快速评估的CRISPR CRISPR诱导突变的转染效率和浓缩使用Dual-Fluorescent记者系统稳定
卡里姆·e·青年外交官访华团
幕斯塔法Aouida
Vijay古普塔
西蒙娜·加尼姆2
奥马尔·m·a·El-Agnaf- 1生物和生物医学科学部门,健康和生命科学学院,哈马德•本•哈利法大学,卡塔尔多哈
- 2神经系统疾病研究中心,卡塔尔生物医学研究所(QBRI),哈马德•本•哈利法塔大学(HBKU),卡塔尔多哈,卡塔尔基金会
CRISPR-Cas9系统依赖的核酸酶活动的交付CRISPR-associated蛋白9 (Cas9)和一个导游RNA (sgRNA)对目标基因。CRISPR组件通常送到细胞作为Cas9 / sgRNA核糖核蛋白(RNP)复杂或质粒编码Cas9蛋白以及sequence-specific sgRNA。多个转染试剂被交付CRISPR-Cas9组件,和交付向量是由几组为不同的目的开发。在这里,我们使用一支dual-fluorescence (RFP-GFP-GFP)记者系统量化的吸收水平功能CRISPR-Cas9组件进入细胞和比较的效率CRISPR交付向量。使用这个系统,我们开发了一个新的和快速细胞标仪测定,使可能的实时、快速和高吞吐量的量化CRISPR核酸酶的活动。细胞稳定表达这种dual-fluorescent记者构建促进水平的直接量化的内化和功能性CRISPR-Cas9分子co-transfecting荧光标记的细胞不需要记者分子。此外,针对一个报告基因整合到基因组概括内源性基因打靶。因此,记者可以用来优化CRISPR组件的各种转染条件,评估和比较转染效率的代理,和丰富细胞包含所需CRISPR-induced突变。
介绍
基因组编辑定期使用集群空间短Pallindromic重复序列(CRISPR) -Cas9系统需要的交付Cas9 gRNA进入细胞的形式核糖核蛋白(RNP)组成的一个功能性Cas9 / gRNA复杂或质粒编码的两个组件(青年外交官访华团et al ., 2020)。在这两种情况下,至关重要的是,Cas9 / sgRNA RNP复杂到达细胞溶质和收益进入细胞核进行基因在特定序列编辑指导下sgRNA。为此,一些交付向量和转染试剂开发(Lostale-Seijo et al ., 2017;苏雷什et al ., 2017;Chaverra-Rodriguez et al ., 2018;吉文斯et al ., 2018;Wilbie et al ., 2019;徐et al ., 2019;青年外交官访华团et al ., 2020;魏et al ., 2020;Yip, 2020)。生物屏障的方式这样的工具,如交付到目标细胞,血清或胞质核酸酶降解,细胞摄取不足或低效endosomal逃脱的实现理想水平的交付和基因编辑(吉文斯et al ., 2018),(利诺et al ., 2018),(带et al ., 2005)。一般来说,使用免疫染色和荧光显微镜等技术以及荧光标记分子监控和量化的水平吸收CRISPR-Cas9交付货物复合物(Rouet et al ., 2018;钟et al ., 2019;Jain et al ., 2019)。这些方法提供了直接的可视化CRISPR-Cas9货物复合物进入细胞的吸收。然而,他们没有显示的功能活动CRISPR分子已经成功地达到了核执行基因编辑。
可以检测的各种记者CRISPR / Cas9核酸酶活性在细胞已经发展为不同的目的(金正日et al ., 2011;室利罗摩克里希纳et al ., 2014 a;任et al ., 2015;周et al ., 2016;温家宝et al ., 2017;Eki et al ., 2020)。这样的记者通常采用自NHEJ是主要修复通路细胞依靠修复双链断裂(双边带)(Sansbury et al ., 2019)。另一方面,SRIRACCHA和CDDR记者能够检测Homology-Directed维修事件(Eki et al ., 2020),(温家宝et al ., 2017)。CDDR是另外一个记者,可以区分高保真和容易出错的NHEJ,使DNA修复结果的量化和DNA修复因素的识别(Eki et al ., 2020)此外,一些记者,C-Check等基于单链退火(SSA)修复通路检测核酸酶活动(任et al ., 2015),(周et al ., 2016)。总体而言,这些记者相对复杂,需要多个元素的co-transfection函数,当我们进一步详细讨论和比较。
记者系统工作是一个系统,利用基于RFP-GFP记者记者构造包含之间插入Cas9目标序列的克隆网站招标书和绿色荧光蛋白基因。它已经开发了检测和浓缩包含CRISPR-Cas9诱导突变的细胞(苏雷什et al ., 2017),(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 a),(金正日et al ., 2011),(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 b),(金正日et al ., 2013)。虽然这dual-reporter系统和类似的记者可以检测Cas9核酸酶的活动,他们通常co-transfected CRISPR-Cas9货物复合物和游离。因此,他们不能被用来量化的总水平Cas9 / sgRNA转染的细胞群内吸收。此外,记者的要求co-transfection质粒和CRISPR-Cas9货物复合物的过程可能会阻碍CRISPR-Cas9交货或诱发不良细胞毒性,导致不一致的或不准确的结果。我们这里描述的发展稳定的记者记者细胞表达系统基于荧光RFP-GFP精确测量功能CRISPR-Cas9货物吸收转染的效率评估代理。与游离系统,针对一个报告基因稳定整合到细胞的基因组概括内源性基因打靶。我们在这里描述的发展快速标量化方法CRISPR核酸酶活动使用记者系统。此外,我们表明,该系统可以用于有效地丰富细胞包含一代淘汰赛Cas9突变细胞系。
结果
发展战略稳定转染细胞系记者发现CRISPR-Cas9核酸酶的活动
检测CRISPR-Cas9细胞内核酸酶的活动,我们设计了一个dual-fluorescence记者系统(pRG2S_Cas9),便于选择细胞表达记者系统和细胞发生了基因编辑(图1一个)。系统持续表达mRFP无论任何核酸酶的活动作为一个标记来丰富细胞表达记者使用flowcytometry构造。mRFP后跟mRFP和一个终止密码子之间的间隔由Cas9-target序列,我们克隆Cas9: gRNA目标网站。第二个荧光团,eGFP,克隆两次在图片(帧+ 1和+ 2)终止密码子的下游(图1一个),允许选择核酸酶活跃的细胞(如前所述)(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 a)。在功能活跃Cas9 / sgRNA复合物在细胞作为质粒DNA或RNP Cas9的核酸酶由sgRNA创建在Cas9-target序列触发容易出错的异源双链断裂End-Joining (NHEJ) DNA修复。这个途径往往导致插入和删除(indels),绕过停止密码子,导致在坐标系的eGFP基因和永久激活eGFP表达细胞(图1 b)。因此,RFP的百分比+绿色荧光蛋白+细胞是细胞的比例发生了基因编辑。这个系统允许快速和有效的流式细胞仪,显微镜,微型板块读者建立基于double-positive nuclease-active细胞荧光检测(图1 b)。
图1。概述记者稳定系统的检测CRISPR-Cas9诱导突变在人类细胞。(一)荧光记者构建地图高亮reporter-guide rna (gRNAs)序列(紫色)和结合位点Cas9目标序列(黄色)工程和克隆的使用BstXI和BamHI限制性内切酶之间招标书(红色)和绿色荧光蛋白(绿色)基因。记者稳定细胞系生成稳定的转化株的选择使用抗生素G418的荧光记者构造和排序稳定转化株使用细胞分选仪。(B)荧光记者的工作机制。的招标书基因(红色),上游Cas9目标序列(黄色),由表示下观察CMV启动子(紫色),而两个绿色荧光蛋白克隆的基因(灰色)框架(+ 1和+ 2)Cas9目标序列的下游,他们表示只有一个合适的移码突变发生在容易出错的异源end-joining (NHEJ) DNA修复双链断裂后引入Cas9核酸酶在目标序列。移码突变绕过了终止密码子防止GFP表达引起的绿色荧光蛋白基因表达在坐标系(绿色)。细胞表达记者构造处理CRISPR-Cas9 gRNA表达质粒或核糖核蛋白复杂和核酸酶活性荧光显微镜下检测和使用流式细胞仪。
基因组编辑活动的评估使用工程稳定的记者细胞系
我们设计gRNAs向插入Cas9目标序列(图1一个),证实了它们的功能在体外(图2一个)。然后我们将他们的效率在HEK293细胞co-transfected记者质粒,CRISPR-Cas9表达质粒,gRNA表达片段(图2 b)。最高的核酸酶活性归因于目标reporter-gRNA2基于合成GFP表达细胞的比例(图2 b)。
图2。使用稳定的记者系统分析基因组编辑。(一)体外乳沟化验。四个reporter-gRNAs针对记者构造Cas9目标序列分别孵化Cas9核酸酶和记者质粒1 h在37°C,然后反应进行琼脂糖凝胶电泳确认gRNAs诱导双链断裂的能力在目标序列。(B)细胞记者分析流式细胞术点阴谋。Flow-cytometric分析HEK293细胞co-transfected记者质粒,Cas9-expression质粒和DNA片段编码的四个reporter-gRNAs U6启动子,使用FuGENE。核酸酶活动的量化显示在右边。结果表示为平均值±标准平均误差:nreporter-gRNA1和gRNA2 = 5;和ngRNA3 = 4。(C)荧光记者细胞的一个高度稳定的人口(RFP)∼98%表达记者使用细胞分类器构造被排序。(D)流的例子cytometry-based分析和荧光microscopy-based detectionof稳定记者HEK293细胞培养转染后72 h Cas9 / reporter-gRNA2核糖核蛋白使用Lipofectamine CRISPRMAX。酒吧= 20µm规模。
确定了双记者构建可用于检测Cas9核酸酶的活动,这是稳定纳入HEK293细胞分为低和高表达数量(图2 c和补充图S1A)。正如预期的那样,稳定记者HEK293细胞显示mRFP的高表达,且仅显示eGFP的表达与表达质粒转染后Cas9和针对gRNAs (图2 c, D和补充图就是S1C)。Cas9目标reporter-gRNA2再次发现最有效的记者稳定细胞co-transfected CRISPR-Cas9表达质粒,和四个gRNA表达片段(补充图印地)。最高的gRNA效率,Cas9 reporter-gRNA2目标,从而为进一步的实验选择是基于最高的GFP表达细胞以流式细胞术(补充图印地)。gRNA2被克隆到CRISPR-Cas9表达质粒,然后作为单一质粒交付货物后续的实验。核糖核蛋白(RNP)基础化验,Cas9核酸酶包裹着一种合成gRNA窝藏reporter-gRNA2 Cas9序列的目标是使用。
基于开发一个新的快速标量化CRISPR核酸酶的活动
支持高吞吐量CRISPR交付效率和核酸酶活动的评价,我们开发了一个基于标协议直接和快速量化CRISPR核酸酶活性在细胞使用dual-fluorescent稳定的记者系统(图3,补充图S2)。我们利用FLUOstar高度敏感®ωmultichromatic标,使信号检测水平低。我们播种RFP+绿色荧光蛋白+细胞在定义数字和初始优化结果表明,FLUOstar®ω标仪可以检测一个截然不同的GFP信号细胞数(补充图S2A)。结果显示之间的线性关系GFP / RFP荧光强度比和播种RFP+绿色荧光蛋白+细胞数(补充图开通)。这种关系被确认通过计算RFP+绿色荧光蛋白+使用flowcytometry细胞(补充图S2C。我们因此能够产生一个公式的核酸酶活性RFP的百分比+绿色荧光蛋白+细胞可以确定标GFP / RFP的荧光强度输出(补充图S2D)。
图3。标量化方法CRISPR核酸酶活动使用记者稳定系统。(一)时间表的示意图说明标仪测定的工作流。稳定的记者HEK293细胞被播种在布莱克威尔,10000每明确底部,96孔板。第二天,与不同数量的细胞转染Cas9 / gRNA2 RNP使用Lipofectamine CRISPRMAX。(B)板是扫描使用FLUOstar RFP和GFP信号®ω微型板块在48和72 h转染。(C)荧光强度矩阵扫描输出。(D)在72 h,细胞使用flowcytometry也进行了分析。图显示了一个比较RFP的百分比+绿色荧光蛋白+计算使用flowctomtery和RFP+绿色荧光蛋白+值从微型板块获得读者使用公式:% RFP+绿色荧光蛋白+= (3 (GFP / RFP) / 5) * 100。结果表示为平均值±标准错误的意思n= 3。
为了演示这种方法的适用性,我们与不同数量的转染稳定记者HEK293细胞Cas9 / gRNA2 RNP使用Lipofectamine CRISPRMAX,测定核酸酶在48和72 h活动使用标(图3 b, C)。正如所料,不同级别的GFP / RFP信号检测在每个RNP数量和随着时间的增加(图3 b)。有趣的是,RFP的百分比+绿色荧光蛋白+细胞获得使用flowcytometry非常类似于我们计算值使用上面的公式生成的(图3 d),进一步验证标方法作为一种有效的方法测量的水平CRISPR核酸酶活动使用dual-fluorescent记者稳定系统。
记者浓缩包含CRISPR-Induced突变的细胞
为了进一步建立我们的荧光稳定记者系统作为一种手段的浓缩CRISPR-induced内源性基因的突变,我们与CRISPR质粒转染稳定的荧光记者HEK293细胞或RNP携带gRNAs针对记者Cas9-target序列(Cas9-reporter gRNA2)和内源性基因同时进行。作为一个概念验证,我们选择的目标SYNE4一个基因,编码核膜蛋白nesprin-4和与听力损失(角et al ., 2013),EMX1与神经发育和不孕不育疾病(Zhang et al ., 2019),(金正日et al ., 2010),SNCA相关的神经退行性帕金森病(Spillantini et al ., 1997),(Bonini和BI, 2005年)。RFP的百分比+绿色荧光蛋白+细胞获得RNP (Cas9 / gSNCA)有针对性的细胞(∼16%)(补充图S3A)是类似于我们上面获得的比例(图3 d)。基因打靶后,我们pureRFP排序+绿色荧光蛋白+细胞使用fluorescence-assisted细胞排序(图4 ai, Bi)。分析indels RFP+绿色荧光蛋白+我使用T7核酸内切酶(T7EI)试验(图4还,Bii揭示了重要的内源性基因GFP表达细胞的破坏使用质粒(目标SYNE4吉恩:60%;针对EMX1吉恩:56%;针对SYNE4和EMX1分别同时基因:33和36%)(图4还)或RNP (SNCA基因:42%)(图4 bii)。indels在RFP的形成+绿色荧光蛋白+细胞进一步证实了桑格的PCR克隆测序(图4哎,Biii)和indels的频率进行了分析通过跟踪indels分解(潮流)试验(补充图S4)。
图4。包含CRISPR-induced Fluorescence-assisted浓缩HEK293细胞突变。荧光记者HEK293细胞转染质粒(一)或核糖核蛋白(RNP)(B)针对内源性基因。(Ai, Bi)显微镜的图像预处理和post-sorted细胞。(暗生,Bii)T7核酸内切酶我试验进行基因组DNA提取显示indels post-sorted细胞已经形成的细胞治疗与质粒或RNP针对内源性基因。量化的indels T7E1显示在右边。从Untransfected组背景值修正。结果表示为平均值±标准错误的意思n= 3从T7E1试验进行靶向细胞的基因组DNA。有显著差异的频率indels (*,p< 0.05;* *,p< 0.01;* * *,p< 0.001)治疗组之间Cas9单独或Cas9 gRNA瞄准一个内源性基因,分析学生的t以及。(哎,Biii)桑格的克隆测序揭示CRISPR-induced indels和突变。gRNA结合位点(绿色)所示的野生型(WT)序列中,PAM序列强调,破折号表示删除(−)、核苷酸的蓝色显示添加(+),表明替换(s)和核苷酸红色。突变频率计算克隆携带突变的数量除以总数量的克隆测序。
证明荧光记者系统与其他应用程序的适用性和细胞类型,我们使用相同的策略击倒一个蛋白质编码基因在神经SH-SY5Y细胞(图5)。我们选择目标SNCA基因在大脑中大量表达,与帕金森病相关(Spillantini et al ., 1997),(Bonini和BI, 2005年)。后评估gRNAs瞄准的第4外显子SNCA,我们发现SNCA-gRNA3作为最有效的gRNA减少内源性SNCA SH-SY5Y细胞蛋白的表达(补充图S5)。然后转染稳定记者SH-SY5Y细胞与CRISPR针对记者序列(Cas9-reporter gRNA2)SNCA基因的使用SNCA-gRNA3,同时,分类处理细胞池RFP+绿色荧光蛋白−和招标书+绿色荧光蛋白+细胞(图5一个和补充图S3B)排序和分析细胞使用T7EI试验和免疫印迹(图5 c, D和补充图S3C)。我们发现基因中断RFP的显著水平+绿色荧光蛋白+细胞与RFP相比(56%)+绿色荧光蛋白−细胞(8%)由T7EI试验(如图所示图5 c)。同样,RFP+绿色荧光蛋白+稳定的记者SH-SY5Y细胞表现出显著减退SNCA蛋白表达相比RFP SNCA表达(18%)+绿色荧光蛋白−SNCA的表达(84%)相对于untransfected集团通过免疫印迹(如图所示图5 d)。这减少表达同意桑格的PCR克隆测序数据显示过早停止密码子的形成67%的测序克隆、蛋白表达可能垮掉了通过介导衰变(问题的过程中貌似没有任何意义Popp来说和Maquat, 2016年)(图5 b)。此外,RNP治疗细胞测序分析显示删除的形成在PCR克隆的73%(目标站点补充图S3D)。
图5。荧光辅助浓缩的淘汰赛SH-SY5Y细胞。(一)显微镜的图像预处理和post-sorted荧光记者SH-SY5Y细胞转染质粒的目标SNCA基因。(B)桑格的克隆测序揭示CRISPR-induced indels和突变。gRNA结合位点(绿色)所示的野生型(WT)序列中,PAM序列强调,破折号表示删除(-),核苷酸的蓝色显示添加(+)和核苷酸颜色用红色表明替换。突变频率(右边)计算克隆携带突变的数量除以总数量的克隆测序。突变频率在饼图说明:总共17%的突变导致插入,导致缺失,33%和67%导致过早终止密码子的形成。(C)T7E1试验进行基因组DNA提取post-sorted RFP+GFP, RFP+绿色荧光蛋白+细胞确认indels在目标区域的形成。量化的indels T7E1显示在右边。从Untransfected组背景值修正。结果表示为平均值±标准错误的意思n= 3从T7E1试验进行靶向细胞的基因组DNA。有显著差异的频率indels (*,p< 0.05)RFP之间+绿色荧光蛋白−和招标书+绿色荧光蛋白+组,分析学生的t以及。(D)免疫印迹评价内生α-synuclein post-sorted RFP的蛋白表达+绿色荧光蛋白−和招标书+绿色荧光蛋白+细胞。量化的蛋白表达在免疫印迹显示在右边。结果表示为平均值±标准错误的意思n= 3点进行细胞溶解产物相同的细胞。蛋白表达有显著差异(*,p< 0.05)RFP之间+绿色荧光蛋白−和招标书+绿色荧光蛋白+组,分析学生的t以及。(E)细胞毒性MTT测定比较细胞的可行性SNCA野生型记者SH-SY5Y细胞和RFP+绿色荧光蛋白+SNCA淘汰赛细胞暴露于1、2.5和5毫米MPP+24 h。结果表示为平均值±标准错误的意思n= 3。细胞生存能力有显著差异(* *,p< 0.01;* * *,p< 0.001)记者SH-SY5Y SNCA野生型细胞和RFP之间+绿色荧光蛋白+SNCA淘汰赛细胞,通过学生的分析t以及。
报道称,MPP+、注射神经毒素的毒性代谢物MPTP药物诱导细胞死亡的神经细胞表达SNCA (多尔et al ., 2002;Fountaine et al ., 2011;Javed et al ., 2016)。评估SNCA的功能作用,我们测试了RFP响应+绿色荧光蛋白+MPP SNCA淘汰赛细胞+并在MPP发现显著减少+细胞介导的细胞毒性与野生型相比记者SH-SY5Y (图5 e)。因此,SNCA是重要的调节反应注射神经毒素MPTP药物和保护神经细胞免受MPP击出SNCA表达式+全身的细胞毒性。这些结果验证我们的荧光稳定记者系统可以用来丰富细胞携带多种内源性基因的突变和表明它可能促进代淘汰赛细胞株用于下游应用,如研究蛋白质功能。
讨论
通过再利用双重荧光记者之前描述(苏雷什et al ., 2017),(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 a),(金正日et al ., 2011),(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 b),(金正日et al ., 2013),我们将演示如何利用这个系统实时和快速检测的核酸酶活性和浓缩包含CRISPR-induced突变的细胞。细胞稳定表达系统可以同样用来丰富细胞使用方法如磁选或抗体选择(苏雷什et al ., 2017),(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 a),(金正日et al ., 2011),(室利罗摩克里希纳et al ., 2014 b),(金正日et al ., 2013)。这样的策略依赖于核酸酶的假设还编辑记者的目标序列编辑内源性基因的目标在一个高概率。相比其他的记者,我们发现这记者的简单的设计和机制非常适合优化CRISPR转染条件,比较CRISPR交付向量的输出效率,和浓缩的细胞包含一个或多个目标内生为淘汰赛细胞系的产生突变。例如,没有要求重新设计记者用一个新的目标为每个基因组序列目标所需的其他记者系统如SRIRACCHA和C-Check记者(温家宝et al ., 2017),(周et al ., 2016)。这允许一步一代稳定的记者细胞可以这里描述的通用实验。SRIRACCHA GFP记者设计还需要co-transfection记者质粒,捐赠者质粒促进HDR修复,和标准化的RFP表达质粒,除了Cas9和gRNA (s)将大大限制其使用的上下文中优化转染条件不受外部干扰因素(温家宝et al ., 2017)。在记者这里使用系统,没有要求的额外gRNA转染记者函数,如CDDR记者一样,它扩展了可能包括gRNA (s)到目标同时内源性基因(Eki et al ., 2020)。此外,“关闭”记者系统,如CDDR,将有限的荧光表达完全减少所需的时间,因此不适合监控核酸酶活动随时间(Eki et al ., 2020)。目前记者是一个“on”记者核酸酶活动的结果立即出现荧光表达。此外,“关闭”记者细胞与多个集成构建报告核酸酶活动的可能不敏感,除非所有的集成结构已经成功地编辑(Eki et al ., 2020),与一个“on”系统,编辑在一个集成的轨迹足以报告核酸酶的活动。记者描述可能是设计对描述DNA修复因素(Eki et al ., 2020)或描述DNA修复途径,如SSA、高保真、non-mutagenic NHEJ修复(Eki et al ., 2020),(周et al ., 2016)。然而,我们发现,这里使用的记者是适合研究的目的是通过检测核酸酶活动容易出错NHEJ修复导致基因中断和/或淘汰赛和可能的主要途径受雇于哺乳动物细胞来修复双边带(Sansbury et al ., 2019)。此外,两个绿色荧光蛋白序列的存在目标序列的帧频失调的下游允许检测+ 1和+ 2只转移呈现一种优势记者能够检测突变导致单帧。在这样的记者,这只会有可能发现三分之一的转移,因为下游的记者只存在于一个框架,从而无法检测+ 1到+ 3转移不会GFP表达结果。
细胞稳定表达这种双重荧光记者可以优化转染条件的有效手段novelCRISPR交付向量,和浓缩的细胞包含多个CRISPR-induced突变。鉴于几乎所有转染细胞是记者,他们代表一个更加敏感的系统的精确测量总水平的吸收功能CRISPR分子内的细胞群。
细胞转染等各种因素中,播种密度、孵化时间,或者用量可以干扰交付载体的转染效率。例如,转染在无血清和antibiotics-free介质可能对应于更高效的交付阴离子水平较低的血清蛋白质或抗生素,可能会干扰复杂地层阳离子脂质体和CRISPR-encoding DNA或RNP之间。血清也被报道对转染效率有负面影响的其他机制(Delteil et al ., 2000)。此外,liposome-based试剂细胞通透性增加导致抗生素被内化到细胞,导致毒性和减少交付效率。此外,减少吸收CRISPR分子/细胞水平并发播种密度较高。因此,它比执行一个基因编辑实验以尽可能低的细胞播种密度,同时避免毒性。此外,他们知道短休闲核酸酶活动的预计使用RNP由于更少的细胞内处理所需执行基因组编辑,而质粒之前,必须经过转录和翻译核酸酶活性RNP复合物形成(青年外交官访华团et al ., 2020)。因此,需要更短的孵化时间使用RNP与质粒因为RNP水平细胞转染后24 h后下降由于细胞退化(舒伯特et al ., 2021)。使转染大量的CRISPR货更容易内化和基因编辑的效率就越高。然而,preferrable CRISPR货物采用最低的剂量可能会获得足量的基因编辑来减少可能的毒性和脱靶效应忍受更高的剂量,降低整体基因编辑效率(王et al ., 2016)。
实现有效的交付感兴趣的细胞已经面临的最大挑战之一CRISPR应用于临床。这样,大量的持续的研究重点是开发和优化小说交付向量(青年外交官访华团et al ., 2020)。我们声称我们的记者系统有助于有效地测量和优化分娩CRISPR质粒或RNP使用向量。本质上,细胞稳定表达荧光记者可以直接量化功能CRISPR吸收细胞中不需要co-transfection记者或荧光标记分子可能会干扰导致的治疗过程不一致或不准确的结果。这有助于评估效率的小说交付向量以最小的来自外部的干扰因素。因为只有三分之二的转移(+ 1和+ 2)检测到GFP表达,dual-fluorescent记者系统有一个理论最大值的百分比GFP表达激活的66%。虽然这个比例可能有所不同根据目标基因的背景下网站,检查Cas9-induced indels在超过1000个基因组网站透露,∼indels导致转移的80% (Chakrabarti et al ., 2019)。这些点可能值得考虑在分析交付向量使用这个系统的输出效率。
我们这里开发使标方法准确高吞吐量的评价转染效率和实时检测CRISPR核酸酶活动使用稳定的记者系统(图3和补充图S2)。我们表明,FLUOstar®ω标仪可用于在高灵敏度检测核酸酶活性下降到1000 RFP的最初播种密度+绿色荧光蛋白+细胞(补充图S2A)。此外,荧光强度的输出显示一个线性关系获得的数据使用flowcytometry (补充图S2C)。使用这里描述的协议,我们能够准确地比较不同数量的核酸酶活性随着时间的推移RNP转染到稳定HEK293细胞。与传统的荧光显微镜或flowcytometry相比,微型板块读者准确、直接检测的方法允许CRISPR核酸酶活性随着时间的推移从相同的板没有扰乱细胞。尽管flowcytomtery是一个黄金标准量化方法,微型板块的读者提供高吞吐量、实时、定量信息CRISPR核酸酶的活动。
考虑到记者基因组中基因整合,笔者系统也部分概括内源性基因打靶,从而可以优化手段CRISPR针对内源性基因转染条件简单地使用一个微型板块读者,而不需要耗时的下游分析。我们表明,这个系统也可以用于有效地丰富细胞包含使用fluorescence-assisted CRISPR-induced突变细胞排序(图4)。我们还表明,该系统可以扩展到其他感兴趣的细胞类型,它代表了一个可靠的方法来生成淘汰赛细胞系(图5)。据报道,T7EI测定当indel频率高于30%(不敏感Liesche et al ., 2016),(Sentmanat et al ., 2018)。我们因此进行潮流分析的测序数据更准确量化indel频率(补充图S4;看到补充数据序列)。有趣的是,潮汐分析显示值,非常类似于indel频率基于PCR克隆和总削减效率接近T7分析量化(图4,5,补充图S4)。(Liesche et al ., 2016),(Sentmanat et al ., 2018)(Liesche et al ., 2016),(Sentmanat et al ., 2018)我们可能进一步证明系统可以用来研究蛋白质功能如SNCA我们显示SNCA淘汰赛细胞生成(图5 e)。未来的研究是必要的来实现稳定dual-fluorescent记者系统在其他细胞类型。很多潜力在于产生诱导多能干细胞表达这个记者各设置ups系统研究基因功能。
基因组编辑在各种应用程序中使用CRISPR确实是有益的。我们在这里证明细胞稳定表达dual-fluorescent记者系统可以用来评估转染条件,丰富CRISPR-induced突变,并生成淘汰赛细胞系,为范围广泛的应用程序可能会有用的。
方法
gRNAs
gRNAs设计(见使用Benchling在线gRNA设计工具补充数据序列)和合成tracrRNA crRNA和购买从集成DNA技术(美国IDT珊瑚镇,IA)或sgRNA (Synthego、钙、美国)或嵌入在gRNA表达下碎片U6启动子(IDT Inc .)。gRNAs设计使用benchling在线gRNA设计工具和从Synthego购买,gSNCA4从IDT公司购买。
质粒和克隆
构建pCas9 / gRNA2质粒,gRNA2 U6-pRG2S-Cas9-gRNA2片段克隆到的gRNA脚手架Cas9表达质粒,pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9,礼物冯张(Addgene质粒# 42230)消化使用的两倍BbsI购买来自新英格兰生物学实验室(马内,01938年,美国)。一枪DH5-α主管大肠杆菌细胞表达载体,热费希尔科学,马02451,美国)被转换结扎反应和镀到磅琼脂板包含100μg /毫升的氨苄青霉素(热费希尔科学、马、美国)。
pCas9 / gSYNE4 pCas9 / gEMX1和pCas9 / gSNCA3 gRNA序列构建质粒通过添加到Cas9表达载体使用重叠的寡核苷酸。退火后,产生的寡核苷酸片段包含gRNA序列两侧BbsI悬臂和被结扎成Cas9克隆表达向量线性化BbsI。一枪DH5-α主管大肠杆菌细胞转化结扎反应和镀上磅琼脂板包含100μg /毫升的氨苄青霉素(热费希尔科学)。
构建记者质粒(pMRS_Cas9:目录# TGEN_dRRR1;pRG2S_Cas9:目录# TGEN_dRRM1 ToolGen,首尔,韩国),我们设计了一个DNA序列包含多个CRISPR-Cas9 gRNA结合位点两侧BstXI和BamHI克隆的网站。合成的序列窝藏Cas9 gRNA绑定网站作为pIDT-plasmid IDT和购买。针对序列从pIDT sub-cloned记者之间mRFP和EGFP荧光报告基因质粒双消化利用BstXI和BamHI(内)。一枪DH5-α主管大肠杆菌细胞转化结扎反应和镀上磅琼脂板包含50μg /毫升卡那霉素(热费希尔科学)。使用prg2为例阳性克隆并测序验证桑格的正向和反向引物,合成了IDT公司(见补充数据序列)。
体外劈理分析
核糖核蛋白(RNP)体外研究中使用的复杂的准备以相似的方式被Saifaldeen et al。(Saifaldeen et al ., 2021)。短暂,最终浓度50 nM Cas9核酸酶添加到内缓存解决方案包含300 ng pRG2S_Cas9质粒和50 ng gRNA,超过20μl过滤消毒蒸馏去离子的nuclease-free水。反应被允许发生在37°C 1 h。结果分析在一个Ethidium Bromide-stained 0.8%琼脂糖凝胶使用紫外线透照器(ChemiDoc™成像系统,Biorad, CA,美国)。
细胞培养和稳定的细胞系制备
人类胚胎肾细胞(HEK293)保持在高葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM、高葡萄糖、目录# Gibco™11965092,热费希尔科学)补充10%胎牛血清(目录# Gibco™10082147,热费希尔科学)1%的青霉素和链霉素(目录# Gibco™15070063,热费希尔科学)。神经元SH-SY5Y细胞保持在杜尔贝科修改鹰中/营养混合物F-12 (DMEM / F12 1:1,目录# Cytiva HyClone™SH30272.02,热费希尔科学)补充20毫米消息灵通的缓冲区(目录# Gibco™15630080,热费希尔科学)),10%的边后卫,1%青霉素和链霉素。细胞生长在37°C的孵化器有限公司5%2和95%的湿度。
生成一个稳定的记者细胞系,细胞转染与10μgBsaI线性化pRG2S_Cas9质粒(图1一个)使用FuGENE(目录# E2311 Promega WI,美国)(3μl /μg)。3天后,Geniticin G418硫酸盐(目录# Gibco™0131035,热费希尔科学)添加(HEK293 500μg /毫升,300μg /毫升SH-SY5Y细胞)选择稳定的2周细胞在一段时间内。高(RFP∼98%)和低(RFP)∼72%表达稳定poopulations排序使用流式细胞仪分选机(BD FacsAria™II细胞分选仪,BD生物科学、钙、美国)。荧光显微镜是用来证实RFP表达几个段落。
转染
选择表现最好的gRNA: HEK293细胞被播种在8×104细胞每在500 ul完成DMEM 24-well板(目录# Nunc™142475年热费希尔科学)。24小时后,细胞co-transfected 100 ng pMRS_Cas9记者质粒,150 ng U6-gRNA不同gRNAs的片段,和500 ng pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Cas9表达质粒用FuGENE(3μl /μg遵循制造商的指令)和孵化一个额外的72 h。天的分析,细胞分离使用TrypLE(目录# Gibco™12605010,热费希尔科学)在DMEM和收集;GFP表达和荧光强度是评价使用流式细胞分析仪(LSRFortessa BD生物科学)。
比较gRNA活动稳定细胞:HEK293细胞被播种在100年15000细胞/μl完成DMEM在96孔板(目录# Nunc™167008年热费希尔科学)。第二天,细胞co-transfected 30 ng U6-gRNA不同gRNAs的片段,和100 ng pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Cas9表达质粒用FuGENE(3μl /μg)。使用flowcytometry 72 h后细胞进行了分析。
标仪测定:稳定的记者HEK293细胞被播种在10000每100年µl phenol-free Opti-MEM转染的前一天。野生型、荧光HEK293细胞被播种在同一密度修正。然后转染细胞与不同数量的RNP表示使用Lipofectamine CRISPRMAX(目录# CMAX00001热费希尔科学)后,制造商的协议。细胞被充值100μl phenol-free Opti-MEM后6 h。
细胞内源性基因打靶(HEK293):稳定的记者被播种在500年25000细胞/μl Opti-MEM 24-well板。第二天,细胞转染共有1μg pCas9 / SYNE4和/或pCas9 EMX1质粒用FuGENE(3μl /μg)。RNP转染的细胞转染和RNP包含gRNA # 3的目标SNCA基因(Synthego)使用Lipofectamine CRISPRMAX遵循制造商的协议。
内源性基因打靶(SH-SY5Y):稳定的移植细胞被播种在37500细胞每口井500年μl OptiMEM 24-well板。第二天,细胞转染共有1μg pCas9 / gSNCA3质粒使用Lipofectamine 2000按照制造商的协议。RNP转染的细胞转染和RNP包含gRNA # 3的目标SNCA基因用Lipofectamine RNAiMAX遵循制造商的协议。
细胞被超过了20%的边后卫包含Opti-MEM后6 h。细胞生长,直到他们达到confluency然后转移到6-well板(目录# Nunc™145380年热费希尔科学),生长在完成DMEM直到他们到达confluency。细胞进一步转移到T75瓶血压得到较好的控制(目录# Nunc™156499年热费希尔科学)排序。
标仪测定
确定标是否足够灵敏检测细胞GFP表达的差异,我们播种RFP+绿色荧光蛋白+表达细胞细胞定义数字(1000、5000、10000、15000、20000和30000年)在96孔板(目录# 164588,热科学Nunc光学总经理汇报,布莱克威尔,清除底部)phenol-free介质中减少荧光背景(补充图S2C)。细胞和RFP稀释+绿色荧光蛋白−细胞保持恒定细胞数量的40000每板是放在孵化器过夜。40000年招标书−绿色荧光蛋白- - - - - -被播种和作为空白控制。
使用基于过滤器多模FLUOstar荧光测定®ω标。底进行光学扫描使用螺旋平均或10×10矩阵扫描(6毫米直径井)消除细胞分布不均匀。获得确定使用标仪内置的增益调整选项(RFP;3468年,绿色荧光蛋白;2259)。运行多个扫描来确定最佳的激发和发射波长(RFP;λ前女友-584海里,λ前女友620 - 10 nm和绿色荧光蛋白;λ前女友485 - 12海里,λ前女友基于信号背景比-520海里)。使用信号来自RFP荧光强度被纠正−绿色荧光蛋白- - - - - -细胞,GFP / RFP比率计算归一化值。
通过绘制规范化GFP对% RFP / RFP比率+绿色荧光蛋白+使用flowcytometry细胞数,下面的公式是产生的线性趋势线:
与传统flowcytometry测试和比较分析,细胞转染如4.6节所述。在时间点显示在结果部分2.3中,板使用透明的微型板块封口机密封和阅读如上所述。另外72 h,细胞被收集和分析使用flowcytometry如下所述。
流式细胞术和细胞排序
HEK293细胞被胰蛋白酶化分离为5分钟37°C和收集。细胞过滤使用50μm截止细胞过滤器(BD生物科学)删除聚合和5毫升圆底收集管收集。流式细胞术进行了LSRFortessa (BD生物科学)机,分析了10000事件每样PE-CF594 (RFP)和Alexa-Fluor 488 (GFP)表达式(补充图S6A)。编辑的百分比然后推导了计算RFP的百分比+/ GFP+从所有招标书+细胞。
细胞分类:治疗后gRNA针对报告基因和内源性基因的同时,RFP+绿色荧光蛋白+和招标书+绿色荧光蛋白−细胞分类使用BD FACSAria II细胞分选仪(补充图S6B)。细胞种植在96孔板分别转移到24-well板然后6-well板。在confluency,细胞DNA和蛋白质的分离分析。
DNA提取、PCR扩增基因组目标基因
从处理和未经处理的细胞基因组DNA分离控制使用QIAamp DNA迷你包(目录# 51306、试剂盒、希尔登,德国)制造商所使用的协议和协议后Aouida et al ., 2015 (Aouida et al ., 2015)。PCR进行放大SYNE4目标使用AccuPrime高保真Taq(目录# 12346 - 086,表达载体、钙、美国),根据制造商的说明40周期(94°C, 30年代;65°C, 30年代;60年代,68°C)。EMX1目标是扩大使用AccuPrime高保真Taq(退火57°C)。放大SNCA目标,Phusion热态启动Flex 2 x大师(内)混合使用,根据制造商的指示30周期(98°C, 30年代;65°C, 35 s;30年代,72°C)。每个组合涡和离心机之前将变成一个热循环。确认PCR 2μl反应混合1 ul加载染料(6 x)和3μl H2O加载并运行在2%琼脂糖凝胶(目录# 16500100,热费希尔科学)。只有一个乐队的预期每个样本大小应该显示。PCR产物纯化和筛选了在水使用试剂盒的PCR净化设备制造商的协议。
免疫印迹
测量SNCA浓缩后蛋白表达的细胞包含SNCA突变,细胞悬浮在裂解缓冲(太细胞裂解试剂,目录# CelLytic C3228-50ML,σ)包含10μl /毫升蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(目录#停止™78440、热费希尔科学)和细胞溶解使用制造商的协议。30μg细胞溶解产物加载到15% SDS polyacrylamide1 mm凝胶电泳和分离的100 V 90分钟。随后被转移到蛋白质硝化纤维膜在100 V 60分钟。膜立即被放在沸腾的PBS为5分钟,阻止了5%阻断缓冲区(Blotting-grade杀杀杀,目录# 1706404,Biorad)在PBS-T 1 h然后孵化与1:2,500 anti-α-synuclein抗体(Syn-1目录# 610787年,BD生物科学)和β-actin抗体(ab8227 abcam)一夜之间在4°C。蛋白质乐队可视化使用超级信号西方毫微微化学发光底物(热科学)和带强度决定使用数量One-4.1.1软件(Bio-Rad)和ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)。
细胞毒性试验
评估MPP +毒性,我们测量细胞氧化还原与MTT如前所述活动(Javed et al ., 2016)。短暂,记者SH-SY5Y细胞被镀5000细胞的密度在96 - 100年板µl完整的媒体。第二天,细胞暴露于1-methyl-4-phenyl吡啶(MPP +碘化,目录# d048 - 100毫克,σ)24 h。麻省理工试剂(目录# M2128-1G,σ)然后添加到最后一个0.6毫克/毫升的浓度和培养4 h。媒体和100µl细胞裂解缓冲,由of15% SDS(目录# 11667289001,σ),50%N,N二甲基甲酰胺(目录# 227056 - 100毫升,σ),pH值4.7,然后添加到细胞和在一夜之间湿润孵化器孵化37°C。吸光度是然后用一盘以590海里读者(TECAN)。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。
作者的贡献
构思的想法和设计实验:OE-A, MA, KS。进行实验:KS, MA (Cas9质粒克隆gRNA)。分析了数据:KS、马和OE-A。该报写道:KS、马和OE-A。
资金
这项工作是由卡塔尔生物医学研究所,哈马德•本•哈利法塔大学健康和生命科学学院,哈马德•本•哈利法塔大学研究生奖学金KS。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
我们感谢卡塔尔的流式细胞术和基因组学的核心设施生物医学研究所的技术支持。我们也感谢博士Dindial Ramotar帮助审查的手稿。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.854866/full补充材料
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关键词:稳定的记者,快速的细胞试验,CRISPR-Cas9,吸收、充实
引用:青年外交官访华团KE, Aouida M,古普塔V, Ghanem SS和El-Agnaf OMA(2022)的快速评估CRISPR CRISPR诱导突变的转染效率和浓缩使用Dual-Fluorescent记者系统稳定。前面。基因组。4:854866。doi: 10.3389 / fgeed.2022.854866
收到:2022年1月14日;接受:2022年2月15日;
发表:2022年3月21日。
编辑:
Yonglun罗丹麦奥尔胡斯大学版权©2022青年外交官访华团,Aouida,古普塔Ghanem El-Agnaf。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
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