效率和错误修正的镰状突变在人类使用' editor-2红细胞细胞
Anila乔治
1、2
Nithin萨姆拉维
1、2
普拉萨德医生说
1、3
Lokesh Panigrahi
1、3
三亚Koikkara1
Vignesh Rajendiran
1、2
Nivedhitha Devaraju
1、3
约书亚保罗
1
Aswin Anand派2、4
日本中村
5
Kurita良6
Balasubramanian Poonkuzhali
4
Saravanabhavan Thangavel
1
Srujan Marepally
1
沙棘r . Velayudhan
1、4
阿斯利瓦斯塔瓦
1、4
Kumarasamypet m . Mohankumar
1、2*- 1干细胞研究中心(inStem单位,班加罗尔)、基督教医学大学校园,Vellore、印度
- 2Sree Chitra Tirunal医学科学研究所和技术,印度特里凡得琅
- 3印度麦利普高等教育学院,印度麦利普,卡纳塔克邦,印度
- 4血液学、基督教医学院和医院,Vellore、印度
- 5理研生物细胞工程部门,中心,日本茨城县
- 6研究和开发部门,中央血液研究所血液服务总部,日本红十字会,日本东京
镰状细胞贫血(SCA)是一个常见的常染色体隐性单基因疾病,引起的横向点突变(GAG > GTG)第六个β球蛋白基因的密码子,导致溶血性贫血由于脆弱的红血球。基因组编辑的最新进展治疗治愈的SCA引起了人们的关注。直接校正homology-directed修复依赖于SCA突变的双链断裂(双边带)这个目标站点生成beta-thalassaemic突变的风险如果编辑没有错误。另一方面,基础编辑不能纠正致病SCA突变造成> T基础颠换。'编辑器(PE),最近描述基于CRISPR / Cas 9基因编辑工具,使精确的基因操作没有双边带和意想不到的核苷酸变化,SCA是一个可行的方法治疗。然而,使用'编辑的主要限制是低效率尤其是人类红细胞细胞系和初级细胞。为了克服这些限制,我们开发了一个基于模块化lenti-viral '编辑系统的精确建模,并演示了其使用SCA突变及其后续修正人类红细胞细胞系。我们实现了高效安装SCA变异(72%)及其后续修正人类红细胞细胞。第一次,我们演示了成人血红蛋白的功能恢复没有任何意想不到的核苷酸变化或使用PE2 indel地层系统。我们也验证的脱靶效应由最小即使PE2系统是非常有效的目标转换,使之成为一个安全的治疗选择。 Taken together, the modular lenti-viral prime editor system developed in this study not only expands the range of cell lines targetable by prime editor but also improves the efficiency considerably, enabling the use of prime editor for myriad molecular, genetic, and translational studies.
介绍
镰状细胞贫血(SCA)是一种最常见的单基因疾病在世界范围内,由一个单一的横向点突变(GAG > GTG)第六个密码子的β球蛋白(HBB)基因(Brittenham et al ., 1985)。这种突变导致的更换极性与非极性氨基酸(谷氨酸)残留残留(缬氨酸)导致成人血红蛋白聚合条件下的低氧饱和度和红细胞表面获得与增加易感性溶血镰刀形状特征。SCA患者出现溶血性贫血以及其他急性和慢性并发症,如反复发作的疼痛和器官损伤由于阻塞血管的扭曲的红血球(Kavanagh et al ., 2022)。作为一个常染色体隐性障碍,哈佛商学院突变可以出现在杂合的(镰状细胞性状),纯合子(镰状细胞贫血),或复合杂合的状态(结合其他结构或功能β球蛋白变异)和这个频谱的疾病通常称为镰状细胞病(SCD)。镰状细胞性状是一个更少的不利条件和患者不存在临床并发症,除非暴露在极端条件下,可以诱导镰状红细胞表面,但SCA是一种严重的疾病减少寿命和巨大的医疗负担(加藤et al ., 2018)。目前的治疗方法在实践中是羟基脲的管理,可以提升non-sickling胎儿血红蛋白或输血与铁螯合剂能改善non-sickling红血球的数量(普拉特et al ., 1984;Sheth et al ., 2013)。的唯一治疗方法通过SCA是同种异体干细胞移植,但受限于缺乏HLA匹配的捐献者和移植排斥的风险促使其他治疗方法的研究(萨利纳斯西斯内罗斯和登,2020年)。
基因治疗和体外基因组编辑方法证明是成功的,临床前研究和临床试验正经受着持续的(摩根et al ., 2017;Magrin et al ., 2019)。Lenti-viral缺陷的基础方法补充成人血红蛋白non-sickling胎儿或成人血红蛋白是目前的首选策略,但长期的安全问题由于插入突变是未知的(Pawliuk et al ., 2001;Ribeil et al ., 2017;坎特et al ., 2022)。现在基于CRISPR / ca方法获得承认体外由于效率和多功能性基因编辑工具(Barbarani et al ., 2020;普拉萨德et al ., 2021)。先前的研究已经试图纠正哈佛商学院使用同源性定向突变修复(HDR) Cas9但遭受低效率和移植潜力(德威特et al ., 2016)。此外,未修理的indels从双边带在目标网站会导致更严重的beta-thalassemia表型,而不是纠正SCD。多年来尝试提高HDR效率和减少indel形成在目标网站已经成功,但是仍然不能克服普通双边带等带来的风险大的缺失,易位,chromothripsis和p53激活(莱博维茨et al ., 2021;Papathanasiou et al ., 2021;Amendola et al ., 2022)。
基地为关键核苷酸的替换编辑gamma-globin监管元素来模拟天然HPFH条件从而提高胎儿血红蛋白是一个潜在的替代策略治疗SCD (Psatha et al ., 2018,11;Esrick et al ., 2021,11;拉维et al ., 2022)。长串尼克在目标站点的使用使代indels最小和基地编辑被证明是高效安装过渡突变(通过脱氨基嘌呤或嘧啶各自的基地)在CD34 +公司而不影响移植潜力(曾庆红等人。,2020年)。然而,校正横向点突变(T >)是不可能的基本编辑描述到目前为止治疗SCD(构成挑战Anzalone et al ., 2020)。最近,转换的镰状β球蛋白non-sickling血红蛋白变体HbG孟加锡,使用腺苷基编辑器(GTG > GCG, Val >赖氨酸)已经被证明是成功的在体外和SCD小鼠模型。然而,这种方法使用了一个更为常见NRCH PAM从而增加潜在的非目标站点的数量。此外,这种方法需要大量的功能效用特征治疗应用程序(纽比et al ., 2021)。
'编辑CRISPR-based小说编辑工具,允许精确的安装突变基因在目标轨迹不会导致双链断裂(双边带)和有限的PAM限制。体育依靠逆转录酶融合到Cas9 nickase将'编辑指南的突变编码RNA (pegRNA)到目标DNA (Anzalone et al ., 2019)。这种方法提供了几个优势传统基于双边带的方法以及治疗基因的基本编辑编辑。体育使精确的点突变引入包括过渡突变,插入,或删除的基因组区域与双边带相关利益而克服的局限性,因此扩大了基因治疗的范围(Anzalone et al ., 2020)。'编辑概念验证研究中已经成功地利用修正遗传疾病以及发展中遗传疾病的细胞和动物模型(Schene et al ., 2020;佩特里et al ., 2021;Doman et al ., 2022;陆et al ., 2022)。然而,'编辑的效率比其他方法低,细胞可以编辑是有限的。提高编辑效率的一种方法是PE3系统使用额外的gRNA缺口的未经审查的链PE3系统以及针对pegRNA和'编辑(PE2),但据报道,生成InDels中占有相当高的比例。至今为止'编辑没有演示了哈佛商学院的校正突变在人类红细胞细胞和功能评价和安全分析没有实施,这限制了其临床应用虽然Anzalone等人描述了概念证明了修正SCA使用HEK293T细胞。
在这项研究中,我们描述了使用的主要编辑校正哈佛商学院的突变在人类红细胞细胞系(HUDEP2)和演示功能的调整成人血红蛋白在SCA模型效率高和精度。作为体育组件的表达更长时间可能会提高编辑效率,我们开发了一个可选择的双lenti-viral系统交付的PE和pegRNA显示人类红细胞比之前报道的方法高效的编辑和其他细胞系。我们希望这项研究将为治疗的基础体外基因编辑公司治疗化合物和其他beta-haemoglobinopathies。进一步开发的模块化lenti-viral PE交付系统,我们将扩大细胞通道通过'编辑的类型,使有效的筛选和功能评价的主要编辑各种遗传疾病。
材料和方法
质粒结构
质粒pCMV-PE2 (Addgene # 132775), pU6-pegRNA-GG-acceptor (Addgene # 132777)和pU6-Sp-pegRNA-HEK3_CTT_ins (Addgene # 132778)从大卫刘的礼物。pMD2。G和psPAX2(第二代lenti-viral包装构造,Addgene # 12259, # 12260)是迪迪埃Trono送给她的礼物。pLenti_PE2_P2A_Puro向量是由装配放大PE2(从Addgene # 132775;引物表)中列出BamH1和Nhe1消化pLenti-ABERA-P2A-Puro向量(Addgene # 112675;卢卡斯(Dow)使用的礼物NEBuilder HiFi DNA混合装配主按照制造商的指示。Lenti_pegRNA_GFP / RFP向量被删除从pLKO5.sgRNA.EFS gRNA脚手架构造。GFP / RFP (Addgene # 57822/57823;本杰明·艾伯特的礼物)。
设计和克隆pegRNA
PegRNA序列选择从先前出版(细节补充表)。从Addgene pU6-Sp-pegRNA-HEK3_CTT_ins得到(# 132778);研究中使用的所有其他pegRNAs克隆Lenti_pegRNA_GFP / RFP向量。垫片、扩展模板和脚手架序列得到悬臂与各自的寡核苷酸在顶部和底部股促进Goldengate大会补充图S1A)。低聚糖进行了退火对各自集按照以前公布的协议(拉维et al ., 2022)。短暂,1µL正向和反向的寡核苷酸(100点),0.5µL T4 PNK(内),1µL T4 DNA连接酶缓冲(内)和6.5µL H2O是复杂的和低聚糖退火。退火后的顶部和底部的各自的组件,金门装配进行了使用Bsmb1 V2(内)消化Lenti_pegRNA_GFP / RFP向量为骨干。总之,1µL每个1:10稀释退火寡核苷酸(总3µL), 50 ng消化向量,0.5µL T4 DNA连接酶,0.25µL BsmB1 V2 T4 DNA连接酶的酶和1µL混合和体积是10µL使用nuclease-free水。金门组装反应进行了如下:(42°C, 3分钟→16°C, 3分钟)x 30周期,60°C, 5分钟→4°C。反应产品就变成了DH10B主管细胞和镀磅琼脂包含100μg /毫升的氨苄青霉素的选择。选中的殖民地是用菌落PCR验证之后桑格测序按出版协议(拉维et al ., 2022)。阳性克隆在磅肉汤和接种进一步培养过夜。质粒分离使用NucleoBond字母x Midi EF (Macherey-Nagel)设备根据制造商的指示。
细胞培养
HEK293T细胞在DMEM培养(HyClone)补充10%的边后卫和1 x青霉素链霉素。K562细胞中维护RPMI补充10%的边后卫和1 x青霉素链霉素HUDEP2细胞培养在StemSpan™SFEM II(干细胞技术)补充50 ng / ml自洽场(ImmunoTools), 3 U /毫升EPO (Zyrop 4000 IU注入),1 x Pen-StrepµM地塞米松(阿尔法蛇丘),1μg /毫升强力霉素(Sigma-Aldrich)和1 xl谷氨酰胺200毫米(Gibco™) (Kurita et al ., 2013)。红细胞分化HUDEP2细胞进行了使用两阶段红细胞分化媒体。第一阶段媒体包括IMDM glutamax (Gibco), 3% AB血清(MP生物医学),2%的边后卫,0.1%的人类胰岛素溶液(Sigma-Aldrich), 3 U /毫升肝素钠盐(MP生物医学),200μg /毫升整体转铁蛋白(BBI解决方案),3 U /毫升EPO(促红细胞生成素)10μg / ml自洽场,1 ng / ml IL3(免疫工具),1 x Pen-Strep, 1μg /毫升强力霉素。第二阶段媒体类似成分,除了它是缺乏强力霉素和包含500μg /毫升holotransferrin。大约一百万个细胞被用来建立差异化。媒体改变了第三天,细胞被转移到第二阶段媒体在第六天。文化在第9天终止。
转染
2×10 ^ 5 HEK293T细胞被播种在12-well细胞培养皿。confluency到达80%,适当的细胞转染质粒用FuGENE-HD (Promega)按制造商的协议。简单地说,100年µL OptiMem 1000 ng的质粒和3µL FuGENE-HD(1:3比例;扩大在需要时)混合,孵化15分钟,并添加到细胞。媒体改变了24 h后,细胞分离,从72 h年代开始进行分析。'编辑pegRNA比例维持在3:1。
电穿孔
pegRNA质粒electroporated进K562 / HUDEP2 PE马厩使用Lonza 4 d electroporator EN138使用程序。2µg nucleofected质粒的一百万个细胞按制造商的协议。
Lenti-virus生产和转导
2×10 ^ 6 HEK293T细胞被播种在10厘米细胞培养皿DMEM (HyClone)包含10%的边后卫和1 x Pen-Strep。confluency 80%, 2.5μg pMD2。3.5 G,μg psPAX2和4μg lenti-viral向量(PE2或pegRNA构造)转染使用FuGENE-HD按照制造商的协议。病毒上清液使用Lenti-X 48 h后收集起来,然后集中集中器(豆类)。浓缩颗粒在500年resuspendedμL 1 xpbs和储存在−80°c到使用。转导,020万个细胞被12板,10µL玫瑰1 m缓冲区(Gibco)和1µL聚凝胺(西格玛奥德里奇;6毫克/毫升浓度)。病毒是100年解冻,µL添加到每个在800 g, spinfected在室温下30分钟。48 h后改变了媒体和1μg /毫升嘌呤霉素(Gibco)添加了稳定的准备。pegRNA的转导效率进行了分析使用绿色荧光蛋白/ RFP表达式通过流式细胞术(BD钢片琴或BC Cytoflex)。
隔离,DNA测序和分析编辑效率
确定主要编辑效率,从编辑细胞基因组DNA是孤立使用DNA隔离设备(试剂盒)。用于实验,编辑测试顺序随着时间的推移,从大约020万细胞DNA分离使用DNA快速提取(中心)。目标区域放大使用各自的引物(补充表),放大产品是桑格测序。测序数据分析使用Synthego冰(插入/删除)(科南特et al ., 2022)或EditR(替换)Kluesner et al ., 2018)。为下一代测序引物组∼250 bp扩增子的大小和使用适当的适配器(列在表)。使用Crispresso-2门店数据分析(克莱门特et al ., 2019)。
互补脱氧核糖核酸测序
检查编辑在RNA水平,从细胞总RNA是孤立使用NucleoSpin RNA工具包(Macherey-Nagel)和反向转录cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad)按制造商的协议。互补脱氧核糖核酸使用表中列出的引物PCR扩增和桑格测序。使用EditR编辑效率进行了分析。
MLPA
MLPA执行使用莎莎MLPA探头混合P102 HBB 100 ng /μL DNA按制造商的协议。使用Coffalyser软件数据分析和视觉效果。
高效液相色谱法
高效液相色谱法被用来量化血红蛋白变异和个体在分化HUDEP2细胞球蛋白链。细胞被收集,清洗1 x PBS, resuspended双重蒸馏水。然后细胞受到声波降解法后,悬挂在14000转离心10分钟在4°C。浮在表面的收集和储存在-80年到分析。样本分析使用变体II血红蛋白测试系统(Bio-Rad)血红蛋白变体和数据量化Bio-Rad的临床数据管理(CDMTM)软件。个人球蛋白链量化使用反相高效液相色谱法(日本岛津公司Corporation-Phenomenex)。
VCN实时PCR分析
向量在基因组DNA拷贝数分析孤立于稳定的细胞系。针对Cas9基因引物被用来检测主要的集成编辑器。一套引物针对IX因子作为一个内部参考。pCMV-PE2 (Addgene # 132775)和内部质粒构建因子IX cd被用作标准。
'编辑表达式分析实时PCR
RNA被隔离使用NucleoSpin从细胞RNA工具包(Macherey-Nagel)和反向转录cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(BioRad)。马厩的相对表达'编辑相应的野生型细胞相比,使用引物瞄准Cas9量化。GAPDH是用作内部控制正常化。PCR反应是使用SsoFast EvaGreen Supermixes (Bio-Rad) QuantStudio六Flex实时PCR系统(应用生物系统公司)三倍稀释后的cDNA样品之前报道(拉维et al ., 2022)。
单个细胞分类
单细胞分选获得同基因的克隆是利用BD流式细胞仪咏叹调细胞分选仪在96 -格式。桑格测序后,所需的克隆被扩大,用于进一步分析。
住宅细胞内染色
评估的频率HbF-positive细胞,这些细胞被固定,permeabilized,胎儿血红蛋白单克隆抗体和细胞内染色进行使用(HBF-1) APC(英杰公司)如前所述Canver et al ., 2015)。染色细胞被流式细胞术分析(CytoFLEX LX流Cytometer-BC)来衡量HbF-positive细胞的数量。
非目标分析
Cas-OFFinder /粘粒被用来预测gRNA-dependent非目标区域,三个不匹配被允许在选择目标。四大目标被放大并使用Illumina公司MiSeq测序平台(补充表)。CRISPResso2用于数据分析和可视化。
统计数据
所有的分析都使用GraphPad棱镜V8.1和执行p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
'编辑极大扩大治疗范围的基因组编辑与正确的替换产生的各种致病突变的能力,小的插入,删除编辑(Indels),而不产生不良的结果。的一个主要限制在推进这一方法为临床翻译'编辑的效率降低,我们从主力细胞系搬到更专业的细胞系和进一步采取的主要细胞(金et al ., 2021)。这效率下降也阻碍了适当的评估诸如脱靶效应的主要编辑器。因此评估之前'编辑在红色的细胞系的校正SCA突变,我们旨在开发一个可选择的lenti-viral体育系统,不仅可以轻松地在多个细胞系也产生更好的编辑效率比传统的交付方法。
Lenti-viral交付主要编辑器可以有效地跨多个目标站点编辑HEK293T细胞
我们试图开发一个'编辑lenti-viral交付系统,将确保本构组件允许最大的可用性编辑效率。克隆的前景'编辑在一个lenti-viral向量被解雇之前由于其大尺寸(高et al ., 2022)。有限数量的研究使用lenti-viral交付的PE和依靠split-intein方法需要同时提供两个不同的构造和没有显示显著海拔编辑效率(Anzalone et al ., 2019)。然而,与我们过去的成功克隆基本编辑器中为一个基于lenti-viral向量(拉维et al ., 2022),我们认为开发一个类似的'编辑系统,与PE在在另一个向量和pegRNA交付。我们限制了研究PE2系统自多个出版物显示增加indels使用额外的攻击gRNA PE3系统。
'编辑器(PE2)序列(Anzalone et al ., 2019)被克隆成lenti-viral骨干由EF1α(短)启动子被给更好的转基因表达和稳定各种细胞系(Zafra et al ., 2018)。体育序列有关通过裂解肽(P2A)嘌呤霉素耐药基因的选择,允许细胞稳定表达'编辑器(图1一个)。随后,pegRNA克隆成lenti-viral骨干由U6发起人co-express GFP,使积极的选择和验证的转导效率(图1 b;补充图S1A)。我们假定,PE的相对较低的效率比其他基因组编辑策略可以克服长期表达体育通过双重lenti-viral系统将确保体育组件的可用性为多次细胞分裂,直到所需的转换实现的目标站点。此外,该系统将使一代的稳定细胞系表达'编辑器,可用于同时排列筛选多个pegRNAs克服大型体育的不一致与转染质粒。
图1。生成和模块化lenti-viral '编辑系统的描述HEK293T细胞。'编辑器的示意图表示(一)和pegRNA(B)lenti-viral结构在该研究中开发的。(C)概述的一般工作流程主要由双lenti-viral系统编辑。(D)评估主要编辑效率CTT插入HEK3轨迹;效率的双重lenti-viral交付的组件(蓝色)比较对pegRNA质粒的转染HEK293T PE马厩黑暗与光明(绿色)和双转染PE2和pegRNA sanger测序(橙色和红色)的两个不同的时间点。(E)'编辑效率的双重lenti-viral交货在3种不同基因位点评价sanger测序的15天。结果从三个复制绘制平均数±标准差;星号表示的统计显著性水平;一维方差分析与图基的测试是用于组之间的比较。(* * * *p< 0.0001)。
我们第一次验证的效率lenti-viral PE系统HEK293T细胞插入序列在使用之前验证pegRNA HEK3轨迹(总部Anzalone et al ., 2019)。HEK293T PE马厩生成的lenti-viral转导PE2构造其次是嘌呤霉素选择10天(图1 c)。lenti-virus的HEK293T PE马厩要么是转导pegRNA的插入序列或总部瞬变转染pegRNA构造被Anzalone et al。这种方法是比较反对的瞬时转染PE2和pegRNA HEK293T细胞。3和6天后交付的组件,收集细胞,基因组DNA分离和接受sanger测序评估编辑效率。我们提到显著提升编辑效率样本转导的lenti-virus pegRNA相比pegRNA转染样本(图1 d)。这可能是由永久的表达式PE组件的转导样本,lenti-virus整合到宿主基因组。第六天,HEK293T PE细胞转染pegRNA还显示编辑效率高于双转染PE2和pegRNA交付这可能是由于增加剂量的pegRNA独自相比,双转染。提高编辑效率提到与浓度的增加组件交付暗示组件的可用性可能是一个限制因素在决定编辑效率。然而,我们没有发现任何明显的差异在编辑效率的浓度PE2双重转染pegRNA增加,可能是因为的局限性使转染的大型PE2结构。虽然在体育编辑单独pegRNA转染效率稳定与lenti-viral可能低于预期的交付,转染高剂量使筛选多个pegRNAs不需要为每个目标生产lenti-virus。
我们进一步测试系统通过创建在其他两个基因位点突变与前所述pegRNAsRNF+ 1 c > G转换和TATC插入六轨迹(Anzalone et al ., 2019)。Lenti-viral pegRNAs转导HEK293T体育细胞,编辑效率是评价sanger测序的15天。虽然转导效率是相似的在所有三个目标网站(补充图印地),编辑效率的目标之间的差异(图1 e)。之前已经观察到(沃尔夫et al ., 2021),插入序列总部的pegRNA HEK3轨迹编辑效率从∼60%都是最高的,次高插入在第三天到第十五天达到∼100% (图1 e)。RNF C > G转换显示适度的编辑的第三天,增加了∼50%∼20%第十五天。另一方面,六TATC插入没有任何明显的编辑到第9天,大约10%在第十五天获得的最大效率。这些数据表明,尽管pegRNA的可用性和'编辑器并不局限,编辑效率和安装所需的突变可能会有所不同从一个轨迹,需要多个步骤的优化在每个所需的位点。综上所述,模块化的主要编辑的方法,我们已经描述了多功能pegRNAs研究需要广泛的筛选和验证。
高效'编辑在人类红细胞细胞介导的行到lenti-viral输送系统
鼓励体育lenti系统的效率和通用性HEK293T细胞,我们评估了'编辑效率两个常用的人类红细胞祖细胞系(K562和HUDEP2)被广泛用作血液学的临床前模型的研究。尽管'编辑测试K562细胞通过不同的方法,编辑效率较低而HEK293T细胞(沃尔夫et al ., 2021在HUDEP2细胞)和'编辑效率报告是非常小的(Zhang et al ., 2022)。我们提出,在这些细胞系可以克服低效率的组成型表达'编辑组件。我们第一次测试一个瞬态是否交付pegRNA K562和HUDEP2稳定细胞系表达体育可以有效地编辑在HEK293T PE相比细胞和效率对双重lenti-viral交付在人类红细胞细胞系。'编辑的效率在红色的细胞系验证使用pegRNA CTT插入HEK3轨迹,显示最高的编辑HEK293T细胞。在nucleofection pegRNA构造,我们观察到温和的K562细胞中编辑效率(13.6%)和非常低的频率3 bp在HUDEP2细胞插入(1.33%),第三天(图2一个;补充图S2A)。另一方面,pegRNA lenti-viral介导转导,我们实现了高效的插入序列总部的K562细胞相当于或优于先前描述的主要编辑交付方法(沃尔夫et al ., 2021)(图2 b)。我们观察到几乎与编辑效率瞬态(第三天)与lenti-viral交付(第四天)K562细胞(13.6%比15.33%)。然而,我们注意到一个编辑的效率增加了lenti-viral介导交付相比在HUDEP2瞬时转染细胞(1.33% vs 7.33%)。编辑效率高于HUDEP2细胞K562细胞最初的日子但随着时间的推移,达到类似的效率。可以通过第12天的最高效率30%左右在这两种细胞系,尽管总体效率低于HEK293T细胞中观察到的是什么(∼30%比89%)(图2一个;图1 e)。令人惊讶的是,我们还观察到indels在细胞系与瞬态交货是没有看到lenti-viral交付pegRNA的持续可用性的可能是因为lenti PE2编辑系统,直到错误转换实现目标站点(补充图开通)。
图2。在人类红细胞细胞系验证'编辑(一)效率CTT插入HEK3轨迹K562和HUDEP2 PE nucleofection pegRNA质粒的细胞。(B)动态CTT插入效率HEK3轨迹lenti-viral交付在K562和HUDEP2细胞评估sanger测序(C)的数量'编辑矢量综合HEK293T基因组的副本,HUDEP2, K562 PE细胞评估RT PCR。(D)'编辑PE稳定细胞系的表达各自的野生型细胞正常。(E)GFP表达的平均荧光强度体育稳定细胞转导与pegRNA CTT插入。(F)安装效率镰状突变(> T转换)β球蛋白基因在三个不同的细胞系lenti-viral交付衡量sanger测序转导后12天。结果从三个复制绘制平均数±标准差;星号表示的统计显著性水平;一维方差分析与图基的测试是用于组之间的比较。(* *p< 0.01,* * *p< 0.001,p* * * * < 0.0001)。
所有3细胞系是转导与'编辑以及pegRNA构造(就是生存在嘌呤霉素选择和GFP表达)(补充图S2C相比),我们是否有任何差异表达的PE或pegRNA这些细胞系,结果在不同编辑效率之间在同一目标站点。PE2向量的数量本整合到基因组的稳定细胞系被rt - pcr量化。HEK293T没有明显的区别和K562细胞株而HUDEP2细胞表现出更多的向量集成(副本图2 c)。这种模式也反映在PE2 mRNA的表达水平在所有这些细胞系(图2 d)。这些结果从PE2组件的集成和表达式模式没有与编辑效率更高的HEK293T细胞表明'编辑器可用性可能不是唯一决定性因素不同的编辑结果。从pegRNA GFP表达的平均荧光强度也在所有3细胞系和模式相比没有证实编辑在各自的细胞系(图2 e)。编辑效率的差异可能是由于细胞内在影响因素等编辑结果染色质易访问性或存在错配修复蛋白(陈et al ., 2021;费雷拉da Silva et al ., 2022)。
在确保'编辑系统的工作原理有效地在红色的细胞系,我们继续创建HbS的突变(HBBE6V)随着HEK293T细胞K562和HUDEP2细胞株。我们选择可以产生最高的pegRNA编辑效率HBBE6V安装HEK293T细胞Anzalone et al . K562, HUDEP2和HEK293T细胞稳定表达PE2被转导pegRNA和培养12天前编辑效率是评价sanger测序。尽管HEK293T细胞表现出最高的效率为哈佛商学院的创建、编辑的区别并不明显的观察结论插入HEK3轨迹(图2 f)。有趣的是,我们观察到一个更高的编辑安装HbS突变的频率相比CTT插入HUDEP2细胞表明'编辑效率依赖于轨迹,从细胞到细胞变化。令我们吃惊的是,我们没有观察到任何重要的编辑在K562细胞虽然转导效率为100% (补充图S2D)。观察结果是类似于沃尔夫等人在第十天的哈佛商学院的主要编辑创建K562细胞的突变piggy-bac转座子。编辑这些细胞可能增加的效率随着时间的延长的文化细胞(沃尔夫et al ., 2021)。进一步的实验需要执行评估如果这个最小编辑以任何方式与基因表达模式变化K562和HUDEP2细胞或其他表观遗传因素之间内在的细胞系。总之,我们展示高效'编辑没有任何indels或旁观者编辑使用lenti-viral系统在两个不同的人类红细胞细胞系。Lenti-viral介导的突变的主要编辑器允许安装在不易转染细胞系,扩大范围的细胞系,可以编辑。因此,用扩展的通道细胞,有可能利用'编辑其全部潜力在解决广泛的研究问题在不同的研究领域。
模拟人类红细胞细胞系的镰状细胞贫血'编辑收益率更高比例的biallelic HbS突变
尽管其他团体曾展示了SCA的造型在HUDEP2细胞使用CRISPR / Cas-9介导HDR (Demirci et al ., 2020),我们对体育的效率利用lenti-viral交付方法生成SCA HUDEP2细胞的细胞模型。(图3一)。我们选择HUDEP2细胞模型和修正的哈佛商学院突变模仿成人红细胞细胞和主要表达β球蛋白。我们首先描述的动力学的主要编辑HbS突变创造sanger测序的30天在HUDEP2 PE马厩PE组件被选择并lenti-viral矢量显示表达更长时间。大多数的细胞完全转导与pegRNA被GFP表达(补充图S3A)。转导后第二天,安装HbS突变的编辑效率是16%左右,在第30天达到最高∼70% (图3 b)。有一个一致的提高编辑效率实验期间day-26趋于稳定。我们也评估indels在尼克的形成与PE2系统网站,如预期没有indel形成甚至在第30天当整个编辑效率达到了73% (补充图S3B)。这些数据提供了信心,SCA的主要编辑器可用于精确建模与可能获得更多的个人与所需的克隆突变相比,基于Cas9 / HDR的方法。
图3。造型镰状细胞突变在人类红细胞细胞使用'编辑器(一)的示意图表示方法建立镰状突变细胞系使用'编辑器(B)30天的'编辑效率变化HUDEP2 PE细胞转导与pegRNA安装HBB E6V突变衡量sanger测序。(C)代表门店数据整体编辑效率在单细胞排序(D)饼图显示的比例分类根据获得的单细胞克隆β球蛋白基因的基因型(E)MLPA分析图WT探针(绿色)和镰状突变探测(红色)突出显示。WT探测器放大只在未经审查的细胞,而哈佛商学院HUDEP2与镰状细胞显示放大调查。(F)血红蛋白变异的百分比HUDEP2红细胞分化后细胞的高效液相色谱法评估。结果从三个复制绘制平均数±标准差。
SCA表型明显表达时纯合子的条件,因为它是一种常染色体隐性方式遗传。因此,我们进行编辑的单细胞分选细胞第12天获得纯合为进一步克隆哈佛商学院的突变表型的描述。几乎一半的细胞被编辑整理当天的总体编辑效率∼55%,没有一丝不受欢迎的突变或indels (图3 c)。激增的21个克隆,38%是哈佛商学院的纯合子突变克隆(8),编辑和平均效率为72% (图3 d,补充图S3C)。进一步的,除了一个克隆测序显示至少50%所需的突变表明编辑的所有细胞池中细胞被窝藏SCA突变并给予更多的时间这些细胞也可能达到纯合子的转换。我们选择八个克隆显示纯合子HbS转换为进一步实验。克隆是评估胎儿血红蛋白水平,消除任何可能会干扰的变化由于单克隆镰状或成人血红蛋白的精确评价。我们发现的8个克隆与住宅水平升高(补充图S3D)。我们汇集克隆显示较低的住宅和进一步扩大与功能描述在继续之前。
即使多个段落,编辑的纯合性细胞保持没有任何不受欢迎的编辑或indel形成(补充图S3E)。我们进行多路复用结扎依赖探测器放大(MLPA)β球蛋白轨迹使用哈佛商学院的基因组DNA,并得到安装突变,缺乏正常的基因型(HBB E6),和其他地区的完整无缺的球蛋白轨迹(图3 e)。我们进一步分化在红细胞中克隆了8天,产生的血红蛋白变体通过高效液相色谱法进行分析。纯合子的克隆显示几乎完全存在的镰状血红蛋白与未经审查的控制(图3 f)。没有显著改变住宅或HbD这表明成功创建HUDEP2镰状细胞突变的细胞,模拟人类疾病的表型和遗传型的。该池的纯合子的克隆(进一步称为哈佛商学院HUDEP2细胞)是用于校正的概念证明HbS变异使用'编辑器。
我们的研究重申这一事实'编辑可以利用有效的疾病在人类红细胞细胞系造型。然而,可能需要更长一段时间的组成型表达实现bi-allelic突变在目标站点。
无缝校正镰状细胞突变和重组成人血红蛋白使用'编辑器
使用创建的细胞模型的镰状细胞突变在人类红细胞细胞(HbS HUDEP2细胞),我们进行概念验证评估修正的哈佛商学院成人血红蛋白突变和恢复生产(图4一)。生成的细胞模型的主要限制是最初的组成型表达转导pegRNA安装哈佛商学院的突变即使长期培养由于lenti-viral交付。预防纠正等位基因的复原回到哈佛商学院由最初转导pegRNA突变,我们选择了pegRNA校正的突变,将创建一个沉默的PAM突变除了所需的T >转换。pegRNA扩展长25个基点12元引物结合位点(PBS)和13元逆转录酶(RT)模板和类似于一个用于安装在所有方面,除了哈佛商学院的突变SCA突变和沉默的安装PAM变异(GTG >棉酚)。进一步评估的转导效率修正随后转导pegRNA HbS突变而不干扰其他pegRNA lenti-viral向量co-expresses RFP,而不是使用绿色荧光蛋白。
图4。修正的镰状细胞突变在人类红细胞细胞使用'编辑器(一)工作流程的示意图表示修正HbS HUDEP2镰状细胞突变的细胞。(B)编辑效率修正转导后第12天的哈佛商学院突变评价下一代测序(C)修正的镰状突变cDNA sanger测序水平评估(D)产物分析代表个体的百分比球蛋白链在红细胞分化后'编辑(E)血红蛋白变异分析,高效液相色谱红细胞分化后的细胞进行编辑。(F)分析编辑顶部4在网上预测脱靶网站使用门店为目标编辑安装的哈佛商学院的突变HBB基因。结果从三个复制绘制平均数±标准差。
哈佛商学院HUDEP2细胞转导的pegRNA校正哈佛商学院的突变和转导效率估计使用RFP表达式。我们使用普通的向量作为负控制占任何变化在执行第二轮在细胞转导先前pegRNA集成。我们获得∼100%转导效率实验和矢量控制转导细胞,类似于之前所观察到的补充图S4A)。这些数据可以有效地交付给信心,第二个pegRNA并有效表达,即使另一个pegRNA正在持续表达。转导HbS HUDEP2细胞保持文化为12天,编辑效率评估下一代测序。我们发现修正的编辑效率与哈佛商学院的安装变异(47%)(图4 b)。类似编辑效率也观察到cDNA水平表明校正哈佛商学院的变异并不影响转录的HBB基因(图4 c)。甚至没有indel目标站点的生产效率更高的目标转换(补充图S4B)。这些结果强调使用PE2系统编辑的优势在编码区域indel一代将导致疾病表型。进一步分析与MLPA还显示减少编辑SCD突变等位基因的细胞(补充图自己)。
广泛描述哈佛商学院突变的功能效应修正的主要编辑器,编辑细胞培养红细胞分化条件下,分析了血红蛋白的生产。反相高效液相色谱分析显示无显著差异在编辑个人球蛋白链的生产水平细胞相比,控制表明'编辑目标轨迹并不影响翻译效率(图4 d)。我们观察血红蛋白变体分析编辑细胞产生大量的野生型成人血红蛋白(HbA: 49.20±0.16%细胞和5.40±0.15%未编辑),顺便还能减少镰状血红蛋白(哈佛商学院:32.43±0.28%细胞和85.40±0.46%未编辑),这印证了与我们观察到的目标在DNA和RNA编辑水平(图4 e)。有轻微提升住宅+细胞的数量在哈佛商学院突变纠正以及模拟转导HbS HUDEP2细胞相比untransduced亲代细胞(补充图S4D)。随着住宅数量的+水平两个pegRNA转导HbS HUDEP2细胞之间的可比性,海拔可能是由于传导压力和可能不是重要的自镰状血红蛋白水平和γ球蛋白链检测高效液相色谱-分析没有显著改变。自校正错误,没有任何其他的点突变,我们希望成人β球蛋白在缺氧条件下不会产生镰刀。
成功确认后编辑系统的使用SCA HbS突变的修正和改进的表型,我们继续描述pegRNA的安全性。'编辑器比传统的基因被认为是安全的编辑工具需要多个杂交步骤之间的间隔,PBS和RT与各自的模板绑定地区DNA成功'编辑发生(Anzalone et al ., 2019)。几项研究已经报道最小脱靶效应'编辑的全基因组测序和有针对性的放大(金正日et al ., 2020;金et al ., 2021)。然而,重要的是要评估每个pegRNA的脱靶效应在临床验证。
探讨可能的脱靶效应,我们使用了未分类的编辑与pegRNA细胞的转导安装哈佛商学院的突变,而不是单个克隆或镰状细胞纠正的突变。我们认为使用无序编辑细胞提供一个公正的观点pegRNA脱靶效应介导的。pegRNA之间的间隔序列是很常见的,用于创建和调整哈佛商学院的突变,我们假定脱靶效应也会发生在一个类似的频率。我们进行了有针对性的深度测序预测的四大非目标网站在网上工具。我们没有观察到任何网站或日常indels在目标地区。进一步,我们没有观察到任何pegRNA驱动突变四分之三的非目标地点与控制(图4 f)。
唯一的非目标网站显示编辑是高度同源HBD地区几乎8 kb的上游HBBpegRNA有精确的序列同源性基因。正如预期的那样,我们注意到大量的编辑的HBD地区(∼19%)但这转换的频率明显低于编辑观察到目标HBB区域(图4 f)。从目标站点的编辑效率也随着时间的增加一直在观察到目标站点(补充图S4E)。日常编辑不会担心在哈佛商学院的校正突变患者样本WT序列将出席HBD地区。沉默的安装PAM突变仍有可能出现类似的效率HBD非目标网站所看到的桑格测序WT细胞处理pegRNA校正的哈佛商学院突变(补充图S4F)。
此前的研究表明与可编程的核酸酶20 - 30%修正HbS突变患者CD34 +公司就足够了治疗化合物。几乎百分之五十的修正通过'编辑预测更高的可能性编辑细胞窝藏杂合的哈佛商学院的突变。从个体克隆获得基于等位基因频率在哈佛商学院创建和考虑到正常的表型变异的杂合的哈佛商学院突变,我们预计错误转换通过水平的主要编辑器就足够了SCD突变的病人的治疗调整。
讨论
镰状细胞病(SCD)作为一个单基因疾病,由于缺乏其他有效的治疗方法是基因治疗的一个有吸引力的目标(加藤et al ., 2018)。Homology-directed修复和基础编辑已经使用在过去证明SCA的修正,但这两种方法产生可怕的固有局限性。HDR,由双边带可能是有害的在SCA的修正如果indels的比例高是由于创建beta-thalassaemic突变的风险(德威特et al ., 2016)。基本编辑另一方面,不能用于安装T >突变过渡,并依赖于创建Hb-G孟加锡,克服非致病性的Hb变体SCA突变(纽比et al ., 2021)。的功能效率Hb-G孟加锡变体尚未广泛评估。'编辑克服这些问题通过避免双边带和安装精确的T >突变的能力。纠正SCA使用'的概念验证编辑Anzalone等人已被证明的HEK293T细胞;然而,没有研究证明功能校正哈佛商学院的突变和评估的安全使用'编辑在人类红细胞细胞。
在这里,我们试图评估主要编辑校正HUDEP2 HbS突变的细胞使用PE2系统安装没有任何旁观者编辑或indels突变。到目前为止,大部分的体育研究依赖于PE3系统,这需要一个缺口gRNA相反的链来实现更好的编辑效率但也小的风险生成目标站点的插入和删除。不受欢迎的编辑和indels会干扰的评估功能突变尤其是编码区域的影响。改善PE2系统在一种有效的和通用的方式,我们首先开发了一个基于lenti-viral,可以编辑不同的目标网站在各种人类细胞系。这种方法是有效地利用造型HbS HUDEP2的突变细胞进一步用于演示的效用主要编辑校正哈佛商学院的突变。此外,全面评价功能的重建adult-haemoglobin创建SCA细胞模型和评估和脱靶安全性主要编辑器的使用β球蛋白轨迹。
交付方法编辑效率在很大程度上影响' '编辑器的可用性和pegRNA更长一段已被证明,以确保有效的编辑目标站点(Eggenschwiler et al ., 2021;沃尔夫et al ., 2021)。Lenti-viral向量为交付提供一个有吸引力的平台将整合到基因组的PE和既定表示组件。先前的研究试图提供pegRNA和'编辑作为一个全能型lenti-viral向量需要截断版本的体育的发展或交付基于split-intein系统,由于减少转导效率增加向量的大小(Anzalone et al ., 2019;高et al ., 2022)。然而这两种方法编辑效率相当有限和一个全尺寸的lenti-viral向量未能产生任何编辑。我们旨在解决这个问题通过解偶联PE和pegRNA交付和开发出两种不同的结构,可以分别提供的组件。我们展示了这个系统是高效的比其他病毒和病毒性交付方法,甚至能够达到100%的编辑在特定目标网站。此外,基于双重lenti-viral系统可以有效地用于细胞系HEK293T以外,扩大目标'编辑的范围。可能准备的稳定细胞系表达PE可以相互pegRNAs启用有效的排列的多个pegRNAs筛选初始优化。我们也显示的顺序交付两个pegRNAs并不影响的表达从而能够使用lenti-viral系统研究需要双重pegRNA交付。发达双lenti-viral系统极大地提高了目标'编辑临床前研究的范围,并允许高效的pegRNAs比较。
使用基于模块化lenti-viral优化的方法,我们能够编辑难度HUDEP2细胞与编辑效率达到75%使用'编辑2系统。HUDEP2细胞是重要的细胞模型涉及beta-haemoglobinopathies的临床前研究,因为他们可以很容易地分化成红细胞血统和表达成人血红蛋白可量化的水平。除了评估'编辑工具校正的突变,这种方法便于使用'编辑在理解球蛋白生物学和基因转换的能力介绍精确突变具有更高的效率。提高编辑效率由lenti-viral PE系统也克服了需要单细胞排序对于大多数应用程序避免偏见与克隆选择当评估相关的基因表达。我们希望lenti-viral系统可以用于其他类型的细胞,促进相关研究在不同领域。
造型HUDEP2 beta-thalassaemic突变的细胞已经被另一个研究小组尝试但显示非常低效率(Zhang et al ., 2022)。我们能够安装HbS突变以非常高的效率和获得高比例的纯合子与SCA突变克隆。我们也没有观察到任何小尼克的插入或删除网站即使编辑效率达到了70%以上。这可以归因于PE2系统的使用,不产生任何不受欢迎的突变(费雷拉da Silva et al ., 2022)。PE2系统将是一个更好的选择涉及编码区域或地区序列完整的研究中需要保存的表型结果将是一个准确反映安装编辑甚至不受副产品到最小的程度。产生的模型系统,我们开发了镰状血红蛋白只在不损害任何其他的表达球蛋白链。开发了模型系统的主要缺点是体育的组成型表达和pegRNA '编辑研究限制它的使用不受最初转导pegRNA的表达。瞬态的主要编辑组件可以克服限制虽然效率降低,需要交付的信使rna或RNP复杂和筛选大量的克隆获得所需的纯合子编辑克隆。
修正SCA突变是评估使用开发模型细胞系使用pegRNA安装无声PAM突变除了纠正HbS突变。沉默的安装PAM突变会克服的限制与最初转导pegRNA的表达有关,这是用于创建HbS突变。我们演示了高效的校正HbS突变以及验证的功能生产正常成人血红蛋白同时编辑效率。这演示了效用的主要编辑修正现在可以被评估的哈佛商学院突变SCD患者CD34 +公司通过优化交货。在编辑在日常网站的评估,尽管其他不相干的网站没有编辑,我们注意到一个更高频率的编辑delta-globinβ球蛋白基因高度同源。这可能没有任何结果的校正SCD突变患者CD34 +公司的相应序列delta-globin将完好无损。该系统还提供了一个平台安装的高效筛选pegRNAs突变,最好的可采取的进一步评估患者CD34 +公司从而降低主细胞所需的数量遗传操纵以及减少支出。然而,这个声明可以普遍之前,'编辑效率的比较特定的轨迹在不同细胞系和CD34 +公司需要执行正如我们所观察到的细胞类型依赖编辑效率的变化为同一pegRNA即使PE和pegRNA表达水平是一致的。产生的变异可能是由于细胞内在因素或基因表达谱,需要一个彻底的评估开发改进版本的PE特定细胞类型的问题。此外,我们和其他人已经注意到一个一致的增加与组成型表达'编辑效率随着时间的推移,暗示细胞分裂依赖的主要编辑一个瓶颈在编辑主要细胞(沃尔夫et al ., 2021)。
交付基地编辑与合成gRNA mRNA在公司已被证明有效地编辑。Hanqin等人相比不同的交付模式'编辑在人类诱导多能干细胞,发现PE mRNA结合合成pegRNA给编辑效率最高(李et al ., 2022)。类似的方法将是最适合在公司'编辑和最近在总理描述修改编辑器(PE马克斯,PE4和PE5)和pegRNA (epegRNA)可以提高整体效率(陈et al ., 2021;纳尔逊et al ., 2022)。PE的交付整合酶缺乏Lenti病毒(IDLV)可能是另一个可行的方法编辑病人派生CD34 +公司(Ortinski et al ., 2017)。'编辑已被证明产生最小的染色体畸变与双边带调节方法,因此编辑细胞移植潜在的改善治疗效果可能更好。
最后,目前的研究表明模块化lenti-viral PE交付系统的开发,可以编辑效率和精度高跨多个细胞系和不同的基因位点。这种方法被用来精确模型和正确的哈佛商学院突变(HBBE6V)没有任何不良的转换在HUDEP2细胞β球蛋白的功能调整和安全'编辑的特征是广泛的第一次。总体而言,我们的研究范围不仅扩展了应用程序和主编辑difficult-to-transfect细胞,但也提供了一个全面的临床前评价pegRNA校正的化合物。结果为临床前评估提供了一个框架的主要编辑CD34 +公司修正的血液紊乱不仅限于化合物。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,PRJNA905550。
作者的贡献
AG-Conceptualization、方法调查、形式分析、可视化、数据管理、原创作品草案;NR、KP LP、SK、VR, ND, JP-methodology, writing-review和编辑;- ap, PB-methodology和资源;YN, RK-resources;圣,SM-writing -检查和编辑;SRV-methodology、资源writing-review和编辑;——项目管理、writing-review和编辑;KMM——概念化、监督形式分析、数据管理、融资收购,项目管理,资源,原创作品草案,审查和编辑。所有作者阅读和批准提交的版本。
资金
这项研究是由NAHD格兰特:BT / PR17316 /地中海/ 31/326/2015(生物技术部门,新德里,印度)。我们真诚地承认CSCR (inStem单位,CMC校园,Vellore,印度)提供启动资金。AG)的高级研究奖学金支持科学和工业研究理事会,印度。虚拟现实是印度支持由印度生物技术部高级研究奖学金。
确认
太太,我们感谢尤妮斯博士Sindhuvi Sumithra Neelagandan先生的血液学,CMC,帮忙用高效液相色谱法变体。我们要感谢Sandhiya Gopinathan和B Vaishnavi Muthuraman博士为技术援助和N的批判阅读手稿。我们感谢CSCR核心设施支持我们与所有必要的工具来执行这项工作。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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关键词:CRISPR '编辑、镰状细胞贫血,血红蛋白病,β球蛋白
引用:乔治,拉维NS,普拉萨德K, Panigrahi L, Koikkara年代,Rajendiran V, Devaraju N,保罗•J Pai AA,中村Y, Kurita R, Balasubramanian P, Thangavel年代,Marepally年代,Velayudhan SR,斯利瓦斯塔瓦和Mohankumar公里(2022)效率和错误修正的镰状突变在人类使用' editor-2红细胞细胞。前面。基因组。4:1085111。doi: 10.3389 / fgeed.2022.1085111
收到:2022年10月31日;接受:2022年12月05;
发表:2022年12月20日。
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