植物在21世纪生物大分子交付方法
萨钦Rustgi
萨尔曼Naveed
乔纳森·温德姆
张洹
Gozde s Demirer- 1植物和环境科学、健康研究学院的克莱姆森大学小便迪研究和教育中心,佛罗伦萨,SC,美国
- 2农业与生物学院,上海交通大学,上海,中国
- 3加州理工学院化学工程系,帕萨迪纳市,美国
21世纪见证了繁荣在植物基因组学和基因特征研究通过RNA干扰和定点诱变。具体地说,过去15年标志着快速增长在发现和实现不同的基因组编辑技术。方法将基因编辑试剂也试图跟上基因编辑工具的发现和实现植物。因此,各种瞬态/稳定,快速/冗长、昂贵的(需要专用设备)/便宜,和通用的/具体(物种、发展阶段或组织)方法开发。简要描述这些方法与重点综述文章提供了最近的进展。此外,列出了每种方法的优点和局限性,允许读者选择最合适的方法具体研究。最后,未来的发展和需求的角度提出了在这一研究领域。
介绍
有一个指数增加植物物种的基因组信息的可用性在过去的二十年里,从完整的基因组序列拟南芥(拟南芥基因组计划,2000年)的pangenomes玉米(Hufford et al ., 2021)和小麦(Walkowiak et al ., 2020)。然而,基因功能的了解没有赶上基因发现的步伐。这个障碍的主要原因是变换的能力只有数量有限的植物物种(只有少数选择基因型在一个物种内)和所需的时间和精力将选定的基因型。越来越多的基因组信息和基因之间的滞后特性进一步凸显了需要开发或改进现有的生物分子交付方法,如果可能,消除需要trans-differentiation,组织培养,genotype-dependence。美国国家科学基金会承认这与植物转换的创建需要挑战赠款(TRANSFORM-PGR)在植物基因组研究项目(PGRP)在2016年。
这篇评论文章涵盖了建立和更新的生物大分子交付方法,最近调查传统方法的变化。也已取得实质性进展的使用地貌成因的基因(发展监管机构)通过诱导trans-differentiation避免genotype-dependence和组织培养的外植体,多余的或静止的分生组织和促进克隆传播通过种子(孤雌生殖)将减数分裂转换为有丝分裂(MeMi)和改变基因诱导单倍体。然而,这些主题超出了本文的范围,他们感兴趣的读者的评论Khanday和,转向开始涉足(2021),郭et al。(2021),Chan) (2010)。
大分子货物交付方法讨论了评论文章可以用不同的方法分类。例如,他们可以分为传统和新方法取决于他们的用法。此外,基于交付的模式,这些方法可以分为直接或向量(生物/物理)介导的货物交付方法。基于交付的模式,这些基因传递方法也可以分组在物理、化学或生物方法。最后,这些生物大分子交付方法可以分为瞬态/永久或non-integrative /综合。为了便于演示,下面讨论不同的交付方法基于一种混合分类系统强调的常规方法和交货方式。
传统的生物大分子交付方法
在本节中,关注传统生物大分子交付方法,目的不是提供一个全面的历史的叙述他们的发现,从发现者回忆录是可用的和有兴趣的读者可以参考(Paszkowski et al ., 1984;桑福德,2000;奇尔顿,2001;克莱恩,2011;范·蒙塔古,2011)。此外,本节将不记录所有研究使用这些常规基因传递方法,致力于这些话题有特定的书(王2015年;Rustgi和罗2020)。相反,努力做出一些修改/更新这些程序列表。
即peg方法及其修改
的发现即peg(多用途的“生物”和“弹道”)生物分子交付是20世纪最优秀的农业创新之一。这是两种基因传递方法可用于研究基因修改植物(Rustgi罗,2020年),另一个是农杆菌属介导的基因传递。农杆菌属介导的基因传递略早于即peg法和有其局限性,如基因型依赖,因为它在很大程度上依赖于宿主基因组的基因相互作用,农杆菌属基因组,Ti (tumor-inducer)或Ri(毛root-inducing)质粒(Christou 1994,1996年)。相反,即peg法提供的主要优势是其基因型独立,因为它依赖于物理力而非生物之间的相互作用对生物分子交付。其他优点包括大型DNA片段的交付(甚至一些整个细菌人工染色体的大小),这可能是线性或圆形(元et al ., 2012)。交付的可能性线性DNA的整合提供了另一种优势通过消除质粒骨架(元et al ., 2012)。此外,该方法允许一个巨大变化的范围,特别是蛋白质,核蛋白复合物,荧光染料(技术被称为“DiOlistics”) (Sherazee和阿尔瓦雷斯,2013;Sudowe Reske-Kunz, 2013;Rustgi罗,2020年)。其他改变涉及研究microprojectile(粒子)的大小,类型和外植体之间的距离和microprojectile加速器或喷嘴(桑福德,2000)。一些研究也进入了七的发展™适配器,分支管加速度在七个部分七macrocarriers扩大领域的粒子。因此,它应该是均匀传播DNA-coated粒子在一个更大的区域和细胞的数量最大化转变在一次轰炸。的七™适配器的pds - 1000 /他即peg系统据称已经改变了细胞比标准的适配器(7 - 10倍https://www.bio-rad.com/)。由于气体是划分为七个部分,压力和粒子速度降低,使它理想的外植体培养和细胞培养系统需要更少的强有力的渗透。microprojectiles和涂层方法的研究正在进行中(Ismagul et al ., 2018;坎宁安et al ., 2020)。最近,黄金涂层微载体与聚乙二醇(PEG)和镁盐的解决方案,而不是亚精胺和氯化钙,大幅提高转换频率在普通小麦(Ismagul et al ., 2018)。
即peg法仍然是最常用的基因传递方法在植物和大多数商业发布的源基因转移在1990年代开发的(Christou 1996)。方法仍然在发展和被修改的纳米级粒子涂以核酸/核蛋白质复合物;一个过程称为“nanobiolistics”(O ' brien Lummis, 2011;这一主题的详细检查,看到坎宁安et al ., 2018,2020年)。另一个修改称为“Agrolistic转换”的好处农杆菌属与即peg介导基因传递方法。在这种方法中,农杆菌属毒力基因,virD1和virD2需要解放T-strands Ti质粒的细菌,被置于控制之下的本构花椰菜花叶病毒(CaMV)35个年代启动子和通过即peg co-delivered方法与目标包含边界序列侧翼感兴趣的基因的质粒。因此,这种方法提供了基因型的独立性即peg法结合单份基因整合的好处农杆菌属介导的转换方法(汉森和奇尔顿,1996年)。这种方法是专门用来修饰difficult-to-transform作物,如棉花和大豆(后来修改的方法的详细信息,请参见低音部et al ., 2020)。
其他的修改即peg法包括交付植物和动物细胞的蛋白质。这种方法,名为“proteolistics”,需要蛋白质的沉积以及微载体上macrocarrier表面。这个不需要蛋白质沉淀到micro-projectile表面,它不涉及任何微载体的化学修饰,也没有化学蛋白质之间的相互作用和微载体;因此,这种方法并不局限的蛋白质,可以交付(Martin-Ortigosa和王出版社,2014年,2020年)。尽管给定的优点,该方法并没有引起很大的关注的时候发现直到最近提供的基因编辑试剂的需求增加,即。,指导rna包裹着Cas9蛋白质。有几个优势直接交付CRISPR / Cas9核糖核蛋白复合物(rnp)或体外转录(IVTs) gRNA和Cas9进入植物细胞。其中一个优点是减少非目标突变通过避免插入突变或外国在基因组DNA片段的集成。交付通过microprojectile轰炸RNP复杂,相同浓度的gRNA和Cas9混合比例4-5:1为了发展RNP复杂,随后与金颗粒混合,传播到macrocarriers,风干。该方法成功地用于常见的小麦诱导突变预计所需的基因和功能同样在其他作物(梁et al ., 2018,2019年;张y . et al ., 2021)。
农杆菌属介导的基因传递方法及其修改
农杆菌属介导的基因传递的主要植物遗传转化方法。它的流行的主要原因之一是可以方便地采用和实施实验室熟悉植物组织培养和分子克隆程序,没有大量资源(等人。,1997年)。细菌种类以外农杆菌属/根瘤菌后来证实是植物细胞的DNA (Hooykaas et al ., 1977)。然而,到目前为止,农杆菌属仍然是主要载体DNA转移。
两个物种,根癌土壤杆菌和答:rhizogenes(根瘤菌rhizogenes),和几个农菌株用于变换各种各样的植物。总的来说,这些菌株的可用性的宿主范围增加农杆菌属然而,spp。使用不同农杆菌属菌株对不同寄主植物需要大量优化,随着培养时间和随后的消除之后是物种/ genotype-specific。根癌土壤杆菌和r . rhizogenes也有不同的模式的遗传转化和使用不同的蛋白质动员DNA进入植物细胞(令,2009)。根癌土壤杆菌介导的基因传递收益率植物在或完全改变了植物转基因表达(Fernandez-Pinan et al ., 2019),而r . rhizogenes生产转基因毛状根在野生型芽导致植物与转化野生型的复合拍毛根(Fernandez-Pinan et al ., 2019)。因此,的选择农杆菌属物种转换取决于实验的目的;例如,r . rhizogenes是向量的选择当根系比基因的功能需要及时加以研究。
在早期的研究中,Hooykaas et al。(1977)介绍了农杆菌属Ti质粒进根瘤菌trifolii,发现r . trifolii感染高凉菜属叶产生肿瘤,建议DNA转移。类似地,范Veen等人改变了Phyllobacterium myrsinacearum与农Ti质粒和发现它还诱导肿瘤发生在高凉菜属(范Veen et al ., 1988)。之后,Broothaerts et al。(2005)展示了其他三个细菌,根瘤菌NGR234 sp.压力,Sinorhizobium meliloti,Mesorhizobium洛蒂(统称为Transbacter™)修改农Ti质粒基因转换拟南芥,烟草,栽培稻(Broothaerts et al ., 2005)。然而,这些细菌表现出转换效率相对较低农,因此他们没有广泛应用于植物转换。同样的,但最近,拉索尔教授和马林斯证明Ensifer动因OV14修改与农Ti质粒转化马铃薯、烟草、拟南芥、大米、木薯(有关此主题的全面审查,看看拉索尔教授和莫林斯,2018年)。然而,Ensifer也被证明是毒性低于农杆菌属。此外,曹等人证明了植物病原细菌,Ochrobactrum haywardenseH1,修改后的表达农Ti质粒,成功地改变了大豆,否则仍然具有挑战性的变换使用农杆菌属spp。(曹et al ., 2022)。
从这些研究很显然,所谓的“转化原则,“Ti / Ri质粒,只确认了农杆菌属/根瘤菌物种,并用于将不同种类的细菌提供范围广泛的寄主植物的本文,否则是不可能使用农杆菌属由于其特定的宿主范围。这将是有趣的,看看,在未来,“改造原则”将识别更多的细菌种类相似,如果他们可以修改农杆菌属提供DNA或蛋白质复合物植物,真菌和动物细胞。这些细菌之间的共同特征是IV型分泌系统,允许交付核蛋白质复杂的植物细胞,其次是集成在植物基因组中。最近,农杆菌属转换效率和提高宿主范围通过修改其基因组表达两III型分泌系统(T3SS)。使用工程农杆菌属增加250%,-400%小麦、紫花苜蓿和柳枝稷转换观察(拉曼et al ., 2022)。此外,细菌和真菌,植物细胞已确定可以提供蛋白质,和他们使用向量是本文的后续部分讨论。
聚乙烯glycol-mediated基因传递方法
成功演示的启发,真菌和动物细胞转染通过化学处理、聚乙二醇(PEG), poly-L-ornithine,表面有被用在类似的实验进行植物原生质体(奥特曼et al ., 1992;韦伯和莫里斯,1992;Bilang et al ., 1994;Kuwano Shirataki和伊藤,2008;卡瓦依,桥本和日本村田公司,2010年版)。聚乙二醇是一种存在于各种原料的聚醚聚合物分子量。聚合物亲水性和展品低生物毒性;因此,它的使用各种生物应用。它的一个主要用途是作为转染剂增加等离子体膜的渗透性,提高传播能力的带电高分子(奥特曼et al ., 1992)。事实上,挂钩在二价阳离子的存在在高pH值证明提供裸DNA或liposome-encapsulated成植物原生质体早在1980年代(奥特曼et al ., 1992)。PEG-mediated交付的DNA已经被明显改善(韦伯和莫里斯,1992;Bilang et al ., 1994)。几个变化的方法进行改善挂钩的转换效率和频率和所讨论的评论奥特曼et al。(1992),韦伯和莫里斯(1992)。
有几个优势与PEG-mediated转换有关。这种方法在技术上是简单的;因此,它允许同时处理许多样品。它利用廉价的供应和没有专业设备的需求。PEG-mediated转换是万能的;因此,它并不表现出的宿主范围限制农杆菌属介导的转换和可以很容易适应不同的植物物种和组织来源与优化(Bilang et al ., 1994)。此外,这种方法适用于瞬时表达的转基因导致生产transgene-free genome-edited突变体。然而,这种方法的主要瓶颈是植物原生质体的再生成完整的植物。鉴于这些优点,该方法发生了兴趣,复活特别是随着基因编辑程序,测试后与所需的突变基因编辑试剂和再生植物基因组编辑(悦et al ., 2021)。同时,这种方法已被用于交付triplex-forming寡核苷酸(TFOs)或基因修复寡核苷酸(GRON)诱导植物细胞突变(Gocal 2014;Gocal et al ., 2015;萨奥尔et al ., 2016)。原生质体分离和转换与挂钩进行在许多农作物(Bilang et al ., 1994)包括但不限于小麦(布兰德et al ., 2020)、水稻(林et al ., 2020;Bes et al ., 2021),玉米(Svitashev et al ., 2016)、土豆(Carlsen et al ., 2022)和大豆(帕蒂尔et al ., 2022)。此外,近年来,PEG-mediated原生质体转染Cas9蛋白质和Cas9包裹着体外合成指导RNA(核糖核蛋白,RNP)被成功用于主要行作物和园艺作物在已经没有dna寻求建立细胞基因组编辑平台(桑特导演et al ., 2020;Subburaj et al ., 2022;刘et al ., 2022)。
的和竞争的步伐快速发展领域的植物基因组编辑,出现一些新的育种技术,目标瞄准效率提高和降低成本。在这些特征快速发展系统(由Cibus™)高压。™是一个transgene-free,高压精密基因编辑平台,利用Oligonucleotide-Directed诱变(ODM)针对特定基因序列与基因修复寡核苷酸(GRON)。工程GRON(通常约40 bp)股票与目标DNA序列同源性,除了一个或几个不匹配的碱基对(Gocal 2014;Gocal et al ., 2015)。然后™高压依赖于植物细胞的内源性DNA修复机器识别不匹配和修复DNA使用GRON作为模板(Gocal 2014)。ODM之后,GRON是植物细胞的退化,减少非目标突变的机会。这个系统与上述nuclease-based基因编辑系统,提供一个核酸酶诱导乳沟不是必需的。此外,GRONs不需要交付向量,避免外源DNA整合到宿主基因组。然而,类似于基因编辑rnp GRONs可以通过PEG-mediated交付,交付到原生质体电穿孔(见下文)或粒子轰击(见上图)(Gocal et al ., 2015)。根据Gocal et al。(2015)已经证明了,使用ODM拟南芥、油菜、玉米、水稻、烟草、和小麦。简单、精度和避免转基因整合呈现ODM,和随后的系统如™高压、快速基因编辑有吸引力的选择。然而,尽管有这些优势,实现该系统的主要瓶颈是缺乏有效的原生质体生产、转换和再生协议对于大多数农作物的genotype-dependence原生质体再生系统。
非传统的基因传递方法
除了利用传统基因传递方法,还有其他方法所使用的开发和研究社区。下面阐述了其中的一些方法。
电穿孔
电穿孔、物理、遗传转化方法,用于提供DNA结构通过等离子体膜产生瞬态,不稳定的毛孔,使运输等大分子DNA, RNA,蛋白质在细胞(Ozyigit 2020)。在植物中,原生质体(弗洛姆et al ., 1985)通常用于电穿孔由于易于吸收的稳定或瞬态遗传转化质粒。电穿孔参数优化后,法成功地将胚胎细胞(徐和李,1994年),受精卵(李、杨,2000年),线粒体(Farre阿瑞亚,2001年)、小孢子(Brew-Appiah et al ., 2013;Bhowmik et al ., 2018),拍摄极点(de GarcA-a Villarroel, 2007)在一些植物物种,如烟草、水稻、小麦和玉米(审查,请参阅Barampuram et al ., 2011)。然而,在electroporation-mediated基因传递,需要再生外植体获得转化后代,使劳动密集型和genotype-dependent方法。
最近,Furuhata等人表明,蛋白质(Cre重组酶)可能送到培养拟南芥细胞细胞壁完整高达83%的效率,这是一个一步electroporation-mediated植物遗传转化(Furuhata et al ., 2019)。总之,electroporation-mediated植物基因传递快捷、成本低廉;然而,它可能需要优化的参数,如电场强度、脉冲持续时间、货物浓度和外植体类型获得满意的转换效率以最小的损伤。
Magnetofection
Magnetofection已经被证明是一种简单而有效的方法将目标动物细胞通过应用外部磁场(谢勒et al ., 2002;木板et al ., 2003)。最常用的magnetofection系统包括超顺磁性氧化铁纳米颗粒与聚合物涂层表面(PEI),它可以绑定带负电荷的核酸分子通过静电相互作用(Zuvin et al ., 2019)。磁纳米颗粒(MNP)介导交付可以实现通过将病毒或病毒性与基于向量。magnetofection的主要好处在于快速、高效转染使用矢量剂量和相对较低的可能性,针对矢量磁场下到一个特定的外植体面积(木板et al ., 2011)。
虽然magnetofection已经广泛应用于动物系统,只有两个发表文章描述magnetofection成功应用的植物。具体地说,在2017年,赵等人证明了使用magnetofection引入质粒DNA-coated裴功能化氧化铁纳米颗粒直径(168海里)的花粉粒棉花,南瓜,西葫芦,辣椒和莉莉(赵et al ., 2017)。他们推测DNA-loaded纳米颗粒进入花粉通过光阑(∼5μm)花粉壁。通过花粉magnetofection,瞬态转换和直接生产转基因种子没有再生可以实现;因此作者声称该系统是组织培养和genotype-independent。然而,在2020年,Vejlupkova等人发表了一篇文章声称棉花研究的结果在单子叶植物不能复制的,特别是在玉米、高粱和莉莉(Vejlupkova et al ., 2020)。最近,王等人建立了玉米花粉转染系统使用基于大规模、快速、高效的玉米转染(王z . et al ., 2022)。重要的是,他们指出,打开花粉孔径通过预处理与转染缓冲10分钟和转染8°C(保护玉米花粉活力)对外源基因传递至关重要。
尽管magnetofection尚未被接受作为一个主流的遗传转化方法,它具有理想的一些特性,比如genotype-independence和低毒性。如果优化更多的作物,它有潜在的广泛使用。
声波降解法
Sonication-mediated基因传递采用超声波可以产生多种非热能的生物效应,如声空化破坏细胞膜,permeabilizing和促进基因的吸收材料(Joersbo Brunstedt, 1992;米勒et al ., 2002)。这种技术提供了一个有吸引力的替代其他物理方法由于其低成本。据报道,允许在植物原生质体基因传递(Joersbo Brunstedt, 1990),悬浮细胞(刘et al ., 2006;Zolghadrnasab et al ., 2021),甚至完整的叶段(Zhang et al ., 1991)。由于气蚀,声波降解法还结合其他基因传递方法来达到更高的效率,比如sonication-assisted农杆菌属介导的转换(种子)(技巧和细,1997;Dutta et al ., 2013)和sonication-mediated pollen-transformation (杨et al ., 2017)。声波降解法,作为一个机械方法,不依赖于外植体类型。它可以提供DNA的有效手段植物细胞/组织,给手术的条件进行了优化,以减少任何细胞和组织损伤,同时提供有效的货物交付(刘et al ., 2006)。
碳化硅胡须
碳化硅(SiC) whisker-mediated转换在植物被Kaeppler等人首次报道小针状的碳化硅胡须混合的液体培养基中,通常用涡,在质粒DNA和目标植物细胞(Kaeppler et al ., 1990;Kaeppler et al ., 1992)。转基因植物如水稻(松下et al ., 1999),玉米(帧et al ., 1994),和棉花(Asad et al ., 2008使用这种方法生产。虽然方法简单,需要更少的资源,和具有成本效益的,只有少数的论文报告使用这种方法稳定的遗传转化。SiC胡须对人体是有害的(Svensson et al ., 1997;陈et al ., 2018);因此,安全的替代品,如硼酸铝胡须(ABW),后来被探索生产转基因水稻(美津浓et al ., 2004)。此外,ABW也显著增加农杆菌属感染效率(Nanasato et al ., 2011在不定kabocha壁球拍器官发生()Cucurbita moschata杜赫)。几个因素需要考虑当使用SiC-mediated转换:胡须的类型,植物细胞/组织的类型,和潜在的健康危害物质征收。
使用真菌和细菌提供本地或重组蛋白在植物细胞
这些方法最初是用来描述真菌效应蛋白和宿主-病原体相互作用的理解。然而,这些方法有很大的潜力提供其他重组蛋白,如TAL效应核酸酶或锌指核酸酶,编辑基因组在所需的网站或暂时性的蛋白质表达转录因子或监管。例如,Linde等人报道一个独特的“特洛伊木马”提供重组蛋白玉米使用黑穗病菌的分泌功能黑粉菌属maydis(Linde et al ., 2018)。这个策略允许作者提供重组蛋白玉米成单个细胞在特定的细胞层和在一个精确的时间点。宿主-病原体相互作用的方法利用重组蛋白运输到宿主细胞和组织,首次展示了潜在的丝状真菌的植物基因传递载体。
另一方面,细菌与III型分泌系统(T3SS)更广泛用于蛋白质直接交付,特别是在哺乳动物细胞的生物医学应用程序(Ittig et al ., 2015;白et al ., 2018)。然而,细菌的效用T3SS在植物研究比较有限,很大程度上是由于过敏的反应(HR)诱导寄主植物的这些向量。鉴于这种限制,重组菌株HR-inducing和non-HR-inducing病原体识别作为运载工具。这些细菌向量用于eudicots和单子叶植物,这里包括一些例子。的一个变种两删除多个效应器的减少过敏的反应是用于小麦。同时,荧光假单胞菌工程T3SS和没有人力资源被用来描述细菌和真菌在小麦效应器(阴和赫伯特,2011年)。同样,Sharma等人报道使用大米病原体的效应传递系统伯克glumae描述AVR-Pik和AVR-Pii效应器的真菌病原体Magnaporthe oryzae(Sharma et al ., 2013)。符合本研究Upadhyaya等人证明了使用小麦病原体黄translucens提供包含T3SS信号融合蛋白p .两(AvrRpm1)和x定(AvrBs2)无毒性(Avr)蛋白在小麦叶细胞(Upadhyaya et al ., 2014)。这一领域的研究发展,在适当的时候,我们可能见证更多的害虫/病原体具有类似功能将在基因识别和使用产品特性或基因组编辑。
Nanoparticle-based基因传递方法
几种nanoparticle-based技术已经开发为植物基因传递在过去3年,表现出许多优于传统方法。首先,纳米粒子使植物细胞与对象无关交付货物的输入假设是mechanically-driven (卢et al ., 2020 a)。第二,纳米颗粒保护或至少推迟遗传物质降解,增加货物的活跃的一生在植物组织和细胞,这对于脆弱的货物,如RNA(尤其重要Shidore et al ., 2021)。第三,纳米颗粒交付使瞬时表达的可能性没有基因插入植物宿主基因组(Demirer et al ., 2019 a;王et al ., 2019)。这不仅是理想的许多研究应用基因功能迅速在足底学习,但也是一个变革性技术为转基因和非转基因CRISPR / Cas9作物工程(Demirer et al ., 2021)。最后,更大范围的货物类型,包括核酸、蛋白质、小分子,农用化学品,可以交付与纳米粒子(Ng et al ., 2016)。然而,有一些限制等纳米颗粒的低效率,他们不能系统性的旅行在植物组织,和有限的研究对环境的安全性和积累。
下面,我们强调nanoparticle-mediated交付领域的最新发展覆盖仅仅过去3年。全面审查的技术在2019年之前,鼓励读者引用这些引用评论(王et al ., 2016;坎宁安et al ., 2018;Sanzari,里昂和Ambrosone, 2019;王et al ., 2021)。
的一个研究植物基因传递单壁碳纳米管的纳米材料类型(SWCNTs)。当covalently-functionalized带正电荷聚合物,如贝聿铭和壳聚糖(气),这些纳米材料能提供electrostatically-attached DNA质粒转化为植物细胞核和叶绿体,分别为(图1一个)(Demirer et al ., 2019 b;夸克et al ., 2019)。这些第一代研究碳纳米材料建立了瞬态和植物各eudicot交付与对象无关,单子叶植物物种,而记者在烟草基因表达持续了7 - 10天,芝麻菜、菠菜、小麦、豆瓣菜,棉花。最近,第二代进行了优化研究纳米粒子物理参数和货物绑定模式增加货物交付效率(胡锦涛等人。,2020年;阿里et al ., 2022;沙玛和卢,2022年)。
图1。Nanoparticle-mediated交付工厂。(一)Polymer-functionalized单壁碳纳米管(SWCNTs)提供质粒DNA转化为植物细胞核和叶绿体基因的表达。(B)细胞穿透肽提供多个DNA、RNA和蛋白质货物植物叶子。(C)SWCNTs、DNA纳米结构和金纳米粒子用于提供核和dsRNA植物通过叶片渗透。(D)BioClay和碳nanodots局部喷洒在叶片和花粉dsRNA和核交付。图创建BioRender.com。
另一个名为玫瑰纳米管的中空纳米管平台(RNTs)是由通过互补的鸟嘌呤−胞嘧啶图案的自组装,这些纳米颗粒与质粒DNA为工厂交货(曹et al ., 2020)。RNTs进入小麦小孢子和不影响健康,部门,或小孢子再生能力。单独标记的DNA和RNTs显示,尽管RNTs达到小孢子核,DNA主要是存在于细胞胞质,导致效率低了DNA的基因表达。然而,这项研究是有前途的,使纳米材料的发现配方,可以输入作物小孢子。
许多纳米材料平台开发单-和双链RNA的基因沉默货物,除了DNA质粒基因表达(图1 c)。例如,oligo-wrapped SWCNTs生成提供小干扰RNA (siRNA)货物植物叶子内源性疾病易感基因沉默效率高(Demirer et al ., 2020)。此外,DNA纳米结构和可编程的大小、形状和刚度特性建立了核到烟草的叶子,芝麻菜,豆瓣菜(Zhang et al ., 2019 a)。碳和dna纳米材料并不是唯一的配方用于植物RNA交付。最近,一些研究通过球形核执行交付到植物叶片和杆状的金纳米粒子(Zhang et al ., 2022),用金子发光机制(张y . et al ., 2021)。更值得注意的是这些研究发现纳米颗粒细胞内化并不是siRNA-mediated所需基因沉默,而杆状的金纳米粒子有更高效率的细胞吸收,可以阻止通过球形金纳米粒子诱发更强的基因沉默(Zhang et al ., 2022)。
Nanoparticle-cargo轭合物可以通过叶渗透使用不必要的注射器在实验室的研究背景,以及可扩展的应用领域,有一些研究表明局部应用双链RNA的可行性(极)和核货物与层状双氢氧化物(LDH)纳米粒子(米特et al ., 2017)和碳点(施瓦茨et al ., 2020)(图1 d),它消除了问题的裸体RNA喷洒在植物上的不稳定。叫做BioClay LDH平台,使病毒/真菌保护21天当喷在病毒/ fungus-challenged树叶(米特et al ., 2017;Nino-Sanchez et al ., 2022)。最近,BioClay技术已局部申请dsRNA交付到番茄花粉(勇et al ., 2021),延长植物组织类型为各种应用程序。除了BioClay,碳点(CDs)被用来局部小干扰rna分子交付并生成高效的基因沉默在烟草和番茄叶(施瓦茨et al ., 2020)。
已经有大量的领域的进步nanomaterial-mediated生物分子交付工厂在过去三到四年。纳米粒子使用通常的选择取决于货物的利益,目标植物组织和应用程序类型。例如,SWCNTs是有效的质粒传递的瞬时表达式应用于体细胞,RNTs小孢子交付,可能是一个更好的选择和BioClay局部RNA交付极为有利。然而,甚至有更多的实现领域的植物CRISPR基因编辑使用nanoparticle-mediated交付和稳定作物的转换。
Cell-penetrating肽
除了纳米颗粒,cell-penetrating肽(cpp),短肽氨基酸组成的30,显示非凡的能力提供多样的生物分子,如DNA, RNA,蛋白质,和RNP复合物到许多植物(图1 b)(Thagun et al ., 2020;张s . et al ., 2021)。
阳离子cpp是最常用的一种多肽,它们可以与带负电荷的核酸DNA /加载通过静电相互作用和产生瞬时表达蛋白质与DNA的货物。同样,RNA分子被送到植物细胞使用cpp,半衰期增加相比,免费的RNA。最后,cpp不仅用于核酸、蛋白质和多种生物分子同时植物细胞(张s . et al ., 2021)。类似于核酸,带负电荷的蛋白质,如BSA、阳离子cpp嫁接上静电。演示同步多个货物交付,Thagun等人用superfolder GFP-based互补的胞质为试验阿拉比卡咖啡7-methylxanthine甲基转移酶1的蛋白质。多个质粒或蛋白质的codelivery cpp导致创建补充植物叶片中的GFP荧光细胞(Thagun et al ., 2020)。同样,王等人开发了一种荧光complementation-based分析量化CPP-mediated蛋白质输送到植物细胞(王j . w . et al ., 2022)。
纳米粒子相比,他们更可降解,因此可能有更好的适合领域的研究。然而,大多数的研究仅限于阳离子cpp限制只带负电荷的货物交付。
病毒介导的交付
使用提供DNA病毒细菌细胞起源于早期的分子生物学。然而,使用病毒给真核细胞基因表达结构直到很久以后才开始。解除武装的使用病毒和最近的病毒样颗粒(一种)交付货物,如DNA,信使rna,蛋白质复合物比植物更常见于医学研究(审查,请参阅张s . et al ., 2021)。然而,该方法获得牵引在植物研究来确定基因功能表达/沉默基因,俗称病毒诱导基因沉默(中收取)和virus-mediated过度(声音)。它也被用于定点诱变使用CRISPR-associated核酸酶,这种技术被称为virus-enabled基因编辑(VEdGE)或病毒诱导基因组编辑(VIGE)(详细检查这些主题,请参阅罗斯纳et al ., 2022;Gentzel et al ., 2022)。有成熟的病毒基因运载系统,开发和利用中收取,嗓音,VIGE(中讨论Gentzel et al ., 2022;罗斯纳et al ., 2022)。这些包括系统基于卷心菜卷叶病毒(CaLCuV DNA病毒;Baltes et al ., 2014),狐尾草花叶病毒(FoMV DNA病毒;梅et al ., 2019),蚕豆枯萎virus2 (BBWV2 RNA病毒;崔et al ., 2019),以及一个系统基于烟草拨浪鼓病毒(和RNA病毒;Khakhar et al ., 2021)称为“VipariNama。的重点,以较小的阐述了在病毒系统在以下段落。
DNA virus-based交付系统
许多DNA病毒用于运载基因表达磁带或植物基因沉默试剂(佩雷茨et al ., 2007;梅et al ., 2019;罗斯纳et al ., 2022),除了他们的应用程序在病毒诱导基因沉默。利用DNA病毒中收取阐述了在一个单独的段落;同时,回顾了最近罗斯纳et al。(2022)。因此,在下面的文章中,我们集中讨论一个独特的番茄黄卷叶病毒(TYLCV)的交付系统,TraitUP™,避免重复。
et al。(2007)开发了一个通用矢量系统,IL-60从TYLCV沉默和外源基因表达,Begomovirus Geminiviridae。这个向量是成功测试了番茄植物上,它是机械地注入阀杆。重组病毒传播系统,但植物保持无症状。此外,向量没有整合到基因组中,没有产生ssDNA后代,没有扩散到其他植物烟粉虱,使其成为理想的基因传递系统。
之后,为了进一步提高TYLCV向量的载货能力系统(TraitUP™),同一个研究小组删除病毒基因组的不同组件和确定了314 - bp (IR)基因间区域作为唯一病毒病毒dsDNA复制所需的元素,和两个sense-oriented病毒基因(V1和V2)的表达和运动(戈夫et al ., 2014)。作者叫这最小的病毒构建p1470并展示其交付标记基因的能力。
到目前为止,IL-60向量系统已成功地应用于40岁以上植物物种属于14个不同家庭包括多年生木本植物,如橙、苹果、葡萄(佩雷茨et al ., 2007;Cusin,翻领和Maraschin, 2017;Malabarba et al ., 2018)。向量引入植物通过根渗透或注射器接种。前者的方法被用来表达一个6.3 kb细菌操纵子,允许一个完整的代谢途径的介绍番茄植物和抗真菌代谢物的生产,pyrrolnitrine(打印),呈现他们抵抗辣椒(Mozes-Koch et al ., 2012)。本研究表明这个向量系统传递和表达的能力大的基因结构,没有对其运动和复制产生负面影响,这是一个优势其他病毒载体。
在苹果,这种技术被成功地用于暂时性的表达马吕斯COP1基因(李et al ., 2012)。它打开另一个苹果在一个同源基因的功能鉴定系统。Cusin et al。(2017)使用IL-60苹果表达报告基因质粒,绿色荧光蛋白。“春晚”品种的苹果对待pIR-GFP + p1470显示一个稳定、广泛和强烈的表达GFP传遍所有组织随时间和保持稳定质粒治疗后6个月。这种早期的成功促使研究人员把痂抗性基因(如Vf2),以及其他基因的生物技术的兴趣,精英苹果品种。似乎稳定表达的基因在植物的过程中发展。这种方法消除了遗传交叉和植物遗传转化的必要性,提出了即时工具将感兴趣的基因特征。这个基因传递系统最近在葡萄用来研究的作用VviAGL11基因在种子形态发生(Malabarba et al ., 2018)。同样,在2018年进行的一项研究在巴西IL-60技术被用来引入一个抗除草剂基因桉树物种。
这项技术为快速打开了令人振奋的新的可能性特质交付伍迪水果种类(Nagamangala Kanchiswamy et al ., 2015)。游离表达系统,根据修改后的病毒,可以使稳定的遗传性状的表达可以通过移植前治疗子嗣引入精英基因型,绕过回交需要恢复原来的遗传背景。
RNA virus-based交付系统
提高病毒载体的多功能性,RNA virus-based交付方法是(张y . et al ., 2019;Ariga岐和Ishibashi 2020;Varanda et al ., 2021)。几个RNA病毒修改过提供基因组编辑的组件机械(Cas9和gRNA)植物进行了总结表1。类似于DNA病毒,RNA病毒也修改中收取。我们在一个段落分别处理;此外,主题最近了罗斯纳et al。(2022)。
表1。RNA病毒修改交付Cas9和/或gRNA结构在植物。
江泽民et al。(2019)开发了一种甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的系统交付gRNA瞄准PDS(八氢番茄红素Desaturase)基因在Cas9-overexpressingN。benthamiana植物。它导致了78%的光漂白接种植物叶面积。同样,大麦条纹花叶病毒的基因编辑功能(BSMV)证实了N。benthamiana,小麦和玉米胡锦涛等人。,2019年)。成功交付后PDS通过BSMV gRNAN。benthamiana植物与Cas9 co-infiltrated结构。胡锦涛et al。(2019)进一步评估这个系统与转基因Cas9-expressing小麦和玉米。在小麦,gRNAs瞄准TaGASR7基因,确定粮食长度和重量,表现出突变效率高达78%的限制消化的目标基因。同样,在玉米植株,gRNAs瞄准ZmTMS5基因,负责燥热引起败表型表现出编辑效率(48%胡锦涛等人。,2019年)。在随后的研究中,结果表明,多个BSMV构造可以co-inoculated同时目标多个基因在小麦(李et al ., 2021)。进一步解决问题的低gRNA病毒载体表达,科迪,Scholthof Mirkov (2017)修改了烟草花叶病毒(TMV)向量通过删除一个外壳蛋白通过植物和防止其系统性运动因此增强当地的瞬时表达病毒效价测定。
绿色荧光蛋白gRNAs当co-infiltrated TMV-based Cas9交付系统显示近70%在GFP-overexpressing编辑效率N。benthamiana叶子。在后续研究中,RNA干扰抑制被用来进一步优化系统。在这项研究中,交付Cas9和gRNAs从单个TMV构造同时消除需要生产转基因植物表达Cas9或co-delivery组件(即。从单独的结构(Cas9 gRNA)Chiong,科迪和Scholthof, 2021)。虽然编辑效率较低时使用一个构造co-delivery相比,仍有可能获得近7%编辑效率N。benthamiana即使4.2 kb插入(Chiong,科迪和Scholthof, 2021)。相比之下,马et al。(2020)编辑效率最高的报道日期使用Sonchus黄色网病毒(SYNV)。因为SYNV可以携带大型插入货物,这一特点使它适合表达Cas9以及单个或多路复用gRNAs。马et al。(2020)使用这个系统N。benthamiana,一个编辑效率从40 - 91%在植物感染gRNA构造目标吗GFP, NbPDS NbRDR6,或NbSGS3基因被观察到。类似编辑效率观察当SYNV构造设计的多路复用编辑NbRDR6和NbSGS3基因。
Potexviruses (PVX)也被用作gRNA运载工具。Ariga、岐和Ishibashi (2020)显示的成功交付Cas9并使用PVX gRNAsN。benthamiana通过Agroinfiltration植物。此外,Cas9取代这组与一个更大的base-editing版本,这被证明是稳定整合到基因组的病毒。PVX向量没有感染生殖系或产生后代进行编辑。然而,植物从机械(摩擦)接种组织再生NbTOM1编辑,但比从Agroinfiltrated-plants再生效率较低(62%)。后来研究发现PVX可能是一个有用的向量提供多路复用gRNAs (Uranga et al ., 2021)。
此外,有两个Tobraviruses,和和豌豆Early-Browning病毒(PEBV),目前被用作CRISPR / Cas9交付向量。和广泛的宿主范围,易于修改的双方的积极意义RNA基因组。这也是一个证明向量数作物中收取。先前的研究表明,和可以成功编辑PDS3和PCNA无论是单独或同时在基因N。benthamiana当gRNAs co-delivered从单独的结构(阿里et al ., 2015 a)。阿里et al。(2015 a,b)报道说,生殖系PDS3编辑在种子收集从最早的植物的花蕾,从而消除植物再生从感染组织。在Cas9-expressing进一步测试这个系统拟南芥和交付的AtGLI或AtTT4gRNAs产生indels在目标网站(阿里et al ., 2018)。直接比较和与PEBV编辑效率PDS3在Cas9-expressingN。benthamiana透露,PEBV编辑效率显著提高了57 - 63%相比,27 - 35%和富的情况下(阿里et al ., 2018)。在最近的研究中,TRV-delivered gRNAs融合移动时产生可遗传的编辑开花轨迹T(英尺)或tRNA序列的目标NbPDS和NbAG(埃里森et al ., 2020)。在另一项研究中,和gRNA交付用于目标病毒病原体直接而不是专注于植物与国防有关的基因增加电阻(阿里et al ., 2015 c)。大多数使用TRV-based构造进行了研究N。benthamiana;因此,还需要更多的研究来验证这些发现在其他作物。
DNA和RNA病毒修改病毒诱导基因沉默
中收取是一个反向遗传学工具植物体内基因功能研究(海沃德et al ., 2011),这取决于转录后基因沉默(发现)机械sequence-specific的方式。简单地说,在这个过程中,感兴趣的基因片段克隆到一个virual向量,和寄主植物的内源RNA沉默机制导致RNA降解,从而降低目标基因的表达(Baulcombe 2004)。
中收取了使用大量的植物病毒类型(Burch-Smith et al ., 2004;康德和Dasgupta 2019)。在过去的十年里,一些病毒基因组已经被修改来创建强大的反向遗传工具在植物基因的功能特性,如烟草拨浪鼓病毒(RNA病毒,刘et al ., 2002),苹果公司潜在的球形病毒(RNA病毒,Gedling et al ., 2018;Igarashi et al ., 2009),非洲木薯花叶病毒(DNA病毒,Lentz et al ., 2018),黄瓜花叶病毒(RNA病毒,Tzean et al ., 2019),大麦条纹花叶病毒(RNA病毒,Bennypaul et al ., 2012),等等。然而,大多数的报道中收取向量只有单个基因沉默和中收取向量与可见的指标来评估早期外显率植物组织的缺乏。发现后不久,中收取的方法获得了巨大的受欢迎程度和在许多植物由于容易采用易于应用和研究基因敲除表型的能力(罗斯纳et al ., 2022)。之后,一些病毒载体实施异位基因表达和基因沉默谢et al ., 2021)和交付指导RNA (Gentzel et al ., 2022;罗斯纳et al ., 2022)。然而,植物领域的研究缺乏virus-mediated RNA激活(RNAa;Voutila et al ., 2012)。沉默的继代遗传表型也展示了一些研究(Senthil-Kumar迈索尔,2011;Bennypaul et al ., 2012)。考虑到大量的文献上可用这个话题,这也被广泛地回顾了在几个优秀的评论和书籍(Courdavault Besseau, 2020;罗斯纳et al ., 2022),只有总结一些常用的病毒中收取向量下面提供和交付方法。
接种步骤是至关重要的成功交付中收取构造和后续步骤涉及病毒扩散,扩散和基因沉默。病毒结构可以由三种不同的方法:农杆菌属介导的渗透,体内/体外产生RNA渗透,和DNA的渗透。然而,农杆菌属介导的感染是最常见的和方便的方法。有几种可以用于植物组织农杆菌属感染包括豆芽(燕et al ., 2012),根(Ryu et al ., 2004)、茎(王et al ., 2015),树叶(刘et al ., 2002;刘et al ., 2012),幼果的carpopodium (傅et al ., 2005)和水果(Orzaez et al ., 2006)。
中收取提供了许多优点,包括植物接种后的短时间内可以观察到基因沉默效应。中收取的另一个优点是,它可以应用于任何植物,单子叶植物,eudicots (贝克尔和兰格,2010年;康德和Dasgupta 2017;张j . et al ., 2018;Zhang et al ., 2018 b),由于增加可用性的病毒载体。可以实现有效和统一的基因沉默当执行工厂发展的初始阶段,但该方法也适用于诱导组织在开发过程中基因沉默后(Stratmann et al ., 2011;Bennypaul et al ., 2012)。中收取允许必要的特征基因对植物的生存,不能产生突变体或稳定的遗传转化研究(Brigneti et al ., 2004)。与几家上市的优势,中收取也有一些局限性。在大多数情况下,中收取一般不会导致完全沉默的基因(Sahu et al ., 2012;辛格et al ., 2015),genotype-dependent过程。最后,中收取的时机表型外观和基因沉默效果持续的时间是种专一性。此外,环境温度的影响通过二级核生产报告(中收取范,Pyott Molnar, 2021)。
直接交付
如前所述,许多基因的方法编辑技术关注的引入原始分布进入细胞。这些分布转录或翻译,使原生细胞机械组装的基因编辑核糖核蛋白(RNP)复杂的体内。质粒表达,然而,并不是唯一的方法引入rnp进入细胞。基因编辑RNP复合物可以预体外转染到细胞,这一过程称为直接交付。
直接交付rnp基因编辑提供了几个优势。也许最引人注目的是缺乏依赖转录和翻译(Andersson et al ., 2018;金正日et al ., 2018;刘et al ., 2019)。rnp直接传递到细胞不依赖于这些过程,允许编辑细胞内的低利率(库恩et al ., 2020;张y . et al ., 2021)。此外,独立于转录和翻译允许直接交付rnp转染后立即显示活动(金正日et al ., 2014;Zuris et al ., 2015;金正日et al ., 2018)。除了这个立即活动,直接交付rnp产生更少的脱靶效应,因为他们通常退化转染后几个小时,减少曝光时间和偏离目标的机会劈理(Gaj et al ., 2012;梁z . et al ., 2017;山et al ., 2019;Nicolia et al ., 2020;杨et al ., 2021),瞬态的方式表现,同时产生永久性的编辑。使用基因编辑rnp还允许更大的灵活性和快速筛查指南rna (金正日et al ., 2014;梁et al ., 2015;Tyumentseva et al ., 2021),不再需要为每个目标位点产生新质粒。最后,直接交付rnp也避免融入核DNA (金正日et al ., 2014;梁z . et al ., 2017;德维特,玉米和卡罗尔,2017),它可以绕过监管障碍,缓解公众担忧转基因生物体(吴et al ., 2015)。
有限制,然而,RNP直接交付方法。例如,不是所有的基因编辑rnp函数同样由于未知的原因,当他们不表达质粒(Vakulskas et al ., 2018)。低细胞生存能力也被报道的并发症直接交付(山et al ., 2019;Tyumentseva et al ., 2021)。rnp的直接交付,也可能在某些情况下,需要重复转染和大量rnp有效(梁et al ., 2015;Tyumentseva et al ., 2021)。尽管存在这些挑战,直接交付rnp快速拥有很大希望,多才多艺,和准确的基因组编辑。一些作物已经被修改利用直接交付各种rnp (表2)。
表2。总结关于rnp直接交付的各种研究。
直接交付不仅用于基因编辑,也可以用于基因调控。例如,双链RNA(极)可以直接送到细胞通过外源性应用诱导RNA干扰(RNAi) (Dubrovina Kiselev, 2019;Das和谢里夫,2020)。不像nuclease-based和ODM-based系统(见上图),体内应用dsRNA和随后的RNAi不作用于植物的基因组,而是植物转录组的。这个策略可以避免一些缺点的基因编辑包括转基因集成(弗莱彻et al ., 2020),依赖核交付功能(达德利和戈尔茨坦,2003年;玻璃et al ., 2018)和外植体再生(Tenllado 2004;Dubrovina Kiselev, 2019)。这些优势,RNAi通过直接交付dsRNA是一个有吸引力的选择研究基因功能和基因表达调控在不改变基因组。
考虑到便于应用和技术的有效性,这是再自然不过的RNAi通过直接交付dsRNA是商业化的研究和实践领域的应用,如生物农药。这种方法,称为spray-induced基因沉默(团体)(王、金,2017年;Christiaens et al ., 2020)利用非转基因基因沉默的直接交付dsRNA目标害虫和病原体。第一个这样sprayable dsRNA-based生物杀虫剂开发是Calantha™Greenlight生物科学。的活性成分Calantha™Ledprona, 490个基点dsRNA设计专门针对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(罗德里格斯et al ., 2021)。这部小说,foliar-applied生物杀虫剂代表一个新的杀虫剂作用方式类。拜耳的(以前孟山都)BioDirect™也代表着SIGS-based bioproduct,瞄准瓦螨螨虫保护蜜蜂(关et al ., 2021;德舒特et al ., 2022)。
虽然这个技术创新并更环保的害虫管理与使用化学农药相比,有一些限制之前,必须解决直接交付dsRNA bioproducts成为商业上广泛。或许最重要的是,dsrna必须承受环境退化足够长的时间是有效的(Mezzetti et al ., 2020)。涂料dsRNA到层状双氢氧化物(LDH)粘土nanosheets,被称为BioClay,提供了一个解决方案,因为它减缓dsRNA退化(米特et al ., 2017)。另一个挑战是,不同植物器官应用dsrna体内的吸收能力不同,可能阻碍RNAi (Das和谢里夫,2020)。潜在的脱靶效应提高生物安全问题(也Senthil-Kumar迈索尔,2011)。最后,昆虫摄取极不同的物种,复杂的大规模应用程序(Christiaens et al ., 2020)。尽管存在这些挑战,直接交付dsRNA仍然是一个有前途的基因调控的新前沿。
类似于dsrna, Fluoroarabino核酸反义寡核苷酸(FANA ASOs)为基因调控提供了机会通过直接交付没有实现基因编辑。FANA ASOs设计单链核酸绑定到一个指定的RNA通过互补碱基配对。FANA麻生太郎/ RNA复杂然后由核糖核酸酶识别和裂解H,把分散的mRNA的进一步退化细胞的核酸酶(Kalota 2006;Sandoval-Mojica et al ., 2021)。与dsRNA-induced-RNAi依靠帽子和RISC FANA ASOs依靠核糖核酸酶H(本地原核生物和真核生物),两步反应简化为一步反应,扩大宿主范围(Sandoval-Mojica et al ., 2021)。FANA ASOs比dsrna也被证明是更稳定(法拉利et al ., 2006;猎人et al ., 2021)和显示活动在细胞质和细胞核(梁X.-H。et al ., 2017))。也许最有趣的和最有用的属性FANA ASOs是他们能力self-delivery (gymnosis),独立于转染代理(道理et al ., 2011;Souleimanian et al ., 2012;Pelisch et al ., 2021)。这些属性利用FANA ASOs引发极大的兴趣在广泛的领域和生物杀虫剂中特别感兴趣的应用程序(猎人et al ., 2021;Sandoval-Mojica et al ., 2021),特别是FANA ASOs目标细菌的能力。商业化的FANA麻生太郎技术用于研究正在进行中,如资产管理生物技术的广泛的产品目录300000多个定制的RNA沉默产品(www.businesswire.com,2018)。产品设计使用的普通消费者肯定会跟进。
总之,核糖核蛋白的直接交付,dsRNA,和FANA反义寡核苷酸是一种可行的方法,已经没有dna诱导细胞transgene-free基因编辑和基因调控。虽然突变频率不高跨物种和转染方法,直接交付将使研究人员可以避免许多监管障碍,目前困扰当今生物技术的法律环境。Transgene-free产品也更深受消费者青睐,这有望提振公众的支持持续的研究和开发。
花粉/ microspore-mediated基因传递
广泛的花粉或不成熟的花粉(也称为microspores-single-celled)转换程序开发和测试在各种各样的植物物种使用花粉/小孢子作为转基因交付的“超级向量”(Resch Touraev, 2011)。然而,无论是外来DNA整合到基因组内花粉/小孢子或仍然作为一个附加体,后来被集成到鸡蛋或中央细胞基因组双受精后仍有争议,需要进一步的研究(Resch Touraev, 2011)。不管转基因整合基因组的时机,使用花粉作为转基因载体交付有几个优点,不成熟的花粉等单细胞和单倍体加倍单倍体,因此可用于再生(纯合子)通过组织培养植物或可能成熟花粉和用于人工授粉的植物。小孢子和花粉作为定义的单个/同步质量存在大量单倍体细胞的数量,可以将以不同的方式给所需的转基因植物。在过去,成熟花粉(两个或三个(结构)在DNA转化孵化等各种方式的解决方案,即peg, co-cultivation农杆菌属、电穿孔和liposome-mediated交付(审查,请参阅Resch Touraev, 2011)。这些方法也试图在小孢子。例如,即peg法称为“男性生殖系转换(MAGELITR)”开发,在单细胞小孢子与microprojectiles被涂以DNA和转染小孢子成熟到花粉粒用于人工授粉。获得的转基因植物都发芽的种子人工授粉的植物选择介质(Touraev et al ., 1997)。同样,小麦、大麦和玉米小孢子electroporated,培养农杆菌属,或暴露于挂钩后诱导产生花粉胚状体和成熟的转基因植物(出口的。Brew-Appiah et al ., 2013;Rustgi et al ., 2017,2020年;Kumlehn et al ., 2006;落和奥尔森,2001;Bhowmik et al ., 2018)。
最近,花粉是改变了使用不同的纳米载体,如玫瑰纳米管(RNTs)小麦(曹et al ., 2020茄()、片状粘土纳米颗粒勇et al ., 2021),单壁碳纳米管在油棕(纳米)(卢et al ., 2020 b)、阳离子cell-penetrating肽(CPP)小麦(Bilichak, Luu Eudes, 2015)和黑小麦(丘格,阿蒙森和Eudes, 2009;胡椒et al ., 2017),氧化铁磁性纳米粒子(基于)棉花(赵et al ., 2017)和玉米(王et al ., 2022)。然而,像许多其他花粉转换方法,这些方法仍有争议的一些由于无法复制结果或获得类似的结果在不同的植物系统或一个不同的研究小组。因此,需要更多的工作来支持日常和广泛使用这些方法。
HI-Edit方法是另一个独特pollen-mediated基因传递方法,在基因编辑试剂通过单倍体诱导物行传统的基因型(Kelliher et al ., 2019)。这个过程允许交付的卵细胞基因编辑试剂,紧随其后的是失去父亲的基因组。目标站点的基因编辑试剂诱导突变的单倍体孕产妇基因组,这是使用抗有丝分裂的药物后翻了一倍。这个程序允许在小麦突变纯合子的发展在一个代(Kelliher et al ., 2019)。这种独特的系统在其他植物物种的适用性还需要评估。
的角度来看
植物和生物大分子交付方法的重大利益。随着基因组相对友好的编辑方法,这些试剂的进一步恢复利益在开发和测试不同的交付方法。从货物交付方法的需求也发生了变化随着时间的稳定需求的转换(基因组集成)瞬态表达式,因此从严格DNA交付交付的DNA / RNA,蛋白质或蛋白质复合物。如本文中所述,已经取得了重大进展在过去四十年。然而,仍有改进的空间覆盖特定的未来需要短暂表达CRISPR-associated蛋白质允许编辑基因在生殖或植物分生组织遗传后代(种子/无性繁殖系地传播)和瞬变spatiotemporally-controlled的方式表达在某些情况下或组织。这将允许为研究基因的功能或产生耐生物/非生物压力(CRISPR-based修复淘汰制,CRISPR-TSKO;Decaestecker et al ., 2019)。这个区域的瞬态的DNA, RNA (mRNA,核,microrna dsRNA),蛋白质/肽有巨大的研究机会。除了传统的单基因或几个基因编辑或介绍,基因工程的科学指导的方向是一个系统的方法,即。、工程全新途径或修改现有的为一个目的服务。这种需求还创建了一个需求寻找工程选项在不同规模和交付的大分子司机改变植物细胞。以下两款谈论这样的需求。
除了线性DNA,还有其他生物形态的DNA,如环状DNA可以用于基因工程细胞中。在文献中有大量的证据支持的存在和维护染色体外的环状DNA (eccDNA,统称为mobilome / circulome)在植物和动物细胞的细胞核和线粒体(左et al ., 2022)。这些eccDNAs可以设计来表达转基因或用于安装电池的转基因产品实现仿生工程。此外,artificially-engineered自然植物微型染色体或重组现有extranumerary /额外B-chromosomes可以用来安装新途径改善基本植物光合作用和固氮的过程,或生产生物柴油和生物材料(Birchler et al ., 2016)。这些巨大的大分子复合物的交付可能令人兴奋的研究开辟新的途径。
原子核的移植后需要改变成所需的细胞质或混合核三分之一的细胞质基因型(tri-parental融合)来测试一个基因在不同的母体环境效应一直试图在过去。这可能是一个感兴趣的区域,扩大我们的理解母体遗传效应的核基因的表达(逆行信号)。这个基因传递方法简要使用在过去(Saxena et al ., 1986),但在未来可能高度相关的合成生物学的新工具。同时,生产后代的可能性两个男性和女性的父母在玉米Grossniklaus 2017;文和约翰逊,2018年)。这个途径可以采取提供基因编辑试剂植物基因组,使所需的基因改变。最近,Cournoyer et al。(2022)工程人工光合作用的酵母细胞通过引入蓝藻细胞酵母原生质体(原生质球)研究光合真核细胞的进化。我们预计这部小说基因传递方法可以用于进一步的理解逆行信号organellar和核基因组之间的植物和工程师一天新的生命形式在空间。总之,尽管取得了一些进步在过去的几年中交付大分子organellar基因组使用纳米粒子(野蛮人,2022),交付方法organellar基因组是有限的,但它是一个领域,有望在未来发展的影响生产transplastomic植物在某些情况下,转基因植物。最后,结合transplastomics tri-parental继承将为未来的研究有更显著的影响。
作者的贡献
SR、锡、JW,赫兹和GD写的手稿。GD设计了图。老了的观念。所有作者的修改、编辑和批准的手稿。
资金
这项工作是支持由克莱姆森大学克莱姆森(种子),国家粮食和农业研究所(NIFA多国格兰特S009), SC花生,国家花生委员会,粮食和农业研究基金会(FFAR)支持老GD Resnick可持续发展研究所加州理工学院。赫兹承认的支持中国广东省自然科学基金(2022 a1515011839)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
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关键词:生物大分子的交付方法、基因组编辑CRISPR, RNA干扰,遗传转化,定点诱变、纳米粒子、植物
引用:张Rustgi年代,Naveed年代,温德姆J, H和Demirer GS(2022)植物在21世纪生物大分子交付方法。前面。基因组。4:1011934。doi: 10.3389 / fgeed.2022.1011934
收到:2022年8月04;接受:2022年10月3日;
发表:2022年10月14日。
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