利用开花植物生殖细胞/组织的基因组编辑方法
艾丽卡户田拓夫
Norio加藤
Tetsuya这个1而且
隆Okamoto- 1东京大学生物科学系，日本东京
- 2东京都大学生物科学系，东京，日本
有针对性的突变通过包括聚簇调节间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9 (Cas9) (CRISPR/Cas9)系统在内的可编程核酸酶已广泛用于生成包括开花植物在内的基因组编辑生物。迄今为止，在生殖细胞或组织中特异性表达Cas9蛋白和引导RNA (gRNA)被认为是最有效的遗传靶向突变基因组编辑方法之一。在本报告中，我们综述了生殖细胞或组织的基因组编辑方法的最新进展，这些细胞或组织在将遗传物质传递给下一代中起着重要作用，如卵细胞、花粉粒、合子、未成熟合子胚胎和芽尖分生组织(SAMs)。Cas9蛋白在启动细胞中的特异性表达可有效诱导靶向突变通过农杆菌属介导的在足底转换。此外，通过将CRISPR/Cas9组件直接递送到花粉粒、受精卵、胚胎细胞和sam中进行基因组编辑，已成功建立了基因组编辑植物系。值得注意的是，通过递送Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNPs)进行的无dna基因组编辑与转基因生物的任何立法担忧无关。综上所述，生殖细胞或组织的基因组编辑方法不仅在植物繁殖的基础研究中具有巨大的潜力，而且在分子植物育种的应用科学中也具有巨大的潜力。
简介
利用可编程核酸酶(如锌指核酸酶)进行靶向诱变的技术(Urnov等人，2010)、转录激活子样效应核酸酶(TALENs) (Cermak et al.， 2011)和rna引导内切酶(RGENs)的研究正在迅速发展，并在促进基础科学和应用科学方面具有巨大潜力。可编程核酸酶在基因组DNA的目标位点上产生双链断裂(dsb)，这些dsb可以通过两种独立的途径进行修复:非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR) (罗斯和威尔逊，1986年；Puchta等人，1993年；Moore和Haber, 1996；Jasin和Rothstein, 2013)．
在RGENs中，聚集调节间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9 (Cas9) (CRISPR/Cas9)系统为快速和经济有效的程序开发铺平了道路，以在植物中创建新的突变群体(Belhaj等人，2013；2013年丹尼尔)．一般来说，CRISPR/Cas9表达盒和可选择标记被整合到质粒DNA中，并将构建物递送到植物细胞中通过农杆菌-介导转化或粒子轰击(库马尔和贾恩，2015年；Luo等，2016)．将构建物整合到基因组DNA中的植物系由可选择标记选择，基因组编辑的植物系可以通过目标位点的测序筛选。然而，植物生命周期中CRISPR/Cas9的本构表达在体细胞中产生了很大比例的非遗传突变(冯等，2014)，并在植物基因组编辑中增加非特异性位点的DNA切割可能性，即所谓的脱靶修饰(劳伦斯等人，2015年)．为了诱导可遗传突变和减少脱靶修饰，在生殖细胞或组织特异性启动子下通过CRISPR/Cas9表达的基因组编辑系统已经开发出来，我们将在本综述的后面总结。
在动物中，为了产生感兴趣的遗传特征，在体外编码Cas9和gRNA的转录rna直接传递到卵子或受精卵中，从而高效地生产转基因动物(Hwang et al.， 2013；王等，2013)．在被子植物中，虽然雌性配子、合子和胚胎存在于深嵌于胚珠组织的胚囊中(罗素1992；Raghavan 2003)，这些从花中分离出来的生殖细胞/组织已成功用作直接递送CRISPR/Cas9载体或预组装Cas9蛋白引导RNA (gRNA)核糖核蛋白(RNPs)的靶点。此外，茎尖分生组织(SAMs)包括一个表皮下细胞层，L2，生殖细胞随后在花器官发生过程中从其发展，也是可遗传基因组编辑方法的目标组织。在这篇小综述中，我们总结了目前利用植物生殖细胞/组织(如卵细胞、花粉粒、合子、胚胎和SAM)进行基因组编辑的方法，基于靶向突变和脱靶突变的频率。
细胞/组织特异性Cas9表达拟南芥启动细胞
一般来说,农杆菌属介导的在足底将CRISPR/Cas9表达盒引入拟南芥．广泛表达的Cas9蛋白和gRNA高效地进行靶向基因修饰;然而，只有在生殖细胞中产生的基因修饰才能传递给下一代(冯等，2014)．为了有效地诱导可遗传的靶向突变，种系的特定启动子(伸长率因子- 1α（EF1α)启动子;Osakabe等人，2016)和卵细胞(电子商务启动子;王等，2015；郑等，2020,DD45启动子;毛等，2016)已成功用于Cas9-gRNA复合物的外源性表达拟南芥．此外,核糖体蛋白5a（RPS5A)启动子，在卵细胞形成过程的开始具有组成性活性，被证明可以有效地驱动Cas9的表达拟南芥女性生殖细胞(图1一个；Tsutsui和Higashiyama, 2017)．除了Cas9在雌性配子中的优先表达外，该研究还发现SPOROCYTELESS（SPL)基因组表达盒，特异性表达在孢子细胞和小孢子细胞，已用于男性种系特异性Cas9表达拟南芥配子体(毛等，2016)．此外,姚该启动子优先在胚囊、胚、胚乳、花粉和SAM中活跃，已被用于Cas9 (严等，2015)．这些方法有效且优先地在目标位点上产生具有高度多样性突变的子代。
图1．植物生殖细胞或组织的基因组编辑方法概述。(一)农杆菌属-介导的植物转化与CRISPR/Cas9载体，其中Cas9表达启动子特异性表达拟南芥启动细胞。矢量信息是参照的Tsutsui and Higashiyama (2017)．(B)CRISPR/Cas9载体在烟草花粉粒中的生物传递虚线箭头表示未经过实验测试的程序。(C)PEG-Ca2 +用CRISPR/Cas9载体或Cas9- grna RNP介导水稻受精卵的转染。(D)CRISPR/Cas9载体或Cas9- grna RNP生物传递到小麦胚胎和sam细胞中。使用BioRender.com．
在足底基因靶向利用卵细胞特异性Cas9表达拟南芥
除了基于nhej的基因组编辑，启动细胞的细胞/组织特异性启动子已应用于Cas9表达，以诱导遗传基因靶向(GT)拟南芥．在这种策略中，表达Cas9的亲本系在卵细胞和早期胚胎特异性下DD45启动子与HDR供体DNA的递送结合使用，可提高基因组编辑活性，获得约5.3%-9.1%的高效GT (Miki等人，2018)．沃特等人(2018)还证明了在泛素启动子下使用Cas9导致种子低频率地发生GT事件，而在卵细胞特异性启动子下使用Cas9控制是最有效的方法，实现了约1%的种子频率。这些结果表明，使用生殖细胞或组织特异性启动子是实现遗传靶向突变的有效基因组编辑方法通过无论是NHEJ还是HDR农杆菌属介导的在足底转换。
直接向花粉粒输送大分子
粒子轰击可用于将大分子输送到各种组织中，如未成熟的合子胚胎、叶盘和愈伤组织，并且不受植物-宿主范围的限制(Altpeter等人，2005年)．花粉粒结构简单，含有雄性生殖细胞，很容易从花药中分离出来。因此，直接将CRISPR/Cas9载体导入烟草benthamiana花粉通过生物传递触发了花粉粒的基因组编辑，轰击的花粉使花粉管伸长和精子细胞进入胚囊(表1；Nagahara等人，2021)．虽然生物传递条件和种子检测方法有待优化，但这种使用花粉粒的传递方法可能广泛适用于获得具有靶向突变的后代(图1 b)．此外，将外源物质输送到花粉粒的过程已通过各种方法得到证实(Eapen et al.， 2011；赵等，2017；Bhowmik等人，2018)．最近,Lei et al. (2021)有报道使用花粉特异性Cas9表达进行基因组编辑吗通过农杆菌属棉花的真空渗透。此外，磁性纳米颗粒已被报道为一种转化花粉颗粒的新生理过程(赵等，2017)，虽然花粉磁感应只适用于棉花粉(Vejlupkova等人，2020年)．
表1．通过直接将CRISPR/Cas9组件传递到植物生殖细胞或组织进行基因组编辑。
PEG-Ca2 +用CRISPR/Cas9成分介导受精卵的转染
在动物中，为了产生感兴趣的遗传特征，在体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA或预先组装的Cas9蛋白-sgRNA复合物直接注射到合子中，从而高效地产生双等位基因突变体(Gratz et al.， 2013；Hwang et al.， 2013；王等，2013)．在被子植物中，基因组编辑系统通过CRISPR/Cas9载体或Cas9- grna RNPs直接递送到水稻受精卵最近已被开发出来(图1 c；Toda等人，2019年)．将CRISPR/Cas9载体或Cas9- grna RNPs转染水稻受精卵在体外独立配子的受精(IVF)通过聚乙二醇钙2 +)介导的转染(Koiso等人，2017)．此后，在没有选择剂的情况下培养处理过的受精卵，结果再生出具有目标突变的水稻植株，频率范围约为4%-64% (表1；Toda等人，2019年)．除水稻外，玉米也已建立体外受精系统(Kranz和Lörz, 1993)和小麦(Maryenti等人，2019年)，这表明基于合子的基因组编辑方法也适用于其他作物物种。
CRISPR/Cas9组件生物递送到胚胎和sam细胞中
虽然粒子轰击将CRISPR/Cas9表达盒递送到未成熟的合子胚胎中已显示出成功的基因组编辑，但在子代植物中观察到孟德尔分离畸变(Svitashev等人，2015)．一种可能是CRISPR/Cas9的本构表达导致体细胞突变，导致嵌合植物(冯等，2014；Svitashev等人，2015)．因此，为了克服这一问题，在玉米中开发了直接将Cas9-gRNA RNPs传递到胚胎细胞中的基因组编辑方法，靶向突变的频率在2.4%-9.7% (表1；Svitashev等人，2016)．同样，在小麦中获得了2.2% ~ 4.4%含有目标突变的再生植株(图1 d；表1；梁等，2017)．
除了胚胎，在足底利用CRISPR/Cas9载体生物传递对小麦sam进行转化，保持其发育成花器官的潜力，已被报道为一种新的转基因技术在足底粒子轰击(iPB)方法，在5.2%的轰击植物(图1 d；表1；滨田等人，2018)．值得注意的是，iPB法是一种不需要愈伤组织培养和再生过程的非培养方法。此外，最近已经建立了一个将Cas9-gRNA RNPs直接递送到小麦sam的系统，并且在潜在的脱靶位点没有发现突变(表1；Kumagai等，2022年)．
讨论
在动物中，已经建立了使用生殖细胞、受精卵和胚胎的基因组编辑方法，通过诱导可遗传的遗传变化来获得基因组编辑的生物(库珀等，2017年；Lea和Niakan 2019；Koslova等人，2020年)．在这篇小型综述中，我们描述了利用植物生殖细胞或组织进行高效和精确基因组编辑的基因组编辑方法。在拟南芥Cas9蛋白在启动细胞(如生殖细胞、卵细胞和SAMs)中的特异性和充分表达对于高效的靶向诱变至关重要农杆菌属介导的在足底转换(详见大阪和大阪，2017年)．
除了农杆菌属-介导方法，基因组编辑通过将CRISPR/Cas9组件直接递送到植物细胞或组织已经被开发出来。值得注意的是，通过将Cas9-gRNA RNP直接递送到体细胞原生质体中，可以避免将外源DNA序列引入基因组DNA的无DNA基因组编辑已经实现通过PEG-Ca2 +-介导的转染，比如在烟草中拟南芥、生菜、大米(吴等，2015年)，佩妮（Subburaj等人，2016)、葡萄藤、苹果(Malnoy等人，2016)、土豆(安德森等人，2018)和番茄(Liu等，2022)．虽然基于体细胞原生质体的基因组编辑可以利用大量的分离细胞进行转染，但由于植物再生困难和获得低频率的基因组编辑植物，将其广泛应用于广泛的植物物种仍然是一个重大挑战。
农杆菌属基于-介导转化和体细胞原生质体的基因组编辑尚未应用于某些植物种或品种;相比之下，直接将大分子传递到生殖细胞或组织的新系统有可能应用于在广泛的物种或栽培品种中生产基因组编辑系。直接将Cas9-gRNA RNPs导入水稻受精卵的基因组编辑方法(通过PEG-Ca2 +介导转染;Toda等人，2019年)、玉米和小麦的胚胎细胞(通过粒子轰击;例如,Svitashev等人，2016；梁等，2017)，以及小麦SAMs细胞(通过粒子轰击;Kumagai等，2022年)已成功建立。因为外源DNA序列引起了有关转基因生物的立法关注(琼斯2015年)、基因组编辑水稻、小麦和玉米的生产通过Cas9-gRNA RNPs在基因功能研究和分子植物育种中具有重要的应用价值(Gu等人，2021)，并可减少偏离目标的更改频率(吴等，2015年；Svitashev等人，2016；梁等，2017)．
dsb主要是修复通过除了hdr介导的玉米胚细胞NHEJ基因编辑外，本方法中NHEJ信号通路均未被检测到(Svitashev等人，2015)．因此，基因靶向通过当Cas9-gRNA RNPs和供体DNA在生殖细胞/组织中传递时，HDR途径原则上可以应用并发挥作用。尽管需要进一步优化rnps供体DNA成分的制备和传递程序，以生产在目标基因组位点拥有供体DNA的基因组编辑系，但这些使用不同植物物种或栽培品种的植物生殖细胞/组织的方法有可能加速一系列不同的研究。这包括基础研究，例如，与开花植物配子分化、受精、胚胎发生和胚乳发育等生殖和发育事件相关基因的功能分析，以及分子植物育种的应用科学。
作者的贡献
ET构思了这篇综述。ET写了一份手稿草稿，并准备了图表和表格。NK、TH、TO编辑定稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
资金
这项工作在一定程度上得到了日本农林水产省(MAFF委托进行的项目研究，批准号为。JPJ008723)和日本科学促进协会(资助JSPS研究员，资助号21J01093和资助早期职业科学家，资助号21K15126给ET)。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
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关键词:CRISPR/Cas9，胚胎，启动细胞，靶向诱变，植物，花粉粒，茎尖分生组织，合子
引用:Toda E, Kato N, Higashiyama T和Okamoto T(2023)在开花植物中使用生殖细胞/组织的基因组编辑方法。前面。基因组。4:1085023。doi: 10.3389 / fgeed.2022.1085023
收到:2022年10月31日;接受:2022年12月30日;
发表:2023年1月11日。
编辑:
Jochen Kumlehn德国莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所(IPK)审核:
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*通信:艾丽卡户田拓夫,etoda@g.ecc.u-tokyo.ac.jp