而损耗RAB7A导致减少的细胞表面表达ACE2 (Daniloski et al ., 2021)。
此外,古戎et al .,进行双重全基因组CRISPR屏幕(淘汰赛和激活)使用人类肺上皮细胞行Calu-3和识别宿主因素调节SARS-CoV-2感染(古戎et al ., 2021)。应该注意的是,只有ACE2基因在基因敲除和激活屏幕和多个主机确定了他们之间没有重叠的基因,可能是因为不同的模式在缩小的基因表型的改变。这些结果表明,在两个方向上都执行筛选有利于推出的全谱宿主因素与病毒感染有关。
讨论
CRISPR-Cas9系统彻底改变了医学研究的发展。肠病毒研究而言,CRISPR-Cas9系统有助于扩大我们对病毒感染的分子机制的理解。特别是,CRISPR-Cas9淘汰赛/激活屏幕导致哺乳动物的基因组中发现了大量的功能主义针干草堆,包括CD300lf和CD300ld MNV受体(条目),STAG2 (pro-rotavirus因素),SETD3 (pro-EV因子2病毒蛋白酶相互作用),和HMGB1 RAB7A (pro-SASRS-CoV-2 ACE2表达影响因素或本地化)。
给定的准确性CRISPR-Cas9导致完成目标基因敲除,相比与不完全击倒,RNAi重新评估的RNAi使用CRISPR-Cas9基因敲除实验可能是必要的。特别是基因(s)的表型被认为由于发表的研究之间的差异。相比之下,这一特性CRISPR-Cas9系统不宜在调查某些基因(s),其功能是不可或缺的细胞生长和/或生存,因为很难建立细胞缺乏这样的基因。在这种情况下,廉价的技术,如基因RNAi核或成分)和CRISPR干扰(CRISPRi)系统,我们下面提到,对于研究非常有用的效果(s)病毒感染的重要基因。
除了CRISPR淘汰赛和激活方法,在本文我们介绍,其他各种应用工具是目前可用的(Brezgin et al ., 2019)。例如,dCas9融合转录阻遏物,如Kruppel-associated盒(带锁)领域,可用于CRISPRi沉默基因表达分析。dCas9也可以用于表观遗传研究融合一个后生的监管机构,如DNA甲基转移酶DNMT3A。CRISPR-Cas9系统现在是不可或缺的分子工具,和我们希望这部小说技术将进一步采用全球推进肠病毒的研究。
作者的贡献
JH TH研究的构思和写的手稿。公里批判性审查和纠正了手稿。所有作者批准了最终版本的手稿。
资金
这项工作是支持由SENSHIN医学研究基金会(JH和TH),日本社会科学促进KAKENHI格兰特JP20K07520 (TH),和日本医学研究和开发署(艾湄湾)赠款JP21fk0108149(公里和TH)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
我们感谢Kouichi北村博士阅读手稿和提供建议。我们还要感谢Raychel石头和Editage博士(www.editage.com编辑稿件。
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关键词:CRISPR-Cas9,基因组宽屏幕,宿主因素,诺瓦克病毒、轮状病毒、肠道病毒基因敲除
引用:村上春树Hirano J, K和Hayashi T (2022) CRISPR-Cas9-Based技术研究肠病毒感染。前面。基因组。4:888878。doi: 10.3389 / fgeed.2022.888878
收到:2022年3月3日;接受:2022年5月23日;
发表:2022年6月08年。
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