成像独特的DNA序列使用CRISPR-Cas9-Based单个细胞,分裂荧光素酶生物传感器
尼古拉斯·g·希斯
O h 'Geen
妮可·b·Halmai
雅各布·e .玉米3、4和
大卫·j·西格尔- 1基因组生物化学和分子医学中心和部门,加州大学戴维斯,戴维斯,CA,美国
- 2综合遗传学和基因组学,戴维斯的加州大学戴维斯,CA,美国
- 3创新的基因组学研究所,加州大学伯克利分校伯克利分校,美国
- 4生物学系、乙、瑞士苏黎世
若工具的一个广泛的阿森纳已经开发了基于集群定期中间短回文重复(CRISPR)平台,包括那些检测特定DNA序列在体外在活细胞。迄今为止,DNA成像方法传统上使用完整的荧光记者融合探测。这种“永远在线”探测器区分不绑定和游离探针之间不能敏感地检测单个细胞中独特的目标序列的拷贝。这里我们描述一个DNA生物传感器提供了一个敏感的读出这种low-copy DNA序列通过proximity-mediated优化重组的两个独立的碎片NanoLuc荧光素酶(NLuc),一个小,明亮发光的记者。应用这种“刺激”探测器在活细胞中,我们将演示应用程序不容易通过荧光记者调查,发现个人使用标准显微数字化内源性基因位点。这种方法可以使检测基因编辑期间体外编辑程序,应该是一个有用的平台,许多其他活细胞DNA生物传感。
介绍
基因编辑过程的一个关键瓶颈是能够识别和分离单个细胞所需的编辑在一个人口的细胞治疗。当前的方法通常需要耗费时间和劳动密集型的单细胞隔离后,同基因的人口扩张(Mathupala和斯隆,2009年;胡锦涛等人。,2016年;朱利亚诺et al ., 2019)和下游在体外分析的DNA序列(鲍尔et al ., 2015;Vouillot et al ., 2015;Sentmanat et al ., 2018;任et al ., 2019)扩大人口的一部分。细胞类型,具有转染效率低,编辑、单细胞隔离,或者人口膨胀可以使这些过程特别具有挑战性的(Bruenker 2006;塔姆et al ., 2016;Zhang et al ., 2017 a;李et al ., 2018;Modarai et al ., 2018)。此外,同源性定向修复(HDR)可以表现出极低的效率在某些细胞类型(刘et al ., 2019)。
一个有前途的替代策略验证基因编辑可以在单一的直接若用户定义的序列与单细胞决议副本。近年来,CRISPR / Cas基因编辑系统已经修改了成像内源性基因位点,但是目前绝大多数的方法利用完整的荧光记者调查,如dCas9-GFP (陈et al ., 2013;邓et al ., 2015;马et al ., 2015;Dreissig et al ., 2017;你们et al ., 2017;陈et al ., 2018;Zhang et al ., 2018;吴et al ., 2019)。然而,每个完整的记者传感器分子产生一个信号是否绑定到目标DNA,导致高荧光背景,负面影响signal-to-background比率(SBR)。出于这个原因,这种“永远在线”的传感器必须依靠获得高当地的浓度探测区分信号和背景,限制其使用高度重复的元素可以被一个sgRNA或有针对性的独特序列的目标20 - 30或更多sgRNAs (陈et al ., 2013;陈et al ., 2018)。成像短序列出席一个副本到目前为止不可能的。
然而,“刺激”DNA生物传感器提供了可能性,绑定后信号只能生产一个或者多个子单元目标序列。在这样一个系统可以发生光生产的发色团的激活能量转移另一个明亮的发色团激活或重新组装的记者。然而,最近的努力运用福斯特共振能量转移(FRET) DNA感(Didenko 2001;Boutorine et al ., 2013;Dahan et al ., 2013;吴et al ., 2018;毛et al ., 2019)仍然需要超过三个独特的sgRNAs,而记者分裂DNA或RNA若被描述主要是由以前的研究在体外(污渍et al ., 2005;Ghosh et al ., 2006;Ooi认为et al ., 2006;Zhang et al ., 2017 b;周et al ., 2021),几项研究描述使用转录activator-like效应器(故事)DNA结合域和分裂DNA若在活细胞荧光蛋白(胡锦涛等人。,2017年;胡锦涛等人。,2019年)。
除了更高的背景从游离探针,荧光技术若被问题困扰光毒性、光漂白以及自然高细胞auto-fluorescent背景(白菜et al ., 2003;贝赫那et al ., 2005;东et al ., 2016SBR),所有的负面影响。来抵消这些负面影响若SBR和增加的敏感性的基础理化目标,发光记者可以提供一个有吸引力的替代若实验。细胞荧光背景信号本质上是不存在由于产生光催化反应的一种酶的底物,而不是从外生事件激发光(东et al ., 2016)。虽然发光记者低背景的优势,荧光记者历史的优势之一是,他们仍然比可用发光记者(大厅et al ., 2012)。然而,一个相对较新的荧光素酶,NanoLuc (NLuc;Promega公司,麦迪逊,WI信号强度)桥梁这一差距。NLuc提供了几个优势萤火虫(美国人)和Renilla (RLuc)荧光素酶包括增强稳定性,小得多的大小和> 150倍增强发光输出(大厅et al ., 2012;英格兰et al ., 2016)。
furimazine,此外,基质为NLuc更加稳定和展览背景活动水平下降比RLuc衬底,coelenterazine (大厅et al ., 2012;英格兰et al ., 2016)。
我们开发了一个分裂的荧光素酶DNA生物传感器基于NanoLuc二进制技术(NanoBiT;Promega公司,麦迪逊,WI)互补记者系统为NLuc创建(迪克森et al ., 2016)和催化地活动Cas9 (dCas9)酿脓链球菌。由于高电离常数(KD= 190μM)和极低的催化活性NanoBiT互补记者系统subunits-termed LgBiT和SmBiT-they必须带进近长篇NLuc为了重新组装起来。因此,我们的方法是直接两个dCas9-sgRNA-NanoBiT复合物两个目标DNA网站与特定DNA取向和间距。最初,我们实现了信号增加生活最多8倍的数量与目标DNA生物传感器和各种细胞转染支架相比,人口转染DNA生物传感器,但没有目标。随后,我们测试了生物传感器的敏感性在特定的内源基因的DNA序列在多个细胞系相比,这种方法的signal-to-background常见荧光技术方法。最后,我们能够检测单一副本与单细胞基因组编辑由CRISPR-Cas9决议通过不同的信号强度的差异之间的纯合突变体和野生型细胞。
材料和方法
建设定向dCas9-NanoBiT dCas9-NanoLuc融合蛋白
的定向包含LgBiT融合结构和SmBiT NLuc (Promega公司)融合催化地活动Cas9 (D10A和H840A双突变体)使用吉布森组装方法生成(新英格兰生物学实验室)。我们使用一种改进的版本的pCDNA3-dCas9包含两个核定位信号,一个氨基3×标记抗原决定基标记和[(gg)5灵活的链接器序列和和两个独立的多个克隆站点的N - c终端dCas9(矢量地图所示S1补充方法)。LgBiT和SmBiT每个克隆到N - c终端dCas9使用两个独立的多个克隆网站的修改pCDNA3-dCas9向量(S1补充方法序列)。一夜之间N -和C -末端的双重限制消化组侧翼限制性位点(XbaI KpnI)和(NheI NotI)产生必要的后续向量骨干吉布森组装。LgBiT和SmBiT插入命令gBlocks基因片段(集成DNA技术)包含大约45 bp同源序列与doubly-digested dCas9向量上游和下游的两个网站。积极控制NLuc-dCas9融合构造创建使用重叠延伸PCR LgBiT-dCas9和SmBiT-dCas9 gBlocks定向接头序列其次是吉布森的组装方法再次使用氨基双消化dCas9向量。四个dCas9-NanoBiT结构组装,dCas9-NLuc构造,pGL4.53 (luc2 / PGK)萤火虫荧光素酶向量(Promega公司)分别转换成5股alpha主管大肠杆菌(新英格兰生物学实验室)使用标准的化学转换过程与热休克42°C和转换大肠杆菌镀在磅板块含有氨苄青霉素的最终浓度100μg /毫升。18-h孵化后在37°C, MiniPreps(试剂盒)创建的一个子集,布置得井然有序。大殖民地的所选子集筛选重组载体和插入使用PCR诊断限制消化和殖民地。阳性克隆的四个NanoBiT插入、全NanoLuc插入,luc2插入使用两种方法随后被测序确认准确的序列。
建设sgRNA表达质粒
sgRNA表达向量骨干来自Addgene (Addgene # 41824)和线性化使用限制与AflII消化。两个19-bp sgRNA目标在几个基因组序列普遍但不存在在人类基因组中选择使用CRISPRscan和UCSC基因组浏览器(S2补充方法序列)。每个sgRNA序列被纳入两个60 mer含有同源序列的寡核苷酸sgRNA表达载体为后续吉布森组装。寡核苷酸退火和扩展后,PCR-purified (PCR净化设备;试剂盒)100 bp dsDNA插入AflII线性化sgRNA表达载体使用吉布森组装。
建设sgRNA目标站点向量支架
包含两个支架sgRNA目标序列串联,倒置,翻转方向都使用两个单独的创建计划。第一个计划包括一系列重叠延伸PCR ssDNA寡核苷酸(集成DNA技术)其次是PCR净化使用MinElute PCR净化设备(试剂盒)。由此产生的目标序列脚手架寡核苷酸接受了最后一个放大2×GoTaq绿色主人混合(Promega公司)创建poly-dT尾巴和克隆到PCR4TOPO向量使用威尼斯平底渔船TA对测序克隆工具(表达载体)。第二个计划包括一系列的有针对性的钝端双重限制消化在克隆支架从第一个计划,PCR-purification(删除寡核苷酸<∼70个基点)再次使用PCR MinElute净化设备(试剂盒),并使用多余的T4 re-ligation DNA连接酶(新英格兰生物学实验室)。看到S3补充方法对序列。
Plasmid-Based DNA生物传感器测试活HEK 293 t细胞
HEK 293 t细胞最初从写明ATCC购买和维护在杜尔贝科修改鹰介质(生命技术)与10%的边后卫和补充1 x青霉素和链霉素在37°C下5%的股份有限公司2。在第一个实验中,试图确定最优摩尔转染LgBiT SmBiT融合结构,比25000年低通道HEK 293 t细胞被播种在96孔白色opaque-side微型板块(热费希尔科学)转染前大约20 h。这些细胞被暂时性的总DNA转染100 ng /使用Lipofectamine 3000瞬时转染协议(表达载体)。每个好与16.67 ng / co-transfected好每个dCas9-NanoBiT融合表达质粒构建,16.67 ng /的质粒表达每个两个sgRNAs, 16.67 ng /包含目标序列的质粒,和16.67 ng / pMAX-GFP质粒。用这些方法,细胞通常是转染效率约90 - 95%。我们测试了各种LgBiT: SmBiT摩尔转染率与构造被转染超过16.67 ng /好,小构造被特定数量减少形成所需的摩尔转染率。33 LgBiT + SmBiT井相隔转染串联PAMs 10个基点的目标序列的脚手架和33 LgBiT + SmBiT井相同DNA转染但没有任何目标。井没有达到100 ng总DNA, pUC19向量转染弥补差额。在这个实验中,测量24小时post-transfection信号。在我们的下一个实验中,几个摩尔过剩的sgRNA dCas9-NanoBiT融合结构(1:1,1.2:1,2:1,5:1,20:1)被送到细胞使用相同的方法如上所述,保持sgRNA的摩尔量不变但dCas9-NanoBiT融合蛋白的摩尔量减少。 We then held the 20-fold molar excess sgRNA parameter constant and progressively decreased the amount of target DNA transfected, making up the difference with pGL4.53 (luc2/PGK) Firefly luciferase vector (Promega Corporation), essentially random DNA with no binding sites with >5 bp homology with the protospacer of either sgRNA. All fluorescent signals were measured on the SpectraMax M5 Microplate Reader (Molecular Devices) with high PMT sensitivity setting and 100 reads/well before taking any luminescent readings. After adding 25 μL furimazine substrate (Promega Corporation) reconstituted at a 1:19 volumetric ratio with Nano-Glo LCS Dilution Buffer (Promega Corporation) according to the Nano-Glo Live Cell Assay System protocol to each well, luminescent signals were measured on the SpectraMax M5 Microplate Reader with 1 s integration and high PMT sensitivity setting. The ideal delivery parameters were used with the same Lipofectamine 3000 transfection protocol for comparing all orientations of PAM orientation, spacer length, and dCas9-NanoBiT fusion construct pairing.
荧光显微镜和图像处理
转染实验设置显微镜会话是标相同设置会话除了惰性pUC19质粒被添加到混合转染质粒的数量占了通过消除背景目标DNA和sgRNAs转染条件。此外,一个汽车工业协会背景条件没有目标DNA(鼠标细胞系转染与sgRNA轨迹1)是包括在测量非重复性的地区MUC4基因内区1除了没有sgRNA背景条件如轨迹1 sgRNA没有匹配在老鼠的基因组有100%的同源性。用这些方法,细胞通常是转染效率约90 - 95%。在这些实验中,低HEK 293 t,海拉,MCF7, HCT116、K562,和JLat细胞被镀在SensoPlate 24 F-Bottom,玻璃底黑色微型板块(他一一Bio-One)。下一个,而不是成像整个贴壁细胞的数量,我们分裂细胞1.5×10 (任et al ., 2019)细胞/毫升,把图像Superfrost +细胞悬浊液的显微镜载玻片(费舍尔科学)溢价盖玻片(费舍尔科学)结合1:1体积比与重组furimazine衬底(Promega公司)。试剂furimazine Nano-Glo活的细胞是无毒、nonlytic当送到活细胞。一个优化NLuc成像协议是用于开发的徕卡DM6000 B全自动立式显微镜配备徕卡DFC9000 GT sCMOS相机和Exfo X-Cite 120荧光照明系统中,细胞被放置在一个黑盒与所有光源屏蔽和灯强度被设置为0,曝光时间设置为30年代,sCMOS增益设置为2.0。从pMAX-GFP转染GFP信号产生成像使用一个曝光时间150毫秒和sCMOS增益为1.0。
后处理应用更好的可视化图像。生16位灰度GFP图像上色使用“绿色”查找表(附近地区),亮度增加了50%,对比在斐济下降了50%。生16位灰度NLuc图像上色用“红”附近地区,显示领域的最高强度一样白色的平均强度和较低的地区或不同深浅的红色。然后,亮度增加到100%,对比度下降了大约50%。随后,减去背景函数应用在斐济(图片J)半径为5.0和“创建背景(不减)”选项用于减少散射背景和工件的成像过程。合并GFP和NLuc图像,我们直接合并颜色通道在斐济(图片J)。
定量然后进行原始未经处理的图像。WEKA分割包(Arganda-Carreras et al ., 2017)在斐济(J)被用于部分细胞使用50 ROI的痕迹核NLuc信号和50 ROI的痕迹背景以外的细胞作为核的训练数据集的边界。这个训练WEKA分割模型被应用于每个NLuc映像来确定核的边界。每8位分割图像的输出使用auto-threshold WEKA模型的关键功能,并分析颗粒函数用于创建为每个核区域roi。这些roi被叠加在原始未经处理的图像。然后,平均强度(相当于每个核的积分强度除以面积每个核)经过30年代的总光收集计算和记录每个分段核区域使用ImageJ(斐济)。任何细胞,GFP阳性信号但NLuc负面信号是省略了最后的统计分析。
统计测试
双尾signal-to-background分析学生的t Microsoft Excel 2016中进行。双向方差分析及两两图基HSD事后测试进行了R(版本4.0.3)在组合信号从最初在活细胞若实验。统计所示box-and-whisker情节都计算在R(4.0.3版)。
结果
建设和优化DNA序列分割荧光素酶生物传感器
设计一个活细胞DNA序列生物传感器,我们融合两个独立优化蛋白质片段NLuc-LgBiT和SmBiT-to Cas9从催化地无所作为链球菌(dCas9) (图1一个)。我们建造五融合蛋白质体:两个LgBiT和SmBiT被融合的羧基端dCas9 (dCas9-LgBiT和dCas9-SmBiT),两个在他们融合其氨基酸(LgBiT-dCas9和SmBiT-dCas9)和一个长篇NLuc融合dCas9的氨基酸(NLuc-dCas9) (图1 c;S1补充方法)。目标站点,我们生产的33个质粒DNA目标站点的每个窝藏一份包含两个支架SpCas9 sgRNA目标网站在三个方向与1-50碱基对(bp)它们之间的间隔序列串联,倒和翻转方向(图1 b;S2补充方法)。被选出的两个sgRNAs没有同源性在人类基因组和最小的非目标(S3补充方法)。这种生物传感器,以确定最优条件不同的摩尔比率dCas9——sgRNA-expressing质粒和不同的摩尔量的目标暂时DNA质粒转染到HEK 293 t细胞一系列post-transfection孵化倍(图1 d)。一个普通记者转染效率,pMAX-GFP co-transfected在所有条件。Signal-to-background达到顶峰时,我们使用的比例10:1 LgBiT-dCas9 dCas9-SmBiT融合蛋白,sgRNA 20:1比率:总NanoBiT质粒,转染和信号之间的24小时孵化时间测量(补充图S1)。此外,我们发现很少依赖signal-to-background的摩尔量的目标DNA转染(补充图S1)。假设融合蛋白DNA取向和目标取向可能会对输出信号产生协同效应,我们进行了双向方差分析假设这两个变量之间有一个互动。显著变化的效率NLuc观察重组的条件(图1 e),融合蛋白定位和目标取向与DNA显著差异在发光信号输出(p< 0.0001和p分别为< 0.05,双向方差分析,补充表S1)。信号输出和融合蛋白取向之间的关系也取决于目标DNA取向,反之亦然(F (96、264) = 2.064,p< 0.0001、双向方差分析、补充表S1)表明这些结果影响DNA融合蛋白之间的相互作用和目标取向。此外,LgBiT-dCas9 + dCas9-SmBiT蛋白质配置产生最高的一组发光信号(p< 0.0001三两两比较,图基HSD,补充表S2)。
图1。将荧光素酶DNA生物传感器的设计和特性。(一)漫画描述的顺序相依NanoLuc荧光素酶的重新组装。(B)目标站点的设计原理与PAM站点(并联在同一链),反向相反(面向PAMs内链)和翻转(面向PAMs在相反的方向上向外)。(C)卡通代表dCas9-NanoBiT和全身dCas9-NanoLuc融合结构。(D)描述实验过程初始luminometer-based co-transfected质粒DNA若化验标签。(E)热图显示发光信号强度的变化之间的四种可能的方向dCas9-NanoBiT融合蛋白在33 DNA目标站点间距和方向。顺序尺度范围从最低的信号(红色)的最高信号集合(白色)。
住单细胞成像的重复性和独特的内源性基因序列
优化后交货条件为我们的DNA序列在活细胞中生物传感器使用光度计测量发光在整个细胞群,我们试图调查的可行性检测发光在单个细胞相对常见的成像设备。为此,我们修改一个正直的荧光显微镜捕捉到的光强度相对较低NLuc和其他发光记者。细胞被放置在一个黑盒与所有光源屏蔽和曝光时间延长。来决定我们将荧光素酶生物传感器的适用性成像内生的DNA序列,我们首先比较其灵敏度的一个前所述dCas9-EGFP荧光探针(陈et al ., 2013从我们的研究)和NLuc-dCas9探针。我们使用一个优化sgRNA, sgMUC4-E3 (F + E) (陈et al ., 2013)直接这些探针结合区域的多态48-bp重复拷贝数外显子2内大约有100至400人MUC4轨迹(图2一个)。我们发现两个完整的记者调查类似的信号时绑定的串联重复序列相比,背景条件没有sgRNA HEK 293 t和海拉细胞(补充图S2)。然后我们使用sgMUC4-E3 (F + E)作为一个锚sgRNA和构造四个sgRNAs周围独特的间隔长度和方向指导我们将荧光素酶探针来绑定相同的重复区域MUC4在HEK 293 t细胞(S4补充方法目标序列和施工方法)。随后,我们比较的信号两两组合的四个独特的sgRNAs和sgMUC4 (F + E)相同的信号没有gRNA HEK 293 t细胞转染。我们观察到的变量的敏感性MUC4基于摩尔的串联重复序列探针转染和目标站点配置(图2中)。整体gRNA-directed信号更大更高浓度的调查,但伴随更大的背景信号在细胞缺乏gRNA。然而,我们发现signal-to-background大大提高大约5.5 7倍减少探测器的数量从10到1 fmol交付。评估诊断的探针来检测真正积极的单一重复的基因位点,我们使用接受者操作特征(ROC)分析。我们发现,敏感性和特异性的探针在转染的低浓度,增加从0.89∼∼∼0.82到1.0和0.94,分别。(图2中)。
图2。若重复人类基因组序列MUC4轨迹(一)卡通可视化的重复区域内的外显子2人MUC4轨迹显示sgRNA设计策略使用绑定网站sgMUC4-E3 (F + E)为一个锚点。(B)所有活细胞DNA描述实验过程若使用显微镜进行化验,标签所有co-transfected质粒。(C)融合GFP荧光(绿色)和NLuc发光(红色)在徕卡DM6000B直立显微镜拍摄的图像放大10×描绘dCas9-NanoBiT若重复区域的MUC4外显子2生活HEK 293 t细胞使用两个不同数量的dCas9-NanoBiT质粒的转染(10 1 fmol)。酒吧= 50μM规模。(D)个人GFP荧光(绿色),NLuc发光(红色),和合并在徕卡DM6000B直立显微镜拍摄的图像放大10×描绘dCas9-NanoBiT若使用sgRNA 1搭配sgMUC4E3 (F + E)的重复区域MUC4外显子2相比不sgRNA控制使用两个不同数量的dCas9-NanoBiT质粒转染(10 1 fmol)。酒吧= 50μM规模。(E)信号量化的图像分割荧光素酶探针绑定的重复区域MUC4外显子2活HEK 293 t细胞。明显signal-to-background比率上面括号中列出每个若条件。5 <n< 61,n表示独特的细胞数量化;未配对的双面学生′s t检验,*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。框显示中位数和四分位范围(差)和胡须显示分散从IQR等于1的较小圣或3理查德·道金斯四分位+ 1.5 xiqr或的距离1圣或3理查德·道金斯四分位数的最小值或最大值点,分别。接受者操作特征(ROC)曲线代表若结果使用sgRNA 4搭配sgMUC4E3 (F + E) 10点和1 fmol转染的重复区域内MUC4在HEK 293 t。假阳性测定信号由于汽车组装(没有sgRNA)。区分真阳性和假阳性信号阈值最大化Youden J的统计(敏感性+特异性- 1)显示为一个点在ROC曲线上相应的特异性和灵敏度值在括号中。
因为大多数的人类基因组内基因座非重复性的,更重要的应用程序将这样的潜在检测低拷贝数,独特的基因组序列。为此,我们针对非重复性的内含子区域1的人类MUC4轨迹与1 - 3双独特sgRNAs花砖沿着轨迹之间至少有200个基点对避免探头组件之间的相互作用在不同的绑定网站(图3一;补充图S3,S4补充方法目标序列和施工方法)。我们观察到强大的特定类型细胞生物传感器灵敏度的差异基于探针转染的数量(图3 b;补充数据S3-S5 S8)。具体来说,signal-to-background在海拉细胞达到大约1.3倍使用单一一双sgRNAs和10在转染fmol调查,但在转染fmol调查0.1 7倍使用。此外,评估诊断的探针来检测真正积极的存在一个非重复性的基因位点,我们使用接受者操作特征(ROC)分析。我们发现曲线下的面积(AUC)是0.608 10 fmol调查海拉细胞转染,而AUC增加到0.992 1 fmol转染时(图3 c)。同样,使用单一sgRNAs和10 fmol探针MCF7细胞,signal-to-background达到4.5倍,但是增加到7.6倍减少数量的探针fmol转染到0.1。而AUC是0.877 10 fmol MCF7细胞转染,AUC增加到0.983 1 fmol转染时(图3 d)。10点fmol探针转染HCT116、K562, 293 t,和Jlat细胞,AUC为0.622,0.734,0.841,和0.856,分别为(补充图S3C)。
图3。若非重复性的人类基因组序列MUC4轨迹(一)卡通可视化的非重复性的地区内基因内区1人MUC4显示sgRNA设计策略。(B)合并后的荧光(绿色)和发光(红色)在徕卡DM6000B直立显微镜拍摄的图像放大10×描绘dCas9-NanoBiT若在非重复性的一个轨迹MUC4基因内区1 MCF7和海拉细胞生活。酒吧= 50μM规模。(C)拍摄的图像的信号量化dCas9-NanoBiT探针绑定几个位点的组合的非重复性的地区MUC4基因内区1在海拉细胞10 fmol探针转染(左)和探测器的图像绑定到一个非重复性的轨迹MUC4基因内区1 1和0.1 fmol探针在海拉细胞转染(右)。明显signal-to-background比率(没有sgRNA =背景条件)括号中列出。32 <n< 150年海拉细胞10 fmol和28 <n< 100两个低浓度,为海拉细胞n表示独特的细胞数量化;未配对的双面学生′年代t以及,*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。接受者操作特征(ROC)曲线代表若结果MUC410点轨迹1 fmol(左)和1 fmol(右)探测器在海拉细胞转染。(D)拍摄的图像的信号量化dCas9-NanoBiT探针绑定几个位点的组合的非重复性的地区MUC4MCF7细胞基因内区1(左)和探测器的图像绑定到一个非重复性的轨迹MUC4基因内区1两个低浓度MCF7细胞(右)。明显signal-to-background比率括号中列出。19日<n< 159 MCF7细胞10 fmol和32 <n< 106 MCF7细胞的两个低浓度,在哪里n表示独特的细胞数量化;未配对的双面学生′年代t以及,*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。接受者操作特征(ROC)曲线代表若结果MUC4轨迹1 10 fmol fmol(左)和1(右)探针MCF7细胞转染。框显示值和差和胡须显示分散差。
住单细胞生物传感器成像单碱基变化引起CRISPR-Cas9编辑
最相关的申请我们将荧光素酶生物传感器是各种突变的检测基因组DNA序列与CRISPR-Cas9目标基因组编辑后。因此,我们创建了G > T错义单核苷酸多态性(snp)在两个不同的位点在两个细胞系:在8抓起multi-cancer风险位点HCT116细胞和内PALB2轨迹HEK 293细胞(图4一)。snp都呈现在PAM sgRNA用于编辑的网站(考金斯et al ., 2017)(S5补充方法)。在先前的研究中,突变体被证实为G > T突变纯合子稀释镀后通过检测特定的等位基因Kompetitive Allele-Specific PCR (KASP)扩大人群(考金斯et al ., 2017)。我们假设这些突变应该完全由sgRNA抑制绑定用于编辑、制作发光在突变细胞克隆低于野生型内发光细胞克隆转染的探测器组件。调查这一假设,我们转染野生型和纯合突变克隆细胞株与dCas9-NanoBiT探测器携带sgRNA用于编辑连同4 - 5 sgRNAs侧翼在不同的方向在不同的距离。我们观察到降低发光在克隆克隆突变体与野生型相比0.1 fmol探测器送到细胞(图4 b, C;补充数据S6, S7)。
图4。若CRISPR-Cas-induced基因组编辑在活细胞。(一)卡通可视化CRISPR-Cas编辑实验的人类8抓起poly-cancer轨迹和风险PALB2。sgRNAs用于编辑有蓝色PAM网站而sgRNAs突变体的突变的用于检测细胞若实验红PAM网站。单一碱基对编辑以粗体显示。(B)合并后的荧光(绿色)和发光(红色)在徕卡DM6000B直立显微镜拍摄的图像10×dCas9-NanoBiT探针应用于放大PALB2轨迹在野生型和证实细胞突变纯合子后目标CRISPRCas9基因组编辑。酒吧= 50μM规模。(C)合并在徕卡DM6000B直立显微镜拍摄的图像放大10×dCas9-NanoBiT探针应用于8抓起poly-cancer风险位点野生型和确认后纯合突变细胞靶向CRISPR-Cas9基因组编辑。酒吧= 50μM规模。(D)上述图像信号量化以及其他几个sgRNA对。明显signal-to-background比率(突变细胞信号=背景)在括号中列出。数据提出了框显示中位数和四分位范围(差)和胡须显示分散的差等于1圣或3理查德·道金斯四分位数- / + 1.5 xiqr或1的距离圣或3理查德·道金斯四分位数的最小值或最大值点,分别。26日<n20 < < 55 293野生型,n< 84 293突变体,51 <n< 102年HCT116野生型,和32 <n< 86年HCT116突变体,n表示独特的细胞数量化;未配对的双面学生′s t检验,*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001;* * * *p< 0.0001。接受者操作特征(ROC)曲线代表若在CRISPR-Cas编辑线所示结果。293个细胞,中华民国代表sgRNA一对gMis1-g3和0.1 fmol探针交付HCT116细胞,中华民国代表sgRNA一对g259-g248和0.1 fmol探针。假阳性测定纯合突变体中使用信号。
具体来说,发光HEK 293野生型克隆是大约2.8高-11.5倍在所有五个sgRNA成对测试PALB2相比HEK 293突变克隆(图4 d)。同样,在HCT116、发光的野生型克隆是大约1.2高-9.8倍在所有四个sgRNA对测试8抓起poly-cancer风险位点突变克隆相比(图4 d)。
讨论
传统上,荧光signal-to-background分析包括专业共焦荧光显微镜,可以解决的焦点和比较这些信号在高分辨率的背景核浆。我们设想一个发光的测量平台单一细胞相对常见的成像设备通常面向荧光。我们的希望是,这可能减少对昂贵的需要,专门为发光成像设备和最终服务来降低这一技术的门槛。与传统荧光成像DNA探针,这种技术的成像分辨率不足以持续区分明亮的焦点和更大的区域内的信号积累核浆。然而,一系列的信号强度在许多细胞核核区域是可见的。有可能白信号区域表示原子核内的近似位置探测器和剩余的信号积累区域代表自由浮动,补充NanoLuc。此外,我们没有sgRNA背景条件代表信号造成补充NLuc不绑定到给定的DNA转染条件。因此,我们期望我们的SBR度量的差异主要是由于总补充NanoLuc -自由浮动补充NanoLuc和大部分的信号在目标条件下应该通过明亮的发光焦点产生的DNA。
当优化交货条件,我们发现使用20倍摩尔过剩sgRNA相比,转染质粒dCas9-NanoBiT质粒导致增加signal-to-background比率比其他测试。这一结果部分可以解释为短核细胞rna的一生相比,细胞DNA和蛋白质(Schwanhausser et al ., 2011)。由于RNA分子降解速度远远超过他们的DNA和蛋白质相比,瞬态质粒transfection-based交付的生物传感器可能需要更高的初始数量的DNA模板sgRNA稳态细胞的转录水平。这些因素也可以解释我们的理想孵化时间测量发光post-transfection 24 h。质粒转录,信使rna降解,与信使核糖核酸的翻译显示精致的时序控制细胞(Schwanhausser et al ., 2011)和一个24小时孵化时间可能导致相当稳定水平的dCas9-NanoBiT融合蛋白和可用sgRNAs,允许高sgRNA-fusion协会和DNA结合蛋白质在细胞。
在所有情况下,< 10 fmol探针质粒传递给细胞,我们观察到不同目标条件和背景条件重复和非重复性的地区MUC4统计学意义(p< 0.01和p分别为< 0.0001,未配对的学生的学习任务,双尾)。这些显著差异在信号强度显示NLuc重新组装是发生在目标细胞细胞核的绑定这些地区的调查MUC4轨迹。此外,ROC分析显示我们的调查是一个很好的鉴别器的真和假阳性检测内源性转染在低浓度时的事件MUC4曲线下的面积高重复性和非重复性的序列。因此,我们将荧光素酶探针可以检测低拷贝数序列具有高敏感性和特异性和最优信号截止点可以选择使用统计数据如Youden J最大化这些参数。然而,鉴于变量signal-to-background比率在6个细胞系测试,这个探针特异性适度的性能。许多因素可能会改变在某种程度上在不同的细胞系,转染效率,包括sgRNA融合蛋白衰减率,吸收效率的发光底物,或产生信号的衰减率。另外,我们观察到一个相对高度的变化在每个转染条件。额外的探针的设计和优化方法在未来的研究中,如微调链接器组成和长度和探索替代瞬时转染,可以减少可变性,互补提高效率,改善这种方法的实用程序。给定的基因组拷贝数的轨迹也不同细胞系,与高拷贝数可能导致更健壮的信号输出。
此外,我们设想,我们可以运用我们的探测器隔离从人口genome-edited细胞突变细胞通过检测单核苷酸多态性引起的编辑实验在两个基因位点HEK 293和HCT116细胞。我们发现,发光信号高跨多个网站受sgRNA对周围的原始Cas9削减网站相比,野生型HEK 293和HCT116细胞HEK 293和HCT116突变纯合子细胞。这有效地证明区分绑定两个和零目标序列的副本,HEK 293细胞有两份染色体16和HCT116细胞有两套染色体8一般没有异常报告(Roschke et al ., 2002;林et al ., 2014)。我们假设突变PAM网站在Cas9细胞系都将创建一个条件将无法识别最初的目标站点(江和Doudna, 2017)。所有sgRNA对产生更高的信号在野生型相比,突变细胞表明我们将荧光素酶探针可以检测很小在单个细胞基因组的差异,包括差异SNP拷贝数。对突变细胞会发光期望比野生型突变体可以更容易地孤立在实践中,指导RNA探针的设计可以改变。此外,ROC分析数据显示我们的调查是一个很好的鉴别器的真和假阳性SNP检测具有较高的编辑曲线下的面积PALB2和8个抓起。因此,我们的调查也可以检测单核苷酸多态性高的敏感性和特异性。然而,值得注意的是,不匹配在PAM网站不太宽容比sgRNA杂交地区内绑定。snp protospacer地区发生应该评估他们的影响探针的特异性。筛选编辑从野生型细胞细胞内细胞群编辑,也许最相关的指标的最低分数是编辑细胞要求为了使一个积极的筛选电话。这也等于1减去正确地识别一个积极的概率克隆突变的细胞群或1-sensitivity内。293年编辑的细胞,因为我们观察到0.91∼的敏感性在一个人口同基因的突变,我们需要屏幕至少9%的细胞在这个人口来检测一个真正积极的突变克隆。以来HCT116编辑细胞,同样,我们观察到0.88∼的敏感性,我们需要屏幕至少12%的细胞内人口找到一个如此积极的突变克隆。在实践中,细胞的最低分数要求从一个编辑的筛选细胞群会高得多,因为这人口是该和杂合子的混合物和突变体比野生型克隆将取决于编辑效率。
在实践中,信号检测与这个调查有可能被用作前兆手动单细胞基因编辑后隔离,从而允许用户编辑的基因技术来节省宝贵的时间和资源在单细胞克隆过程中。当我们把在高密度和replate细胞转染的低密度成像,这对下一步技术奠定了基础,这将是孤立的细胞检测到编辑。可想而知,使转染后细胞群与我们的调查和采取一个子集编辑的编辑人口成像,单一突变细胞可以通过手动分离孤立使用专门的克隆气缸基于发光信号强度的差异。然后,这些隔离可以无性繁殖系地扩展到产生同基因的细胞群。我们得出结论,这种分裂荧光素酶探针应该是一个广泛的有用的平台,许多活细胞DNA生物传感要求低拷贝数分辨率和最小的破坏有价值的细胞的数量,包括识别和隔离的突变细胞的细胞经历了一个基因组编辑过程中,实时识别细胞窝藏新驱动突变或广泛的染色体重组如倒置或易位在肿瘤,或更普遍的是,原位的基因的杂合子以及该定义的轨迹。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
作者的贡献
已进行的实验和写的手稿。DS手稿编辑,团队主要的资金资助。JC团队主要的资金资助。何鸿燊石头协助概念和设计的实验。NBH创建CRISPR-edited细胞系提供了用于实验。
资金
NH和DS受到创新基因组学研究所的支持。
的利益冲突
JC聚光灯疗法的创始人之一。
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
我们承认杰森低悉尼大学提供质粒编码衔接着导向和面向反向SpCas9目标网站的最终目标质粒最终创建。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.867390/full补充材料
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关键词:CRISPR,活细胞成像,将记者,单基因位点,dCas9
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收到:2022年2月01;接受:09年3月2022;
发表:2022年3月25日。
编辑:
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*通信:大卫·j·西格尔djsegal@ucdavis.edu