CRISPR / ca系统的应用抗病毒药物治疗
海伦·j·e .·巴德利
马克Isalan- 生命科学部门,伦敦帝国理工学院,英国伦敦
CRISPR / Cas系统已经完善,一直努力将它们应用于现实世界的问题,如发展sequence-targeted抗病毒疗法。病毒对人类构成重大威胁,迫切需要新的工具来对付这些迅速变异病原体。重要的是,各种CRISPR系统有可能直接分裂DNA和RNA病毒基因组,有针对性、适用性强的方式,从而预防或治疗感染。这个角度看文章突出了最近的研究使用不同的Cas效应器与各种RNA病毒引起急性感染人类;一个潜伏病毒(hiv - 1);一种慢性病毒(乙肝);和病毒感染家畜和动物物种的工业的重要性。讨论了剩下的前景和挑战,尤其是在附加的背景下新出现的病毒,如SARS-CoV-2。
介绍
当前COVID-19流行提醒我们新兴力量的病毒和新的抗病毒治疗的必要性。自从发展CRISPR / Cas9作为RNA-guided可编程基因组编辑工具(Jinek et al ., 2012),有希望它可能适用于直接裂开病毒基因组(Doudna和贝纳2014;2015年肯尼迪和卡伦)。在自然界中,CRISPR / Cas系统中自适应免疫系统抵御入侵的病毒和细菌外国核酸(霍Barrangou, 2010)。因此,逻辑,它可能不是一个过分利用保护人类免受病毒感染。
在自然的多样性CRISPR / Cas系统(Koonin et al ., 2017),二类中科院内切酶(单一蛋白效应)最近被丰富的主题研究活动尽可能的抗病毒疗法。效应器Cas9和Cas12(减少双链DNA, dsDNA)和Cas13(削减单链RNA, ssRNA)适合与一些DNA和RNA病毒,分别为(图1;表1)。PFS的Cas13亚型不同(protospacer-flanking序列)需求(表1)。Cas13亚型,Cas13d交付是最小的影响燕et al ., 2018)。因为所有中科院的蛋白质是制导的RNA分子,这可以很容易地将病毒基因保守区域设计,这使得它们吸引灵活抗病毒的脚手架平台。
图1。CRISPR / Cas系统抗病毒治疗的示意图。(一)Cas13削减ssRNA,可以用来降低病毒RNA基因组。(B)Cas9导致钝DNA切割和hiv - 1可以切除集成前病毒的DNA从宿主基因组,要求2 sgRNAs。双重编辑位于相同的单元中可能并不总是足够有效切除病毒DNA的干预市场,但单一的网站编辑事件,导致indels削减网站,可以灭活病毒复制。(C)Cas12导致交错DNA切割和可以删除地区目标基因在病毒基因组。的例子在活的有机体内研究动物模型。箭头指示的降低结构效应的蛋白质。缩写:dsDNA,双链DNA;ssRNA单链RNA;sgRNA、单指导RNA;crRNA CRISPR RNA;hiv - 1,人类免疫缺陷病毒1;猴免疫缺陷病毒,猴免疫缺陷病毒;BmNPV,家蚕nucleopolyhedrovirus;SARS-CoV-2,严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2。 Figure created with BioRender.com.
表1。二类CRISPR / ca系统的性质和总结开发CRISPR / Cas抗病毒药物的研究。PAM / PFS是目标识别的关键。导游RNA组成的间隔(互补的目标)和支架(绑定到中科院效应蛋白)。在活的有机体内研究以粗体显示。目前尚不清楚是否有中科院蛋白质存在分裂双链rna,也许是因为他们复杂的二级和三级结构;目前抗病毒Cas方法必须在病毒,因此关注ssRNA目标如下所示。缩写:PAM, protospacer相邻的主题;PFS protospacer-flanking序列;BmNPV,家蚕nucleopolyhedrovirus;人类免疫缺陷virus-1 hiv - 1;KSHV,卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒;PRRSV,猪繁殖与呼吸综合征病毒;SARS-CoV-2,严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2。
本文认为CRISPR / Cas的不同的上下文中可以直接开发目标病毒,和的可行性,而不是修改宿主基因组的方法(审查的,请看:陈et al ., 2018))。新颖的策略是急需对抗许多严重的病毒感染的全球公共卫生问题。这些感染通常缺乏有效的治疗方法或显示现有抗病毒药物耐药性问题。尽管这令人兴奋的领域的研究仍处于临床前阶段,它却拥有更大的潜力来保护我们免受病毒、which-SARS-CoV-2-is目前在全世界造成毁灭性影响之一(胡锦涛等人。,2021年)。
主要内容
急性抗病毒Therapy-RNA病毒的例子
RNA病毒是一种急性的崛起以来全球优先COVID,在这种背景下,Cas13吸引了很多利益作为抗病毒药物,因为它削减ssRNA,如发现SARS-CoV-2 (胡锦涛等人。,2021年)。事实上,ssRNA病毒占大多数的病毒可以感染人类,所以Cas13抗病毒系统已经开发和验证在哺乳动物细胞之前COVID (Freije et al ., 2019)。例如,Cas13a和Cas13b测试三种不同的致病性ssRNA病毒(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、甲型流感病毒和疱疹性口炎病毒)和CRISPR rna (crRNAs)针对病毒基因组的高度保守的区域被发现是有利于避免逃避突变体。此外,多路复用(针对多个位点),使用混合crRNAs,可以减少突变的机会逃脱的方法是高度适应作战的可能进化病毒(Freije et al ., 2019)。
一旦COVID出现,迅速开始工作在此设置应用这种方法。Cas13抗病毒策略首先是测试SARS-CoV-2人类肺上皮细胞,称为吃豆人(在人类细胞中预防性抗病毒CRISPR) (雅培et al ., 2020)。这一策略使用pan-coronavirus crRNAs指导Cas13d降低病毒基因组和抑制基因表达。这个探索发生在大流行的早期(2020年4月),没有访问SARS-CoV-2生活。因此,只有合成片段中使用在体外研究。由于SARS-CoV-2是积极意义病毒,Cas13原则上可用于目标基因组和病毒mrna限制病毒复制。为了目标尽可能多的菌株在家庭,阿伯特和他的同事使用生物信息学屏幕识别高度保守的区域在病毒基因组,发现6 crRNAs可能目标91%的测序冠状病毒(雅培et al ., 2020)。
自那时以来,许多研究已经使用CRISPR SARS-CoV-2目标。pan-coronavirus方法相比,另一组设计crRNAs指导Cas13a在一个非常具体的,可定制的,方式的RNA SARS-CoV-2飙升蛋白(王et al ., 2021)。同样,吃豆人的方法使用anti-SARS-CoV-2 Cas13d预防性,表明它可以表达人类的肺上皮细胞在体外,抑制SARS-CoV-2片段的表达和生活感染甲型流感病毒(IAV;RNA病毒与类似的趋向性SARS-CoV-2) (雅培et al ., 2020)。在不同概念的方法,突变体“停用”Cas13 (dCas13),缺乏酶的活动,展示了降低峰值蛋白质的表达而不改变它的RNA表达水平,通过摄动的翻译(王et al ., 2021)。
虽然这些研究是令人兴奋的,CRISPR / ca系统的使用对急性病毒仍然雄心勃勃,几个挑战需要克服实现功能的抗病毒药物在活的有机体内。首先,高效的交付在哺乳动物的问题才刚刚开始得到解决。2021年,Cas13a减轻流感和SARS-CoV-2感染在活的有机体内在啮齿动物模型(布兰查德et al ., 2021)(图1)。这里,Cas13a是作为一个合成的信使rna,这是吸引人因为表达式是瞬态和重复剂量可能。Cas13a交付能够强烈感染流感后击倒病毒RNA在活的有机体内,显示的能力首次Cas13a治疗后感染。然而,在SARS-CoV-2在活的有机体内感染实验,Cas13a之前交付,所以只是作为一种预防性进行测试,而不是治疗。第二个问题是,ca蛋白的免疫原性是没有完全理解和需要更多的安全性研究为了建立如何以及何时他们可能安全地表达人类(梅塔和默克尔,2020年)。第三,与大多数病毒,感染后的症状开始表演的时候,和正式的诊断确认身份的病毒,病毒载量可能已经和感染的很高,使病毒的消除具有挑战性。已经说过,在这个领域迅速显然是建筑。
应该注意的是,SARS-CoV-2不是唯一病毒活性研究的目标。例如,Cas13a已成功用于抑制丙型肝炎病毒(HCV)的复制人类细胞通过目标高度保守的内部核糖体进入位点(阿什拉夫et al ., 2021)。CRISPR-based抗病毒药物在这里承诺因为丙肝病毒是具有挑战性的治疗由于其较高的遗传多样性。登革病毒复制的另一个概念验证研究达到抑制病毒基因组的乳沟在哺乳动物细胞(李et al ., 2020)和类似的方法后来在人类细胞(Singsuksawat et al ., 2021)。
然而Cas13的另一个应用程序是使用在昆虫,如埃及伊蚊和白纹伊蚊蚊子传播RNA病毒基孔肯雅热、登革热和Zika病毒。在这种背景下,Cas13b已被证明可拆卸的基孔肯雅病毒RNA在蚊子细胞(Tng et al ., 2020)。这种方法有可能创建virus-refractory蚊子。然而,一个意想不到的结果是,导游没有Cas13b rna就可以产生影响。显然,这些作品也仍在进行中,但其潜在的影响是伟大的。
最后,我们注意到,核糖核酸干扰(RNAi)沉默病毒基因表达可能是另类疗法。RNAi Cas13一样,也提供了一个sequence-targeted抗病毒的方法在这种情况下通过绑定和有辱人格的特定的RNA转录(Levanova Poranen, 2018)。小核RNA)治疗抑制症状和抑制病毒复制的恒河猕猴模型冠(李et al ., 2005)。鉴于RNAi依赖于原生细胞机制,它不还面临着对引入外源蛋白的免疫原性;Cas13这可能是一个问题,特别是对于重复给药。然而,临床应用Cas13似乎青睐前进,因为它显示更高的效率和特异性和较低的脱靶效应相比,RNAi (Abudayyeh et al ., 2017;Konermann et al ., 2018)。
DNA-Integrated潜伏病毒Therapy-HIV
因为以上所提出的一些问题和急性RNA病毒,部署CRISPR /中科院作为抗病毒药物可能更适合针对潜在的DNA病毒。hiv - 1是一个很好的案例研究以来重要的临床使用CRISPR / Cas9正在取得进展,对治疗潜伏性感染。抗病毒药物本身并不能消除集成前病毒DNA从宿主基因组。因此,当停止抗逆转录病毒疗法时,病毒迅速反弹发生和阻力可以一个问题(Deeks et al ., 2016)。因此,CRISPR / Cas抗病毒药物提供了一个更加灵活和敏捷方法可能实现根除病毒,可能提供一个永久的治疗。
原Cas9-based基因编辑工具有可能切除或变异潜伏dsDNA病毒(图1)。成功切除后集成的hiv - 1病毒在人类骨髓细胞(Ebina et al ., 2013;胡锦涛等人。,2014年),抑制病毒复制的实现体外培养CD4+从感染患者t细胞(卡明斯基et al ., 2016 b),抑制hiv - 1病毒基因表达的转基因小鼠和大鼠(卡明斯基et al ., 2016 a)和老鼠道感染hiv - 1阳性患者外周血单核细胞(贝拉et al ., 2018)。最近,CRISPR / Cas9被加上“长效slow-effective释放抗病毒疗法”(激光艺术)在感染hiv - 1的人源化小鼠模型(Dash et al ., 2019)。激光艺术由疏水亲脂性的抗逆转录病毒药物前体纳米颗粒可以降低抗病毒治疗的给药频率从几天到几周,但不是消除hiv - 1本身的能力。结合清除病毒的小鼠起到了关键性作用,防止反弹后停止抗病毒疗法,因为CRISPR / Cas9单独也是不充分的。在第一个非人类灵长类动物研究评估这项技术,腺相关病毒(装甲防护)被用作传递向量。单一静脉注射(IV)注入AAV9-CRISPR / Cas9能够切除的碎片猴免疫缺陷病毒(SIV)综合病毒DNA和biodistribution广泛,达到组织的范围(曼库索et al ., 2020)。虽然一个相对较小的人群,结果显示实际的进展消除hiv - 1的目标水库在人类患者提供一个永久的治疗,和资金已经获得1/2期临床试验。
尽管Cas9 anti-HIV-1研究的主要焦点,其他Cas核酸酶最近测试。一种方法使用Cas13a降解病毒RNA能够大大降低hiv - 1的生产粒子(阴et al ., 2020)。另外,Cas12a比Cas9证明有更好的抗病毒活性在体外引起突变和不同的配置文件(缺乏纯插入)(高et al ., 2020)。一个限制是,两个Cas效应器PAM不同需求直接比较是具有挑战性的。总体而言,艾滋病毒治疗的可能是第一个应用CRISPR / Cas抗病毒药物来达到人类的病人。
慢性游离病毒Therapy-Hepatitis B病毒
另一个具有挑战性的病毒可能是服从CRISPR / ca方法是乙型肝炎病毒(HBV)。乙肝病毒基因组坚持肝细胞的形式共价闭合环状DNA (cccDNA),游离DNA复制的模板,它也可以将其DNA整合到宿主基因组,它不是复制能力但仍然可以产生病毒rna和蛋白质(赵et al ., 2020)。因此,这慢性感染是一个很好的测试开发CRISPR / Cas抗病毒药物。
时,必须精心挑选的Cas9直接同源发展抗病毒CRISPR / Cas治疗,因为它已被证实能抗病毒活性的影响。例如,乳酸链球菌(St)Cas9被证明是更有效地降低乙肝病毒转录,脱靶效应而没有察觉酿脓链球菌(Sp)Cas9 (Kostyushev et al ., 2019)。圣Cas9可能更适合人类疗法由于其较低的不宽容和长PAM的要求。等其他因素也会影响抗病毒活性的影响cccDNA的甲基化对HBV CRISPR / Cas9活动;事实上,最近的一项研究显示anti-HBV活动的障碍(Kostyushev et al ., 2019)。
尽管如此,这种方法有持续的进步。一项研究liver-humanized使用小老鼠金黄色葡萄球菌(Sa)Cas9,由第四AAV,能够提高人类肝细胞的生存,尽管减少乙肝病毒cccDNA并未达到统计学意义(石头et al ., 2021)。本研究使用更严格的乙型肝炎病毒感染模型,包括cccDNA的存在,而以往的研究(李et al ., 2018;刘et al ., 2018)。因此,成功的针对乙肝病毒可能更具挑战性,表明需要进一步的优化。例如,小分子抑制剂的DNA双链断裂(双边带)修复途径可能会有用,因为他们可以增强对HBV cccDNA CRISPR / Cas9活动(Kostyusheva et al ., 2019)。
另一个考虑是,针对综合病毒DNA,例如乙肝病毒和艾滋病毒,导致双边带在宿主基因组中可能导致病态的染色体重组(Kosicki et al ., 2018)。然而,最近的一次CRISPR / ca系统的发展,基础编辑(里斯和刘,2018年),可以将基地没有双边带特定位点。因此这项技术对目标的吸引力综合病毒,因为它可能永久沉默基因表达通过生成无意义突变,在集成的HBV DNA和cccDNA (杨et al ., 2020)。此外,为了解决安全问题,CRISPR的活动/ Cas9对抗乙肝病毒可以通过使用局限于肝脏AAV8显示高肝取向。肝脏特异性启动子控制的表达CRISPR / Cas9 AAV8是有效的作为一个额外的方法来限制活动到肝脏,在老鼠(燕et al ., 2021)。
实际应用CRISPR / Cas9对抗乙肝病毒当然需要高效的交付。最近开发的高容量运载体(HCAdVs)提供的机会Cas9和多个gRNAs交付在一个向量对抗乙肝病毒(Schiwon et al ., 2018)。此外,脂质nanoparticle-based CRISPR / Cas核糖核蛋白交付nanoplatform已经被开发出来,使大规模生产潜力(铃木et al ., 2021)。在这里,成功的抑制HBV DNA和cccDNA的证明在体外。更好的发展运载工具将这些技术的推广的关键。
除了乙肝病毒,Cas9已被证明目标卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV / HHV8)游离DNA在体外(梁et al ., 2020)。具体来说,针对KSHV sgRNAs microRNA基因(microRNA)摄动的功能和导致upregulation主机肿瘤抑制基因。这可能发展成KSHV-associated恶性肿瘤的治疗,延长申请Cas9目标游离病毒DNA。
更Ethically-Accessible操场?抗病毒治疗的动物
重大经济损失是忍受,因为病毒感染的动物,导致一些创新的发展策略。等方法直接针对病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) (崔et al ., 2020),全球养猪业的主要威胁,可能更好的监管部门的批准,相对于人类的应用程序。CRISPR / ca方法相比,这一目标局部的病毒,它是简单的创建germline-edited动物要么修改宿主基因所需的病毒感染(Burkard et al ., 2017,2018年;杨et al ., 2018;陈et al ., 2019;郭et al ., 2019;王et al ., 2019)或表达CRISPR抗病毒药物基因上。因此,Cas13b正在调查针对PRRSV既是一个方法来打通病毒RNA (崔et al ., 2020)和视觉诊断方法适用于字段(Chang et al ., 2020)。另一个例子是稳定的能力表示Cas13a减少IAV滴定度在鸡细胞,使用四个crRNAs(的组合Challagulla et al ., 2021)。这项研究表明,生殖系转基因鸡的创建包含CRISPR / Cas13a抗病毒转基因可能防止高致病性流感毒株家禽业。
使用CRISPR /中科院作为预防性抗病毒药物在人类也许是不可能在这个阶段,但可以提供巨大的保护industrially-relevant动物物种如蚕(家蚕)。转基因蚕已经由CRISPR / Cas9整合到其基因组目标家蚕nucleopolyhedrovirus (BmNPV)基因组。这提供了丝绸生产电阻同时保留经济重要特征(陈et al ., 2017;董et al ., 2018 a,2019年,一个)。有趣的是,virus-inducible CRISPR / Cas9系统已经开发针对BmNPV避免负面影响幼虫和茧发展与稳定表达系统。因此,转基因蚕行包含Cas9 baculovirus-inducible启动子的控制下39 K,这意味着系统激活只在病毒感染(董et al ., 2018 b)。其他发展包括使用多路复用CRISPR / Cas系统针对不同的蚕病毒在同一时间(董et al ., 2019 b)。此外,尽管Cas12a尚未广泛应用于昆虫生物技术,一个Cas12a直接同源被证明对BmNPV抗病毒活性,改善相比SpCas9 (董et al ., 2020)(图1)。
重要的是,这些研究是超越测试的潜力CRISPR / Cas抗病毒疗法在疾病模型和真实自然的病毒感染。总之,CRISPR / Cas抗病毒药物治疗动物的发展可能比人类更快发展以来,转基因动物可以很容易生成。
讨论
周围有很多的承诺的应用CRISPR / Cas,但抗病毒药物的快速进展认为这些可能真的在发展中实际应用。
在本文中讨论不同病毒环境,必须克服的一个主要挑战,实现有效的治疗方法是常规交付CRISPR / Cas组件。的详细讨论超出了本文的范围,但,以及使用标准病毒传递向量(例如装甲防护(曼库索et al ., 2020),一个创新的方法是使用已知的receptor-ligand交互,使特异性交货(Rouet et al ., 2018)。这可能允许针对特定的感染细胞通过使用相同的受体对于病毒条目。另外,尽管不是在一种抗病毒的背景下,研究证明成功的基本编辑在灵长类动物一个脂质纳米颗粒冲剂(Musunuru et al ., 2021)。除了交付挑战,预先存在的适应性免疫Cas9人类显然是一个重要的问题(Charlesworth et al ., 2019)。然而,短暂的“肇事逃逸”交付的使用,结合抗炎药或有针对性的免疫抑制机制可能有助于克服这些问题一天,以及潜在的应用替代Cas患者的蛋白质。
关于后者,似乎有很多被发现。今年早些时候,两个家庭CRISPR / Cas13感受器被发现在野生微生物宏基因组分析和一个显示有前途的抗病毒活性SARS-CoV-2和流感疫苗(徐et al ., 2021)。这些感受器更加紧凑起来会更轻松。此外,由于细菌是坐落在高盐环境中,人类不太可能有预先存在的免疫相比,这些直接同源Cas9 Cas12,来自细菌对人类通常暴露出来。
从另一个发现在细菌基因组和Cas7-11宏基因组序列,一个可编程的单一蛋白融合的效应导致Cas7 Cas11 (Ozcan et al ., 2021)。Cas7-11削减RNA没有显示任何抵押品的活动或细胞毒性,Cas13相比,所以打击RNA病毒是一种很有前途的新工具。由于其大尺寸、工作需要缩小酶交付。
支持治疗病毒感染,病毒的快速检测和诊断使用CRISPR可能会更快地达到临床的影响(Gootenberg et al ., 2018;梅尔沃德et al ., 2018)。这种方法已经被研究与量化的能力迅速发现SARS-CoV-2病毒载量(Fozouni et al ., 2021)。
CRISPR / Cas抗病毒平台可以提供巨大的改善灵活性对新兴病毒与疫苗开发和筛选新的抗病毒药物。最近,初步建议了埃博拉病毒可能出人意料地表现出延迟(Fairhead et al ., 2021),强调需要一个抗病毒的平台,如CRISPR / Cas,准备部署。虽然我们已经设法开发疫苗对COVID-19记录时间,CRISPR-based抗病毒疗法可能是重要的在未来应对新兴病毒。因为它可能需要数年时间达到临床应用,我们现在应该开始准备。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。
作者的贡献
HB写的手稿。MI编辑和写的部分手稿。
资金
乙肝是由MRC DTP医学研究理事会的资助。MRC没有参与撰写这篇文章的。由BBSRC格兰特小姐EVO-ENGINE BB / P020615/1和大众的基础。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
感谢乔治•Gilestro博士为他深思熟虑的讨论。
引用
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关键词:CRISPR、抗病毒、Cas9 Cas13、艾滋病毒、乙型肝炎、RNA病毒,SARS-CoV-2
引用:·巴德利HJE和Isalan M (2021) CRISPR / ca系统的应用抗病毒药物治疗。前面。基因组。3:745559。doi: 10.3389 / fgeed.2021.745559
收到:2021年7月22日;接受:2021年9月23日;
发表:2021年10月13日。
编辑:
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*通信:海伦·j·e .·巴德利helen.baddeley20@imperial.ac.uk