鱼精蛋白1的激活使用表观基因组编辑减少致瘤的细胞的增殖gydF4y2Ba
赴麦加朝圣NamousgydF4y2Ba,gydF4y2Ba
卡米拉则布拉兹gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
王一丁gydF4y2Ba和gydF4y2Ba
哈提卜哈桑gydF4y2Ba*gydF4y2Ba- 麦迪逊市威斯康辛大学麦迪逊分校的WI,美国gydF4y2Ba
DNA甲基转移酶(DNMT)和组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDAC)抑制剂作为癌症表观基因组药物。然而,这些表观遗传药物缺乏针对特异性和可能导致基因组不稳定,致癌基因的表达。因此,需要开发新的治疗策略,可以针对特定的癌症基因沉默或激活。CRISPR / dCas9系统代表了一种很有前途的,强大的治疗工具,因为它的简单性和特异性。鱼精蛋白1 (PRM1)只表示在精子和紧包装的DNA有至关重要的作用,因此在精子细胞诱导转录沉默。我们假设激活的gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba基因在肿瘤发生的细胞会导致DNA凝聚和减少这些细胞的增殖。为了测试我们的假设,我们人类胚胎肾细胞转染293 t dCas9-P300质粒添加乙酰基的启动子区域gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba通过特定的gRNAs质粒。RNA-Seq分析显示高特异性的靶向基因转染细胞的激活。gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba表达导致显著降低的细胞增殖BrdU ELISA测定。确认激活的gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba是由于乙酰基沉积H3K27, ChIP-qPCR。乙酰化的gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在转染细胞启动子区域的目标dCas9-p300高于控制细胞。有趣的是,乙酰化的目标子区域显示DNA甲基化。这些发现证明表观基因组编辑在激活的功效gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在non-expressing致瘤的细胞,它们可以作为一个有前途的治疗在癌症治疗策略。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
基因表达是策划和各种表观遗传控制的监管机构,如DNA甲基转移酶,组蛋白乙酰转移酶,染色质组蛋白甲基转移酶和其他监管机构参与表观遗传标记的添加或删除(gydF4y2BaFeinberg, 2018gydF4y2Ba)。改变这些表观遗传标记与肿瘤发生相关的紧密(gydF4y2Ba纳尔逊et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaVerdelli et al ., 2015gydF4y2Ba)。此外,这些表观遗传学标记的可逆的性质使其吸引人的癌症治疗的目标(gydF4y2Ba凌晨et al ., 2014gydF4y2Ba)。的确,有一些抗癌药物获得FDA批准,如5-azacytidine和decitabine作为DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂或萨哈和romidepsin作为组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(gydF4y2BaRius Lyko, 2012gydF4y2Ba)。治疗癌症的细胞与DNMT或HDAC抑制剂导致hypomethylation和hyperacetylation能够恢复正常的甲基化和乙酰化模式,分别导致基因沉默或激活正常细胞的关键功能(gydF4y2BaYoo和琼斯,2006年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba杨et al。(2004)gydF4y2Ba报道1 - 16%和18 - 60%减少甲基化Alu和长时间的重复元素点缀核苷酸元素(1号线)、后分别与甲基化抑制剂治疗结肠癌细胞系5-aza-2'deoxycytidine称为decitabine。使用1号线作为代理全球基因组DNA甲基化标记,gydF4y2BaAparicio et al。(2009)gydF4y2Ba发现了一个显著的减少甲基化的1号线gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和实体肿瘤患者DNA甲基化抑制剂。此外,治疗结肠癌细胞系的DNA甲基化抑制剂decitabine导致全球hypomethylation,导致发生重大变化的表达基因中确定这些细胞的70% (gydF4y2BaGius et al ., 2004gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
虽然表观遗传药物证明有益的治疗癌症,他们也表现出显著的副作用,包括缺乏靶向特异性。缺乏特异性的抑制剂导致基因组不稳定性和有害基因的激活,如致癌基因(gydF4y2BaYoo和琼斯,2006年gydF4y2Ba)。此外,药物引起的表观遗传修饰之间的因果关系和治疗反应这些药物还没有定论(gydF4y2BaRius Lyko, 2012gydF4y2Ba)。因此,有必要开发创新的方法针对性的表观基因组操纵基因的激活或沉默特定癌症治疗。与现有的表观遗传药物,多种epigenome-editing工具与目标的能力近年来开发,包括取得,锌指蛋白,CRISPR dCas9系统(gydF4y2Ba杰弗里斯,2018gydF4y2Ba)。CRISPR-based系统精确、高效和易于使用的其他方法相比。的特异性和易用性CRISPR / dCas9系统是由于导游RNA (gRNA)序列特定于目标区域和protospacer相邻的存在主题(PAM)序列(gydF4y2BaLaufer辛格,2015gydF4y2Ba)。停用Cas9融合与作家或橡皮蛋白质的表观遗传修饰,如组蛋白乙酰转移酶和DNA甲基转移酶,已被证明是有效的在激活和沉默基因gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba希尔顿et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba福岛et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaHanzawa et al ., 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
最近,出现了研究使用CRISPR / dCas9系统激活肿瘤抑制基因和致癌基因沉默。gydF4y2BaChoudhury et al。(2016)gydF4y2Ba脱甲基的启动子区域gydF4y2Ba乳腺癌易感基因1gydF4y2Ba使用dCas9-TET1基因,导致它的表达和随后的海拉细胞增殖的抑制作用。gydF4y2Ba歌et al。(2017)gydF4y2Ba证明dCas9融合的效率与组蛋白甲基转移酶G9的下调gydF4y2BaSPDEFgydF4y2Ba,粘液生产相关基因在肺癌A549细胞株。这些研究主要集中在针对特定基因;然而,癌症是复杂的,和肿瘤发生畸变的多个位点的表达结果。此外,并不是每一个操纵基因将抑制细胞增殖。需要一个方法,侧重于抑制异常细胞的转录活性和增殖能力。Protamines-proteins只表示在精子DNA包装影响紧nucleus-present表观基因组癌症治疗的一个有前途的工具。激活这些基因在癌细胞会导致转录沉默。gydF4y2Ba
精蛋白不同家庭的短蛋白质(50 - 110个氨基酸)专门表达post-meiotic男性生殖细胞(gydF4y2BaBalhorn 2007gydF4y2Ba)。它们包含一个中央arginine-rich dna结合域两侧短肽段含有半胱氨酸残基。带正电荷的精氨酸与带负电荷的磷酸基的DNA,而半胱氨酸形成二硫桥,精蛋白链接起来。这种独特的结构精蛋白促进精子染色质的包装和凝结,防止基因转录(gydF4y2Ba米勒et al ., 2010gydF4y2Ba)。转录沉默在成熟精子是由大量凝结核染色质protamine-DNA互动,这一过程被称为protamination (gydF4y2Ba吴、楚,2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba考尔gydF4y2BaGill-Sharma et al ., 2011;gydF4y2Ba卡斯蒂略et al ., 2014gydF4y2Ba)。一些研究报道精蛋白表达的影响染色质包装和non-germ细胞的增殖。gydF4y2BaIuso et al。(2015)gydF4y2Ba表明,外生鱼精蛋白1 (gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba)表达在成年体细胞染色质重组导致高,但没有公布对细胞增殖的影响。另一项研究表明,外生的表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba干扰海拉细胞的增殖(gydF4y2Ba冈瑟et al ., 2015gydF4y2Ba)。我们的发现demonsrate dCas9-p300和特异性和有效性两个PRM1 gRNAs激活基因。此外,细胞表达PRM1表现出减少细胞增殖。同时,组蛋白乙酰化作用与DNA甲基化模式相关的负面PRM1的启动子区域。因此,目前appraoch代表了癌症治疗的一个有前途的工具。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
gRNA序列设计和质粒结构gydF4y2Ba
启动子区域的序列gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba得到从真核生物启动子数据库(gydF4y2BaDreos et al ., 2017gydF4y2Ba)。具体与CRISPOR gRNA针对启动子序列的设计(gydF4y2BaHaeussler et al ., 2016gydF4y2Ba使用人类的参考基因组GRCh38 / hg38)。SNPs148和Kaviar数据库被用于gRNA设计避免突变可能会妨碍gRNAs的定位效率。gRNAs的序列中可以找到gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba。dCas9-p300质粒构建了从Addgene(猫# 61357)。PRM1 gRNA表达质粒是由切断使用T4退火gRNA寡核苷酸连接酶(内,美国)psPgRNA向量(Addgene,猫# 47108)。gydF4y2Ba
细胞培养和质粒转染PRM1激活gydF4y2Ba
人类胚胎肾HEK293T细胞从Dharmacon公司购买。(美国地平线发现)。细胞被维护在Gibco DMEM / F12培养基(生命技术、钙、美国)含有10% (v / v) Gibco胎牛血清(技术)。细胞培养在37°C湿润5% (v / v)有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba包含的气氛。gydF4y2Ba
转染实验,细胞之间的第三和第八段被播种到24-well板块(4井/治疗/控制)。播种后24小时,细胞转染lipofectamine 2000(技术),375 ng dCas9-p300, 125 ng的克分子数相等的集中的每个PRM1 gRNA表达载体。转染在三个生物进行复制。相同的实验进行了使用6-well板,细胞转染0.75和2.25μg dCas9-p300μg克分子数相等的集中的每个PRM1 gRNA。我们还与dCas9-p300转染细胞,独自gRNA质粒,lipofectamine孤单。gydF4y2Ba
评估HEK293T细胞的转染效率,与EGFP细胞转染质粒(Addgene,猫# 21320)。Brightfield和EGFP荧光图像被使用BIOTEK显微镜(日本基恩士,,美国)。总共三个图像每口井被三个独立的井。斐济软件(gydF4y2BaSchindelin et al ., 2012gydF4y2Ba)被用来估计转染效率。短暂,每口井的细胞总数估计从brightfield图像,而转染细胞计数估计EGFP荧光。转染效率是使用以下公式计算:gydF4y2Ba
PRM1gydF4y2Ba表达评估使用实时定量PCR (RT-qPCR)gydF4y2Ba
细胞转染48小时后,细胞溶解,每四井24孔板的结合对总RNA提取使用试剂盒(技术)/制造商的指示。当使用6-well盘子,RNA提取从单一的油井。使用NanodropONE RNA质量和数量进行评估(Thermofisher科学、德、美国)。总共有200 ng纯化RNA是反向转录cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad、钙、美国)。执行RT-qPCR使用iTaq SYBR绿色Supermix (BioRad)。gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba(目标基因)和gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba(内生控制)引物(gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba)使用NCBI引物设计工具设计(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/gydF4y2Ba)。RT-qPCR产品运行在2%琼脂糖凝胶确认存在与否gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在控制和治疗细胞信使rna扩增子。gydF4y2Ba
RNA序列和微分表达式分析gydF4y2Ba
评估的特异性gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活整个基因组,我们进行RNA-Sequencing (RNA-Seq)四个转染和四个控制样本。RNA质量评估通过生物分析仪2100真核细胞总RNA Nano(安捷伦科技、钙、美国),和所有样本RIN > 7。执行RNA-Seq Admera健康生物制药(南平原镇,新泽西,美国)。gydF4y2Ba
对于每一个样本,FastQC (gydF4y2Ba西蒙•安德鲁斯2010gydF4y2Ba)和Trimmomatic (gydF4y2Ba博尔格et al ., 2010gydF4y2Ba)被用来生成序列质量报告和削减适配器序列和低质量的读取,分别。修剪读取对齐到人类参考基因组(NCBI智人GRCh38.p13)使用明星(gydF4y2Ba多布林et al ., 2013gydF4y2Ba)。读计数为每个基因估计使用”——quantMode GeneCounts”选项在明星(gydF4y2Ba多布林et al ., 2013gydF4y2Ba)。只有表达基因至少15项在所有四个样本进行分析,导致13893个基因。基因计数被规范化的削减意味着M-values (TMM)方法(gydF4y2Ba罗宾逊和Oshlack, 2010年gydF4y2Ba)使用“刨边机”R包(gydF4y2Ba罗宾逊et al ., 2010gydF4y2Ba)。转染之间的微分表达式分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)和控制(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)样本基于负二项广义线性模型,包括两个细胞系阻碍因素,使用磨边机包(gydF4y2Ba罗宾逊et al ., 2010gydF4y2Ba)。统计测试修正为多个测试;因此,只有基因错误发现率(罗斯福)小于0.10被认为是重要的(gydF4y2BaBenjamini和业务,1995年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
潜在的非目标PRM1 gRNAs预测使用CRISPOR (gydF4y2BaHaeussler et al ., 2016gydF4y2Ba)。由此产生的非目标基因然后比较差异表达的基因。特异性gRNAs时得出的非目标列表中不存在的差异表达基因。gydF4y2Ba
细胞增殖实验gydF4y2Ba
评估的影响gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活细胞增殖率,BrdU ELISA试验使用。HEK293T细胞之间的第四和第八章节被播种在0.2 ^ 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞组织培养板/在96 -好。播种后24小时,细胞转染要么dCas9-p300和PRM1 gRNAs(完整的复杂),仅dCas9-p300, PRM1 gRNAs,或lipofectamine 2000(见gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba转染条件)。20±1 h转染后,20μL BrdU试剂(Abcam,妈,美国)添加到每个包含100μL DMEM / F12培养基和细胞培养22 h在37°C公司为5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。细胞被固定并接受适当的抗体根据制造商的指示。吸光度测量在450 nm使用SpectraMax板读者384(分子器件、钙、美国)。为每个条件反应进行了一式三份。减少细胞百分比计算是基于450海里/控制治疗比使用以下公式:gydF4y2Ba
统计学差异的治疗和控制使用一个单向进行评估gydF4y2BatgydF4y2Ba以及在Microsoft Excel。gydF4y2Ba
染色质免疫沉淀反应和ChIP-qPCRgydF4y2Ba
测试是否dCas9-P300组蛋白乙酰化作用形成的gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba启动子区域导致gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活,染色质免疫沉淀反应进行分析使用芯片表达酶工具包(活动主题、钙、美国)。短暂,HEK293T细胞生长在15厘米的菜和转染30μg dCas9-p300和10μg PRM1 gRNAs。转染48 h后,细胞被固定用甲醛和收获。染色质剪使用活跃主题酶鸡尾酒。总共20μg剪切染色质免疫沉淀反应中使用了反应2μg H3K27Ac抗体(活动主题)为控制和治疗细胞。把DNA纯化使用活动主题DNA净化设备(活动主题)。gydF4y2Ba
引物设计跨度的启动子区域gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba,这是组蛋白乙酰化和目标区域gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba基因激活(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。看到gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba引物序列。总共12 ng H3K27Ac丰富gDNA每个反应使用控制和治疗的细胞(每个样本一式三份)。gDNA放大使用iTaq SYBR绿色Supermix (BioRad)。褶皱变化差异计算使用公式gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。基因组的位置PRM1基因启动子(虚线),gRNAs(红色箭头)和芯片区域(黄色突出显示)。CRCh38.p13: NC_000016.10 PRM1基因的染色体定位子。图上的数字是核苷酸位置。gydF4y2Ba
使用单向统计差异了gydF4y2BatgydF4y2Ba以及在Microsoft Excel。gydF4y2Ba
PRM1gydF4y2Ba启动子区域甲基化评估gydF4y2Ba
自组蛋白乙酰化和DNA甲基化是敌对的标志,我们选择评估DNA甲基化的启动子区域针对乙酰化作用。DNA提取使用Zymo从转染和控制细胞快速DNA Miniprep +工具包(Zymo研究、钙、美国)。总共有500 ng亚硫酸氢提取DNA的转换使用EZ DNA Methylation-Lightning™工具(Zymo研究)。bisulfite-converted DNA被用来放大gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba通过PCR发起人针对乙酰化作用。产生的PCR产物纯化使用DNA凝胶回收(Zymo研究)和结扎成pGEM-T-easy向量(WI Promega,麦迪逊,美国)和转换成JM109主管细胞(Promega)。每组至少20克隆测序利用Sanger测序。单CpG甲基化水平的网站和整体甲基化比例评估使用BISMA在线工具(gydF4y2Bahttp://services.ibc.uni-stuttgart.de/BDPC/BISMA/gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba罗德et al ., 2010gydF4y2Ba)。确切概率法被用来测试的意义差异甲基化之间的转染和控制细胞在R软件(gydF4y2BaRStudioTeam 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba,我们与融合蛋白dCas9-p300质粒转染HEK293T细胞,而存款在组蛋白乙酰基,连同gRNAs质粒直接启动子区域的融合蛋白gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba。质粒转染后,我们测量gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba表达水平和评估细胞增殖。此外,要理解基因活化的机制,我们评估H3K27乙酰化和DNA甲基化水平在启动子区域gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
鱼精蛋白1激活dCas9-p300和两个特定PRM1 gRNAsgydF4y2Ba
为gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活,dCas9-p300和两个gRNAs特定于gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba启动子转染到HEK293细胞。转染效率是31.26%基于EGFP荧光在转染细胞。post-transfection两天,细胞收获了基因表达分析。qPCR分析表明non-transfected细胞不表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba(原始CT值> 38),而转染HEK293T细胞显示原始CT值为29.76 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。凝胶电泳的qPCR产品(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)表明,gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba治疗细胞扩增子在场和缺席在控制细胞。的gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba基因作为内生控制由于其在样品稳定表达,治疗细胞平均CT值为19.30和19.03在控制细胞。non-transfected细胞相似,PRM1并不表示仅在细胞转染与dCas9-p300, PRM1两gRNA质粒,转染细胞与lipofectamine孤单。这些结果表明成功的激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在转染dCas9-p300和两个gRNAs。此外,我们评估使用单个gRNA PRM1激活的可行性;然而,这种方法是不够的,PRM1不是表达细胞接受dCas9-P300和单个gRNA。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。使用RT-qPCR HEK293T PRM1表达式控制和治疗。原始CT值获得使用SYBR绿色BioRad只连接。低CT值代表高表达的基因。控制细胞生CTs > 38这是没有表情。结果从三个生物复制。误差线代表平均数标准误差。gydF4y2Ba
我们执行RNA-Seq分析处理和摘要HEK293T细胞来确定问题症结PRM1 gRNAs。我们的研究结果表明,预测in-silico非标靶基因差异表达基因的列表中不存在(补充文件2)。此外,只有gydF4y2BaEP300gydF4y2Ba基因显示治疗细胞中表达显著高于控制细胞,与表达式(10.77折的区别gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0001,富兰克林·德兰诺·罗斯福= 0.10)。其他有褶皱的差异表达基因改变< 2或提出一些读计数(< 10)。有趣的是,的表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba没有检测到RNA-Seq数据的样本,尽管其表达在RT-qPCR验证测序的样品一样。gydF4y2Ba
细胞转染HEK239T扩散gydF4y2Ba
BrdU试验是用来评估HEK293T细胞的增殖率gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活。转染细胞表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba表现出较低的平均吸光度在450纳米细胞增殖减少20.29%相比,控制细胞(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.016)(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。此外,治疗细胞显示较低的450 nm吸光度治疗/控制比(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)比其他转染条件(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba),这表明gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活细胞增殖缓慢是必要的。增加450纳米吸光度是观察到细胞治疗PRM1 gRNA质粒+ lipofectamine 2000(增加21%;gydF4y2BapgydF4y2Ba2000 = 0.05),只有lipofectamine(增加14%;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.124),表明增加细胞增殖。相比之下,细胞转染只有dCas9-p300 + lipofectamine 2000表现出控制细胞的增殖率接近(下降2%;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.320)。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。使用BrdU测定扩散试验。值的gydF4y2BaYgydF4y2Ba设在代表450海里的吸光度的比值控制细胞治疗。误差线代表平均数标准误差。结果从三个生物复制。(-)表示没有组件在转染复杂。(+)表示的组件在转染复杂。gydF4y2Ba
在转染HEK293T细胞组蛋白乙酰化富集gydF4y2Ba
确认乙酰基的沉积H3K27 dCas9-p300导致gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活,ChIP-qPCR使用引物执行特定于地区横跨gRNAs(∼123个基点)(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。乙酰化的gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在转染细胞启动子区域的目标dCas9-p300高于控制细胞(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。生平均CT值放大H3K27ac丰富转染细胞的基因组DNA为25.12比26.62为控制细胞(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba),表示更H3K27Ac浓缩在处理样品gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba是表达。褶皱变化浓缩为2.82 (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.06)(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。为控制和治疗细胞H3K27ac ChIp-qPCR CT值。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba使用SYBR绿色原始CT值了gydF4y2Ba;(B)gydF4y2Ba褶皱变化差异(FC = 2 ^gydF4y2Ba−ΔCTgydF4y2Ba)。结果从三个生物复制。误差线代表平均数标准误差。gydF4y2Ba
转染HEK293T细胞DNA甲基化变化gydF4y2Ba
组蛋白乙酰化和DNA甲基化是表观遗传标记,因为第一拮抗物激活并提高基因表达而后者与降低基因表达有关。然而,这些表观遗传标志之间的因果关系不成立,和改变一个是否会影响其他的状态需要进一步调查。因此,我们评估了DNA甲基化在该地区针对组蛋白乙酰化作用。DNA甲基化是98%gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba启动子区域的控制细胞相比,85.71%的总甲基化在转染细胞(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.034)(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。在单一CpG决议,CpG 1 (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)在启动子区域显示,96%甲基化在控制细胞转染细胞的89.28% (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.61)。CpG甲基化两个显示100和82.14%控制和转染细胞,分别为(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.053)。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba。gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba启动子区域甲基化模式在控制和治疗细胞。总体甲基化和单一网站CpG甲基化水平。每个序列的DNA甲基化比例为计算使用以下公式:成功的甲基化CpG网站/总数数排序CpG网站。BISMA在线工具被用来评估甲基化比例。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
目前癌症表观基因组治疗缺乏靶向特异性。因此,本研究的目的是激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2BaHEK293T细胞诱导转录沉默的细胞,减少扩散使用epigenome-editing dCas9-p300系统。精蛋白提供精子的DNA的严密包装,停止转录活动(gydF4y2BaBalhorn 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba卡斯蒂略et al ., 2014gydF4y2Ba);因此,这些蛋白质存在干扰细胞的转录沉默的一个有前途的工具,如肿瘤。我们的目标gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活,因为蛋白质相比,它的产生是成熟gydF4y2BaPRM2gydF4y2Ba,这就需要翻译后加工功能。此外,gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba存在于所有哺乳动物的精子,而gydF4y2BaPRM2gydF4y2Ba只在老鼠身上被发现,仓鼠,马,一些灵长类和人类(gydF4y2Ba阿克马尔et al ., 2016gydF4y2Ba),这表明gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba就能足以引起染色质的更严格的包装。的确,gydF4y2BaIuso et al。(2015)gydF4y2Ba证明了gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba单独诱导体细胞核凝结。此外,要理解基因活化的机理,我们评估目标地区的H3K27ac马克浓缩和DNA甲基化模式。gydF4y2Ba
dCas9-P300诱发一个健壮的和具体的激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba
组蛋白乙酰化作用在H3K27与积极的调节基因表达(紧密相关gydF4y2Ba东翁,2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba日圆et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2020gydF4y2Ba)。我们使用dCas9-p300融合蛋白,目标H3K27乙酰化作用,因为它效率高的基因激活(gydF4y2Ba希尔顿et al ., 2015gydF4y2Ba)。启动子区域的目标gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba,我们能够激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在HEK293T致瘤的non-germ细胞系。我们还成功地激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在黑色素瘤M375A癌症细胞系(数据没有显示)。因此,我们的方法可以应用到不同的细胞类型。gydF4y2Ba
单个gRNA在我们的研究不足以激活目标基因。gydF4y2Ba希尔顿et al。(2015)gydF4y2Ba显示,使用单一gRNA瞄准gydF4y2BaIL1RNgydF4y2Ba和gydF4y2BaMYODgydF4y2Ba启动子,就足以让强大的基因激活。相比之下,同样的作者展示了多个gRNAs需要增加的表达gydF4y2BaOCT4gydF4y2Ba基因。因此,表达水平上激活与dCas9-p300 locus-specific。为gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba也有可能,基因的启动子区高甲基化和广泛凝聚由于其DNA-packaging角色,需要使用两个gRNAs成功激活。gydF4y2Ba
的报告数量CRISPR / dCas9脱靶绑定网站范围从10到1000年,根据gRNA (gydF4y2BaKuscu et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba吴et al ., 2014gydF4y2Ba)。没有一个潜在in-silico非目标在RNA-Seq分析差异表达的基因。此外,细胞治疗的高表达EP300预计由于瞬变dCas9-p300质粒转染P300催化领域。同样的,gydF4y2Ba希尔顿et al。(2015)gydF4y2Ba报告增加了细胞治疗的P300 mRNA的表达。这些发现表明,PRM1 gRNAs特定于目标启动子区域。gydF4y2Ba
目标基因PRM1并不在转录组分析,发现可能由于其小尺寸。的确,检测记录的能力取决于它的长度和丰富的序列库(gydF4y2BaOshlack韦克菲尔德,2009年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba西姆斯et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba江泽民et al。(2011)gydF4y2Ba证实偏见简称量化成绩单和个人外显子。作者还得出结论,在观察读取计算值精度提高阅读的深度和RNA的长度。此外,微分表达式的识别依赖于文本长度因为长读取记录生成比短的(gydF4y2BaTarazona et al ., 2011gydF4y2Ba)。这些研究表明,小成绩单等gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba不太可能发现RNA-Seq数据。gydF4y2Ba
细胞表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba扩散速度较慢gydF4y2Ba
减少HEK293T细胞的增殖,这被认为是肿瘤发生的(gydF4y2BaStepanenko Dmitrenko, 2015gydF4y2Ba),表明gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba可以减少肿瘤细胞增殖,在癌症治疗提供了一种很有前途的方法。同样的,gydF4y2Ba冈瑟et al。(2015)gydF4y2Ba表明,瞬态的表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在海拉细胞诱导显著减少扩散。相比之下,gydF4y2Ba陈et al。(2018)gydF4y2Ba观察细胞增殖增加gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba超表达在结肠癌。作者还发现,gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba表达增加细胞迁移。因此,调查的作用gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在不同的肿瘤类型是必要的。虽然减少了20%似乎低,重要的是要注意,转染效率∼31%。因此,更高的估计减少扩散应预期如果转染效率增加。gydF4y2Ba
组蛋白乙酰化作用之间的相互作用和DNA甲基化是一种可能的机制gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活gydF4y2Ba
特定区域的ChIP-qPCR实验生成gRNAs和启动子区域gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba显示增加H3K27乙酰化作用的细胞相比,控制细胞治疗。乙酰化作用的增加呈正相关,的表达gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba在细胞治疗。这些结果预计由于H3K27Ac与活性密切相关基因(gydF4y2Ba东翁,2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba日圆et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2020gydF4y2Ba)。值得注意的是,转染细胞尚未排序在这个研究。因此,转染效率相对较低(∼31%)结合的混合人口转染和non-transfected细胞可以解释缺乏显著的结果观察组蛋白乙酰化富集。同时,浓缩的转染细胞可能会导致H3K27Ac水平。gydF4y2Ba
整体的DNA甲基化模式在降低了12%在治疗细胞启动子区域组蛋白乙酰化富集。分析CpG网站启动子区域的甲基化模式表明,CpG2的甲基化水平较低的治疗比控制细胞的细胞。这些结果表明组蛋白乙酰化和DNA甲基化之间的负相关。据报道,组蛋白甲基化和脱乙酰作用发生在DNA甲基化。gydF4y2Ba吴et al。(2008)gydF4y2Ba表明,低水平的H3K9甲基化导致贫穷招聘heterochromatin-associated蛋白1 (HP1)和DNMT1 p16启动子,导致DNA甲基化在该地区的损失。其他研究表明,DNA demethylase活动是由组蛋白乙酰化的状态(gydF4y2BaSzyf Cervoni和2001gydF4y2Ba;gydF4y2BaCervoni et al ., 2002gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2BaD 'Alessio et al。(2007)gydF4y2Ba表明组蛋白乙酰化作用之前但不足以引发DNA脱甲基,RNA聚合酶II (RNAP II)的DNA demethylase招聘是必要的。我们试图激活gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba基因用dCas9-TET1 gRNAs是失败的(数据未显示)。这些发现表明,gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba子组蛋白乙酰化作用可能是启动基因表达的机制。然而,进一步的研究是必要的为了揭开的确切机制和级联事件导致健壮gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba表达式使用dCas9-P300时伸长。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
本研究表明,gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba可以激活目标组蛋白乙酰化作用在使用dCas9-p300启动子区域。重要的是,我们证明了鱼精蛋白激活导致显著减少致瘤的细胞的扩散。此外,添加dCas9-P300导致DNA脱甲基乙酰基的启动子区域,表明之间的串扰表观遗传标记基因表达所必需的。总的来说,gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活non-natively-expressing致瘤的细胞在减少细胞增殖是一种有效的工具。然而,这种影响可能肿瘤特异性,所以评估的影响至关重要gydF4y2BaPRM1gydF4y2Ba激活细胞增殖的不同的癌症类型。此外,我们的研究集中在单一细胞培养中肿瘤的毒性不是问题。Howoever,当应用这个方法在复杂环境中与肿瘤细胞存在,关键是使用肿瘤细胞特定的交付工具,防止正常细胞毒性。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba,GSE188251。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
环导致了研究设计,进行了实验,数据分析,起草,并回顾了手稿CB进行生物信息学分析和回顾了手稿YW进行香港构思研究DNA甲基化的评估实验,参与设计实验,起草和审查手稿。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项研究是由研究生院资助(基金号AAD2617)、威斯康星大学麦迪逊分校。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者要感谢以下实验室捐赠Addgene本研究中使用的质粒,这允许我们进行这项工作。詹姆斯·埃利斯实验室捐赠EGFP质粒用于评估在HEK293T细胞转染效率。查尔斯Gersbachfor实验室捐赠dCas9-p300 psPgRNA质粒用于激活PRM1。作者在使用技术指导谢谢Nathan切斯摩尔BioTek显微镜评估转染效率。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.844904/full补充材料gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
阿克毛,M。,Aulanni'am, A. a., Widodo, M. A., Sumitro, S. B., Purnomo, B. B., and Widodo, (2016). The Important Role of Protamine in Spermatogenesis and Quality of Sperm: A Mini Review.亚洲Pac。j .繁殖gydF4y2Ba5,357 - 360。doi: 10.1016 / j.apjr.2016.07.013gydF4y2Ba
CrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Aparicio,。北,B。,Barske, L., Wang, X., Bollati, V., Weisenberger, D., et al. (2009). LINE-1methylation in Plasma DNA as a Biomarker of Activity of DNA Methylation Inhibitors in Patients with Solid Tumors.表观遗传学gydF4y2Ba4,176 - 184。doi: 10.4161 / epi.4.3.8694gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Balhorn, r (2007)。鱼精蛋白家族的精子核蛋白质。gydF4y2Ba基因组医学杂志。gydF4y2Ba8,227。doi: 10.1186 / gb - 2007 - 8 - 9 - 227gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Benjamini Y。,和Hochberg, Y. (1995). Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.j . r . Stat。Soc。爵士。B Methodol。gydF4y2Ba57岁,289 - 300。doi: 10.1111 / j.2517-6161.1995.tb02031.xgydF4y2Ba
CrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
博尔格、a . M。Lohse, M。,和Usadel, B. (2014). Trimmomatic: a Flexible Trimmer for Illumina Sequence Data.生物信息学gydF4y2Ba2114 - 2120年。doi: 10.1093 /生物信息学/ btu170gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
卡斯蒂略,J。阿马拉尔,。,和Oliva, R. (2014). Sperm Nuclear Proteome and its Epigenetic Potential.男科学gydF4y2Ba2,326 - 338。doi: 10.1111 / j.2047-2927.2013.00170.xgydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Cervoni, N。,Detich, N., Seo, S.-B., Chakravarti, D., and Szyf, M. (2002). The Oncoprotein Set/TAF-1β, an Inhibitor of Histone Acetyltransferase, Inhibits Active Demethylation of DNA, Integrating DNA Methylation and Transcriptional Silencing.生物。化学。gydF4y2Ba277年,25026 - 25031。doi: 10.1074 / jbc.m202256200gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Cervoni, N。,和Szyf, M. (2001). Demethylase Activity Is Directed by Histone Acetylation.生物。化学。gydF4y2Ba276年,40778 - 40787。doi: 10.1074 / jbc.m103921200gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
陈,Z。,Shi, C., Gao, S., Song, D., and Feng, Y. (2018). Impact of Protamine I on Colon Cancer Proliferation, Invasion, Migration, Diagnosis and Prognosis.医学杂志。化学。gydF4y2Ba399年,265 - 275。doi: 10.1515 / hsz - 2017 - 0222gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Choudhury, s R。崔,Y。,Lubecka, K., Stefanska, B., and Irudayaraj, J. (2016). CRISPR-dCas9 Mediated TET1 Targeting for Selective DNA Demethylation at BRCA1 Promoter.OncotargetgydF4y2Ba7,46545 - 46556。doi: 10.18632 / oncotarget.10234gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
D 'Alessio, a . C。,Weaver, I. C. G., and Szyf, M. (2007). Acetylation-Induced Transcription Is Required for Active DNA Demethylation in Methylation-Silenced Genes.摩尔。细胞。医学杂志。gydF4y2Ba27日,7462 - 7474。gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
多布林,一个。,Davis, C. A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., et al. (2013). STAR: Ultrafast Universal RNA-Seq Aligner.生物信息学gydF4y2Ba29日,15至21。doi: 10.1093 /生物信息学/ bts635gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
咚,X。,和Weng, Z. (2013). The Correlation between Histone Modifications and Gene Expression.表观基因组学gydF4y2Ba5,113 - 116。doi: 10.2217 / epi.13.13gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Dreos, R。,Ambrosini, G., Groux, R., Cavin Périer, R., and Bucher, P. (2017). The Eukaryotic Promoter Database in its 30th Year: Focus on Non-vertebrate Organisms.核酸Res。gydF4y2Ba45,D51-D55。doi: 10.1093 / nar / gkw1069gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Feinberg, a p (2018)。表观遗传学的关键作用在人类疾病预防和缓解。gydF4y2Ba心血管病。j .地中海。gydF4y2Ba378年,1323 - 1334。doi: 10.1056 / NEJMra1402513gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
福岛,h·S。武田,H。,和Nakamura, R. (2019). Targeted在活的有机体内gydF4y2Ba表观基因组编辑H3K27me3的功能。gydF4y2Ba表观遗传学染色质gydF4y2Ba12日,17岁。doi: 10.1186 / s13072 - 019 - 0263 - zgydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Gius D。,Cu我,H., Bradbury, C. M., Cook, J., Smart, D. K., Zhao, S., et al. (2004). Distinct Effects on Gene Expression of Chemical and Genetic Manipulation of the Cancer Epigenome Revealed by a Multimodality Approach.癌症细胞gydF4y2Ba6,361 - 371。doi: 10.1016 / j.ccr.2004.08.029gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
冈瑟,K。,P一个r一个dowska-Dogan, A., Bärmann, B., Klein, H., Eichel-Streiber, C. V., and Hartley, R. (2015). Expression of Sperm-specific Protamines Impairs Bacterial and Eukaryotic Cell Proliferation.Histochem细胞杂志。gydF4y2Ba143年,599 - 609。doi: 10.1007 / s00418 - 015 - 1309 - 3gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Haeussler, M。Schonig, K。埃克特,H。,E年代ch年代truth,A., Mianné, J., Renaud, J. B., et al. (2016). Evaluation of Off-Target and On-Target Scoring Algorithms and Integration into the Guide RNA Selection Tool CRISPOR.基因组医学杂志。gydF4y2Ba17日,1 - 12。doi: 10.1186 / s13059 - 016 - 1012 - 2gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Hanzawa, N。,Hashimoto, K., Yuan, X., Kawahori, K., Tsujimoto, K., Hamaguchi, M., et al. (2020). Targeted DNA Demethylation of the Fgf21 Promoter by CRISPR/dCas9-mediated Epigenome Editing.科学。代表。gydF4y2Ba10日,5181年。doi: 10.1038 / s41598 - 020 - 62035 - 6gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
希尔顿,i B。,D'Ippolito, A. M., Vockley, C. M., Thakore, P. I., Crawford, G. E., Reddy, T. E., et al. (2015). Epigenome Editing by a CRISPR-Cas9-Based Acetyltransferase Activates Genes from Promoters and Enhancers.生物科技Nat。》。gydF4y2Ba33岁,510 - 517。doi: 10.1038 / nbt.3199gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Iuso D。,Czernik, M., Toschi, P., Fidanza, A., Zacchini, F., Feil, R., et al. (2015). Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.细胞的代表。gydF4y2Ba13日,1765 - 1771。doi: 10.1016 / j.celrep.2015.10.066gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Jeffries m a (2018)。表观遗传编辑:尖端有针对性的表观遗传修饰如何提供自身免疫性疾病治疗的新途径。gydF4y2Ba中国。Immunol。gydF4y2Ba196年,49-58。doi: 10.1016 / j.clim.2018.02.001gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
江,L。,Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., et al. (2011). Synthetic Spike-In Standards for RNA-Seq Experiments.基因组Res。gydF4y2Ba21日,1543 - 1551。doi: 10.1101 / gr.121095.111gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Kaur Gill-Sharma, M。Choudhuri, J。,和D'Souza, S. (2011). Sperm Chromatin Protamination: An Endocrine Perspective.PplgydF4y2Ba18日,786 - 801。doi: 10.2174 / 092986611795714005gydF4y2Ba
CrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Kuscu C。,Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., and Adli, M. (2014). Genome-wide Analysis Reveals Characteristics of Off-Target Sites Bound by the Cas9 Endonuclease.生物科技Nat。》。gydF4y2Ba32岁,677 - 683。doi: 10.1038 / nbt.2916gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Laufer,我。,和Singh, S. M. (2015). Strategies for Precision Modulation of Gene Expression by Epigenome Editing: An Overview.表观遗传学染色质gydF4y2Ba8,34-12。doi: 10.1186 / s13072 - 015 - 0023 - 7gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
米勒,D。,Brinkworth, M., and Iles, D. (2010). Paternal DNA Packaging in Spermatozoa: More Than the Sum of its Parts? DNA, Histones, Protamines and Epigenetics.繁殖gydF4y2Ba139年,287 - 301。doi: 10.1530 /代表- 09 - 0281gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
尼尔森·w·G。,De Marzo, A. M., and Yegnasubramanian, S. (2009). Minireview: Epigenetic Alterations in Human Prostate Cancers.内分泌学gydF4y2Ba150年,3991 - 4002。doi: 10.1210 / en.2009 - 0573gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Oshlack,。,和Wakefield, M. J. (2009). Transcript Length Bias in RNA-Seq Data Confounds Systems Biology.医学杂志。直接gydF4y2Ba4,14-10。doi: 10.1186 / 1745-6150-4-14gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Rius, M。,和Lyko, F. (2012). Epigenetic Cancer Therapy: Rationales, Targets and Drugs.致癌基因gydF4y2Ba31日,4257 - 4265。doi: 10.1038 / onc.2011.601gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
罗宾逊,m D。,米cc一个rthy, D. J., and Smyth, G. K. (2010). edgeR: a Bioconductor Package for Differential Expression Analysis of Digital Gene Expression Data.生物信息学gydF4y2Ba26日,139 - 140。doi: 10.1093 /生物信息学/ btp616gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
罗宾逊,m D。,和Oshlack,。(2010). A Scaling Normalization Method for Differential Expression Analysis of RNA-Seq Data.基因组医学杂志gydF4y2Ba11日,R25。doi: 10.1186 / gb - 2010 - 11 - 3 - r25gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
罗德,C。,Zhang, Y., Reinhardt, R., and Jeltsch, A. (2010). BISMA - Fast and Accurate Bisulfite Sequencing Data Analysis of Individual Clones from Unique and Repetitive Sequences.BMC Bioinforma。gydF4y2Ba11。doi: 10.1186 / 1471-2105-11-230gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Schindelin, J。,Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., et al. (2012). Fiji: An Open-Source Platform for Biological-Image Analysis.Nat方法。gydF4y2Ba9日,676 - 682。doi: 10.1038 / nmeth.2019gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
西蒙•安德鲁斯。(2010)FastQC:高通量序列数据的质量控制工具。可以在:gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
西姆斯,D。,Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., and Ponting, C. P. (2014). Sequencing Depth and Coverage: Key Considerations in Genomic Analyses.Nat,启麝猫。gydF4y2Ba15日,121 - 132。doi: 10.1038 / nrg3642gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
歌,J。,C一个no-Rodriquez, D., Winkle, M., Gjaltema, R. A. F., Goubert, D., Jurkowski, T. P., et al. (2017). Targeted Epigenetic Editing of SPDEF Reduces Mucus Production in Lung Epithelial Cells.点。j . Physiology-Lung细胞。摩尔。生理学gydF4y2Ba312年,L334-L347。doi: 10.1152 / ajplung.00059.2016gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Stepanenko, A。,和Dmitrenko, V. v. (2015). HEK293 in Cell Biology and Cancer Research: Phenotype, Karyotype, Tumorigenicity, and Stress-Induced Genome-Phenotype Evolution.基因gydF4y2Ba569年,182 - 190。doi: 10.1016 / j.gene.2015.05.065gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Tarazona, S。,G一个rcía-Alcalde, F., Dopazo, J., Ferrer, A., and Conesa, A. (2011). Differential Expression in RNA-Seq: A Matter of Depth.基因组Res。gydF4y2Ba21日,2213 - 2223。doi: 10.1101 / gr.124321.111gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
Verdelli C。、《我。Vaira, V。,和Corbett一个,S. (2015). Epigenetic Alterations in Human Parathyroid Tumors.内分泌gydF4y2Ba49岁,324 - 332。doi: 10.1007 / s12020 - 015 - 0555 - 4gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
凌晨,S。,Dhanak, D., Li, H., Armstrong, S. A., Copeland, R. A., Sims, R., et al. (2014). Targeting Epigenetic Regulators for Cancer Therapy.安。纽约私立高中科学。gydF4y2Ba1309年,30-36。doi: 10.1111 / nyas.12356gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
吴,L.-P。,Wang, X., Li, L., Zhao, Y., Lu, S., Yu, Y., et al. (2008). Histone Deacetylase Inhibitor Depsipeptide Activates Silenced Genes through Decreasing Both CpG and H3K9 Methylation on the Promoter.摩尔。细胞杂志。gydF4y2Ba28日,3219 - 3235。doi: 10.1128 / mcb.01516-07gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
吴,t·F。,和Chu,D. S. (2008). Sperm Chromatin: Fertile Grounds for Proteomic Discovery of Clinical Tools.摩尔。细胞蛋白质组学gydF4y2Ba7,1876 - 1886。doi: 10.1074 / mcp.R800005-MCP200gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
吴X。,Scott, D. A., Kriz, A. J., Chiu, A. C., Hsu, P. D., Dadon, D. B., et al. (2014). Genome-wide Binding of the CRISPR Endonuclease Cas9 in Mammalian Cells.生物科技Nat。》。gydF4y2Ba32岁,670 - 676。doi: 10.1038 / nbt.2889gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
杨,a S。,E年代técio, M. R., Doshi, K., Kondo, Y., Tajara, E. H., and Issa, J. P. (2004). A Simple Method for Estimating Global DNA Methylation Using Bisulfite PCR of Repetitive DNA Elements.核酸Res。gydF4y2Ba32,e38-6。doi: 10.1093 / nar / gnh032gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
日元,c . Y。,Huang, H. W., Shu, C. W., Hou, M. F., Yuan, S. S., Wang, H. R., et al. (2016). DNA Methylation, Histone Acetylation and Methylation of Epigenetic Modifications as a Therapeutic Approach for Cancers.癌症。gydF4y2Ba373年,185 - 192。doi: 10.1016 / j.canlet.2016.01.036gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
柳,c, B。,和Jones, P. A. (2006). Epigenetic Therapy of Cancer: Past, Present and Future.Nat。启药物。gydF4y2Ba5,37-50。doi: 10.1038 / nrd1930gydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
张,T。,Zhang, Z., Dong, Q., Xiong, J., and Zhu, B. (2020). Histone H3K27 Acetylation Is Dispensable for Enhancer Activity in Mouse Embryonic Stem Cells.基因组医学杂志。gydF4y2Ba21日45-47。doi: 10.1186 / s13059 - 020 - 01957 - wgydF4y2Ba
《公共医学图书馆摘要》gydF4y2Ba|gydF4y2BaCrossRef全文gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
关键词:gydF4y2Ba表观基因组编辑、PRM1、活化、增殖,肿瘤发生,癌症gydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba哈提卜Namous H,布拉兹铜、王Y和H(2022)鱼精蛋白1的激活使用表观基因组编辑减少致瘤的细胞的增殖。gydF4y2Ba前面。基因组。gydF4y2Ba4:844904。doi: 10.3389 / fgeed.2022.844904gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2021年12月29日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2022年5月26日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2022年6月16日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
c·马丁劳伦斯gydF4y2Ba美国蒙大拿州立大学gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba哈提卜©2022 Namous布拉兹,王。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)。gydF4y2Ba使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba哈提卜哈桑,gydF4y2Bahkhatib@wisc.edugydF4y2Ba