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前面。基因组。2022年11月10日
秒。在血液疾病基因组编辑
卷4 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fgeed.2022.1050507

CRISPR核酸酶日常活动和缓解策略

Beeke Wienert ¹

¹石墨生物有限公司、南旧金山、钙、美国
²外科学系,加州大学,旧金山,旧金山,加州,美国
³生物工程和治疗学系,加州大学,旧金山,旧金山,加州,美国
⁴Eli并广泛的再生医学中心,加州大学,旧金山,旧金山,美国CA

CRISPR允许特定站点的发现基因组改造成为现实,现在这种技术被应用在许多人体临床试验。虽然这种技术展示了令人印象深刻的功效在诊所到目前为止,仍然存在潜在的意想不到的——而非目标效应的CRISPR核酸酶的活动。各种各样的在网上的预测工具和经验开发了实验方法来识别最常见的意外effect-small插入和删除在指导RNA基因组同源性的网站。然而,大规模的畸变最近报道如易位,倒置,删除,甚至chromothripsis。这些是很难发现使用当前工作流显示主要的未满足的需求。综述我们总结潜在sequencing-based解决方案可以检测这些即使在低频率发生大规模的影响。此外,许多现有的临床试验使用CRISPR涉及体外隔离患者自身的干细胞,修改和筛选标准。然而,越来越多的直接兴趣,在活的有机体内交付基因组编辑工具。虽然这个战略有可能解决疾病的细胞类型中不服从体外操纵,在活的有机体内编辑只有一个理想outcome-on-target编辑感兴趣的细胞类型。CRISPR活动意外的细胞类型(和非目标)是组织的一个主要安全以及伦理问题,可以使生殖系的传播。在这次审查中,我们总结了当前编辑的优缺点和交付工具和潜在的改进非目标和off-tissue CRISPR活动检测。我们还概述了潜在的缓解策略,将确保CRISPR会跟上的安全有效性,如果这个技术是必要的要求,充分发挥其转化的潜力。

介绍

基因疗法和非目标基因组编辑

基因治疗来纠正,添加或修改许多遗传病基因拥有更大的潜力,包括人、免疫缺陷和溶酶体储存障碍。从历史上看,基因疗法被称为viral-mediated基因,然而这有可能破坏重要基因或激活癌基因由于半随机基因集成(Hacein-Bey-Abina et al ., 2008)。基因编辑工具,如CRISPR-Cas、取得、大型核酸酶或锌指核酸酶因此成为令人兴奋的选择由于能力目标基因组的特定网站。其中,越简单,模块化设计CRISPR指南的rna (gRNA),它直接中科院基因组蛋白质互补的站点,让他们的首选工具的研究和临床应用。正在进行的临床试验使用CRISPR-modified细胞发表了结果没有任何不良事件为基因组编辑在T细胞(陆et al ., 2020;Stadtmauer et al ., 2020)和造血干细胞和祖细胞(公司)(Frangoul et al ., 2021)。此外,第一个临床试验使用CRISPR-Cas9转体基因治疗淀粉样变通过编辑肝细胞在活的有机体内报告了一小群患者的疾病表型的改进(Gillmore et al ., 2021)。这些早期的临床试验突出CRISPR-Cas9治疗疾病的巨大潜力,但缺乏长期随访数据支持人类的安全。

临床基因组编辑的一个担忧是可能造成意想不到的DNA的改变可能会对细胞产生不利影响函数(图1)。这些不受欢迎的后果可以来源于目标或非目标编辑造成不必要的插入和删除(indels)或更大的重组(结构性变异(sv))如易位、倒置和重复。领域已经取得了很大的进步在发展中检测不受欢迎的编辑事件的方法在网上,在DNA游离在体外,在活细胞体外(布拉特纳et al ., 2020),但通常是具有挑战性的链接基因组改变它们对细胞的影响健康和功能。例如,非目标indels发生在一个基因沙漠有表型的影响,虽然有些indels在目标站点上可能会导致异常的信使rna和蛋白质产品(Tuladhar et al ., 2019),显著影响细胞功能(Lindeboom et al ., 2019)。作为CRISPR-Cas9基因组编辑走向在活的有机体内治疗性应用,使这种联系变得更加关键罕见的事件可能是有害的,如果发生在一个致癌上下文。此外,在活的有机体内应用程序执行的风险——和非目标基因组编辑在一个意想不到的细胞类型,如生殖系或其他组织。

图1

图1。突出的问题在治疗基因组编辑应用程序,以确保安全。Indels:插入和删除;sv:结构性变异。创建BioRender.com。

这个领域正在迅速发展和新技术来量化意外修改不断被开发和评估。此外,没有广泛共识最合适的需要采取措施,全面评估CRISPR脱靶的频率和风险活动,发表在高影响力杂志或临床前FDA。雷竞技电竞体育竞猜平台因此本文将总结字段的当前状态的方法来评估和非目标基因编辑的方法开发的最新进展体外和在活的有机体内编辑工作流程和策略完全缓解和减少非目标和off-tissue编辑。

方法找到非目标站点在基因组编辑应用程序

CRISPR-Cas编辑在病毒基因组的一个主要好处是除了是专门针对一个基因位点,而不是依赖于随机整合。然而,随着基因组包含数十亿碱基对,CRISPR-targeted序列有可能near-match别处。事实上,它已被证明,Cas9和其他核酸酶往往会降低高度同源的序列根据不匹配的位置和基因组上下文(马里et al ., 2013 a;傅et al ., 2013;许et al ., 2013;Pattanayak et al ., 2013)。找到这些不相干的网站是至关重要的,这样意想不到的风险基因事件可以评估和最小化(图2)。

图2

图2。当前非目标检测方法的挑战和可能的解决方案。创建BioRender.com。

有很多可用的计算工具识别高度同源的基因组序列,从而预测潜在的非目标网站CRISPR-Cas9活动(Bae et al ., 2014;Cradick et al ., 2014;Heigwer et al ., 2014;蒙塔古et al ., 2014;肖et al ., 2014;朱et al ., 2014;辛格et al ., 2015;除梗器et al ., 2015;Concordet Haeussler, 2018;Aprilyanto et al ., 2021)。机器学习的应用到大型实验数据,进一步提高了预测能力的生物信息学工具(艾伦et al ., 2018;沈et al ., 2018;湘et al ., 2021),尽管这些算法偏向于输入gRNAs和参考基因组用于构建他们的预测。识别可能的地区的日常活动后,筛选genome-edited细胞必须确认是否这些网站CRISPR活动的迹象。这是最常使用的目标序列测序候选站点与标准板实现检测的变异在5%或以下频率(斯塔克斯et al ., 2021),而indels可能较低的检出限(0.2 -1%)根据测序深度(Chaudhari et al ., 2020)。

另外,一些实验方法已经被开发出来找不相干的网站可能没有被gRNA角度预测基于同源性。这些方法差别很大的方式甚至起始物料,使用基因组游离DNA在体外(金正日et al ., 2015;卡梅伦et al ., 2017;蔡et al ., 2017;金和金,2018年;Lazzarotto et al ., 2020),在完整的活细胞体外(Crosetto et al ., 2013;蔡et al ., 2015;燕et al ., 2017;Wienert et al ., 2019;2020年;朱et al ., 2019;多布斯et al ., 2022),在活的有机体内动物模型(Akcakaya et al ., 2018;Wienert et al ., 2019;梁et al ., 2022)。方法使用细胞——nucleosome-free DNA通常报告最多的非目标,其中许多在细胞无法验证上下文(克罗默et al ., 2022 a)。此外,GUIDE-Seq等方法已被证明能够识别更多的非目标网站比当分析主要细胞永生化细胞系(夏皮罗et al ., 2020)。这强调了染色质上下文和DNA修复的重要性因素在决定治疗相关的日常活动。甚至当使用完整的细胞作为输入到这些化验,得出的结论与累积变异永生化细胞系,扭曲的分析和功能失调的DNA修复途径(Mittelman和威尔逊,2013年;Passerini et al ., 2016)可能混淆的临床相关性识别不相干的编辑。

尽管这些无数策略检测脱靶indels,最近的研究表明,体外编辑公司抒发很少真正的非目标网站(< 1真的不相干的网站/ gRNA)当使用临床相关的工作流(克罗默et al ., 2022 b)。真正的网站,都是高度同源的序列和大多数预测的目标在网上方法包括在这项研究。然而,一些来源表明,遗传变异中人们可以影响日常活动(Lessard et al ., 2017;Lazzarotto et al ., 2020;克罗默et al ., 2022 a)。因此,实施个性化的特定的工作流程可能需要在基因治疗产品来规避这个问题。常见的单核苷酸多态性可以考虑在网上预测,在体外方法可以通过使用个性化基因组DNA提取病人样本(蔡et al ., 2017;Lazzarotto et al ., 2020),和一些细胞的方法是适合使用主细胞来自患者(Wienert et al ., 2019)。然而,这种类型的个性化的非目标分析受限于成本,物流的可行性,和病人的可用性材料。

综上所述,研究人员广泛的工具,使他们可以识别潜在的非目标网站在网上,在DNA游离在体外,在活细胞体外,在动物模型。通过应用这些工具的实验设计合理治疗基因组编辑策略,非标靶基因编辑可以被识别,并可以采取措施来减少这些意想不到的事件。

方法在双链断裂检测结构变化

虽然上述非目标检测方法是最有用的识别本地化的影响(双边带),DNA双链断裂规模较大脱靶效应已经被观察到。这些包括染色体易位等重组总值(削et al ., 2020;Stadtmauer et al ., 2020;萨缪尔森et al ., 2021),chromothripsis (莱博维茨et al ., 2021)和非整倍性(Amendola et al ., 2022;Nahmad et al ., 2022)。易位事件经常发生的后果:1)目标乳沟和重组基因的同源区域(Turchiano et al ., 2021);2)在一个目标和非目标序列同时劈理(Lattanzi et al ., 2021);或3)在多路复用多个目标乳沟事件后编辑工作流(卡西姆et al ., 2017;削et al ., 2020;Stadtmauer et al ., 2020;萨缪尔森et al ., 2021;Diorio et al ., 2022)。此外,大规模删除周围减少站点或染色体的末端可以发生(Cullot et al ., 2019),以及copy-neutral loss-of-heterozygosity (Boutin et al ., 2021)。

虽然有针对性的扩增子测序通常用于小indels报告的网站,最标准的测序方法只允许测序的相对较短的扩增子(数百个碱基对)。检测和量化大规模、multi-kilobase事件与pcr测序方法因此仍然具有挑战性的(图2 b)。这是由于几个原因:1)任何可以消除引物结合位点的删除不会有效地放大与标准测序方法将错过;2)如果引物结合位点保存大删除可以斜PCR反应扩增子短和高估删除事件;和3)其他不受欢迎的目标事件可能包括倒置、基因的复制和大型插入(Skryabin et al ., 2020),也可以规避pcr的检测方法。新No-Amp远程避免PCR和测序协议而不是使用CRISPR-Cas9丰富兴趣多达几十个碱基的序列。这种PCR-free策略绕过了尺寸偏差和可以识别大型删除和其他结构性变异的目标站点。然而,有限的阅读深度可以很难检测和量化base-calling低频事件和低精度的一些方法可能不会实现单一碱基对决议(朗et al ., 2020)。然而,如果这些测序方法能够改善和变得更便宜,他们可能成为评估的标准结构变异后基因组编辑。

除了大的删除,其他基因组异常保持技术挑战性的捕捉,尤其是当发生在低频率。识别易位的目标网站与其他基因组区域,几个化验开发(郑et al ., 2014;胡锦涛等人。,2016年;卡西姆et al ., 2017;Giannoukos et al ., 2018;阴et al ., 2019;Turchiano et al ., 2021)在目标站点上使用一个序列作为“诱饵”,下一代测序和生物信息学识别“猎物。“这使得识别基因组序列已经融合到目标站点。另一个生物信息学方法分析multiplexed-PCR数据和非目标网站上使用特定易位检测管道(Amit et al ., 2021),这些事件将会从已有的量化数据。

交付方式的基因组编辑工具还可能带来意想不到的效果。例如,如果核酸酶或DNA修复模板是由腺相关病毒(AAV),有异源集成的可能性的末端反向重复(也是)可能发生(Hanlon et al ., 2019;纳尔逊et al ., 2019),但是这可能对邻近基因的影响很小如果promoter-less模板。引入双边带的核酸酶增加数量的异源集成AAV载体序列(米勒et al ., 2003;米勒et al ., 2004),然而整个频率似乎是由基因决定的背景和事件总量的0.06%和12.5%之间(Hanlon et al ., 2019)。这些罕见的事件可以与远程捕获测序方法或最近开发的新一代测序方法,名为ITR-Seq (布列塔尼的et al ., 2020),它可以识别和量化ITR集成在全基因组的基础上独立于目标网站。

总之,该领域已经取得了很大的进步在发展中方法可以识别结构变体包括删除、倒置、重复、插入和易位。然而,这些事件的绝对量化仍然具有挑战性由于发生的低频。虽然有前途,小说远程测序策略仍然缺乏阅读的深度和质量相比,传统的测序方法。作为结构性变异多样性目前不可能单一的分析捕获所有可能的事件,但未来的测序技术的进步可以让这成为现实。

方法来识别意想不到的编辑事件在活的有机体内

大多数CRISPR-based疗法目前在诊所依赖隔离patient-derived干细胞,体外修改和筛选标准。这种方法从而地址匹配的捐献者的有限的可用性和免疫排斥反应或移植物抗宿主病的风险与同种异体移植。然而,这些策略只是兼容细胞类型可能安全地隔离,修改体外移植到患者后,如公司。因此,下一个前沿将提供基因编辑组件直接修改细胞体内驻留的地方。

为此,许多交付模式已经开发和优化转导临床相关的细胞类型在活的有机体内(长et al ., 2016;戈尔茨坦et al ., 2019;Mangeot et al ., 2019;Gillmore et al ., 2021)。这些平台现在被用来包装和交付CRISPR-based编辑工具在活的有机体内,这表明最初的成功在第一个人体临床试验。这些试验的一个最突出的是由Intellia, liver-tropic脂质纳米粒(LNP)被用来提供Cas9 mRNA gRNA特定于竞技场队伍基因以转体基因治疗淀粉样变(Gillmore et al ., 2021)。这个策略有效地降低血清竞技场队伍从人类患者的基线水平高达87%,作为一项具有里程碑意义的研究Cas9达到临床疗效的端点。而在活的有机体内Cas9交付被发现很有效的在这种情况下,有有限的数据收集确认安全除了在这些患者没有严重不良事件。

当交付编辑工具在活的有机体内,只有一个理想outcome-on-target编辑的目的CRISPR裂解位点的目标组织(图3)。然而,许多意想不到的后果可能发生以下为患者提供的编辑工具在活的有机体内,如:1)非标靶基因的活动目标组织(非标靶,对组织);2)目标基因活动意想不到的组织类型(能够切中要害,off-tissue);和3)非标靶基因活动意想不到的组织类型(非标靶,off-tissue)。Off-tissue生殖腺是特定的临床事件和伦理问题,因为这些可能会导致生殖系的变化可能会传染给病人的后代(Turocy et al ., 2021)。尽管有这些恐惧和使用的方法来检测脱靶Cas9活动在活的有机体内在动物模型(Akcakaya et al ., 2018;Wienert et al ., 2020;梁et al ., 2022),没有研究调查了意外事件的频率以下交货日期的编辑工具对人类患者在临床上下文体内。Cas9-LNP竞技场队伍的重要文章,只有调查非目标活动是由GUIDE-Seq表演体外在肝细胞(Gillmore et al ., 2021)。虽然这有助于定位网站的潜在非目标活动在病人的基因组,这些结果没有验证在活的有机体内。在最简单的形式中,临床常规肝活检可能是前和产后的(也许在网站从肝动脉远近现况会进入肝脏)量化和非目标活动的频率取决于组织的网站。然而,这种方法会产生小肝外的洞察CRISPR活动,据报道,尽管这LNP编辑脾脏,肾上腺和卵巢可检测频率。尽管肝脏可能很容易检查,这不是一个常规过程对于许多其他组织,尤其是卵巢。因此介绍确保安全的一个主要障碍在活的有机体内CRISPR交付。

图3

图3。可能的结果的体内基因组编辑。

遗传物质的潜在来源,可以获得以微创的方式来确定后有意和无意的编辑事件的频率在活的有机体内CRISPR交付是基因组游离DNA (cfDNA)。CfDNA主要是来自死亡的细胞基因物质释放到血液中。由于这个原因,分析cfDNA可能是一个强大的方法来检测潜在的致病性的影响CRISPR交付,的基因毒性或致癌编辑事件。虽然cfDNA主要被用于诊断空间探测发生/复发的癌症(Bronkhorst et al ., 2019),这种技术足够的样本母体血液发现很敏感新创在怀孕期间胎儿突变(Kitzman et al ., 2012)。事实上,一个概念验证研究使用cfDNA插入地图网站在活的有机体内交货慢病毒载体(Cesana et al ., 2021)。因此,一个类似的策略可以用来量化和非目标的频率分裂活动在活的有机体内CRISPR交付。但是,与慢病毒插入映射的工作流开发依赖于排序向量骨干外,地图网站CRISPR活动可以帮助定义高发地区的活动。这可能是使用在网上或经验上面定义非目标检测方法,候选区域可以探测indels cfDNA的有针对性的深度测序。另一种方法,不需要定义CRISPR不相干的网站先天的可以使用易位的代理和非目标活动LAM-HTGTS等改进技术(胡锦涛等人。,2016年),CAST-Seq (Turchiano et al ., 2021),或者PEM-Seq (阴et al ., 2019)使用病人细胞或cfDNA作为输入。此外,如果使用cfDNA从外周血分离成功,类似的方法可以用来检测CRISPR活动发生脑脊液(CSF)和量化的能力基因组编辑工具穿过血脑屏障和编辑细胞驻留在大脑中,这可能不是安全检查。

虽然cfDNA量化目标和非目标编辑提供了一个机会,它可能给小洞察起源的组织。阐明这个没有侵入性活检,使用无细胞RNA (cfRNA)是一种可能性。类似于使用cfDNA,工作流从外周血分离cfRNA已经开发,允许洞察的组织起源的主要表达模式细胞向血液中释放DNA和RNA (张et al ., 2019)。虽然tissue-of-origin的程度可以从这种方法尚未充分探讨,调查和脱靶CRISPR活动预计在cfRNA乳沟网站可以确定是否有意或无意的基因组编辑导致转录组的变化。由于CRISPR非目标活动的网站通常驻留在基因间区域的基因组与任何已知的功能性意义(克罗默et al ., 2022 b),有可能cfDNA CRISPR活动将被探测到,但不是在转录cfRNA。这可能是一个重要的测量分析的有效性和安全性在活的有机体内编辑后立即治疗交付以及随着时间的推移。结合cfDNA / RNA的方法也可能是一个有效的方法来检测致病性克隆扩张后编辑细胞治疗。在这种特定的用例,它可能没有必要确定启动驱动程序基因组事件,但即使oligoclonality乘客暂时作为特定indel——或常见的非目标网站可以允许我们推断克隆扩张正在发生。重要的是,提出的策略最有可能捕获和监测的频率小定位indels和更复杂的方法可能需要(如前所述)来识别大型基因畸变cfDNA / RNA。

基因组的结果与非目标的意义

即使我们能够成功识别脱靶CRISPR效果,确定一个意想不到的编辑事件的关注病人的健康仍然是具有挑战性的图1)。一般来说,非标靶基因事件最有可能引起任何影响或导致损失或获得健康。而失去健康可能会导致辍学的细胞携带着不受欢迎的事件,获得健身更令人担忧的是由于致肿瘤性的可能性。尽管特定站点脱靶效应并不常见(克罗默et al ., 2022 b),如果他们发生时,直接破坏另一个基因的可能性很小(只有1%的人类基因组编码DNA和只有7.2%的预测脱靶网站exon-targeting gRNAs下降其实地区)。虽然修改非编码DNA序列可能改变基因表达模式或修改元素到重要作用(编码项目协会,2012)解释非编码基因中断是很困难的。我们理解的非编码DNA区域的功能改善,我们可以更好地预测未来的非目标修改的影响。在那之前,我们必须依靠方法可以测量从不相干的修改事件致肿瘤性和毒性在体外或在活的有机体内。

最传统的方法来评估细胞的致瘤性产品植入细胞在免疫缺陷小鼠异位站点监测肿瘤的生长和其他不良事件(人类基因治疗产品将人类基因组编辑| FDA)。该方法的一个主要的警告是有限的敏感性,取决于使用的动物模型,可能会错过低频事件(佐藤et al ., 2019)。替代在活的有机体内方法已经开发出技术来追踪单克隆细胞后的产品体外公司编辑和移植通过条形码包含在HDR模板(法拉利et al ., 2021;Sharma et al ., 2021)或通过跟踪indel多样性(魔法师et al ., 2022)。这些技术可以识别克隆扩张异常,提示对基因组事件,导致致癌的转换。目前这些方法仅限于研究应用程序,但也有可能被纳入治疗在未来工作流。然而,在活的有机体内研究时间——和cost-intensive可以减缓药物开发过程无比。因此,在体外研究测定致肿瘤性或基因组不稳定性将是首选,尽管这些可能不正确的概括在活的有机体内活动。在执行全基因组测序对每个病人每个细胞产品将确保一个公正的方法在整个基因组变异的发现,当前有限覆盖每个碱基对会想念低频事件。使用一个中间外显子组测序的方法最常见的突变致癌基因和肿瘤抑制显著增加阅读的深度,可以提供一个可行的替代评估的安全体外基因治疗药物产品(克罗默et al ., 2022 a)。

上述工作时专注于意想不到的脱靶效应,甚至意想不到的在—target效应会导致不利影响。例如,当治疗编辑方法目标编码序列击倒一个致病基因正确的疾病表型(Gillmore et al ., 2021)——indels将形成减少现场的数组。最近的一份报告表明,Cas9-induced indels可能导致破坏的形成,非天然的mrna,可以翻译成异常蛋白质产品(Tuladhar et al ., 2019)。本研究发现indels可以诱发内部核糖体进入位点产生替代mrna或诱导外显子跳过通过扰乱exon-splicing增强剂。同样的研究也提供了一种生物信息学工具来帮助设计gRNAs避免这样的事件(Tuladhar et al ., 2019)。因为截短蛋白产品可以发挥主导负函数(萨瓦河et al ., 2006蛋白质),潜在不受欢迎的翻译应该仔细研究。正确描述genome-edited细胞群结合目标与信使核糖核酸扩增子测序序列和蛋白质组学可能允许我们识别和开发策略来减少此类事件的发生。

综上所述,连接基因组事件致肿瘤性和目前是困难的在体外和在活的有机体内化验往往缺乏敏感度。进展开发条码技术可以追踪转化细胞和外显子组测序和RNA等下一代测序方法还可以帮助确定致癌事件。

减少非目标和off-tissue编辑方法

当我们了解更多关于类型的编辑事件可以发生在非目标网站,许多研究人员正在开发的方法来减少非目标效应。这些努力包括蛋白质工程使核酸酶更特定于小说的发现,更具体的运载工具的基因组编辑试剂在活的有机体内(图4)。

图4

图4。策略来减少意外基因组编辑事件。创建BioRender.com。

小心核酸酶选择和gRNA选择往往是在设计的第一步新创基因组编辑策略(李et al ., 2016)。而许多CRISPR核酸酶被发现(斯沃茨Jinek, 2018;李和彭,2019年),绝大多数临床努力到目前为止使用原酶的特征之一,酿脓链球菌Cas9 (SpCas9) (Jinek et al ., 2012)。核酸酶是最常见的一种由于其相对非限制性的protospacer相邻主题(PAM)和高频的乳沟活动各种各样的位点在各种细胞类型的生物,从人类到拟南芥(马里et al ., 2013 b;杨爱瑾et al ., 2018)。虽然这核酸酶通常很少有基因组非目标活动的网站,其中一些可以减少高频等位基因窝藏indels(> 30%),根据特定的特异性gRNA (克罗默et al ., 2022 a)。为了解决这个问题,更具体的版本Cas9所改造,减少非目标活动> 20倍(陈et al ., 2017;Vakulskas et al ., 2018;布拉沃et al ., 2022;卡尔克撒et al ., 2022)。在这一过程中,将这些高保真Cas9变体已经被证明可以减少大规模基因组重组的风险(Turchiano et al ., 2021)。除了工程更具体的核酸酶,核酸外切酶的研究,融合Cas9 TREX2为了防止完美的DNA修复报告显著减少大型删除,几乎消除了染色体易位在T细胞(多路复用编辑阴et al ., 2022)。

的格式Cas9 delivered-most经常DNA,信使rna或核糖核蛋白(RNP)——改变Cas9表达式和曝光时间。这反过来又影响日常活动,与短半衰期RNP mRNA日常活动导致低于长期DNA配方(卡梅伦et al ., 2017;陆et al ., 2019;Zhang et al ., 2021)。此外,可调/诱导控制策略结合使用生物小分子调节CRISPR的表达,(Truong et al ., 2015;赵et al ., 2018),光(Nihongaki et al ., 2015),甚至磁铁(许,胡锦涛,2019)。同样,其他组织已经开发出self-inactivating Cas9 AAV传递向量,可以防止长时间暴露于基因组编辑工具,因此减少意想不到的活动或基因的可能性事件(李et al ., 2019;Ibraheim et al ., 2021)。然而,根据这些策略应用的工具,还有潜在的非目标活动或大规模基因组重组后建立双边带。此外,在他们当前的形式,大多数方法只是兼容体外编辑工作流程,高效的大型有效载荷是可能的。

所有nuclease-based基因组编辑应用程序依赖双边带分辨率,因此修改自然细胞的DNA损伤修复途径已经成为战略增加的比率旨在意想不到的基因组事件(叶et al ., 2019;雪和格林,2021年)。例如,瞬变抑制异源端加入(NHEJ)介质如53 bp1或依赖dna的蛋白激酶催化亚基会降低indels和增加精确基因组编辑结果通过homology-directed修复(罗伯特et al ., 2015;精明的et al ., 2018;Riesenberg Maricic, 2018;Riesenberg et al ., 2019)。虽然做了一些工作,以确定哪些DNA修复酶是负责小indels(的形成Hussmann et al ., 2021),所知甚少的因素,促进大型删除。最近,一项研究克隆的胚胎干细胞缺陷库,用于DNA修复基因发现NHEJ-mediating酶抑制频率的增加很大的缺失,而抑制microhomology-mediated joining-mediating蛋白质减少(Kosicki et al ., 2022)。当然,这是至关重要的,以确保暂时抑制DNA修复酶不影响其他区域的细胞的基因组。另一项研究表明,存在一个HDR模板如单链oligodeoxynucleotide或AAV捐赠者可以大缺失的频率降低50% -80% (温家宝et al ., 2021),强调测试的重要性意想不到的编辑结果中核酸酶和DNA供体。

虽然Cas9核酸酶技术的不断改善,最近编辑工具取代这核酸酶nickase介绍单碱基对变化或小特定站点修改,最常见的形式的单一或双nickase编辑(et al ., 2013年),基本编辑(Komor et al ., 2016),或'编辑(Anzalone et al ., 2019)。尽管这些工具避免双边带的形成和可能减少大规模基因组重组的频率,还有意想不到的日常活动的可能性。基地和主要的编辑,这源自拘束Cas9脱氨酶和反转录酶,分别。事实上,一些研究报道,基地编辑可以启动非目标活动网站很少gRNA同源性(金et al ., 2019;左et al ., 2019;Lei et al ., 2021)和一个重要的细胞信使rna的比例(Grunewald et al ., 2019 a)。此外,基地editor-induced修改往往单核苷酸变异较难检测的下一代测序比本地化indels引入传统CRISPR核酸酶。持续努力继续这些基地的工程师改进版本编辑器来减少非目标活动(里斯et al ., 2017;Grunewald et al ., 2019 b;李et al ., 2022)。

上面的进步主要关注编辑工具本身,这是最有可能提高目标效果和减少意外不相干的后果。然而,这些改进可能会影响对组织的比例有限off-tissue活动后在活的有机体内编辑工具。为此,许多组织正在努力提高交付模式本身的特异性。这包括筛查向量或有特定的组织取向纳米颗粒,如优化穿过血脑屏障,转导维管组织,和更多的(白色et al ., 2004;Choudhury et al ., 2016;西米et al ., 2018;Boehnke et al ., 2022)。也有努力共轭细胞特定类型的抗体交付向量来改善目标在活的有机体内交货(Tombacz et al ., 2021)。虽然初步的,这种方法可能是一个有效的方法来提高对组织编辑时注入系统交付向量。

在开发的早期阶段,但由于巨大的转化潜力,是编码逻辑进入细胞(即策略。介绍DNA代码的能力对一个给定的细胞状态)。与CRISPR一样,许多这些努力使用RNA-based同源性促进下游转基因的表达在一个用户定义的RNA序列(绿色et al ., 2014,2017年;Kaseniit et al ., 2022)。一些概念验证研究证明,这种技术可以用来编码复杂的逻辑进入细胞,如多输入,或者,而不是门。尽管这项工作的完成大肠杆菌或人类细胞系,如果一个类似的系统移植到临床相关的主要细胞只能允许基因组编辑工具表达在细胞与特定基因表达profile-effectively减少或消除off-tissue活动。

结束语

上述所有努力都旨在减少意外的非标靶和off-tissue活动。然而,由于数百万或数十亿细胞移植体外疗法,和数十亿或数以万亿计的细胞可能会相互作用在活的有机体内交付向量,任何程度的意想不到的活动有可能是有害的。詹妮弗Doudna表示,有一天,她希望看到CRISPR成为一个“标准”(珍妮弗·Doudna和威廉·卡尼)。如果这成为现实,我们如何让这些疗法经常交付给病人足够安全吗?

而任何操纵基因打开不必要的基因事件的可能性,我们相信非目标/ off-tissue检测方法的进步和改善基因组编辑工具和交付模式最终将允许个性化医疗成为现实。高级工具的发展让我们越来越复杂的功能(甚至逻辑)引入到细胞,我们可能需要建立日益复杂的安全机制。这些可能包括自动或诱导安全开关,提供必要保障临床不良事件的实例(Di史塔西et al ., 2011;梁et al ., 2018;马丁et al ., 2020)。虽然初始数据(从CRISPR-based治疗诊所体外和在活的有机体内)已显示出惊人的承诺,随着越来越多的患者得到基因组编辑处理,我们必须确保编辑安全会跟上功效。如果CRISPR成为标准治疗,那么所有的人们最基本的生物学家,合成生物学家,bioinformaticists,医生会将努力确保基因组编辑尽可能安全的疗法。

作者的贡献

BW和廊坊开发区生成的数据和写的手稿。

资金

廊坊开发区是由基因和细胞治疗的美国社会职业发展奖项以及国家心脏、肺、血液研究所的R01 (HL135607)。

的利益冲突

BW是当前员工和股票持有者在石墨生物,Inc .以营利为目的的公司。

其余作者宣称,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

引用

Akcakaya, P。,Bobbin, M. L., Guo, J. A., Malagon-Lopez, J., Clement, K., Garcia, S. P., et al. (2018).在活的有机体内CRISPR编辑没有可检测全基因组的非目标突变。自然561年,416 - 419。doi: 10.1038 / s41586 - 018 - 0500 - 9