评论文章

前面。基因组。2022年11月02
秒。基因组编辑工具和机制
卷4 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fgeed.2022.1030285

纳米粒子针对造血干细胞和祖细胞:多模式治疗血液疾病的携带者

路易斯·j·克鲁兹 ¹ www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Somayeh雷¹

弗兰克Grosveld ²

Sjaak Philipsen ²

克里斯蒂娜•艾奇 ¹*

¹转化随着成像,放射学、莱顿、荷兰莱顿大学医学中心
²伊拉斯姆斯大学医学中心,细胞生物学,鹿特丹,荷兰

现代造血干细胞(HSC)治疗,基因治疗等修改自体肝星状细胞之前re-infusion myelo-conditioned病人和治疗血液疾病的良好前景。虽然这种方法在许多临床试验取得成功,它依赖于移植体外修改病人肝星状细胞,提出了一些局限性。这是一个昂贵和耗时的过程,其中包括只有少数病人到目前为止,和体外培养负面影响肝星状细胞的生存能力和阀杆细胞特性。如果使用病毒载体,具有插入突变的额外风险。肝星状细胞的治疗了在活的有机体内HSC利基,以最小的干扰,可以提供很好的机会小说旨在扭转疾病症状治疗造血障碍和可能带来安全、有效和可负担得起世界各地的基因疗法。然而,对于存在大量的未满足的需求在活的有机体内交付肝星状细胞的疗法。在过去的十年中,特别是随着基因编辑技术的发展如CRISPR / Cas9,纳米颗粒(NPs)已成为一个新兴平台,促进细胞和器官的操纵。采用表面改性策略,不同类型的NPs设计可以针对特定的组织和细胞类型在活的有机体内。肝星状细胞是特别困难的目标由于缺少独特的细胞表面标记可以用于特异性疗法,和他们的屏蔽本地化的骨髓(BM)。NP技术的最新进展和基因工程的发展导致了先进的人们能够提供治疗和显像剂造血干细胞和祖细胞(公司)在大英博物馆的利基。综述我们提供一个全面的概述NP-based方法针对公司控制和监控公司的活动在体外和在活的有机体内,我们讨论NPs的潜在治疗恶性和良性血液紊乱,与特定的专注于交付基因编辑工具。

1介绍

1.1本文的范围

造血干细胞(HSC)有能力补充所有血细胞血统在稳态细胞营业额的血液系统,和在压力条件下如急性炎症或造血干细胞动员(奥尔金和佐恩,2008年;太阳et al ., 2014;Rodriguez-Fraticelli et al ., 2018)。不同lineage-committed造血祖细胞(手持电脑)摆脱个体HSC通过很多步骤和细胞分裂分化,同时肝星状细胞是通过自我更新维护(奥福特Scadden, 2008;Notta et al ., 2016;Velten et al ., 2017;Rodriguez-Fraticelli et al ., 2018)。遗传性血液疾病(包括血友病、凝血障碍、地中海贫血和镰状细胞病)和后天失调(包括骨髓增生异常综合症和淋巴瘤等恶性肿瘤、白血病、骨髓瘤)是影响造血系统疾病的例子,其中许多是由突变引起的(保et al ., 2019)。治疗这些疾病的一种方法是替代病变的肝星状细胞的健康的同种异体肝星状细胞(Gyurkocza et al ., 2010)。造血干细胞移植是20世纪的一个主要的医学发现50多年,已用于治疗白血病和单基因血缘疾病(Copelan 2006;Appelbaum 2007)。在造血干细胞移植全球每年挽救成千上万的生命(Gratwohl et al ., 2010),许多患者仍剥夺这个救命的过程由于缺少一个兼容的捐赠或移植肝星状细胞的数量不足。这可能导致治疗相关的发病率和死亡率(Mimeault et al ., 2007)。另外,修复自体肝星状细胞的致病基因体外其次是造血干细胞移植或直接治疗在活的有机体内可能是“圣杯”的恶性和良性血液疾病,提供足够数量的自体肝星状细胞可以纠正。在过去的十年中,特别是随着基因编辑技术的发展如CRISPR / Cas9,纳米颗粒(NPs)已成为一个新兴平台促进细胞和组织的遗传操作在体外和在活的有机体内。NPs是submicron-sized粒子,可以产生各种组件,包括聚合物、脂质、金属和稀土元素,或可以孤立的细胞外囊泡(EVs)从细胞或组装病毒衣壳(图1)。NPs代表有前途的工具,用于监视和控制HSC的活动在活的有机体内由于他们的能力来保护有效载荷从过早退化和调解endosomal逃避使核酸和Cas9易位细胞质和细胞核(阴et al ., 2014),而绕过古典病毒工具的有效性和安全性问题。此外,在纳米技术方面的最新发展展示了特定站点交付的可行性通过智能聚合物具有时空的释放动力学(卓et al ., 2021),它可以促进肝星状细胞的操纵原位同时限制非目标交付。

图1

图1。示意图表示不同类型的纳米粒子常用的疗法和显像剂在生物医学应用。

几个NP配方已批准临床使用,主要作为运载工具领域的治疗癌症和再生医学作为医学影像的交付平台代理,或者作为疫苗领域的传染病(安瑟莫Mitragotri, 2019)。NP-based诊断和治疗也受到相当大的关注领域的血液疾病,例如循环肿瘤细胞的检测anti-CD20-coated量子点(Shariatifar et al ., 2019),治疗贫血的口头管理铁基NPs或造血干细胞和祖细胞的操作(公司)在胎儿和成人造血利基(Zariwala et al ., 2013;Hosny et al ., 2015)。

在这次审查中,我们提供了一个全面的概述NP-based方法针对公司在生物医学应用。在第一部分中,我们将重点放在公司与NPs交互,考虑肝星状细胞的特定生物学和手持电脑,和造血利基市场的定位。在第二部分中,我们审查的使用NPs控制和监控公司的活动在体外和在活的有机体内。在本文的第三部分,我们将讨论潜在的NPs治疗恶性和良性血液紊乱,与特定的专注于交付基因编辑工具。

1.2纳米粒子

NPs被广泛接受5 - 300 nm之间的大小(尽管结构也已报告1000海里)。基于他们的化学成分,它们通常分为碳基NPs(碳纳米管和富勒烯),无机NPs(量子点,金属NPs,罕见的土料NPs)和有机NPs(脂质NPs、聚合物NPs和电动汽车)(图1)。NPs作为药物输送系统的使用交付赤裸裸的药物相比,具有很多优点:1)由于他们内部体积大,NPs可以含有亲水和疏水性化合物,包括荧光团、金属、多肽、蛋白质、核酸或仿生分子,可以在本地增加这些化合物的浓度;2)药物封装NPs可以改善传统药物的生物相容性和稳定性,克服不溶性的问题;3)与传统药物相比,NPs呈现一个增强血液循环时间;4)可以设计为多功能NPs施加诊断和治疗的行为;和5)NP表面可以携带针对半个允许网站和/或特异性载荷传递和提高疗效的比例/封装有效载荷的细胞毒性。这降低了副作用常与系统应用高剂量的药物。

1.3纳米粒子吸收

NP吸收影响的三个主要因素:1)NPs的物理化学性质,如大小,多分散性指数(衡量一个样本的异质性基于大小),形状、电荷、表面改性和表面亲水/疏水性质的;2)目标细胞的生理特性及其微环境(例如,细胞表面蛋白聚糖的存在或受体水平的血清蛋白质);3)实验因素,包括温度、培养时间、渗透性和离子强度(他et al ., 2021年)。

后遇到的细胞膜,NPs通过细胞内吞作用机制主要由两个机制,吞噬作用和胞饮。吞噬作用是首选的吸收机制更大的粒子(> 500海里),如病原体、细胞碎片、NPs。胞饮(包括macropinocytosis clathrin-mediated内吞作用,caveolae-mediated内吞作用和网格蛋白,caveolin-independent内吞作用)被认为是主导机制NPs的吸收不到500海里(赵和Stenzel, 2018年)。带正电的NPs正在迅速内化通过clathrin-mediated通路,而带负电荷的NPs内化(主要是通过网格蛋白以外的途径和窖蛋白Harush-Frenkel et al ., 2007)。然而,带正电的NPs一般伴随着更高的细胞毒性(古德曼et al ., 2004;哦,et al ., 2010),从而快速吸收速率不一定是有益的。当前NP-based方法针对肝星状细胞在生物医学的应用程序集中在三个主要目标(图2)。首先,改善标签策略来监测移植肝星状细胞的不同成像模式。其次,药物和基因的传递编辑工具来调节肝星状细胞和大英博物馆发展的利基人类治疗,第三,基础研究开发目标和跟踪NPs biodistribution小说工具在活的有机体内。NPs的例子被用来治疗目标公司或监视目的主要属于有机和无机NPs(集团表1)。

图2

图2。概述bioimaging NPs针对公司的基础研究和人类疗法的发展。开发新型NP设计和bioconjugation策略使多功能NPs在的应用在活的有机体内成像和治疗的公司。

表1

表1。总结NP系统针对公司和大英博物馆在体外和在活的有机体内。

1.4造血干细胞和造血祖细胞

肝星状细胞缺乏认识独特的细胞表面标记可用于简单的细胞隔离。相反,CD34是常用的在实验室里研究公司和BM移植前进行浓缩萨瑟兰et al ., 1990;Baum et al ., 1992)。CD34是一种跨膜糖蛋白表达了对公司和许多血管内皮细胞(ECs)。因此,除了一些肝星状细胞CD34⁺部分包括ECs和未成熟和成熟的手持电脑,可以进一步区分附加标记(Doulatov et al ., 2012)。进展在描述人类长期重新繁衍肝星状细胞(LT-HSCs)基于移植分析CD19 HSC数量⁻CD34⁺CD38⁻CD45RA-CD49f + CD90⁺(Thy-1) (Notta et al ., 2016)。Index-sorting结合RNA序列进一步透露,尤其是CLEC9A^hiCD34^罗子集是富含LT-repopulating肝星状细胞(Belluschi et al ., 2018)。值得注意的是,不同的人类(CD34标记用于研究⁺CD90⁺CD133 + (王et al ., 2015;Schiroli et al ., 2019;法拉利et al ., 2020)和CD34⁺CD90⁺(Michallet et al ., 2000;•et al ., 2000))与非人类的灵长类动物(CD34⁺CD90⁺CD45RA (Radtke et al ., 2017;亨伯特et al ., 2019)。因为大多数使用CD34 NPs与肝星状细胞进行了研究⁺公司,需要采取谨慎的解释NP对肝星状细胞定位数据。在本文中,我们将参考CD34⁺细胞作为公司,除非另有规定。

手持电脑相比,肝星状细胞是主要维持在一个静止(G0)在专门的BM利基市场(Zhang et al ., 2003)。这个状态是伴随着特定的生理属性,如细胞周期阻滞,减少转录和转译活动和独特的能量代谢(Passegue et al ., 2005;Takubo et al ., 2013;Yu et al ., 2013;Ito et al ., 2016)和区分肝星状细胞的祖细胞和成熟血细胞(Herbein et al ., 1994)。公司通常显示一个高nucleus-to-cytoplasm比率,很少有在细胞质中细胞器,而更多的分化细胞显示相反的(Deliliers et al ., 2001)。核内体的内吞作用的关键途径和NPs进入细胞的一个重要入口路线(Behzadi et al ., 2017;里斯et al ., 2019)。因此,核内体的数量影响NP吸收的程度,它已经表明,将手持电脑占用比非区分静LT-HSCs外源性物质容易得多。根据他们的抵抗由某些细菌入侵人类肝星状细胞长期以来被视为无法执行macropinocytosis或受体介导吞噬作用和被认为缺乏必要的内化机制吞噬大量细胞外材料(Kolb-Mäur et al ., 2002)。然而,病毒,主要是慢病毒(LV, 80 - 100 nm),腺病毒(副词,90 - 100 nm)和腺相关病毒(AAV), 25海里),证明可以转换人类肝星状细胞移植实验和临床试验(Aiuti et al ., 2013;歌et al ., 2013;热那亚et al ., 2014;萨瑟et al ., 2015;Traxler et al ., 2016;你们et al ., 2016;坎特et al ., 2017;汤普森et al ., 2018)。细胞内吞作用是主要的入口路线缺乏病毒囊膜病毒(AAV,副词)。因此,尽管肝星状细胞是没有优秀的吞噬细胞,它们具备吞噬颗粒从他们的环境。NPs相似大小的病毒,和NPs与不同的物理化学性质已被证明目标公司体外和在活的有机体内(表1)。公司的内部活动也依赖于CD34的来源⁺细胞。脐带血祖细胞显示更高的内部和实验率相比BM公司(列文et al ., 2000)。

为了有效地交付成像试剂或细胞疗法,截留其次是退化的酸性隔间endo /溶酶体途径必须是可以预防的。聚合物NPs,例如那些由保利(lactic-co-glycolic酸)(PLGA),已被证明逃避endosomal通路,把人类CD34细胞溶质的⁺公司(克鲁兹et al ., 2014;克鲁兹et al ., 2021)。不同的机制,包括膜融合、渗透或机械破裂由于NP肿胀,膜不稳定,提出了pH-responsive NPs基础endosomal逃了出来,随后释放封装有效载荷送入细胞溶质(史密斯et al ., 2019)。endosomal逃脱的NPs是提货的疗效的关键,带正电或pH-sensitive官能团可以纳入NPs提高这一过程(Schmaljohann 2006;希恩et al ., 2022)。

1.5纳米粒子与造血干细胞和祖细胞的相互作用

几组研究聚合物NPs是否适合人类公司的运载系统在体外(表1)。Brustle等人研究了不同类型的聚合物NPs人类CD34的功能和分化能力的影响⁺公司(Brustle et al ., 2015)。惰性聚苯乙烯(没有表面羧基组)和可生物降解的高分子NPs (PLGA-based)显示高摄取率在公司没有诱导细胞毒性。细胞NP内容减少是由于连续扩散事件在血统的承诺。公司的分化潜能并没有受到影响,然而mRNA的表达一些谱系标记被改变。这一发现的意义需要进一步调查。

帝威等人研究了羧酸盐的短期交流和吸收动力学聚苯乙烯NPs CD34⁺公司(帝威et al ., 2017)。有趣的是,在树突细胞相比,显示了NP吸收随着时间的推移,NP吸收在1 h和公司达到最大下降之后,建议一个能量依赖性的细胞过程,积极控制吸收和释放的粒子(帝威et al ., 2017)。NPs的天然复合壳聚糖,唯一的生物高聚物,是带正电的pH值较低,有相当大的潜力作为肝星状细胞的交付系统基于他们存款的能力带负电荷的分子,如RNA和DNA (曹et al ., 2019)。Chitosan-NPs大小不同的探索作为小鼠BM-derived交付系统公司(扎基et al ., 2015)。作者发现高浓度的chitosan-NPs鼠标BM细胞生存能力的影响,特别是对于小尺寸的NPs(200海里)。在低浓度、中型NPs减少肝星状细胞的百分比,而中间和高浓度的生存能力特别降低髓系祖细胞,显示大小,浓度壳聚糖NPs细胞毒性的影响。NPs由高分子量壳聚糖增加了细胞毒性对人体外周血单核细胞(PBMCs) (耶稣et al ., 2020)。尽管其生物降解性,壳聚糖也具有免疫刺激性属性(汉et al ., 2016)。因此,需要进一步研究来评估chitosan-NPs是否适合人类公司的交付系统。

2监测造血干细胞和祖细胞的纳米颗粒非侵入性成像

造血干细胞移植是许多恶性和良性造血疾病的主要治疗策略和执行通常在临床实践中(霍华德et al ., 2015;Laberko Gennery, 2018;Staal et al ., 2019)。移植骨髓移植细胞的利基(“自导”)是一个重要的治疗成功的先决条件。这个过程的监测有助于识别受损归航移植后早期,允许干预改善移植疗效和移植的结果。病毒载体已被用于细胞标记和追踪,但静肝星状细胞很难标签这一策略。阿德向量只转导细胞进行有丝分裂(米勒et al ., 1990),LV向量要求病毒集成(代谢活动萨顿et al ., 1999),从而更有效的方法是需要允许静止细胞的标记。认为HSC标签和检测是可行的,几个环境必须满足。首先,检测方法具有足够的灵敏度来监控标记细胞在活的有机体内。其次,标签应该是生物相容性和保存移植肝星状细胞的生存能力和功能。第三,cell-label协会应该稳定跟踪肝星状细胞在更长一段时间。由于标签分离的风险降低,细胞内标签由NPs可能优于surface-labeling。标签启用了NPs biodistribution的跟踪公司使用非侵入性生物医学成像,如荧光成像、磁共振成像(MRI)和磁共振光谱学(夫人)。

2.1在体外标签程序和造血干细胞和祖细胞的成像

第一个研究结合NPs和公司探讨在体外标签程序提供工具来监控导航和移植肝星状细胞的移植。超顺磁性氧化铁(SPIO)和其他内在监控NPs,包括oxide-NPs钆、介孔silica-NPs, PLGA-NPs封装氟19 (19^F)作为核磁共振对比剂和夫人,被利用为标签代理公司(表1)。脐带血公司被标以不同大小的NPs或脂质体由SPIO ferumoxide,超微SPIO (USPIO) ferumoxtran transferrin-coated磁多糖、P7228(第二代USPIO)和gadopentetate dimeglumine (Daldrup-Link et al ., 2003)。虽然所有NPs无毒,适用于公司标签,SPIO NPs直径约100 - 150海里被更有效地针对公司比单晶氧化铁和USPIO NPs,直径20 - 40 nm。同样,英国等人研究了吸收SPIO CD34⁺公司结合转染剂硫酸鱼精蛋白(一种用于逆转肝素抗凝的药物),批准代理用于患者(英格兰et al ., 2013)。他们发现ferumoxide的吸收人类公司接触硫酸鱼精蛋白后增强。CD34 SPIO标记的⁺细胞并不影响细胞的生存能力和公司可以可视化的标签在体外3 t MRI扫描。相似,另一个策略采用nanocomplexes ferumoxide和硫酸鱼精蛋白CD34的非侵入性的监视⁺公司由核磁共振(Arbab et al ., 2005)。标签的公司硫酸ferumoxide-protamine复合物不诱导细胞毒性或影响SDF-1诱导迁移形成手持电脑和他们的能力。

Bregoli等人研究了七种金属和金属氧化物的毒性NPs在20 - 210 nm之间大小对BM CD34⁺公司(Bregoli et al ., 2009)。克隆形成单位CD34的文化分析⁺公司孵化与不同类型的NPs表明氧化锑(某人₂O₃NPs)和钴NPs毒性作用,而其他NPs无毒,5点25和100μg /毫升。有趣的是,他们发现,公司NPs显示对红细胞和granulocytic-monocytic体细胞毒性,而某人₂O₃NPs特别有毒的红色的殖民地发展,表明选择性毒性对不同公司的亚种(Bregoli et al ., 2009)。

另一种方法,Duinhouwer等人用脐带血CD34标记⁺公司与PLGA-NPs包含19^F(Duinhouwer et al ., 2015)。NP-loaded CD34⁺公司被夫人可检测在体外在生理条件下。重要的是,标签并不影响细胞的生存能力和CD34标记⁺公司保持增殖能力,形成不同类型的祖殖民地甲基纤维素化验。在类似的方法,公司被贴上PLGA-NPs包含perfluoro-1 5-crown乙醚和核磁共振成像(每天et al ., 2014)。虽然NPs没有减少细胞生存能力,每天等人证明了这些NPs调制的旁分泌活动公司减少促炎细胞因子的分泌和衰减toll样受体的活动6和7。因此,这些NPs不仅提供了核磁共振对比剂,但也显示免疫调节特性。

2.2在活的有机体内跟踪NP-labelled造血干细胞和祖细胞的非侵入性成像

2005年,Daldrup-Link等人是第一个人类公司监控,装满SPIO (ferumoxide) NPs或P7228脂质体,在BALB / c小鼠静脉注射后(Daldrup-Link et al ., 2005)。他们发现ferumoxides被更成熟的CD34⁻,但不是通过CD34⁺细胞,而P7228脂质体被CD34⁻和CD34⁺细胞。核磁共振分析证实,铁oxide-labeled人力公司成功引入受体器官,如肝脏和脾脏,4、24和48 h,大英博物馆在24和48 h后注入,在控制与信号强度显著高于纯对比剂注射。

此外,多通道聚乙二醇介孔二氧化硅NPs含有氧化钆和荧光探针用于磁共振成像跟踪的早期公司的老鼠(Sweeney et al ., 2018)。可以使介孔二氧化硅的生物相容性NPs的公司并不影响细胞的生存能力。NP-labeled公司在不同的造血隔间和跟踪确认后注射移植在大英博物馆6 - 9天。有趣的是,作者注意到,大多数的细胞,了介孔二氧化硅NPs像手持电脑,可区分为两种形态不同的亚种有明显吸收行为,说明CD34的异质性⁺细胞数量。

麦克斯韦等人开发了一种多通道方法把人类的标签和分析公司使用荧光分子共价连接到dextran-coated氧化铁NPs,允许先生和荧光成像(麦克斯韦et al ., 2008)。荧光标签允许丰富NP +公司通过fluorescence-activated细胞移植前排序,以及监测NP +细胞在活的有机体内。静和自行车肝星状细胞都有效地标记,没有诱导毒性在体外或在活的有机体内,允许重新繁衍的动态跟踪肝星状细胞在移植后最初几周(麦克斯韦et al ., 2008)。

3纳米颗粒调节造血干细胞的信号

无翼(Wnt)通路的激活自我更新是很重要的,公司的扩张。尽管一些争议的角色Wnt蛋白质和Wnt HSC利基监管因素,体外小鼠肝星状细胞在Wnt5A文化提高了潜在的重新在移植实验(Nemeth et al ., 2007),Wnt3a已知蛋白质增加小鼠造血干细胞自我更新体外(拉赫曼(et al ., 2003)。没有足够的添加洗涤剂皮套裤,纯化蛋白质疏水性Wnt迅速聚合和失去他们的活动,但皮套裤干扰肝星状细胞的自我更新潜能。为了规避这个问题,Wnt蛋白质可以封装在PLGA-NPs和脂质体在长时间保持稳定在干细胞培养系统(Tuysuz et al ., 2017)。另一种方法,药理Wnt信号通路的激活增加肝星状细胞的自我更新能力。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一个主要监管机构的HSC函数由于其灭活能力Wnt-β-catenin通路(Ko et al ., 2011)。重复大剂量抑制移植受者GSK-3β已经令人信服地证明了提高重新群体动力学的道肝星状细胞(特洛布里治et al ., 2006)。基于这一发现,斯蒂芬等人开发了一个NP-based佐剂交付方法提高造血干细胞移植的结果(Stephan et al ., 2010)制定脂质体和liposome-like合成NPs封装GSK-3β抑制剂TWS119,窝藏磷脂表层包括thiol-reactive马来酰亚胺headgroups。NPs是共价表面与CD34⁺公司通过丰富的自由硫醇在质膜。multilamellar脂质NPs慢慢释放GSK-3β抑制剂超过7天,显著提高重建造血干细胞移植,供体肝星状细胞的导航性能的前提下或其multilineage分化潜能。为临床应用的发展,说明长期长期后果的NP保留HSC表面是必要的。

3.1通过纳米粒子改善造血干细胞归巢

公司针对的主要目标是赋予LT-HSCs一生中维持正常造血的能力。几个策略用来提高自导和嫁接移植肝星状细胞的恶性和良性血液疾病。研究多集中在粘附级联,在肝星状细胞的外渗到大英博物馆(图3)。目前的研究集中在增加肝星状细胞的能力感知CXCL12(也称为SDF-1)梯度通过趋化因子受体CXCR4受体在活的有机体内selectin的调制信号之间的肝星状细胞和内皮细胞代谢HSC导航属性的修改,例如,通过抑制血红素加氧酶1 GSK-3β或增强的可用性趋化因子。例如,移植的结果可以提高并发交付的小分子药物,促进肝星状细胞的归巢能力大英博物馆(最近审查(Chander Gangenahalli, 2020 a))。在这种背景下,NPs曾运载系统释放的因素,提高造血干细胞移植(造血重建Stephan et al ., 2010;黄、刘,2012年)。趋化因子释放NPs,例如壳聚糖与SDF-1 NPs加载,也被开发和评估在体外(黄、刘,2012年),有可能调节HSC自导和动员在活的有机体内特别,因为他们可以被交付大英博物馆。

图3

图3。HSC归航大英博物馆。HSC归航,如造血干细胞移植的上下文中,取决于细胞粘附分子(selectins和整合蛋白)和激活的SDF-1 CXCL12 / CXCR4轴:1)selectins促进肝星状细胞的初始拘束/滚动ECs,其次是2)chemokine-induced活化HSC的整合蛋白表面,和3)公司附着力(逮捕)的肝星状细胞在内皮通过integrin-integrin配体(LFA-1: ICAM-1 VLA-4: VCAM-1)交互。随后,4)肝星状细胞接受血球渗出优先通过欧共体的身体,被指定为transcellular轮回,或溢出通过通过BM ECs paracellular路线,到达大英博物馆小众。5)。通过髓内导航,肝星状细胞迁移到和洛奇在骨内膜的血管龛。带有HCELL,造血细胞E - / L-selectin配体;VLA-4,很晚antigen-4;LFA-1,淋巴细胞关联antigen-1;ICAM-1,细胞间粘附分子1;VCAM-1、血管细胞粘附分子;自洽场、干细胞因子;SDF-1, stromal-derived因子1;车,CXCL12-abundant网状;光伏、血管周的基质; EC, endothelial cell; MSC, mesenchymal stroma cell.

4骨髓造血干细胞归巢的利基

虽然一些肝星状细胞在外周血循环或在其他造血脾脏和肝脏等网站,多数本地化大英博物馆,出生后的主要造血组织。大英博物馆是一个复杂的微环境由不同的细胞成分,已被大量的研究的主题(最近的评论(Ashok et al ., 2021;Frobel et al ., 2021))。HSC静止,增殖,分化和迁移不断适应系统需求和控制non-hematopoietic BM利基细胞,而继电器循环信使和神经信号从外面BM公司(Zhang et al ., 2003;斯普金思et al ., 2005;片et al ., 2006;巴特勒et al ., 2010;门德尔松和Frenette, 2014;莫里森和Scadden, 2014年)。因此,估计有10000手持电脑驻留在肝星状细胞和数百万人类BM和每天数十亿血细胞释放到血液循环(卡特林et al ., 2011)。不同的HSC龛,包括骨内膜的血管(动脉和正弦),描述了在大英博物馆(Zhang et al ., 2003;Mendez-Ferrer et al ., 2010;Birbrair Frenette, 2016;Tamma Ribatti, 2017;Frobel et al ., 2021)(图3)。

在鼠标BM,大多数肝星状细胞是存在于血管周的位置在10µm距离密切接触的内皮正弦曲线或小动脉(丁et al ., 2012;Kunisaki et al ., 2013;Nombela-Arrieta et al ., 2013)。深静肝星状细胞被认为居住在小动脉接近骨内膜,而更丰富激活肝星状细胞被认为本地化niche-spanning正弦附近的船只在循环的接口,理想的位置感微环境变化以满足需求的新的血液细胞(谢et al ., 2009;Ehninger Trumpp), 2011年;部门et al ., 2011;Kunisaki et al ., 2013;Nombela-Arrieta et al ., 2013)。

不同的细胞类型已确定在靠近小鼠肝星状细胞在活的有机体内,包括骨内膜的成骨细胞,正弦ECs,瘦素受体阳性(Lepr +)血管周的基质细胞,CXCL12^高网状细胞,巢蛋白+间充质干细胞,non-myelinating雪旺细胞,调节性T细胞和巨核细胞(Kumar和盖革,2017;Perlin et al ., 2017),它分泌生长因子和细胞因子调节HSC静止,导航和分化。例如,成骨细胞分泌多种细胞因子,包括骨桥蛋白、angiopietin-1和3,促血小板生成素,粒细胞集落刺激因子、干细胞因子(SCF)和SDF-1 (Kumar和盖革,2017;Perlin et al ., 2017),调节造血干细胞自我更新和归航。

导航和静脉注射移植肝星状细胞通过大英博物馆HSC利基的血液是由HSC-attracting趋化和其他生物活性分子在大英博物馆微环境(Heazlewood et al ., 2014;联手Suszynska, 2016)。趋化因子包括SDF-1和自洽场(贝利et al ., 2000;徐et al ., 2018)。内皮细胞和基质细胞的重要来源SDF-1和自洽场,促进HSC的维护和本地化的血管周的BM利基(Kumar和盖革,2017;Perlin et al ., 2017)。例如,Tie2-Cre-mediated SDF-1和自洽场ECs的失活导致肝星状细胞耗竭在大英博物馆利基(Kisanuki et al ., 2001;斯普金思et al ., 2005;Greenbaum et al ., 2013;莫里森和Scadden, 2014年)。

ECs的初始步骤很重要的导航过程,涉及受体促进HSC拘束和滚动内皮生理剪切流条件下(贝利et al ., 1999)(图3)。最初的网络共享过程是由selectins一类粘附受体。在大英博物馆之外,ECs上调表达的E -和P-selectin吸引白细胞炎症(礼拜日et al ., 1998)。相比之下,BM ECs持续表达selectins (Frenette et al ., 1998;礼拜日et al ., 1998)。人类CD34⁺肝星状细胞表达几个selectin配体,包括PSGL-1 (P-selectin糖蛋白ligand-1)和带有HCELL(造血细胞E - / L-selectin配体)(Dimitroff et al ., 2001),调解拘束和滚动大英博物馆脉管系统(图3)。在轧制过程中,肝星状细胞趋化因子SDF-1相遇。趋化因子受体信号然后激活整合VLA-4和LFA-1结合配体VCAM-1 ICAM-1,分别。VCAM-1 ICAM-1表达在大英博物馆脉管系统和协调公司肝星状细胞的粘附和ECs (贝利et al ., 1999;贝利et al ., 2000)。这是紧随其后的是内皮轮回,这也是由VLA-4 LFA-1。有趣的是,最近的一个蛋白质组学屏幕识别CD34本身,这是表示公司和ECs selectin配体,在第一步中发挥作用前归航的肝星状细胞大英博物馆(图3)(AbuSamra et al ., 2017)。外渗,肝星状细胞迁移到血管外的空间和洛奇在大英博物馆的利基(Heazlewood et al ., 2014;Perlin et al ., 2017)。因此,大英博物馆脉管系统及其内皮不仅仅是一个被动的边境,相反,他们发挥积极参与肝星状细胞归巢的大英博物馆。

4.1纳米粒子针对骨髓利基

成功交付NPs和大英博物馆小众的货物在活的有机体内需要知识的各种生理障碍及其在健康和疾病中patho-physiological状态,和理解被动和主动靶向策略(他et al ., 2021年)。被动的交付是指NPs在血液中可以本地化组织通过被动扩散,例如提高肿瘤组织的渗透性和保留(EPR)的效果,这是促进淋巴管和血管血管结构的变化,或在肝脏被肝血窦的不连续脉管系统(奥古斯汀和Koh, 2017)。另外,NPs可以携带针对根,如单克隆抗体(或其片段)、蛋白质或肽链型分子,核酸(即寡核苷酸适配子),各种小分子(桑娜Sechi, 2020)。靶向配体不仅提供改进的亲和力和精度等对细胞和组织目标,但也增加NPs通过细胞内吞作用的细胞吸收机械。

NPs注射通常通过系统性的管理和经验范围广泛的血液中流动速度。ECs行血管和已被证明NPs的循环,但随着流速增加NP吸收减少(陈et al ., 2020)。NP半衰期的常用策略来增加血液循环,防止快速肾脏间隙和吞噬作用的表面修饰NPs与聚(ethyleneglycol)(挂钩)或膜涂料(克鲁兹et al ., 2010;克鲁兹et al ., 2011;Suk et al ., 2016)。

到目前为止,大英博物馆微环境的不同组件NPs的目标在活的有机体内,包括BM正弦ECs、成骨细胞、破骨细胞、间充质细胞或免疫细胞。促进本地化大英博物馆小众,NPs与物理化学特征本质上支持骨和BM目标,或链接的目标配体(肽、膜涂料、寡核苷酸适配子或小分子)NP表面曾(彭日成et al ., 2013;Galletti et al ., 2016;程et al ., 2017)。

BM ECs靶细胞由于各种原因很重要。他们在大英博物馆微环境信号,其他细胞,如周、免疫细胞、肝星状细胞(莫里森和Scadden, 2014年)。为一个有效的识别BM ECs, NPs与内在约束力的能力已经被描述。例如,小干扰rna和DNA条码NPs西米等人结合,筛选成百上千的脂质NP配方的不同大小和挂钩组成的在活的有机体内绑定和压制能力对小鼠BM ECs (西米et al ., 2018)。有趣的是,他们发现NP大小(20 - 200 nm)不是一个BM EC取向的关键决定因素。相反,挂钩结构的修改和添加胆固醇改善针对BM ECs (西米et al ., 2018)。他们发现了“BM1”作为第一个lipid-PEG NP有效提供核和sgRNA BM ECs在活的有机体内。

Krohn-Grimberghe等人筛选polymer-lipid NPs内在bone-binding能力(Krohn-Grimberghe et al ., 2020)通过创建一个混合图书馆polymer-lipid NPs,基团与核和PEG-lipid配合使用高通量微流控混合室。他们进一步调制挂钩表面涂料通过调整PEG的分子量、脂链的长度,锚钉NP-surface和表面密度挂钩。他们获得了NP (“NicheEC-15”)与高级绑定贪欲BM ECs。NicheEC-15 NPs小干扰rna是封装系统管理在BM ECs沉默基因的老鼠。小干扰rna序列封装成功目标SDF-1或单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1) mRNA和增强(当沉默SDF-1)或减少(当沉默MCP-1)的发行公司和大英博物馆的白细胞。这个策略允许的规定HSC释放大英博物馆和可以用来微调造血治疗应用过程。作者推测,盯住密集的表面层NicheEC-15可能保护NPs从初步的诱捕肺ECs,增加血液循环时间和吸收到BM内皮。

为了增加PLGA-NPs的定位在大英博物馆,NPs是表面改性的二磷酸盐alendronate,一个随螯合分子沉积在骨骼组织从而防止骨质流失。结果alendronate-conjugated聚合物PLGA-PEG NPs显示增加循环时间和优越的绑定骨骼的能力在活的有机体内(哲人et al ., 2014)。同样,alendronate-modified脂质体NPs携带SDF-1基因增加骨骼间充质干细胞招聘代靶向药物输送进行评估。系统性注入Aln-Lipo-SDF-1 NPs导致骨性组织,NPs积累表达SDF-1的成骨细胞的细胞组织再生和吸引力的间充质干细胞(陈et al ., 2018)。

另一种方法来增加归航的移植大英博物馆展示了公司体外孵化的公司与外周血血小板源细胞外微泡(pmv),如存在于造血贪污。这些pmv submicron-sized异质粒子释放血小板激活(Janowska-Wieczorek et al ., 2001)。从力学上看,据报道,pMV港口几个归巢受体,如趋化因子受体CXCR4、CD41, CD61、CD62P, PAR-1和GPIa /活动花絮,可以转移到肝星状细胞在pMV绑定和协助自导和移植肝星状细胞的过程,大英博物馆(Janowska-Wieczorek et al ., 2001)。尤其是后细胞表面趋化因子受体CXCR4受体丰富在HSC pMV绑定和促进互动与他们的配体SDF-1出现在BM正弦内皮。基于这一发现,公司从小鼠BM孤立或人类脐带血与pmv pre-incubated。这些公司的道后移植到免疫缺陷小鼠正常或快得多(Janowska-Wieczorek et al ., 2001)。从BM公司吸气式相比,公司从动员外周血分离已经丰富的pmv血小板活化的结果在leukapheresis塑料管材。这也许可以解释移植动力学之间的差异周边血液和BM-aspirated公司(Janowska-Wieczorek et al ., 2001;Chander Gangenahalli, 2020 a)。

最近,Chander和Gangenahalli表明复合物pmv和普朗尼克之间形成“nanoclouds”覆盖单一肝星状细胞,增加肝星状细胞的迁移在正弦ECs大英博物馆(Chander Gangenahalli 2020 b)。普朗尼克代表一群thermoreversible共聚物可以坚定地与pmv (钟et al ., 2018),经常被用于药物输送方法。从90年代初在一项研究中,聚苯乙烯涂料NPs与普朗尼克f - 127直接超过50%的静脉注射了聚苯乙烯NPs大英博物馆(波特et al ., 1992)。加载与pMV nanoclouds肝星状细胞,特别是与PF127-stabilized chitosan-alginate,之前移植到老鼠致命的辐射导致归航增加10倍,而有效的移植和再生的血液血统(Chander Gangenahalli 2020 b)。

针对肝星状细胞在外周血和/或大英博物馆,NPs需要克服一些生物障碍(图4)。首先,他们需要逃离识别由单核吞噬细胞系统,把血液ECs亦步亦趋,类似于在导航过程中肝星状细胞。在这种情况下,结果表明:在正常流动条件下,NPs迁移远离内皮表面(布兰科et al ., 2015),然而,表面改性与EC配体导致部分流动阻力的影响和吸收增加了ECs (陈et al ., 2020),这表明表面改性与EC-ligands促进NP绑定到大英博物馆正弦ECs。其次,NPs需要穿过正弦EC层到达大英博物馆。不同类型的ECs形成特色鲜明的船只。例如,不连续的ECs与血管来袭和跨膜孔测量在肝脏出现了50 - 100纳米(节食要好et al ., 2007),而inter-EC缝在脾脏的范围从200到500纳米(陈和维斯,1973年)。然而,毛孔在正弦毛细血管的最大大小60 nm,防止NPs大于60纳米的积累在大英博物馆(萨林,2010)。相反,细胞间和细胞内的传输机制可能扮演一个角色的定位NPs在大英博物馆。Transcytosis,知之甚少但trans-endothelial运输的重要机制可以增强使用靶向配体(刘et al ., 2019)。第三,NPs需要交叉大英博物馆空间交通有效地深深地静LT-HSCs。这个过程可能被这一事实促进肝星状细胞是高度能动的细胞在血管周的空间,最近活体成像大英博物馆的利基(所示Upadhaya et al ., 2020)。最后,NPs需要有效的肝星状细胞和逃避endosomal /溶酶体途径释放货物进入细胞质(图4)。

图4

图4。生物由NPs途中遇到的屏障大英博物馆。在静脉注射,NPs遇到一系列连续的障碍阻碍功效和BM-specific交付。1)NPs进行调理素作用和随后由单核吞噬细胞系统吸收。这导致非特异性NPs在健康器官的分布。2)在血管正常流动条件下,NPs优先本地化遥远ECs,限制活动目标和被动定位策略(例如,EPR)。3)在大英博物馆空间,血液流动被大大降低。确保高效的NP吸收,NPs需要接近肝星状细胞。4)等离子体膜和细胞内化代表NP肝星状细胞,吸收额外的障碍和存在的目标半个NP表面会影响吸收机制(例如,网格蛋白与)和胞内窖蛋白NPs的路由。5)在吸收,NPs需要迅速逃离endosomal路线,NPs在哪里受到低pH值环境和酶,这被证明是有害的NP载荷,特别是遗传物质,容易降解。

此外,NPs设计,可以有效地调节肝星状细胞在自然领域,关键是定义自我平衡的健康稳定状态的特点,以及在应力条件和疾病。例如,它最近被发现血液疾病有一个伟大的对大英博物馆的组成和结构的影响。人源化小鼠模型的SCD,骨血管网络被发现混乱和结构异常,与大量的高度曲折的小动脉大英博物馆的大部分腔,以及分散的正弦EC船只挤满了红细胞的聚集和髓细胞(公园et al ., 2020)。增加血管生成,血管密度的变化和/或炎症细胞的浸润也观察到在BM从几乎所有类型的血液恶性肿瘤患者,类似于实体肿瘤(EPR的效果观察Deshantri et al ., 2018)。这如何影响交付NPs大英博物馆领域需要更多的研究。

针对肝星状细胞在外周血和/或静脉注射后大英博物馆也报道了Intellia科学家(Intellia疗法,我。,2021年)。他们开发了一个在活的有机体内编辑方法HBB基因在小鼠肝星状细胞BM。在这个病毒性方法,Cas9 mRNA和sgRNAs被脂质NPs直接发送到目标细胞。相似的脂质配方NPs曾被用于编辑鼠标转体基因(竞技场队伍)基因在肝脏,导致血清转体基因水平减少97%,持续至少12个月(芬恩et al ., 2018)。脂质NPs被验证在活的有机体内识别特定的化学成分,导致增强的动物的BM和肝星状细胞的遗传物质。一周后注射高剂量的CRISPR脂质NPs尾静脉健康(野生型)的老鼠,有超过40%的基因编辑被发现在整个BM,和在肝星状细胞水平预测SCD患者的疗效。HSC编辑水平维持在5%人口与多个连续治疗1年后和增加。重要的是,BM移植了不影响重新和造血祖转基因肝星状细胞的潜力。这些结果将被证实在非人类灵长类动物。

在血液恶性肿瘤的情况下,NP归航大英博物馆已经通过使用特定的肽结合BM ECs过表达粘附分子,如αvβ3整合蛋白。为此,脂质体与Arg-Gly-Asp涂层(RGD)肽提供核或阿霉素(Schiffelers et al ., 2003;Schiffelers et al ., 2005)。内皮目标的另一个常见的例子是很晚antigen-4 (VLA-4)。脂质体与环五聚物肽共轭,称为VLA-4肽,曾针对血液恶性肿瘤(阿什利et al ., 2014)。同样,针对BM通过接合thioaptamer特定于E-selectin PEG-polylactic酸胶束增加BM积累在急性髓系白血病(宗庆后et al ., 2016)。

4.2纳米粒子针对胎儿造血干细胞的造血利基

在开发过程中胎儿肝脏是主要的造血器官,直到前不久出生。它已经表明,发育中的胎儿和胎儿器官可NPs (Bongaerts et al ., 2020)。NPs在静脉或皮下后通过胎盘运输政府怀孕大坝和积累在胎儿的组织,包括大脑和肝脏(-凯兰et al ., 2015;Manangama et al ., 2019)。一个体外人类胎盘屏障性质的研究发现,聚苯乙烯NPs (50 - 500 nm)拍摄,能够穿过胎盘(灯芯et al ., 2010)。其他研究报告在子宫内本地化的NPs吸入暴露后(Bongaerts et al ., 2020)。胎儿肝脏都可以访问在子宫内操作,如造血干细胞移植或交付的基因疗法治疗先天性的血液疾病。

最近,NPs中应用在子宫内造血干细胞移植(里恰尔迪et al ., 2018;Loukogeorgakis et al ., 2019)。战略第一耗尽自体肝内注射小鼠胎肝肝星状细胞的anti-cKIT抗体,针对SCF-cKIT信号轴对HSC生存是至关重要的(威特,1990)。肝星状细胞耗竭后,脂质体分泌GSK-3抑制剂是共价连接到肝星状细胞的表面在子宫内移植。在这个NP-assisted HSC转移,NPs持续在活的有机体内GSK-3抑制,导致显著增加的整体多孔性post-engraftment HSC供体细胞池,紧随其后的是持续扩张的捐赠者公司数量(Loukogeorgakis et al ., 2019)。

小说基因编辑策略在子宫内操纵基因治疗的肝星状细胞允许修正基因的内生环境。里恰尔迪等人的表现在子宫内携带基因编辑由PLGA-NPs triplex-forming肽核酸(PNAs)和供体dna纠正β-globin的致病突变基因位点在人类β-thalassemia的小鼠模型(里恰尔迪et al ., 2018)。intra-vitelline静脉交付后荧光PLGA NPs封装PNAs, NPs的形式分布于整个鼠标胎儿最突出的积累NPs在胎儿肝脏。一个剂量的机构/ DNA-PLGA-NPs导致编辑β-globin基因位点频率8.81%,导致持续纠正贫血,没有检测到非目标突变。

4.3纳米粒子目标在外周血造血干细胞

而大英博物馆代表了主要的造血成人网站,一小部分肝星状细胞和手持电脑周边血液中循环(Bonig Papayannopoulou, 2012)。尽管在低频率,这些步骤更容易比肝星状细胞在大英博物馆,和它们的频率可以增加了执行外出(调动)注入粒细胞集落刺激因子(g - csf), plerixafor或组合(洪博培et al ., 2015;Lidonnici et al ., 2017)。授予特异性,NPs可以配备针对半个(如配体、抗体)与NP表面。然而,正如上面提到的,肝星状细胞缺乏独特的细胞表面标记物的表达。相反,肝星状细胞是具有一组标记用于积极(CD34,例如,CD90、CD133 cKIT)和消极的选择(造血谱系标记,例如,CD45RA, CD38)。此外,标记面板在短期和LT-HSCs不同(Ng和亚历山大,2017年)。CD34⁺仍然是使用最广泛的丰富人力公司研究或临床使用。因为这个原因NPs装饰着anti-CD34抗体已经广泛用于不同的生物医学应用程序,包括immunomagnetic隔离和浓缩的公司(梁et al ., 2009;帝威et al ., 2017;琼et al ., 2018)。复杂的孤立的高纯度HSC数量需要fluorescence-activated细胞排序使用多个标记。引人注目的是,megakaryocyte-derived微粒(MkMPs)拥有内在属性目标和绑定公司(江et al ., 2017)。MkMPs membrane-enclosed囊泡的直径0.1 - -1.0μm被公司的内吞作用和膜融合。CD11b,具体来说,MkMPs目标CD54 CD18, CD43腹足地区的极化公司是高表达在细胞迁移。MkMPs的生物功能是信号分子的转移,包括蛋白质、磷脂和特别是mrna和microrna (江et al ., 2017)。一个优化电穿孔协议最近开发的外部负载MkMPs与遗传物质具体和有效的交付(81% eGFP-encoding质粒DNA)公司(花王Papoutsakis, 2018)。MkMPs拥有许多有益的特性,可以利用公司交付系统:1)电动车,如MkMPs,可以很容易地生成捐赠(自体或同种异体)细胞(科伦坡et al ., 2014;劳拉et al ., 2020);2)MkMPs具有内在能力提供RNA、DNA和蛋白质为公司(江et al ., 2017;劳拉et al ., 2020);3)MkMPs可以外部含有遗传物质基因转移(花王Papoutsakis, 2018);4)电动汽车从自体的细胞显示低免疫原性和细胞毒性(朱x et al ., 2017);5)MkMPs可以存储长期−80°C,而不丢失生物活性(Jeyaram和杰,2017年)。然而,由于MkMPs诱导分化能力的公司向可血统(江et al ., 2014),它还有待决定MkMPs可以编辑工具旨在提供基因肝星状细胞在活的有机体内,没有诱导血统的偏见。另外,进一步说明MkMPs瞄准机制铺平了道路对新型公司瞄准的方法通过模仿属性赋予公司MkMPs特异性。另一个有趣的可能性特别向公司交付货物由混合输送系统组成的NPs涂MkMP膜(Powsner et al ., 2021)。在这种方法中,合成NPs封装一个货物,如基因编辑组件,可以大批量地做好准备,与特定的MkMP涂膜公司的目标在活的有机体内。MkMPs和合成NPs有类似的形状和弹性,和类似的大小,这表明这样的NPs可以设计目标肝星状细胞。

5 NP-based针对造血干细胞治疗策略

NPs蕴含着巨大的希望作为治疗治疗各种基因输送系统,感染和恶性血液疾病。的发现sequence-specific核酸酶基因编辑工具和他们的进步,新的治疗可能出现血液患者未满足的医疗需要(Hacein-Bey-Abina et al ., 2014;Hacein-Bey Abina et al ., 2015;萨瑟et al ., 2015;Sessa et al ., 2016;坎特et al ., 2017;汤普森et al ., 2018;Staal et al ., 2019)。这一段我们讨论的可能性NP-based疗法针对公司为各种血液疾病。

5.1血液疾病,目前治疗兵团

大多数的人类血液疾病影响肝星状细胞是由突变引起,手持电脑或他们的后代,导致造血作用的缺陷或者lineage-specific损失。基于他们的病理学,他们分为三大类:红细胞疾病、白细胞和血小板疾病。常见疾病如镰状细胞病、地中海贫血、白血病、淋巴瘤和血友病。此外,许多罕见的血液学的条件存在,包括存储紊乱,免疫缺陷和转录综合症。一系列传统和高度进步的治疗方法目前用于治疗血液疾病患者。这些包括化疗、放疗、靶向生物疗法,BM移植、汽车t细胞治疗和基因编辑自体肝星状细胞与造血干细胞移植。

5.2纳米颗粒血液恶性肿瘤的治疗

血液恶性肿瘤是一种广谱的癌症包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤源自异常分化大英博物馆的公司。因此,大英博物馆微环境的平衡是打扰,恶性肿瘤细胞生长的正常造血作用。尽管化疗药物可用于治疗血液恶性肿瘤,这些药物的应用剂量相关毒性和限制是由于缺乏对恶性肿瘤细胞的特异性。因此,有一个未满足的医疗需要合适的药物输送系统来提高治疗血液系统恶性肿瘤的疗效和安全性。NPs,如聚合物NPs和胶束,albumin-stabilized NPs和脂质体,已经广泛用于交付血液恶性肿瘤的化疗药物治疗。几个配方已批准临床使用或正在临床前开发;我们建议一个详细的概述(Deshantri et al ., 2018)。大多数这些配方目标疾病的表现,在血液恶性肿瘤主要位于大英博物馆和外周血,以及二级淋巴器官,脾和淋巴结等。类似于EPR效果,增加血管生成和微脉管结构的变化,以及炎症细胞的浸润,在BM的从几乎所有类型的血液恶性肿瘤患者,这可能促进NP积累在这些器官。偶像等人开发alendronate-conjugated PLGA-PEG-NPs含有bortezomib、蛋白酶体抑制剂,BM目标(哲人et al ., 2014)。另一个策略目标恶性细胞结合单克隆抗体与NPs特定的生物标志物。这种策略特别有利,如果抗体产生细胞毒性影响恶性细胞。例如,daratumumab, fda批准的对多发性骨髓瘤anti-CD38抗体有效时,耦合的脂质体和特异性结合的恶性B细胞与使用联合治疗(Deshantri et al ., 2018)。在另一个例子,doxorubicin-loaded胶束针对CD19被注入了人类急性淋巴细胞白血病异种移植模型。这导致了动物相比,存活时间的增加(Krishnan et al ., 2015)。此外,transferrin-targeted doxorubicin-loaded Pluronic85 /脂质NPs是治疗儿童白血病(朱b . et al ., 2017)。最近,仿生NPs模仿天然结构,如细胞膜,已交付疗法用于血液恶性肿瘤的治疗。仿生NPs避免免疫识别和目标具体位置在体内利用细胞膜的独特的归巢能力交付货物,同时减少毒性的风险(Powsner et al ., 2021)。随着CRISPR及其在癌症免疫疗法,利用血液恶性肿瘤的新疗法的发展。电流的调制方法主要集中在T细胞受体和免疫检查点监管机构提高对恶性肿瘤细胞T细胞反应。在这种背景下,在活的有机体内CAR-T细胞诱导由NPs封装CAR-genes和基因编辑工具在白血病的治疗取得了可喜的成果。原位编程的自体T细胞的帮助下NPs可以避免同种异体T细胞的安全隐患,减少系统性毒性(鑫et al ., 2022)。

5.3纳米颗粒基因治疗血液疾病的交付系统

目前,只有永久治愈许多血液疾病是健康的肝星状细胞的移植,重建myelo-ablated患者的造血系统。但有缺乏合适的同种异体捐赠者和治疗与移植排斥的风险和贪污与宿主病(Cavazzana et al ., 2019)。利用基因修饰自体肝星状细胞消除贪污的风险与宿主病和否定免疫抑制药物的必要性在同种异体造血干细胞移植。在过去的十年中,核酸酶的发现使特定站点基因组编辑,如锌指核酸酶(ZFN)转录activator-like效应核酸酶(取得),PNAs定期和集群空间短回文的重复序列(CRISPR) / CRISPR-associated蛋白质核酸酶(Cas) (CRISPR / Cas)已成为有吸引力的工具来纠正或改善疾病或免疫缺陷,例如那些由HIV引起的,在自体肝星状细胞。这些工具的潜力是巨大的,总的来说,考虑到超过60%的所有人类致病基因变异引起的点突变(里斯和刘,2018年)。在这些核酸酶,CRISPR / Cas系统脱颖而出,因为他们提供了一种灵活的、模块化的和具有成本效益的方式编辑基因组。

基因编辑已经证明是有益的对于遗传血液疾病患者,如镰状细胞病(SCD)。一种方法关注的是修复SCD HBB基因的突变(SNP rs334 c.20A > T,p。Glu7Val)。令人信服的概念验证数据获得使用homology-directed Cas9-induced双链断裂的修复(HDR)(双边带)rs334 (德弗et al ., 2016;田et al ., 2021 a;田et al ., 2021 b;Lattanzi et al ., 2021),基本编辑将SCD等位基因转化为一种编码孟加锡β-globin,非致病性变异(纽比et al ., 2021)。胎儿血红蛋白表达的另一种方法侧重于复活的基础上减少BCL11A的表达,胎儿HBG1β-like球蛋白基因的转录抑制因子和HBG2成人红细胞细胞。损耗BCL11A的成人红细胞细胞复活HBG1/2表达式,这是非常有利于SCD患者。在SCD患者最近的一项研究,CRISPR / Cas9基因组编辑的erythroid-specific增强剂应用于灭活BCL11A基因(Frangoul et al ., 2021),导致治疗γ-globin的表达水平。替代方法关注摧毁HBG1/2推动者BCL11A的结合位点,通过异源的end-joining Cas9-directed双边带,HDR双边带、编辑或基地,取得了可喜的成果在临床前研究(Traxler et al ., 2016;Martyn et al ., 2018;Metais et al ., 2019;吴et al ., 2019;韦伯et al ., 2020)。

几个交付方法用于执行CRISPR / Cas9-mediated基因编辑在公司,包括AAV (歌et al ., 2013;萨瑟et al ., 2015)或LV转导(Traxler et al ., 2016),或者电穿孔的核糖核蛋白(RNP)复合物,实现高达80%的效率在人类CD34基因编辑⁺公司(Verhagen et al ., 2022)。如果需要HDR,最有效的方法是电穿孔与non-integrating病毒载体转导(紧随其后德弗et al ., 2016),或伴随的电穿孔RNP复合物和化学改性单链DNA模板(德瑞文et al ., 2017)。然而,当前的方法有几个局限性。1)AAV载体有一个包装效率低和记录免疫原性,而经典的病毒载体携带插入突变的风险(吴et al ., 2010;阴et al ., 2014)。此外长期Cas9表达式相关的免疫原性会导致编辑细胞裂解,从而进一步限制使用病毒载体(梅塔和默克尔,2020年)。2)虽然成功病毒性基因编辑在公司使用电穿孔报道(亨伯特et al ., 2019),这种方法仍然是与细胞毒性(Gundry et al ., 2016;Charlesworth et al ., 2018)。3)当前基因编辑方法需要体外肝星状细胞的培养和操纵细胞因子的鸡尾酒,它被认为对肝星状细胞的长期生存能力和重新能力造成负面影响。4)体外基因治疗的肝星状细胞需要在专业医疗中心高成本,限制病人的访问。这些限制有启发的发展在活的有机体内交付系统,比如NPs基因编辑工具,可以克服的必要性体外操纵病人肝星状细胞,减少非目标效应Cas9活动(Wilbie et al ., 2019)。这样的进展可能会带来安全有效的基因治疗世界的所有部分,包括撒哈拉以南非洲地区,SCD和艾滋病等疾病的负担很高(Ndung 'u et al ., 2019;大炮et al ., 2021)。

高效基因编辑工具,如CRISPR需要在目标细胞内部足够高的浓度在活的有机体内途中细胞核。DNA和RNA天生容易血清核酸酶降解,和拥有贫穷膜透性潜力(傅et al ., 2014)。慢病毒载体不适合在活的有机体内基因编辑,由于快速补失活后注入和缺乏特定站点的目标主题(竹内et al ., 1994)。几个评论最近解决NP配方开发将不同类型的病毒性基因编辑工具(Wilbie et al ., 2019;段et al ., 2021;Naeem et al ., 2021;徐et al ., 2021)。NPs保护他们的有效载荷和货物带来新颖的物理化学性质,使通过细胞内吞作用基因编辑组件的有效吸收机械。重要的是,正如上面提到的,NPs可以配备针对主题肝星状细胞在大英博物馆或外周血肝星状细胞。特别是,脂质NPs、聚合物NPs和黄金NPs提供巨大的潜力无毒基因编辑组件交付系统(李et al ., 2017;芬恩et al ., 2018;李et al ., 2018)。配方中脂质和聚合物NPs基因编辑组件封装到NP核心(克鲁兹et al ., 2021),它的优点是RNP复杂免受降解在交付到目标站点(王et al ., 2016)。我们最近证明PLGA-NPs代表交付系统适合co-encapsulated RNP复合物和荧光探针,并高效地编辑HBG1/2人类CD34基因在初级⁺公司导致的胎儿血红蛋白mRNA水平升高,而不影响造血祖单独使用潜力(克鲁兹et al ., 2021)。在最近的另一个方法中,聚合物poly-β-amino酯(PBAE) NPs用作Cas9 RNP复合物交付系统破坏CD33的基因在人类肝星状细胞,一个策略来保护从anti-CD33治疗急性髓系白血病患者的肝星状细胞(El-Kharrag et al ., 2022)。重要的是,NP-edited CD34⁺和CD34⁺CD90⁺长期移植细胞表现出高效的亚致死的辐照NSG老鼠和保留multilineage分化潜能。

与聚合物和脂质NPs相比,DNA, RNA和蛋白质通常表面沉积金属NPs,如黄金、通过化学表面改性或电荷的相互作用(Rosi et al ., 2006)。特别是带正电的NPs,比如黄金NPs,允许大量的遗传物质的沉积在NP表面,因此代表了一个有吸引力的纳米材料的基因编辑工具”(拉撒路和辛格2016)。Polymer-stabilized RNP复合物也可以通过静电相互作用形成NPs (阮et al ., 2020),然而,类似于surface-deposited基因编辑组件,这些复合物不免受蛋白酶和核酸酶,除非进一步的表面功能化。在图5我们总结当前NP-mediated交付策略用于基因编辑组件CRISPR和PNAs本文中描述。

图5

图5。Nanoparticle-mediated交付肝星状细胞的基因编辑工具。(a)示意图说明CRISPR——PNA-based NP-delivery系统用于公司的基因改造。迄今为止,黄金NPs polymer-stabilized NPs, PLGA-NPs,脂质NPs,脂质体,病毒样颗粒(一种)和电动汽车已经利用公司的基因改造。(插图)CRISPR / Cas9可以交付为质粒DNA,信使rna,或RNP复杂(连同双链或者是单链DNA模板在HDR)的情况下,实现特定的基因编辑。不同的格式可以封装或surface-deposited高效细胞内交货。质粒DNA需要传递到细胞核转录成信使rna,然后将翻译成Cas9蛋白质在细胞质中,运送回细胞核形成CRISPR RNP复杂从而发挥基因编辑功能。信使rna交付,载荷应被释放的胞质让信使核糖核酸的翻译蛋白质。相比之下,CRISPR RNP需要传递到细胞核。

测试的效用PLGA-NPs基因编辑工具的公司,McNeer等人封装PNAs包含所需的序列和供体DNA模板修改为核心的PLGA NPs (McNeer et al ., 2011)。PNAs由碱基peptide-like骨干,使高亲和性三层结构形成和DNA, DNA修复和刺激引发DNA重组机构结合位点附近(罗杰斯et al ., 2002)。编辑HBB基因位点与PLGA /机构/ DNA NPs CD34⁺公司导致特定站点修改0.5 -1%的治疗没有诱导的细胞毒性和被证明是在nucleofection优越。这是第一个示范的可生物降解的NPs作为基因组编辑组件交付系统。两年后,McNeer等人在活的有机体内辅助受体CCR5基因编辑的艾滋病毒(预防或治疗艾滋病毒感染)和HBB基因位点在静脉注射肝星状细胞的PLGA /机构/ DNA NPs人源化小鼠模型,虽然在低频率编辑(BM的0.05%,0.43%在脾脏)(McNeer et al ., 2013)。

最近的一项研究报告在活的有机体内HSC基因编辑使用静脉注射PLGA NPsβ-thalassemic老鼠,PNAs和供体dna纠正β-globin中的致病突变基因位点,结合自洽场给予腹腔之前NP管理局(Bahal et al ., 2016)。Bahal和McNeer首次报道γ-position mini-PEG集团的公司的部分或全部机构单位。在活的有机体内治疗β-thalassemic鼠标模型导致了基因编辑频率几乎4%的总BM在肝星状细胞和6.9%,和改善血液中血红蛋白含量持续至少140天。作者发现,自洽场增强了PLGA /机构/ DNA NPs-mediated基因编辑在活的有机体内可能增加造血干细胞动员的结果,可能会允许更有效的基因转移。β-thalassemia小鼠模型,PLGA /机构/ DNA NPs也应用intra-amniotically选择妊娠年龄而不影响生存或产后的增长。深度测序显示校正HBB的致病突变基因的所有细胞的6%。这导致了持续纠正贫血,没有检测到非目标突变(里恰尔迪et al ., 2018)。在PNAs上落后CRISPR基因编辑效率,他们的安全优势低不相干的编辑,而不是诱导DNA双链断裂。

另一个基因编辑方法治疗SCDβ-thalassemia小说的介绍中的特定删除HBG1/2发起人地区概括自然发生的突变称为遗传性胎儿血红蛋白的持久性,这是众所周知的,改善疾病症状(Akinsheye et al ., 2011)。在这种背景下,Shahbazi等人开发了一个多层聚乙二醇黄金NP平台携带指南的RNA, Cpf1(或Cas12)核酸内切酶,表面(PEI)和单链DNA模板,导致8.8%的CD34 HDR⁺HPSCs (Shahbazi et al ., 2019)。CD34基因编辑⁺免疫缺陷小鼠HPSCs道在剂量辐照,显示稳定的基因编辑水平的5%在22周后外周血移植。作者发现黄金NPs更有效率比电穿孔HDR,在不影响公司的生存能力。相反,他们发现了一个积极的影响的黄金NPs祖集落形成潜力,最初与HDR水平降低造血干细胞移植后最终稳定。这种现象也报道了其他组(徐et al ., 2017);可能说明了NP吸收峰值,在成熟的CD34基因编辑⁺手持电脑寿命有限。

最近,阮等人报道的方法改善的功效CRISPR / Cas9-based HDR主CD34⁺细胞通过添加截断Cas9目标序列两端的HDR模板与Cas9 rnp和航天飞机细胞核的模板(阮et al ., 2020)。此外,聚合Cas9 / gRNA RNP复合体聚麸胺酸的NPs 100海里进一步提高编辑效率15%主要动员外周血公司。聚麸胺acid-stabilized RNP NPs可以冻干,使升级研究或临床基因修饰细胞制造的翻译。

脂质NPs交付Cas9 mRNA连同一个强有力的单一gRNA也被开发用于治疗血友病,一个基因造血障碍,自发出血引起的凝血通路中的基因功能丧失(汉et al ., 2022)。gRNA旨在目标抗凝血酶,编码的内源性凝血酶生成的负面调节器由serpin家族CC成员1 (SERPINC1)基因。脂质NPs成功CRISPR交付在活的有机体内到肝脏。连续三个剂量导致50%的抗凝血酶抑制和增强的血栓形成,没有感应的脱靶效应(汉et al ., 2022)。

最近技术利用“nanoblades consisiting改良小鼠白血病病毒或HIV-derived病毒样颗粒(车牌区域)融合RNP复合物(Gutierrez-Guerrero et al ., 2021)。准型基因编辑与狒狒信封nanoblades导致40%的编辑删除Wiskott-Aldrich综合征(是)在CD34基因位点⁺人类的公司,没有诱导细胞毒性。这种技术也结合donor-encoding rAAV6向量,从而导致高达40%的稳定表达盒敲入到基因位点。

每个方法结合基因编辑组件到NP平台有其优点和缺点,和一些更适合特定的细胞类型。表2概述了最常用的利弊NP-platforms提供基因编辑工具公司。

表2

表2。概述NP-based交付系统的优势/劣势基因编辑组件。

6挑战和纳米颗粒治疗血液疾病的机会

尽管最近领域的发展和突破NP-mediated交付基因编辑工具允许部署CRISPR / Cas9基因直接编辑在活的有机体内在包括人类在内的灵长类动物(Gillmore et al ., 2021;Musunuru et al ., 2021;Rothgangl et al ., 2021;穆拉德,2022),存在着巨大的障碍NPs的肝星状细胞在活的有机体内。首先,一些内部和外部障碍必须克服严重限制特定站点NPs交付在活的有机体内因此影响治疗效果。此外,调理素作用和随后的封存由单核吞噬细胞系统代表了另一个挑战导致非特异性在活的有机体内分布和积累NPs在健康的器官,如脾脏和肝脏。因此,NP开发者面临的挑战,以减少非特异性积累和到达目标地点的治疗水平。PEGylation可以显著防止封存单核吞噬细胞,减少非特异性分布,意想不到的免疫反应和改善NPs的稳定性。然而,其缺点是NP表面的一个水相的形成,从而减少NPs与靶细胞之间的相互作用的能力逃脱endosomal路线。这种现象也被称为挂钩的两难境地:长时间的血液循环与减少细胞吸收/ endosomal逃跑。截留在核内体/溶酶体导致负载退化和NP系统是一个潜在的故障点携带基因编辑工具。整合pH-sensitive化合物或可分裂的化学基团之间的挂钩一半和NP表面可以克服截留在溶酶体(Schmaljohann 2006;Zerrillo et al ., 2019;希恩et al ., 2022)。在降低pH值在endosomal /溶酶体路由,连接器可以裂解揭露一个带正电的表面来触发endosomal逃避和细胞质易位。改性的聚乙二醇NPs与配体是一种有效的办法把挂钩的优点与特异性交付。此外,使用抗体靶向配体的优点是克隆可以用来介绍点突变的骨干和锁定减少依赖抗体的细胞毒性细胞单核吞噬细胞系统的吞噬作用(康和荣格,2019)。

针对BM肝星状细胞,NPs必须通过一些外部障碍(bloodstream-EC, EC-BM BM-LT-HSCs)。这需要多才多艺的设计NPs携带多个属性范围内皮,EC层传递到大英博物馆,目标LT-HSCs和有效地交付货物。科学家最近报道有效交付CRISPR通过脂质NPs BM取向。肝星状细胞的基因编辑观察小鼠BM水平预测为SCD(治疗Intellia疗法,我。,2021年)。然而,NP的特异性靶向肝星状细胞还有待确定。

因为HSC标记,包括CD34,也出现在其他手持电脑和ECs,目前不可能交付NPs专门使用常见的HSC标记肝星状细胞。策略来增加绑定和吸收的肝星状细胞可能与二价抗体NPs的结合亲和力,较低的设计目标多个HSC图案,这样的高亲和性NP之间的交互和多个标记肝星状细胞会青睐(侯赛因和埃勒曼,2018年)。此外,肝星状细胞生理的一种改进的理解,基于纯化肝星状细胞的研究,将有助于确定哪些受体代表了大多数肝星状细胞选择性的目标。

的应用的一个主要担忧NPs在生物安全性和特异性。运载工具,可以用高度专一目标所需的细胞也会限制非目标效应并提高安全性。不太可能一个NP配方将普遍适用的目标只肝星状细胞。然而,针对主题的合并可能大大增加NPs及其有效载荷肝星状细胞的胞内交付。因为肝星状细胞不显示独特的细胞表面标记,和NPs需要跨多个障碍达到肝星状细胞,针对主题,或组合,必须明智地选择限制NP配方的复杂性,同时增加了BM积累和肝星状细胞所吸收。未来NP平台可以开发,以避免过早负载释放利用生物材料响应刺激特别礼物或大英博物馆中高度表达,结合HSC针对主题增加对肝星状细胞特异性。

未来基因治疗的成功很大程度上取决于先进的基因工程和交付到目标细胞。除了目标细胞交付问题,电流限制在翻译CRISPR疗法的临床问题的脱靶效应Cas9核酸酶。高保真中科院分子,减少非特定的DNA结合结合瞬态输送系统是必需的。Cas9 nickas和突变体,减少非特异性DNA结合专门设计来克服这个问题(利诺et al ., 2018),这是至关重要的持续发展如果CRISPR / Cas9是实现其承诺为人类疾病的治疗。高效基因编辑同时最小化脱靶效应通常是获得交付RNP复杂而不是质粒DNA或信使rna (金正日et al ., 2014)。NPs允许瞬态交付RNP复合物。重要的是,NP系统可以很容易地调整合并的新变种中科院核酸酶,提高目标特异性和非目标效应降低。

治疗造血障碍,它需要LT-HSCs消除或改善疾病表型的遗传校正他们的后代。对于许多遗传性疾病,纠正肝星状细胞的一小部分足以逆转疾病病理。在镜头分割和b-thalassemia,移植后跟进表明混合造血嵌合的10 - 30%的改善临床疾病症状(谢长廷et al ., 2009;乔杜里et al ., 2017)。如果NP-mediated在活的有机体内编辑没有达到足够高水平的嵌合一剂后,重复剂量可以很容易地增加嵌合执行(Intellia疗法,我。,2021年)。恶性血液疾病的情况会不同,所有驾驶疾病的细胞成功必须有针对性。因此这些条件应该更加难以治疗更不用说治疗基因。另外,NP-based方法可以用来实现血液恶性肿瘤的免疫治疗。

NP-based诊断策略监控HSC极大地依赖于HSC针对潜在的交付系统,没有引入毒性或影响其干细胞特性。几个无创性NP-based(多)模式已经发展到标签公司体外移植前和检测公司的初始导航和调整模式在不同的隔间与造血器官,包括公司的早期征兆嫁接在大英博物馆。改善标签技术和成像探针需要肝星状细胞的长期跟踪。NPs是适合和广泛用于相伴成像和治疗的目的。成像探测器和造影剂在基因的整合编辑NP平台中在活的有机体内基因编辑允许在活的有机体内监测NP分布在组织层面,并通过流式细胞术在细胞水平上。而手持电脑扩散和稀释NPs随着时间的推移,预计NP-probe配合将检测到的时间更长在静止肝星状细胞和手持电脑相比,NPs的成像特性提供足够有效的和稳定的。

建立一个有效的NP平台交付肝星状细胞的基因编辑工具,NPs和基因之间的交互编辑组件应该强大到足以确保RNP复合物稳定在血液中细胞内化。相比之下,endosomal /溶酶体逃逸后,RNP复合物应被释放从NPs扩散到细胞质,最后把进入细胞核。任何问题在任何步骤可能导致整个交付过程失败。一种多用途CRISPR / Cas9交付系统仍出现。相反,描述了多种方法提供CRISPR细胞。每种方法都有其优点和缺点,有些更适合特定的细胞类型。阳离子NPs(有机和无机)稳定CRISPR载荷NP表面沉积通过静电相互作用,有机壳(主要是脂质层)常被用来保护RNP从核酸酶复合物。靶向配体可以固定在外壳调解与宿主细胞的相互作用。另一方面,在聚合物的形成和脂质NPs, RNP复合物被封装到NP核心,因此避免过早退化和间隙的免疫系统。聚合物NPs内在优势,他们比脂质NPs显示较长的保质期。此外,它是极其重要的,长期毒性研究NPs执行的安全,如果有必要,改善NP设计开发实现NPs无毒,non-immunogenic,高度稳定高货物交付效率。固有的极大的灵活性NP-mediated基因疗法的使用允许的选择因素的最佳组合最大效率。

7结论和未来的观点

基因编辑技术,其中包括CRISPR编辑/ Cas核酸酶和基地,是永久的承诺修改患者的致病基因。尽管基因治疗的新突破的兴奋,在活的有机体内基因编辑组件的应用仍处于起步阶段。然而,一些基因治疗的临床试验已经完成或正在进行中。这预计将大幅增加在未来几年,将包括许多试验血液疾病。

显然必须克服的挑战。交付的效率将会提高,特别是用于治疗恶性血液疾病,如白血病,白血病细胞的大多数(如果不是全部的话)必须修改或枯竭。细胞表面特异性仍是一个问题,因为目标不同细胞类型之间共享,因此例如抗体介入NP交付时将引起关注其他(一道)细胞也修改,因为这可能会改变其功能,或如果他们需要丰富NP难解的高剂量治疗。编辑系统本身的特异性也将进一步得到改善,确保序列以外的目标序列不修改。

如果针对LT-HSCs或白血病干细胞的效率太低,重复治疗方法可以被认为增加有针对性的细胞或其他目标前体细胞的数量将比LT-HSCs生存期较短。例如,早期的SCD红细胞祖细胞可以纠正,但这需要重复“治疗更新”,因为这样的电池寿命有限。在白血病的情况下这可能是一条控制这种疾病通过限制数量的白血病细胞。然而,在这些例子每个治疗的成本会大幅降低来自当前估计基因治疗每个病人通常超过百万马克(伦纳德et al ., 2022)。尽管存在这些挑战,纳米血液疾病的治疗提供了广阔的前景。最近的出版物表明具体的目标可以实现在活的有机体内(魏et al ., 2020;Gillmore et al ., 2021;Musunuru et al ., 2021;Rothgangl et al ., 2021;穆拉德,2022)。强烈的在活的有机体内屏幕将是必要的,以确定最优的NP平台和修改策略(西米et al ., 2018;Krohn-Grimberghe et al ., 2020),包括发展的最优配方在活的有机体内针对LT-HSCs。

作者的贡献

龙基和CE取得了实质性贡献的概念,本文的设计和编写。SR, FG和SP参与写作的审查。FG, SP,龙基和CE至关重要的知识内容的修订后的手稿。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。

资金

龙基支持由欧洲委员会资助项目:玛丽·居里赠款协议777682(癌症),872860 (PRISAR2), 807281 (ACORN), 852985 (SIMICA), 952520(生物),861190(铺),857894 (CAST), 859908 (NOVA-MRI)和956477(钢琴)。CE h2020 -广泛支持的是2018 - 03 (852985 - simica)欧盟委员会项目拨款。CE、LC、SP和FG是由荷兰PPS津贴可由TKI-LSH卫生∼荷兰NANOCAST项目(EMCLSH20006 TKI-LSH-DT2019-LUMC: 2020 - 03)。老被支持的玛丽·居里授予857894号协议(CAST)。

的利益冲突

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引用

AbuSamra, d . B。、Aleisa f。,Al-Amoodi, A. S., Jalal Ahmed, H. M., Chin, C. J., Abuelela, A. F., et al. (2017). Not just a marker: CD34 on human hematopoietic stem/progenitor cells dominates vascular selectin binding along with CD44.血供订购。1 (27),2799 - 2816。doi: 10.1182 / bloodadvances.2017004317