全基因组测序的CCR5CRISPR-Cas9-edited毛里求斯猕猴猕猴卵裂球揭示大规模删除和不相干的编辑
珍娜·克鲁普施密特
1*,
Yun庆熙金1,
尼克Strelchenko
1,莎拉·r·Gierczic1,德里克Pavelec2,
撒迪厄斯·g·“格罗斯”
1、3、4
__和
伊戈尔。Slukvin
1、5、6
__
- 1威斯康星大学麦迪逊分校威斯康星州国家灵长类动物研究中心,麦迪逊,美国WI
- 2威斯康辛大学生物技术中心,威斯康星大学麦迪逊分校,麦迪逊,美国WI
- 3比较生物科学部门,威斯康星大学麦迪逊分校,麦迪逊,美国WI
- 4威斯康星-麦迪逊大学妇产科学系,麦迪逊,美国WI
- 5病理学和实验室医学系,威斯康星大学麦迪逊分校,麦迪逊,美国WI
- 6细胞和再生生物学,威斯康星大学麦迪逊分校,麦迪逊,美国WI
作品简介:基因组编辑CRISPR-Cas9方法提供了引入的承诺或纠正疾病有关的突变研究和临床应用。非人灵长类动物在生理上更接近人类比其他实验动物模型,提供理想的候选人介绍人类疾病的发展人类疾病有关的突变模型。CRISPR-Cas9-edited人类胚胎的大型染色体异常的发生率和细胞权证编辑综合基因型的调查结果在灵长类动物的胚胎。我们的目标是评估和非目标编辑结果CCR5CRISPR-Cas9-targeted毛里求斯猕猴猕猴的胚胎。
方法:DNA从单个卵裂球分离两个胚胎,父亲和母亲的DNA,受到全基因组测序(WGS)分析。
结果:大猕猴卵裂球中删除目标网站,没有以前用pcr方法检测到。新创突变也确定预测CRISPR-Cas9非目标地点。
讨论:这是第一次报告的WGS CRISPR-Cas9-targeted非人灵长类动物胚胎细胞的分析,编辑效率高的加上编辑错误的发生率在从两个胚胎细胞。这些数据表明,综合sequencing-based编辑方法是保证评估结果在灵长类动物的胚胎,以及任何合成后代确保观察表型是由于目标编辑并不是由于不明不相干的突变。
1介绍
基因组编辑的进步,特别是使用CRISPR-Cas9技术,促进疾病有关的突变的介绍和校正在动物和细胞培养模型。非人类的灵长类动物(额定马力)优越的建模人类疾病方面的相似的免疫,神经和生殖生理学和非常适合移植和神经发育障碍的研究。人类疾病的兴趣创建额定马力模型增强了需要更好地定义疾病的病因和治疗方法的发展和治疗(运货马车et al ., 2018;雅培et al ., 2019;Moshiri et al ., 2019;Tapmeier et al ., 2021;Ozirmak et al ., 2022)。例如,抗人类免疫缺陷病毒(HIV)一直在观察人类的32个碱基对缺失患者CCR5基因(CCR5-Δ32)。CCR5作为艾滋病病毒受体(院长et al ., 1996;刘et al ., 1996;参孙et al ., 1996)。移植的造血干细胞(hsc)包含CCR5-Δ32突变与人类艾滋病患者导致艾滋病毒感染的治疗在一些但不是所有情况下(Hutter et al ., 2009;阿勒斯et al ., 2011;亨利克先生et al ., 2014;康明斯et al ., 2017)。产生额定马力与CCR5删除将帮助确定艾滋病病毒的机制消除同种异体移植后肝星状细胞CCR5突变和临床协议的发展可再生的艾滋病毒治疗(施密特et al ., 2022 b)。
基因组编辑方法创建基因中断额定马力胚胎已经成功,然而CRISPR-Cas9-induced染色体异常的证据在哺乳动物细胞和胚胎有必要进一步研究灵长类动物胚胎的胚胎编辑结果。CRISPR-Cas9编辑已被证明导致大规模删除(6 kb)和全染色体丢失导致基因组不稳定性在小鼠胚胎干细胞(Kosicki et al ., 2018)和胚胎(Adikusuma et al ., 2018;Papathanasiou et al ., 2021)。CRISPR-Cas9编辑在人类胚胎导致的损失目标等位基因(Zuccaro et al ., 2020)和节段性染色体损失(Alanis-Lobato et al ., 2021)。此外,大规模删除在非目标站点也观察到人类胚胎(Zuccaro et al ., 2020)。杂合性丢失周围CRISPR-Cas9瞄准的目标网站是另一个结果中观察到人类胚胎(Zuccaro et al ., 2020;Alanis-Lobato et al ., 2021)。总的来说,这些研究揭示了不受欢迎的,当使用野生型和非目标发生突变Cas9在人类和小鼠胚胎基因修正。
我们之前证明CRISPR-Cas9编辑的CCR5在毛里求斯的猕猴猕猴(MCM,猕猴属fascicularis)胚胎使用pcr方法确认成功目标轨迹(施密特et al ., 2020)。本研究的目的是全面评估和不相干的编辑在CRISPR-Cas9-edited MCM胚胎使用全基因组测序(WGS)调查单个卵裂球的方法。分子分析发现大规模删除导致个体胚胎内镶嵌性比以前使用pcr方法确定。鉴于大规模和不相干的突变可能会阻碍建立可行的怀孕,进一步优化猕猴胚胎编辑来避免针对错误将是必不可少的促进代小说额定马力为人类疾病模型。
2材料和方法
2.1动物
推导MCM胚胎的方法分析了在目前的研究以前报道(施密特et al ., 2020)。父母的DNA来自于一位女性(12年)和男性(6年)MCM用于这项研究。所有程序都按照美国国立卫生研究院执行指南的护理和使用实验室动物和威斯康星大学麦迪逊分校的批准下字母和科学学院和副总理办公室研究和研究生教育机构的动物保健和使用委员会。
2.2隔离CRISPR-Cas9注入胚胎DNA
在体外受精毛里求斯猕猴猕猴胚胎产生如前所述(施密特et al ., 2020)。简单地说,一个细胞阶段胚胎microinjected Cas9包裹着两个sgRNAs针对外显子2的CCR5基因形成了核糖核蛋白(RNP)。胚胎培养个人的microwell CultureCoin MIRI-TL菜(丹麦,能源管理公司医疗)包含25μL全球媒介覆盖与矿物油和培养皿放置在米里TL延时孵化器(医疗)能源管理公司监控胚胎发展。个人从两个胚胎卵裂球被捕的6芯和笔记本阶段被孤立。透明带是被治疗1毫克/毫升的链霉蛋白酶激活E (Sigma-Aldrich,猫没有:P2730)和胚胎被钙- magnesium-free PBS和价格下跌0 EDTA和1毫克/毫升白蛋白(MP生物医学,猫没有:823051)。单个卵裂球被轻轻移液分离胚胎。DNA是放大从单个卵裂球使用REPLI-G单细胞工具包(试剂盒,猫没有:150343)。
2.3 CCR5的PCR分析目标编辑单个卵裂球
PCR扩增进行如前所述评估目标CCR5区域(施密特et al ., 2020)使用引物,扩增短(613个基点)或长(2925个基点)周围的扩增子预测网站。PCR产品运行在1.2% - -1.5%琼脂糖凝胶在120 V。目标CCR5编辑决定通过可视化预期的野生型(未修改)CCR5PCR扩增子的大小613个基点或biallelic突变产生415个基点的产物。评估大规模删除目标站点附近的远程CCR5PCR进行。PCR引物序列和预期扩增子大小中列出补充表S1。使用Q5 PCR反应进行热态启动高保真DNA聚合酶装备制造商的建议。凝胶电泳进行了使用标准的方法来可视化扩增子。
2.4隔离的父母的DNA
血从卵母细胞和精子捐赠者的vitro-produced胚胎进行获得父母的外周血单核细胞的DNA。使用快速DNA基因组DNA从血细胞分离Miniprep工具包(Zymo研究,猫没有:D3024)。
2.5 DNA质量评估
DNA质量评估的威斯康辛大学生物技术中心的NexGen DNA测序核心使用安捷伦毫微微脉冲系统(安捷伦,圣克拉拉,CA)确认统一的DNA产量产品的平均长度大于9.4 kb。
2.6全基因组测序和分析
全基因组测序是由威斯康辛大学麦迪逊分校的生物技术中心使用Illumina公司短内容平台和6000 NovaSeq乐器。读取被修剪删除测序适配器和低质量基本调用使用软件针(江et al ., 2014),然后映射到猕猴属fascicularis参考基因组,M_fascicularis_5.0,使用一个Illumina公司动态阅读分析基因组学(DRAGEN)看到你平台3.7版。使用DRAGEN小变体和调用执行。变异的控制(父母)样本用于筛选和识别新创突变。变异注释使用SNEPeff执行工具,可以预测的或非同义氨基酸的变化,启动/停止密码子的收益或损失,由于插入或删除帧转移。结构分析是使用Parliament2执行(萨拉特et al ., 2020),只有那些由至少两个调用调用者被包括在内。质量较低的变异,以及未经过滤掉变体包括突变作为潜在的候选人。新创结构变异是那些发现卵裂球中没有出现在父母的序列。短阅读顺序并不适合调用结构变异,因此低过滤站出变异以及未经变体都作为潜在的候选人。整合基因组浏览器软件(https://software.broadinstitute.org/software/igv/download)被用来查看WGS数据。
2.7非目标分析
潜在CRISPR-Cas9非目标区域被确定使用Cas-OFFinder工具(Bae et al ., 2014)(http://www.rgenome.net/cas-offinder/),允许三个不匹配。感兴趣的区域被评估在WGS数据集,看看新创突变出现在单个卵裂球相比,父母的DNA。的存在新创基因突变在三个预测脱靶评估Sanger测序的PCR扩增子包含地区单个卵裂球的兴趣。DNA来自野生猕猴猕猴iPSC线并行测序。使用Q5 PCR反应进行热态启动高保真DNA聚合酶装备制造商推荐和反应是清理干净后使用凝胶萃取和PCR清理工具(IBI,猫没有:IB47010)。PCR引物序列中列出补充表S1。桑格测序反应是由功能性生物科学公司,麦迪逊,威斯康辛州和测序数据分析使用4峰值(https://nucleobytes.com/4peaks/index.html)应用程序。
3的结果
3.1 WGS单个卵裂球生产变量序列覆盖
功能删除CCR5在恒河猴胚胎,我们设计了gRNAs将包含一个24-bp删除,曾被证明是必不可少的表达CCR5在非人类的灵长类动物(陈et al ., 1998)。我们之前细胞编辑实验证实成功的目标编辑的功能缺失CCR5在人类基因(康et al ., 2015)和猕猴(D’索萨et al ., 2022)万能。目标区域的示意图所示图1一个。在我们最初的报告描述针对本地区的MCM胚胎,pcr方法被用来评估CRISPR-Cas9瞄准的CCR5轨迹(施密特et al ., 2020)。两个胚胎被分离成单个卵裂球和DNA PCR评价和单细胞WGS孤立。PCR和凝胶电泳显示编辑每个胚胎(镶嵌性图1 b,C),尽管PCR信号未被发现在一个和三个从胚胎卵裂球4和5,分别为(图1 b)。
图1。评价CCR5编辑在MCM胚胎使用pcr方法(一)。的示意图CCR5基因包括gRNA目标和远期(F1)和反向引物(R1)。野生型(WT)产品是613个基点,而biallelic缺失突变(MT)产生一个产品415个基点。虚线与野生型序列表示目标区域(B)。凝胶电泳图像PCR产品从胚胎卵裂球4和5。积极的控制反应unmanipulated控制胚胎的DNA和没有包括模板-控制(NC)。上面的彩色点每个车道指示中所示的编辑结果1 c。PCR和凝胶电泳结果描述的初始报告中提供的CCR5编辑在MCM胚胎(施密特et al ., 2020)(C)。图总结了pcr编辑结果和biallelic编辑效率在每一个胚胎。
单细胞DNA扩增和WGS进行DNA所有六个胚胎的卵裂球4和8 9从胚胎卵裂球5。此外,DNA分离外周血单核细胞从陛下和大坝的胚胎并行测序。染色体覆盖变化在单个卵裂球和染色体结果从- 77.77倍覆盖率,而父母的序列覆盖在一个深度∼30 x,作为体细胞的预期。测序覆盖30 x被解释为基因组测序∼30倍。图2一个显示序列的平均覆盖率和范围深度为每个示例,说明了在染色体变异在卵裂球覆盖相比,父母的DNA分离外周血细胞。的CCR5基因位于染色体2,大大不同的染色体序列深度报道在卵裂球(图2一个)。为每个样本序列保险由染色体中列出补充表S2。胚叶细胞5 - 2有一个非典型分布的GC含量和被排除在分析。剩下的卵裂球,序列覆盖率——和非目标区域是考虑和有限序列时观察到的WGS结果视为不确凿。
图2。WGS鉴定基因型不确定的pcr方法(一)。均值和范围在测序深度报道(x-fold覆盖率)绘制每个分裂球和父母的DNA。均值和范围为所有染色体上所示图和较低的图表显示染色体2;CCR5位于2号染色体(B)。的比较CCR5编辑通过PCR与WGS分析结果。蓝色文本表明细胞在WGS确认删除未被PCR。HET:杂合的,力宏:纯合子(C)。序列覆盖在CCR5目标区域在卵裂球5 - 4和5 - 8,纯合子/ biallelic编辑被WGS观察。WGS查看器软件显示潜在删除红酒吧和5 - 8的定位跟踪,这些出现在目标地区和最小的在父母的缺席覆盖率地图。垂直黑盒显示预期的删除gRNA目标站点之间的区域。
3.2 WGS确定额外的目标缺失
WGS证实了基因型确定使用PCR方法对于大多数的卵裂球检测PCR信号9(7)和一个胚叶细胞的基因型决定的CCR5聚合酶链反应(地区不能放大图2 b)。序列,跨越目标地区野生型序列的象征,而一个删除序列推断如果有休息的报道。代表野生型(WT)的例子,杂合的(HET)和纯合子缺失(坎德尔)基因型由WGS说明补充图S1。WGS序列覆盖的CCR5针对地区还发现了删除未观察到使用pcr方法(图2 b)。如果有穷序列覆盖在目标站点,WGS基因型不能确定并被认为是不确定的。胚叶细胞5 - 4被HET的pcr方法,然而,当看测序对齐,没有序列之间的地区跨越gRNA网站表明胚叶细胞包含biallelic删除(图2 c)。不管5 - 4的意想不到的凝胶带模式,坎德尔的证实通过桑格序列的扩增子孤立最低三个乐队在琼脂糖凝胶;每个包含预期的扩增子∼200 bp删除和未发现WT序列(辅料S2)。使用标准引物PCR对先前未能确定基因型的胚叶细胞5 - 8,而WGS报道表示删除生成gRNA网站和大规模删除透露,包括PCR引物序列(图2 c)。此外,报道的深度降低了大约一半的5 '端,确认一个等位基因包含大规模删除第一gRNA上游站点。
3.3识别和验证CCR5的大规模删除目标区域
新创结构变异,不在父母的DNA,但在单个卵裂球的胚胎4和5都是被WGS (表1)。短阅读测序平台不适合识别结构变异,那些被列出至少两个变种人。目标删除gRNA站点之间被确认为4 - 4的变体。大规模删除跨目标区域被确定在卵裂球4 - 6,5 - 4,也出现了类似的删除∼5.2 kb盘中和5 - 8。一些反演也确定并在每个胚胎一双卵裂球的反演是独一无二的。
表1。新创结构变异的CCR5轨迹中确定单个卵裂球。
PCR引物序列用于最初基因分型卵裂球中删除区域,因此这些删除不能确定使用PCR方法。大规模的位置删除了WGS在卵裂球4 - 6,盘中,5 - 8所示图3一。使用引物pcr方法在每个侧面删除地区紧随其后的是凝胶电泳证实大规模删除4 - 6的存在,盘中,5 - 8 (图3 b)。大规模删除经PCR扩增子的桑格测序删除在4 - 6,发现盘中,5 - 8有一个例外(辅料S1)。可怜的测序数据不允许验证5.8∼5.2 kb删除的分裂球而删除序列被确认在分裂球5.5 (辅料S1)。
图3。识别和验证大规模删除了WGS分裂球4 - 6(一)。原理图中删除被WGS卵裂球4 - 6,盘中,5 - 8,引物的位置来评估在卵裂球4 - 6∼756个基点删除。引物被指示为F或R及其序列中列出补充表S1(B)。凝胶电泳图像生成的PCR扩增子引物,每删除。没有模板-控制(数控)反应也包括在内。
3.4 WGS检测目标INDELs胚叶细胞5 - 4
的插入和/或删除(INDELs)在目标区域被评估。单核苷酸变异(SNVs)识别并被认为是新创突变,如果他们出现在分裂球但没有检测到父母。的数量新创在每一个卵裂球中提供了SNVs检测补充表S3。纯合子插入13 bp, 5 bp, 11日英国石油(bp)和33 bp gRNA附近发现一个降低站点的分裂球5 - 4不确定猕猴猕猴参考基因组和父母的DNA序列(图4)。这是唯一的分裂球INDEL附近形成一个网站。
图4。在胚叶细胞5 - 4插入CCR5目标站点。新创插入在胚叶细胞5 - 4,没有父母的DNA中标识。gRNA 1序列由深灰色栏和蓝色表示表明PAM序列(5′ttg)。纯合子(HOM)变体(VAR),特别是插入,发现附近预测DNA切割(剪刀)中没有检测到猕猴猕猴参考基因组(REF)也没有父母的DNA序列。
3.5非目标编辑检测位点的限制gRNAs序列同源性
评估由WGS不相干的突变检测的可行性,我们利用了在网上Cas-OFFinder工具识别非目标网站基于序列同源性gRNA序列和非目标网站的总数时允许长达9 gRNA之间的不匹配和非标靶序列提供了补充表S4。而非目标编辑可以发生在网站4不匹配(Pattanayak et al ., 2013;克罗默et al ., 2022),我们专注于评估WGS 93数据预测非目标区域包含2或3不匹配时更常见。新创突变在单个卵裂球被WGS确认在16个预测非目标网站的7是位于基因和九位于基因间区域(表2)。WGS发现的特定突变提供了在每个非目标网站辅料S2。
表2。新创突变被WGS预测脱靶地区。
卵裂球与突变在非目标区域被WGS受到PCR和桑格测序,除了所有胚胎的卵裂球5排序了SFMTB2地区。桑格序列所示表3。T G点突变预测地区NFASC基因被发现在胚胎的卵裂球4和5。这种突变可能发生自发突变亲本基因型是T / T,胚胎卵裂球1 5 G / G和胚胎卵裂球进行T / T、G / G和T / G基因型。新创删除日常预测减少站点附近的地区SFMBT2和LIPC表明非标靶基因编辑CRISPR-Cas9 RNP (表3)。此外,胚胎的卵裂球显示删除SFMBT2和对胚胎的卵裂球5有相同的7或8英国石油删除提示,编辑发生在以前的类似细胞分裂突变引入目标CRISPR-Cas9瞄准。
表3。sanger测序被WGS包含预测脱靶的扩增子突变。
3.6结构变异检测到非目标网站
结构变异的存在在预测脱靶网站调查的非目标区域NFASC,SFMBT2,和LIPC基因。大规模删除、倒置和重复被确定在这些网站通过WGS (表4)。倒置和删除NFASC观察非目标区域在每个胚胎的卵裂球4和5,和倒置了LIPC网站卵裂球4 - 5和4 - 6之间共享。一个较小的删除在卵裂球4 - 1检测到210个基点。更少的非目标结构变异是在胚胎卵裂球之间共享相比,那些被确定在目标网站。的总结和非目标突变被WGS每胚叶细胞中提供补充表S5。
表4。新创结构变异预测脱靶地点中确定WGS单个卵裂球。
4讨论
在目前的研究中,综合评估CRISPR-Cas9针对MCM卵裂球的WGS确认编辑镶嵌性,揭示了不受欢迎的在额定马力胚胎和非目标编辑事件,包括大规模删除和解决基因型在目标网站,以前未被发现使用pcr方法。INDELs观察和预测脱靶网站,在序列中断Sanger测序证实了两个非目标区域。WGS分析也提供了洞察CRISPR-Cas9瞄准的时间结构变异和相同新创突变在对卵裂球已经共享,但没有发现在大多数卵裂球表明编辑被推迟,没有发生在一个细胞阶段。虽然CRISPR-Cas9可以引入突变在额定马力胚胎的变异位点,意想不到的编辑事件的发生不仅需要严格评估的胚胎,而且后代确认,任何产生的表型不是由于脱靶效应。
不受欢迎的编辑事件的目标网站,包括大规模删除,曾被观察到在人类与野生型小鼠胚胎有针对性Cas9核酸酶(Adikusuma et al ., 2018;Zuccaro et al ., 2020;Alanis-Lobato et al ., 2021;Papathanasiou et al ., 2021)。在目前的研究中,将删除198个基点和756个基点,925个基点和∼5.2 kb删除被检测到CCR5目标站点通过WGS结构变异分析单个额定马力的胚胎细胞。删除之前的报道中描述CRISPR-Cas9针对在额定马力胚胎转移到代理人和编辑产生的后代,包括∼11.5 kb删除SHANK3在一个猕猴猴(赵et al ., 2017),7.2∼kb删除PINK1在两个恒河猴(杨et al ., 2019),和920个基点OCT4敲入站点在猕猴猴(崔et al ., 2018)。的SHANK3突变体死亡在子宫内在125天的妊娠(期限为165天)和两个PINK1突变体是三胞胎出生后几天就去世了。这些研究表明,植入和怀孕可以实现大规模的编辑错误。此外,目标缺失已经被观察到在研究在额定马力胚胎和组织不同的基因野生型CRISPR-Cas9的目标,需要细化的基因组编辑工具用于创建精确的疾病有关的突变。
在当前的研究中,我们发现对同一胚胎的卵裂球包含类似的结构变异,然而这些变异是不相同的建议他们来自独立的编辑事件(例如,卵裂球盘中和5 - 8∼5 - 4和5.2 kb删除共享盘中∼35341 kb附近的反演CCR5针对网站)。胚叶细胞基因型镶嵌性表明,编辑被推迟,没有发生在一个细胞阶段删除并非在所有的细胞中发现的胚胎。编辑镶嵌现象被观察到组织编辑额定马力从CRISPR-Cas9针对性的胚胎的胚胎移植(妞妞et al ., 2014;陈et al ., 2015;Tsukiyama et al ., 2019;周et al ., 2019)。
本研究的目的是评估的可行性在单个卵裂球使用WGS评估脱靶效应。一个在网上基于引导潜在的非目标区域的提名基于序列同源性gRNAs允许三个不匹配。后CCR5观察目标,突变的基因SFMBT2和LIPC证实了WGS和引入INDELS Sanger测序。胚胎的卵裂球显示顺序混乱通过INDEL形成的存在4 7或9 bp删除一些细胞在预测脱靶网站内SFMBT2基因。这些结果证实,非目标编辑可以在单个卵裂球的WGS评估,尽管我们使用有偏见在网上方法依赖于评估目标序列同源性和不大于三个不匹配评估潜在的目标。额外的在网上指定目标应该评估全面评估的影响日常编辑CRISPR-Cas9乳沟可以发生在非目标网站与四位不匹配(Pattanayak et al ., 2013;克罗默et al ., 2022)。此外,公正的方法,调查整个基因组没有先验知识或预测的序列同源性会更丰富,但目前没有更好的方法或技术分析(Chaudhari et al ., 2020;阿特金斯et al ., 2021)。在体外将来的非目标分析方法可以用于单个细胞,但与当前使用的全基因组扩增(WGA)和一个不完整的参考基因组,大量假阳性的可能被称为由于编剧期间产生的错误或因不同的参考组装。
相对较少的非标靶基因突变已确定在研究生成编辑额定马力后代CRISPR-Cas9针对性的胚胎转移到代孕胚胎接受者。2 bp在一个非目标区域在删除一个编辑猕猴猴(崔et al ., 2018)和一个intronic和两个基因间INDELS被确定在两个编辑恒河猴(王et al ., 2018)。罗et al。(2019)确认新创突变,作者认为没有引入CRISPR-Cas9而可以归因于自然自发的代际突变或由于技术噪声。在这些以前的额定马力研究,WGS分析进行DNA从细胞或组织中获得生活的后代或流产胎儿,而这里我们报道WGS额定马力胚胎的单个卵裂球。发病率较高的非目标编辑在这个研究可以解释的编辑效率RNP或可能这样重要的非目标错误可能是胚胎致命的,因此不存在短期或后代中幸存下来。编辑显示更加快速和高效的定位和RNP与Cas9 mRNA在额定马力胚胎(Midic et al ., 2017)。为了减轻潜在的非目标编辑事件,可以实现以下策略:1)显微镜下注射受精(RNP当时的Lamas-Toranzo et al ., 2019),2)使用Cas9核酸酶改性提高特异性(黄et al ., 2022),或者3)使用基地或'编辑方法,不会导致DNA双链断裂(Zeballos Gaj, 2020)。
非目标INDELs和节段性染色体错误引入CRISPR-Cas9曾被观察到在人类胚胎(Zuccaro et al ., 2020)。形成INDELs据报道在预测脱靶gRNA序列(网站,有两个不匹配Zuccaro et al ., 2020)。此外,节段性染色体错误预测脱靶附近发现了网站和往往是局限于一个细胞,因此,作者认为,事件可能发生在第二或第三细胞周期。虽然目前研究的焦点并非全部或节段性染色体错误,结构变异被发现在非目标地点,可以在未来调查。
大规模突变引入CRISPR-Cas9编辑在人类和小鼠胚胎通过节段和整个染色体导致基因组不稳定性损失(Adikusuma et al ., 2018;Zuccaro et al ., 2020;Alanis-Lobato et al ., 2021;Papathanasiou et al ., 2021)。未修理的DNA双链断裂的CRISPR-Cas9裂解位点表明导致染色体分散导致染色体mis-segregation人类细胞系和微核形成和小鼠胚胎(莱博维茨et al ., 2021;Papathanasiou et al ., 2021)。在人类胚胎卵裂阶段,未能复制基因组之前进入有丝分裂分裂导致贫穷的胚胎质量由于非整倍性与染色体分裂和微核的形成(Palmerola et al ., 2022)。人类和额定马力胚胎自然有更高的发病率染色体非整倍性,部分或全部封装的微核可能存在分散细胞的胚胎(道奇乐团et al ., 2019;Palmerola et al ., 2022)。细胞分裂之前观察> 65%在体外受精恒河猕猴胚胎卵裂阶段,分析单个卵裂球来自50个胚胎,73.5%显示全部和/或部分染色体损失或收益(道奇乐团et al ., 2019)。chromothripsis没有评估的发病率在当前研究的局限性在解释WGA的工件的一个不完整的参考基因组,除了难以辨别是否染色体丢失是由于CRISPR-Cas9目标或自然产生的细胞分裂活动。作为CRISPR-Cas9编辑错误可能导致染色体破坏和/或消除(莱博维茨et al ., 2021;Papathanasiou et al ., 2021),这是合理的胚胎发展可能的负面影响,可以解释穷人胚胎移植率在我们之前的研究(施密特et al ., 2020)和一般CRISPR-Cas9针对性的额定马力的活产率低(施密特et al ., 2022 a;施密特et al ., 2022 b)。
4.1研究的局限性
单细胞WGA的可以介绍放大偏见可能限制的解释变异识别在这个研究。几项研究比较商业化sc-WGA包了再现性的差异,错误率,目标范围,深度分销和等位基因退出阅读,然而,在REPLI-G sc-WGA工具包使用在当前的研究中被证明具有较高的映射愤怒(> 90%),是可再生的和出错率较低(Borgstrom et al ., 2017;Biezuner et al ., 2021与其他工具相比。在目前的研究中,序列覆盖在染色体内变量和单个卵裂球相比,父母的DNA没有接受编剧。本研究的一个限制是unmanipulated控制卵裂球的缺乏分析评估的速度却由于发生错误或工件。易位事件呼吁这个原因,不仅结构变异被两个调用者是在本研究报告。虽然不确定结构变异被WGS是否由于CRISPR-Cas9瞄准,成对变异被发现卵裂球的加工通过独立编剧的反应表明突变发生在早期卵裂部门或类似的网站的基因组中可以容易地放大错误WGA的过程。最近WGA技术的进步等主要template-directed放大(Gonzalez-Pena et al ., 2021通过转座子插入)或线性放大(陈et al ., 2017)显示放大单细胞基因组与更多的一致性和准确性。虽然这些技术不纳入一个商业工具,他们在未来可以实现单个卵裂球WGS研究更大的准确性和重现性。
5的结论
总的来说,利用WGS方法来确定CRISPR-Cas9编辑结果允许编辑不了PCR的识别。在这项研究中,WGS透露目标大规模删除和INDEL形成的发生率在非目标网站。不精确的编辑可能会阻碍发展的一个额定马力疾病模型,拟遗传型和拟表型。不受欢迎的编辑事件的后果在偏离和/或邻近基因的基因表达并不是评估在这项研究中,但应考虑在将来的研究中。基于证据从人类和小鼠胚胎的CRISPR-Cas9攻击,很可能染色体损伤发生在胚胎早期发育胚胎生存能力产生负面影响。目前尚不清楚是否降低浓度或体积RNP交付给一个细胞的胚胎会存在剂量依赖的相关性对目标误差的影响。还需要更多的研究来优化胚胎由野生型Cas9编辑和/或使用替代下一代Cas9核酸酶,不创建一个DNA双链断裂(Komor et al ., 2016;Zeballos Gaj, 2020)。无论如何,WGS分析应该实现彻底描述编辑基因型在额定马力模型生成通过这个技术。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PRJNA880597。
道德声明
动物研究回顾和批准的威斯康星-麦迪逊大学的字母和科学研究和研究生教育和副总理办公室制度动物保健和使用委员会。
作者的贡献
JS, NS, TG,导致研究的概念和设计。NS, YK、SG和JS收集和分析数据。DP进行了生物信息学分析。JS、TG和起草了手稿。出版的内容仅仅是作者的责任,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
资金
这项研究是由国家卫生研究院的基金R24OD021322授予和TG, P51OD011106授予威斯康星州国家灵长类动物研究中心,威斯康星大学麦迪逊分校,K99 HD099154-01授予JS。这项研究是由一个设施建造在格兰特研究设施改进计划的支持下数字RR15459-01和RR020141-01。
确认
作者要感谢博士杰弗里·罗杰斯对他的指导下为他的深刻分析和审查的手稿。我们也愿意承认洛根的平面设计保证了他的贡献图1。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2022.1031275/full补充材料
缩写
WGS,全基因组测序;额定马力,非人灵长类动物;艾滋病毒、人类免疫缺陷病毒;肝星状细胞,造血干细胞;MCM,毛里求斯的猕猴猕猴;RNP核糖核蛋白;CNV,拷贝数变异;WT,野生型;HET,杂合的;力宏,纯合子的; DEL, Deletion; InDel, Insertions and/or deletions; SNVs, Single nucleotide variants.
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关键词:CRISPR Cas9,全基因组测序(WGS),胚胎,猕猴,CCR5
引用:施密特JK,金正日YH, Strelchenko N, Gierczic SR, Pavelec D,“格罗斯”TG和Slukvin II(2023)的全基因组测序CCR5CRISPR-Cas9-edited毛里求斯猕猴猕猴卵裂球揭示大规模删除和不相干的编辑。前面。基因组。4:1031275。doi: 10.3389 / fgeed.2022.1031275
收到:2022年8月29日;接受:2022年12月15日;
发表:2023年1月12日。
编辑:
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