发现生物合成基因簇的小说的环肽化合物,KK-1,Curvularia clavata

介绍

与日益增长的全球利益的实现一个可持续发展的社会,减少环境影响的食物系统被公认为全球最重要的一个问题(Brzozowski Mazourek, 2018;Meemken Qaim, 2018;Lazaroiu et al ., 2019)。尤其在欧洲,有强烈关注对环境和生物多样性的影响由于过度依赖化学农药在农业。这使得欧盟委员会建立具体的数字目标要实现到2030年减少化学农药的使用,促进有机农业在其“农场到餐桌的策略,”2020年5月被释放(https://food.ec.europa.eu/system/files/2020-05/f2f_action-plan_2020_strategy-info_en.pdf)。这是紧随其后的是一个世界性的运动加强对化学杀虫剂的法规,如日本的战略可持续发展的食品系统,称为MeaDRI (https://www.maff.go.jp/e/policies/env/env_policy/meadri.html)。因此,对新农药的需求自然起源,这被认为是有一个相对较低的影响对环境和生物体,未来预计将进一步增加。

产生的次生代谢物微生物如真菌、放线菌、细菌,是多元化的,包括许多化合物表现出显著的生物活性(范教授et al ., 2019;Jakubczyk Dussart, 2020;德四美和塞拉,2021年)。他们中的许多人有复杂的化学结构基于碳骨架特征而导致的生物合成机制,包括酮化合物合成酶、non-ribosomal肽合成酶和萜烯合成酶(范教授et al ., 2019;Jakubczyk Dussart, 2020;德四美和塞拉,2021年)。当天然化合物与这种复杂结构有杀虫的活动,他们将从现有的化学杀虫剂,作用于不同的目标导致农药的发展与减少环境影响,并提供解决重要问题在现代农业中,如农药抵抗害虫和杂草。

一些微生物产生的次级代谢物的商业化杀虫剂(卡佩尔et al ., 2012)。例如,多氧菌素核苷分离的抗生素链霉菌属cacaoi的控制,主要用于植物病原体(Isono et al ., 1965;Isono et al ., 1967)。多氧菌素结构类似的化合物的混合物的基本结构是由三根包括核苷骨架,polyoxamic酸,carbamoylpolyoxamic酸(Isono et al ., 1969;Uramoto et al ., 1981);他们是唯一专门抑制几丁质合成的农药(Endo和也陆陆续续,1969;Endo et al ., 1970),真菌细胞壁的主要组成部分。Spinosyns孤立于Saccharopolyspora spinosa和是大环内酯物化合物杀虫活动(默茨和姚明,1990;Kirst et al ., 1992)。发酵的主要产品文化spinosyn spinosyn D (Kirst 2010),这两个的混合物作为Spinosad已商业化。基本结构由tetracycle包含一个由12人组成的大环内酯与自然糖、鼠李糖、氨基糖,forosamine (Kirst et al ., 1992)。Spinosyns表现出杀虫活动的烟碱乙酰胆碱受体作用于昆虫神经系统(奥尔et al ., 2009;Crossthwaite et al ., 2017)。除了上面指定的代谢物,其他许多次生代谢产物表现出杀虫的活动已经被隔离;然而,在许多情况下,商业化是困难的,即使有前途的活动是证实。这是成本的主要原因之一。考虑到工业生产次生代谢产物的复杂的结构,与微生物发酵的方法,如多氧菌素和spinosyns,是一个现实的生产方法,因为合成有机化学方法无利可图。然而,总的来说,这些次生代谢物生产少量,常常只有在特定的条件下。这使得很难确保成本效益和稳定生产农药,其实际应用的障碍。迄今为止,在提高生产力方面已经取得了一些进展,尤其是在医药领域,通过培养条件的优化和育种通过引入随机突变(帕尔克et al ., 2000;李et al ., 2002;Korbekandi et al ., 2010;克et al ., 2014)。然而,很难实现商业化只使用这些方法,因为它可能需要很长时间才能获得高产菌株,以更低的成本和农用化学品需要批量生产的药品。

一个解决方案有效地产生这样的有价值的次生代谢产物是合成生物学的方法,最近引起关注(Katz et al ., 2018;崔et al ., 2019)。最近新一代测序和生物信息学的发展,它已成为更容易分析基因组信息和微生物的基因功能(Zhang et al ., 2017;胡锦涛等人。,2021年)。这也促进了基因的鉴定与某些次生代谢产物的生物合成和生物合成途径的说明(Zhang et al ., 2017)。这些生物合成基因的克隆及其引入适当的主机和系统建设的专业生产主机中目标化合物通过修改这些基因,即。,合成生物学方法(西迪基et al ., 2012;詹森和科斯林,2015年;李et al ., 2019),预计将实现大量的天然产物提供有用的活动。这些方法的有效生产有用的化合物近年来取得了快速进展(克雷文et al ., 2019;杨et al ., 2020;Zhang et al ., 2021)。例如,在医药领域,青蒿素的前体的生产率,提取的抗疟活性的萜类化合物青蒿一种草本植物,显著提高(威斯特法et al ., 2012;Paddon et al ., 2013;龚et al ., 2018)。因此,这些方法扩大的可能性自然化合物的高效的大规模生产和稳定的供应与潜在农药活动,曾是很难付诸实际应用由于其低效率。

在这里,我们专注于一种抗真菌化合物(CAS No。143380-71-6),以下简称KK-1,丝状真菌产生的,Curvularia clavata(baua - 2787菌株)。BK202 KK-1可能是相同的,这是分离和纯化Curvulariasp.由诺和诺德公司/ S (Bagsværd、丹麦)中描述专利WO1992005191A1 (尼尔森et al ., 1992)和循环depsipeptide由一个甘氨酸,8 l -氨基酸(四个缬氨酸和一个pipecolic酸、天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸每个),和一个D-lactic酸。氨基上的氮原子的五组这些残留甲基化,和酪氨酸残基的羟基苯基上也是甲基化(D-Lac / L-Pip / N-methyl-L-Val / L-Val / N-methyl-L-Asp / N-methyl-L-Val / N-methyl-Ile / g / N-methyl-L-Val / O-methyl-L-Tyr) (图1,也指主管Yoshimi et al ., 2018)。KK-1是一种很有前途的农药活性化合物与高活动对许多植物病原体,特别是葡萄孢菌,病原体引起的疾病在各种灰霉菌农业和园艺作物。然而,需要一个突破,使实用稳定的质量供应。因此,我们旨在识别生物合成基因簇作为第一步的大规模生产KK-1将来通过合成生物学方法。属Curvularia,以及属Bipolaris,是一种丝状子囊菌类的菌属的鉴定Cochliobolus(Manamgoda et al ., 2011),其中一些被称为植物病原体(Manamgoda et al ., 2011),和一些具有生物活性的次级代谢产物分离出真菌属于这些属(Khiralla et al ., 2019;Elkhateeb et al ., 2021)。然而,到目前为止,还没有报道发表Curvularia clavata关于其能力产生生物活性化合物或任何酶相关的次生代谢途径,及其基因组信息还没有被测序。

因此,在这个报告中,我们进行了全基因组测序c . clavatabaua - 2787以及转录组分析。使用这些数据,一个基因簇被确认参与KK-1的生物合成。然后,每个集群基因的超表达或缺失突变体被生成。我们还分析了这些突变体的KK-1生产和集群基因的表达来证明这些基因参与KK-1的生物合成。

材料和方法

应变和生长条件

Curvularia clavatabaua - 2787捐赠的秋田犬Konno有限公司,有限公司,日本秋田和注册国立理工学院及评估(没有。夜间bp - 02399)。的分生孢子的悬架c . clavatabaua - 2787菌株是准备通过增加无菌水的殖民地种植在CMA介质(田中et al ., 1991Ca)[0.15%(不₃)₂h·4₂啊,0.05% MgSO₄h·7₂O, KH氯化钾0.05%,0.04%₂阿宝₄胰蛋白胨K2HPO4 0.003%, 0.1%, 0.1%的酵母提取物,1%葡萄糖,和1.5%琼脂),用无菌刮刀刮,过滤他们通过Miracloth(美国Calbiochem,圣地亚哥,CA)去除菌丝。他们存储在16% v / v甘油在-80°C。所有c . clavata野生型和突变株来源于baua - 2787厘米(CMA -琼脂)系统中,是厄伦美厄烧瓶,准备和给它们注射10分生孢子悬浮液的浓度³分生孢子/毫升。

基因组测序

基因组DNA的c . clavatabaua - 2787使用DNeasy植物提取迷你包(试剂盒,曼彻斯特,英国)培养2天后在CM中26°C和100毫升130 rpm。DNA库准备5500固体Mate-Paired图书馆装备和测序5500 xl固体系统(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。Nextera DNA样本准备工具包也用于图书馆准备,和图书馆使用MiSeq测序平台(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。混合新创基因组大会Ikegami et al ., 2015)都使用了MiSeq和固体短的读取数据。此外,草案基因组蛋白质编码基因的基因预测的组合预测的程序,ALN (后藤2000)和GlimmerHMM (Majoros et al ., 2004)。NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和蛋白质家族包含了数据库(http://pfam.xfam.org/)被用于序列同源性和保守域搜索,是适当的。

寻找KK-1生物合成non-ribosomal肽合成酶基因

BlastP搜索执行对数据库的氨基酸序列预测蛋白质是由基因组信息c . clavatabaua - 2787。的序列NPS1-NPS12被用作一个查询,non-ribosomal肽合成酶(NRPSs)被发现在吗Cochliobolus heterostrophus,一些高度同源基因提取。预测更准确的编码序列(CDSs)的基因,BlastX搜索使用核酸序列对基因库进行数据库从3000年英国石油公司上游下游开始密码子3000个基点的这些基因的终止密码子查询。然后,域由这些基因编码的蛋白质结构预测使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)和antiSMASH (http://antismash.secondarymetabolites.org)寻找NRPSs模块化结构,符合KK-1的结构特点。

预测KK-1基于基因表达水平的生物合成基因簇

野生型菌株的c . clavatabaua - 2787厘米100毫升的培养基培养,准备在130转300毫升锥形烧瓶在两个温度条件为48小时(26°C和37°C)。这些样本的总RNA提取与等基因(日本基因、富山、日本)和纯化使用RNeasy旋转列(试剂盒)。然后,提取RNA的数量和纯度测定安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。RNA序列(RNA-Seq)图书馆准备Truseq RNA样本准备工具包v2 (Illumina公司)和RNA-Seq Miseq系统上执行(paired-end 2×75基地)。获得读取被映射到基因组的草案c . clavatabaua - 2787使用大礼帽程序(杰尔et al ., 2009)和外显子的每千碱基读取每百万映射读取(RPKM)值计算原始读计数数据的每一个基因的基因组。这部小说基因簇采矿工具,motif-independent新创检测算法次生代谢基因簇(MIDDAS-M),预测粘住基因集群使用基因组和转录组数据(Umemura et al ., 2013),被用来检测基因表达的显著的集群在26°C相比37°C。

药敏的c . clavatabaua - 2787原生质体

我们准备5µL原生质体的暂停c . clavatabaua - 2787野生型菌株根据转换方法如下所述。它被发现的中心CM-sucrose琼脂培养基(CM中含1.5%琼脂和1.2蔗糖)补充有六个浓度(1、2.5、5、10、15、20µg /毫升)的aureobasidin(阿坝;豆类生物、志贺、日本)或6个浓度(12.5,25、50、100、200和400年µg /毫升)潮霉素(Hyg;和光纯化学,富士胶片kouichi日本大阪)。经过6天的孵化26岁˚C,菌丝体生长抑制的评估。

的变换c . clavata与pAUR316 baua - 2787

野生型菌株的c . clavatabaua - 2787厘米100毫升的培养基培养,准备在一个300毫升锥形烧瓶30˚C和130 rpm。40小时后,菌丝使用Miracloth被过滤收集,用无菌水清洗,用锅铲压至轻轻去除水中。洗菌丝是悬浮在10毫升的原生质体形成的解决方案(3毫克/毫升Yatalase(豆类生物),0.3毫克/毫升溶解酶木霉属harziaum(Sigma-Aldrich Steinheim Albuch,德国),0.8 mol / L氯化钠,10毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH6.0)],轻轻摇动30˚C和80 rpm。3小时后,细胞壁碎片被过滤删除使用Miracloth离心法收集和原生质体的材料。接下来,原生质体小球与0.8 mol / L生理盐水洗两次,悬浮在溶液1 (0.8 mol / L氯化钠,CaCl 10毫米₂,10毫米Tris-HCl缓冲2×10 (pH8.0)]⁸原生质体/毫升,1/5体积的解决方案2 [40% (w / v) PEG4000, CaCl 50毫米₂,50 mM Tris-HCl缓冲区(pH8.0)]添加温和的混合。大约10µg pAUR316(豆类Bio)添加到0.2毫升整除的原生质体暂停,这是孵化冰上10分钟。随后,1毫升的解决方案2了悬架和孵化在室温下15分钟。之后,0.2毫升的悬架和7毫升CM-sucrose顶级琼脂培养基(CM中含1%琼脂和1.2蔗糖)10μg /毫升的AbA,并覆盖表面的CM-sucrose琼脂培养基(CM中含1.5%琼脂和1.2蔗糖)与10μg /毫升的AbA准备在培养皿中。这些是孵化转化株26°C到殖民地的出现。同时,直接聚合酶链反应(PCR)使用KAPA3G植物PCR试剂盒(Kapa生物系统公司,马威尔明顿、美国)进行殖民地确认如果他们拥有pAUR316。所示的引物信息补充表S1。

建筑的DNA片段CcpyrG删除

Blastp搜索使用执行所编码的蛋白质的氨基酸序列pyrG的曲霉属真菌nidulans(加入:AAB66359)查询,一个基因被发现的相同器官c . clavatabaua - 2787被指定为CcpyrG。该地区从2005年英国石油公司上游的启动密码子1261年英国石油下游的终止密码子CcpyrG基因组DNA的放大c . clavatabaua - 2787使用一套引物,CcPyrG-del_FW3 / CcPyrG-del_RV3, Phusion热起动II高保真DNA聚合酶(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。这个片段被T4多核苷酸磷酸化激酶(Toyobo、大阪、日本)和结扎使用T4 DNA连接酶(日本基因)pUC18消化的质粒SmaI(豆类生物)和脱去磷酸大肠杆菌碱性磷酸酶(Toyobo)构建质粒pUC18 -CcpyrG。随后,逆使用一套引物PCR, CcPyrG-del_FW2 / CcPyrG-del_RV2, Phusion热起动II高保真DNA聚合酶进行放大pUC18——的片段CcpyrG这是缺少的序列CcpyrG启动子区域的CcpyrG《终结者》。片段被T4多核苷酸激酶磷酸化,self-ligated T4 DNA连接酶构建CcpyrG删除质粒。DNA磁带,相当于1150个基点的片段组成片段对应地区从2005个基点至856个基点上游的启动密码子CcpyrG和相对应的1079个基点片段下游地区从183个基点至1261个基点的终止密码子,这是直接连接到彼此作为同源重组的同源性武器,被放大的CcpyrG删除质粒,使用底漆,CcPyrG-del_FW3 / CcPyrG-del_RV3, Phusion热起动II高保真DNA聚合酶。这个DNA磁带用于的生成CcpyrG删除应变。上述计划所示补充图S1和引物信息所示补充表S1

一代的CcpyrG删除应变作为转换的主机

转换基本上是根据执行的方法引入pAUR316上面描述,但尿苷0.2% (w / v), 0.02% (w / v)的尿嘧啶,和1毫克/毫升的5-fluoroorotic酸(和光纯化学富士胶片kouichi)被添加到CM-sucrose琼脂培养基和CM-sucrose琼脂培养基,分别代替AbA。然后,直接PCR使用KAPA3G植物进行了PCR设备越来越多的殖民地确认包含目标区域CcpyrG删除了同源重组。所示的引物信息补充表S1。

质粒的过度建设kk1F

超表达的质粒kk1F基因是由插入四个DNA片段按照以下顺序:1000个基点地区上游的启动密码子Ccnmt1编码的Nmt1同族体粟酒裂殖酵母作为发起人,cDNA序列kk1F,355个基点区域下游的终止密码子Ccnmt1作为它的终结者光环^r,一个AbA与耐药基因曲霉属真菌nidulanspUC19质粒,作为一个可选的标记,使用一个在融合高清克隆工具(美国Clontech山景,CA)。启动子和终结者被放大的基因组DNAc . clavatabaua - 2787,kk1F互补脱氧核糖核酸库的放大c . clavatabaua - 2787,光环^r从pAUR316质粒被放大。使用Phusion PCR进行热态启动II高保真DNA聚合酶。所示的引物信息补充表S1。

一代的kk1F过度的压力

转换是根据执行的方法引入pAUR316如上所述。直接使用KAPA3G PCR植物PCR试剂盒(Kapa生物系统公司)进行越来越多的殖民地确认目标序列引入到染色体。上述计划所示补充图S2所示,引物信息补充表S1。

质粒构建每个集群基因的删除

每个集群的质粒基因删除除外kk1B基因是由按照以下顺序插入三个DNA片段:一个大约1 kbp片段同源的目标基因的上游地区伸出同源性,2231个基点片段对应于该地区从853年英国石油公司上游的CcpyrG起始密码子181个基点下游的终止密码子CcpyrG可选择的标记,和一个大约1 kbp片段同源下游地区的目标基因的同源性的右臂pUC19质粒,使用一个在融合高清克隆工具。的质粒kk1B删除也基本上使用相同的构造方案如上所述相同的右臂,该地区从4482个基点至5463个基点的下游起始密码子kk1B,对应的内部开放阅读框(ORF),是使用。这些DNA片段基因组DNA的放大c . clavata使用Phusion baua - 2787热起动II高保真DNA聚合酶。每个基因删除质粒线性化了合适的限制性内切酶消化和用于转换。所示的引物信息补充表S1同源臂的地区,包括在每删除质粒和限制性内切酶被用于列出每一个质粒的线性化补充表S2。

代的每个集群基因缺失菌株

转换是根据执行的方法引入pAUR316如上所述,但是CcpyrG删除使用应变作为东道主,CM中含有0.2% (w / v)尿苷和0.02% (w / v)尿嘧啶在最初的文化过程中,使用和CM-sucrose琼脂培养基和CM-sucrose琼脂培养基没有任何除了被用于转化株的选择过程。直接使用KAPA3G PCR植物PCR试剂盒进行越来越多的殖民地来确认每个集群基因通过同源重组和转化株中删除了homokaryons。上述计划所示补充数据S3、S4所示,引物信息补充表S1。

定性评价KK-1生产力

少量的文化上层清液消毒过滤通过0.22µm膜滤器(默克公司,达姆施塔特,德国),纸和磁盘直径6毫米(Advantec,东京,日本,ø6毫米)浸泡在上层清液。摘要磁盘放置在马铃薯葡萄糖琼脂板的中心附近一个90毫米培养皿b .灰质接种到对面。经过3天的孵化26岁˚C, KK-1生产力评估是基于对经济增长的影响b .灰质。的文化上层的野生型菌株作为积极的控制,和CM中被用作消极的控制。

量化的KK-1

c . clavatabaua - 2787菌株生长在CM中准备在困惑厄伦美厄烧瓶,同样体积的丙酮是补充说,这是用。然后样本与同样体积的乙酸乙酯提取两次。然后,收集乙酸乙酯层,用无水硫酸钠脱水,消失了。分析的提取是溶解在乙腈和超高效液相色谱(UPLC)、高效液相色谱法(HPLC),或者HPLC-mass谱(HPLC-MS)。KK-1检测波长195纳米。生产KK-1被量化计算每个紫外线色谱图的峰面积。分离和纯化的KK-1野生型菌株的培养基用于外部校准。

首先,UPLC测量是进行一个ACQUITY UPLC我班系统(美国水域,米尔福德,MA)和执行使用一个ACQUITY UPLC本·C18, 130, 1.7µm, 2.1毫米x 100毫米列(水域)0.6毫升/分钟的流量和使用一个梯度从50%到98%乙腈在水中含有0.1%甲酸为3分钟。第二,高效液相色谱法测量进行了Nexera-i lc - 2040 c高效液相色谱系统(日本岛津公司,日本京都)和执行使用CAPCELL PAK C18 SG120, 5µm, 4.6毫米x 250毫米列(日本大阪,大阪苏打)1.0毫升/分钟的流量和使用一个梯度从50%到98%乙腈在水中含有0.1%甲酸15分钟。第三,HPLC-MS测量是进行一个ExionLC系统(AB Sciex、东京、日本)加上一个三重四重4500系统(AB Sciex)。高效液相色谱使用Kinetex执行2.6µm C18, 100 a, LC列(150 x 4.6毫米;美国Phenomenex托兰斯,CA) 0.4毫升/分钟的流量和使用一个梯度从50%到98%乙腈在水中含有0.1%甲酸8分钟。女士条件如下:电离模式、应急服务国际公司;极性,积极;涡轮燃气温度,300˚C;离子喷涂电压、5.5 kV;和扫描范围,m / z 500 - 1200。

RNA-Seq为kk1F突变体

的kk1F超表达菌株,其缺失株和野生型菌株培养基培养在30毫升的厘米,这是准备在26 100毫升锥形烧瓶˚C和130 rpm,和执行RNA-Seq如上所述。

结果

寻找KK-1生物合成non-ribosomal肽合成酶基因

在许多次级代谢产物肽,肽链是由non-ribosomal合成肽合成酶(nrp)。NRPSs大酶复合物具有模块化结构,每个包含多个功能域与特定的活动和能够催化的合成肽链不取决于核糖体机械(户珥et al ., 2012;Duban et al ., 2022)。基本上每个模块包含一个腺苷酸域(域),肽基载体蛋白域(PCP域),和冷凝域(域),这是基本的合成肽骨干,和thioesterase域(TE域)通常位于糖基的最后模块nrp并负责肽链的环化(户珥et al ., 2012;Duban et al ., 2022)。修改的其他领域有功能的肽链合成了这些基本域(户珥et al ., 2012;Duban et al ., 2022)。从模块的顺序和数量结构和其组成域的特点是一致的与相应的肽,氨基酸残基可以推测nrp参与肽的生物合成次生代谢产物基于这些信息。因此,我们寻找nrp基因负责肽的生物合成的骨干KK-1作为第一步确定的生物合成基因簇c . clavata基因组。

我们最初进行基因组测序的草案c . clavatabaua - 2787和142年获得序列与一个将军的价值1472240 bp总共30.6 Mbp GC含量50.3%,由于混合组装结合固体和Illumina公司数据。共有10367个orf预测从基因组序列草案。随后,我们搜查了草案nrp基因编码序列。在Cochliobolus heterostrophus,这是密切相关c . clavata12 nrp基因(NPS1- - - - - -NPS12)被发现(李et al ., 2005)。BlastP搜索的序列信息预测中发现的蛋白质c . clavatabaua - 2787进行了使用的序列NPS1- - - - - -NPS12查询,导致24 orf的候选人nrp负责KK-1基因合成、指定为Ccnps1- - - - - -Ccnps24。更准确的每一个orf序列预测由对基因库的同源性搜索数据库,并显示Ccnps4、Ccnps3 Ccnps2是一个基因连接在这个秩序。我们所谓的基因Ccnps4-3-2。找到nrp基因符合环肽的结构特点是由10 KK-1残留物,域结构的蛋白质是由上面的orf编码使用antiSMASH随后检查(图2)。因此,只有Ccnps4-3-2总长度为39125 bp有10个模块,每一个都包含一个,卡式肺囊虫肺炎,和C域,这表明它是nrp基因参与KK-1的合成。此外,nrp编码的Ccnps4-3-2有五个N-methyltransferase域(nMT域),负责N-methylation纳入相同的氨基酸模块和位于第三,第五,第六,第七,分别从n端和第九模块。如果第一个模块的nrp编码Ccnps4-3-2参与的介绍吗lKK-1乳酸酸渣,模块包含nMT域的顺序完全匹配的N-methylated KK-1氨基酸残基(图2)。这也强烈表明,Ccnps4-3-2可能是nrp负责基本的合成肽KK-1的支柱。

预测KK-1基于基因注释的生物合成基因簇

一般来说,基因参与生物合成次生代谢产物作为集群存在。环孢霉素,作为免疫抑制剂剂,包括一系列的基因硅镁层,编码nrp负责合成的基本支柱,已被确定为一个公认的生物合成基因簇大约95 kb的区域Tolypocladium inflatum基因组(Bushley et al ., 2013)。对于daptomycin,一系列基因,其中包括三个nrp基因(dptA,dptBC,dptD合成的),这是必不可少的基本支柱,位于同一轨迹的基因组链霉菌属roseosporus,这些基因被认为与这种抗生素的生物合成(苗族et al ., 2005)。基于这些情况下,一群KK-1生物合成的基因也可以作为一个基因簇包含Ccnps4-3-2。因此,对于发现的14个orf的上游Ccnps4-3-2(指定子(-14)- - - - - -orf (1))和其他14个orf发现下游(指定orf (+ 1)- - - - - -orf (+ 14)),每个基因所编码的蛋白质功能预测(表1),该地区约71 kb包含一系列10基因orf (1)来orf (+ 8)可能参与次生代谢被预测为KK-1生物合成基因簇(图3一)。这10个基因是以下简称kk1A- - - - - -kk1Jnrp基因,Ccnps4-3-2,对应于kk1B。大约一半的区域集群的占领kk1B(图3 b;表2)。的kk1F基因预测编码一个蛋白质basic-region亮氨酸拉链(bZIP)主题。这是唯一公认的转录因子基因被发现在集群中,并且,因此,被认为是重要的调节其他集群基因的表达。KK-1集群区域的准确性通过执行长阅读测序组装后来证实PacBio RS-II(数据没有显示)。上面的75 kb序列包含了集群地区已经存入基因库(加入:LC371755)。

预测KK-1基于基因表达水平的生物合成基因簇

集群的预测也使用MIDDAS-M执行(Umemura et al ., 2013),一个序列motif-independent检测方法次生代谢的生物合成基因簇。它能敏感地检测基因集群协同调控在转录水平的基因利用基因组序列信息,结合转录组数据在compound-producing和non-producing条件下获得的。c . clavatabaua - 2787生产KK-1在CM中26岁˚C但不产生在37°C。因此,我们组26°C KK-1生产条件和37°C KK-1非生产状态,和RNA-Seq数据是在两种情况下获得的。由于集群识别使用MIDDAS-M和这些数据,一系列的基因,包括上面提到的10个orf,明显发现(图4),这表明这些基因的表达在KK-1 co-induced生产。这个结果支持这个基因簇是参与KK-1的生物合成。

开发转换系统

分析每个子的函数,我们开始开发一个转换系统c . clavata之前,没有建立。自从protoplast-PEG方法是众所周知的一个转换的丝状真菌的方法,我们首先研究了原生质体的制备条件c . clavatabaua - 2787。结果,我们发现通过添加酶获得的原生质体可以有效地解决方案,包含Yatalase和溶解酶木霉属harziaum文化菌丝在100毫升厘米媒介,准备在300毫升锥形烧瓶在30°C和130 rpm 40小时。

接下来,的易感性c . clavatabaua - 2787原生质体AbA和Hyg检查在CM-sucrose琼脂培养基找drug-selectable标记转换。结果表明,AbA和原生质体Hyg几乎完全抑制菌丝的生长浓度的10μg /毫升或更高版本和200μg /毫升或更高,分别为(图5),这表明这些浓度可用于选择转化株相应产生耐药性的药物。

的必要条件,如上所述,我们试图变换c . clavatabaua - 2787使用protoplast-PEG方法和pAUR316质粒,这被称为穿梭载体曲霉属真菌和包含了AbA耐药基因光环^r从曲霉属真菌nidulans作为一个可选的标记。因此,压力可以生长在CM-sucrose琼脂培养基含有AbA得到10μg /毫升、和这些菌株也显示良好增长转移到包含2.5μg /毫升AbA的CMA的媒介。此外,PCR放大的部分序列pAUR316透露,这些菌株港pAUR316 (图6),这表明光环^r进行函数也c . clavataBAUA2787和转换系统使用AbA成功发达。

一代的pyrG删除病毒的宿主转换

在丝状真菌中,pyrG基因,这是同源的酿酒酵母URA3基因,对尿苷是重要的合成和经常被用作转换(可选择的营养缺陷型的标志范Hartingsveldt et al ., 1987;凌et al ., 2013)。在这项研究中,使用pyrG同族体作为替代选择标记的抗药性标记c . clavata检查baua - 2787。的pyrG基因编码orotidine-5磷酸脱羧酶,负责转换orotidine一磷酸尿苷一磷酸的嘧啶生物合成途径,和突变体缺乏这个函数是尿苷、尿嘧啶和营养缺陷型的也耐5-fluoroorotic酸(5-FOA)。BlastP搜索显示显示,55%相似的基因所编码的蛋白质序列pyrG的曲霉属真菌nidulans以后,这个基因称为CcpyrG。随后,生成一个CcpyrG删除应变作为主机,使用CcpyrG删除DNA磁带准备和用于转换的野生型菌株c . clavatabaua - 2787 (补充图S1)。因此,我们成功地获得CcpyrG删除应变,包含DNA区域CcpyrG删除了同源重组,成为尿苷、尿嘧啶和5-FOA-resistant营养缺陷型的。

分析kk1F过度的压力

自kk1F公认的生物合成基因簇的发现,KK-1,预测是一个转录因子和被认为是调节在集群中的其他基因的表达,kk1F突变体生成分析该基因的功能。最初,过度紧张的kk1F是生成的。作为超表达的启动子,我们致力于Nmt1的基因编码产生一个同族体粟酒裂殖酵母和Thi5p酿酒酵母,基因显示74%相似度守恒的地区(NMT1 / THI5像域:09084)包含的NMT1(加入:AAA35318)和被指定为Ccnmt1。自nmt1已知基因被一个强大的启动子,可以由硫胺素美国非洲酒(Maundrell 1990),Ccnmt1也是一个常数中高度表达的方式吗c . clavata基于RNA-Seq baua - 2787数据,我们决定过表达kk1F通过使用Ccnmt-1启动子序列。特别地,我们构建的质粒DNA盒中kk1F连接到该地区可能包含了吗Ccnmt1启动子和野生型菌株c . clavatabaua - 2787转换使用质粒(补充图S2)。然后,确认目标的转化株序列引入到染色体的kk1F超表达菌株。

KK-1生产这些菌株量化3天,第七天的文化质,它被发现增加相比,野生型菌株的生产在这两天,双7天左右(图7)。此外,第二天和第四天的RNA-Seq分析表达水平的文化显示整个集群的假定的kk1F超表达菌株明显高于野生型菌株,和不同的是更大的在4比2天(天图7 b)。这些结果充分表明,强表达kk1F增加集群基因的表达,导致增加KK-1生产力。

应该注意,峰值对应的化合物作为指标的量化KK-1上面是孤立和分析红外(IR)和质子核磁共振(¹核磁共振光谱(补充数据S5, S6),当然各自获得的光谱匹配BK202,这可能是相同的化合物KK-1,专利中描述WO1992005191A1 (尼尔森et al ., 1992)。

分析kk1F删除应变

一个kk1F删除应变也生成检查KK-1集群生产和基因表达水平。质粒是由上游和下游的序列kk1FORF的同源性武器的删除并通过同源重组,和CcpyrG,包括其公认的启动子和终结者的地区,位于它们之间作为一个可选的标记。这个质粒,线性化限制性内切酶,用于转换c . clavatabaua - 2787CcpyrG删除病毒(补充图S3)。因此,被证实是homokaryons转化株kk1F删除的kk1F删除菌株。

量化的7天KK-1文化显示kk1F删除菌株几乎KK-1产生,和他们的文化上层清液的抗真菌活性b .灰质也删除(图8)。此外,删除菌株显示转录表达水平降低整个假定的集群的野生型菌株相比(图8 b)。这些结果表明,删除kk1F导致集群基因的表达减少,导致KK-1生产力的损失。

每个集群基因缺失株的分析

调查的参与的集群之外的其他基因kk1F在KK-1生物合成,每个基因的缺失突变体生成和KK-1生产力评估。每个基因的质粒几乎相同的设计,用于删除kk1F构造,这些质粒被限制性内切酶和转化为线性化c . clavatabaua - 2787CcpyrG删除病毒(补充数据S3、S4)。因此,转化株,被证实是homokaryons删除目标基因得到每个基因缺失菌株。

每个突变的KK-1生产然后测量使用文化的7天(图9)。完全迷失在KK-1生产kk1B删除应变,在四个删除病毒(kk1A,kk1D,kk1H,kk1I)是明显下降不到10%的野生型菌株相比,表明这些基因可能直接参与KK-1的生物合成。此外,在其他四个删除KK-1生产菌株(kk1C,kk1E,kk1G,kk1J)也低于野生型菌株,尽管减少的程度小于上述六个突变体。这表明这些基因并不是必不可少的KK-1合成但参与其生产在某种程度上促进或帮助生产力。

以确定是否kk1A,预测编码S-adenosyl-L-methionine-dependent甲基转移酶,参与合成KK-1 O-methyltyrosine残留物,培养基中的代谢产物kk1A删除应变进行了分析并与野生型菌株和其他集群基因缺失菌株使用质(图10)。除了高峰KK-1 (m / z = 1113 [m + H]⁺),5个化合物(a, b, c, d, e)与相应分子量KK-1 mono-demethylated代谢物(m / z = 1099 [m + H]⁺在野生型菌株(发现)图10),所有这一切都比KK-1亲水。所有这五个化合物的生产是≤KK-1的1/20,基本上每个基因缺失菌株产生它们的数量比例KK-1生产(图10 b)。然而,尽管KK-1生产kk1A删除应变是只有1/100的野生型菌株,生产复合c是保持在同一水平上的野生型菌株(图10 c),扭转KK-1复合c的相对丰度。

讨论

在这项研究中,我们的草案基因组测序c . clavatabaua - 2787和识别了71 kb的区域KK-1生物合成基因簇,由10个orf包括kk1B。的kk1B基因编码一个nrp模块化结构,符合KK-1的结构特点。此外,我们首次报道了变换系统的发展c . clavata使用AbA耐药基因光环^r这是进行了pAUR316作为耐药质粒或相应的标志pyrG基因在c . clavatabaua - 2787作为营养缺陷型的标记。也表明它是可能的修改目标地区的基因组同源重组。因此,转换系统,开发的这项工作是用来证实实验6 KK-1 10 orf至关重要的生物合成和其他人的提高发挥着重要作用。

一般来说,尤其是对细菌NRPSs出席糖基的TE域最后模块nrp已知催化水解或macrocyclization释放肽(户珥et al ., 2012;Duban et al ., 2022),但糖基的nrp编码kk1B缺乏一个TE域,而是包含了C域。已经发现许多NRPSs真菌基因组中发现含有condensation-like域(C_T域),而不是TE域在糖基,和这个领域负责肽macrocyclization (高et al ., 2012)。从这些报道,我们可以推测,在nrp编码kk1B在糖基,其C域最后模块还负责通过macrocyclization释放肽链。

编码的蛋白质,kk1F预测bZIP域,是唯一被发现的基因编码转录因子在假定的KK-1生物合成基因簇。众所周知,次生代谢物集群通常包含一条特定的转录因子,一般调节其他集群基因的表达(凯勒,2019)。锌(II)₂半胱氨酸₆型转录因子称为pathway-specific转录因子在真菌、等AflR黄曲霉毒素及其前体杂色曲霉素的生物合成的集群曲霉属真菌物种(Yu et al ., 1996;费海提和佩恩,1997;埃利希et al ., 1999)。然而,也有一些报道案件bZip-type转录因子(王et al ., 2008;高et al ., 2011),这表明蛋白质编码kk1F可能调节KK-1集群中的其他基因的表达。因此,kk1F超表达和删除病毒生成在这项研究中,我们试图分析的功能kk1F使用这些突变体。结果表明,9个基因的表达,除了kk1F合作,构成了假定的KK-1集群,由蛋白质编码kk1F(图7 b,8 b),强烈支持这些KK-1集群生物合成的基因。此外,orf (2)和orf (+ 10)位于集群的外附近,似乎也与上述九中的基因。编码的蛋白质,orf (2)显示相似几种植物病原体,但一个个蛋白质编码的orf (+ 10)显示高相似性GDP-mannose转运蛋白(表1)。尽管他们参与KK-1生物合成是不清楚单从这个信息没有被实验证实在这份报告中,这两个基因是位于两端的KK-1集群可能严格参与KK-1生物合成。

四个orf KK-1集群中,kk1A,kk1D,kk1H,kk1I,可能包含KK-1结构形成所需的基因功能,因为每个缺失突变体的KK-1生产力与野生型菌株相比显著降低(图9)。特别是三个成分残留KK-1以来,D-lactic酸,L-pipecolic酸,O-methyl-L-tyrosine,无法合成的酶域nrp编码kk1B孤独,是假定一些上述四种基因负责这些残留的生物合成。

在合成循环depsipeptides NRPSs条款,有已知的情况下,某一个域识别和整合了一个α-hydroxy羧酸之前合成的一些酶,而不是一种氨基酸。在这种情况下,一个循环depsipeptide,酯键,释放通过环化肽链的羟基组的α-position残渣作为亲核试剂的终端模块nrp。循环depsipeptide beauvericin的生物合成,由昆虫病原真菌白僵菌bassana,第一个模块的一个域nrp编码的bbBeas基因识别和激活D-α-hydroxyisovaleric酸。这D-α-hydroxyisovaleric酸是合成缬氨酸分解代谢或丙酮酸代谢NADPH-dependentα-ketoisovalerate还原酶,编码的kivr基因,位于上游和毗邻bbBeas(徐et al ., 2008)。本实验证实了使用kivr基因敲除菌株(徐et al ., 2008)。的循环depsipeptide缬氨霉素抗生素产生的链霉菌属tsusimaensis写明ATCC 15141包含D-α-hydroxyisovaleric酸和L-lactic酸残基,两者都是可能由域内激活相应的模块的NRPSs编码vlm1和vlm2(程,2006)。这些残留的合成可能不是来自独立的酶但推测涉及NRPSs发生的不寻常的酶域(程,2006)。编码的蛋白质,kk1HKK-1集群包含特定2-hydroxyacid D-isomer脱氢酶的催化域和具有较高的同源性D-lactate脱氢酶(表1)。这种酶功能促进可逆丙酮酸转化为乳酸,它可能参与D-lactic酸的合成,组成残渣KK-1 (图11 b)。KK-1生物合成中,它被认为是第一个模块的一个域(nrp编码的kk1B)第一次激活免费D-lactic酸,合成D-lactate从丙酮酸脱氢酶编码的kk1H,然后纳入卡式肺囊虫肺炎域相同的模块(图11)。经过一系列的肽伸长反应合成前体肽链,环化的羟基组D-lactic酸作为亲核试剂nrp推测发生在最后一个模块,导致depsipeptide酯键的形成。

L-pipecolic酸,KK-1成分残留,biosynthesized赖氨酸,和一些微生物的生物合成途径已确定(他,2006)。一个是直接的通路biosynthesizes L-pipecolic酸赖氨酸赖氨酸cyclodeaminase催化的。编码的蛋白质,rapL发现雷帕霉素生物合成基因簇的与et al ., 2006)和编码fkbL的生物合成基因簇中找到他克莫司(Motamedi Shafiee, 1998)是已知参与的合成赖氨酸cyclodeaminase pipecolic酸残留。以下其他途径也知道:自发生成的醛的环化脱氨基作用的α-position赖氨酸或消除ϵ-amino组通过saccharopine作为代谢中间物按照赖氨酸代谢途径,导致P2C(Δ¹-piperideine-2-carboxylate)或P6C(Δ¹分别-piperideine-6-carboxylate)。这些进一步减少特定酶生成L-pipecolic酸(他,2006)。P6C通路,也有直接从赖氨酸已知的情况下,生成P6Cϵ-aminotransferase (他,2006)。它已经表明,减少P6C L-pipecolic酸微生物至少部分由pyrroline-5-carboxylate催化还原酶(藤井裕久et al ., 2002),它是普遍存在于几乎所有的生物和负责Δ的转换¹-pyrroline-5-carboxylate L-proline作为最终L-proline生物合成反应(一张,Verma 1993;Csonka莱辛格,2007年)。循环的四肽apicidin F,由一个已知的组蛋白脱乙酰酶抑制剂镰刀菌素fujikuroi,pipecolic酸的生物合成渣实验证实涉及APF3基因编码pyrroline-5-carboxylate还原酶,在生物合成基因簇(Niehaus et al ., 2014)。编码的蛋白质,kk1I在KK-1生物合成的集群显示高序列同源性pyrroline-5-carboxylate还原酶(表1),这表明这是一个重要的基因合成的L-pipecolic KK-1残酸(图11 b)。因此,据推测,P6C,生成的赖氨酸的代谢中间物,转化为L-pipecolic酸的催化pyrroline-5-carboxylate还原酶,编码的kk1I,然后它被认为和合并nrp第二模块的一个域,即编码kk1B(图11)。

的kk1A基因预测编码S-adenosyl-L-methionine-dependent甲基转移酶基于序列信息和守恒O-methyltransferase域(表1)。S-adenosyl-L-methionine-dependent甲基转移酶可以从S-adenosyl-L-methionine转移一个甲基,普遍甲基供体细胞,等亲核受体C、O, N,或年代,它们参与甲基化在次生代谢产物的生物合成(Roje 2006)。skyllamycin的生物合成,由循环depsipeptide链霉菌属sp。学报2897年和O-methyltyrosine残渣,它已经表明,集群生物合成的基因sky37(编码S-adenosyl-L-methionine-dependent甲基转移酶)负责的O-methylation酪氨酸作为一个自由氨基酸活化前的相应的域作为aminoacyl-AMP nrp (Pohle et al ., 2011)。同样,在KK-1,我们假设kk1A负责O-methyl-L-tyrosine残留的合成。为了说明这一点,文化野生型菌株的代谢产物和每个应变与集群基因缺失比较(图10)。结果表明,每个应变的文化中提取包含至少五个代谢产物(化合物a, b, c, d, e),可能是mono-demethylated KK-1形式,基本上所有的生产不到把KK-1的数量。相比之下,kk1A删除应变,只有生产的化合物与野生型菌株c是不变,尽管KK-1的生产力是野生型菌株相比显著降低。KK-1包含六甲基化氨基酸残基:三N-methyl-L-Val N-methyl-L-Asp之一,N-methyl-L-Ile,和O-methyl-L-Tyr,五N-methylated氨基酸是合成了相应的nrp nMT域的功能。如果mono-demethylated代谢物中发现的文化精华c . clavatabaua - 2787菌株是副产品,由于低的合成unmethylated氨基酸的识别和结合每一个域,这应该激活甲基化氨基酸、复合c是脱甲基KK-1 O-methyltyrosine残渣的形式。换句话说,而删除kk1A阻止酪氨酸O-methyltyrosine和自由的转换,因此,KK-1的合成,并没有影响正常unmethylated酪氨酸的整合模式的一个域nrp第十模块,应该对应于O-methyltyrosine残渣。因此,复合c可能是不变的生产力与野生型菌株。这些结果强烈表明,细胞内酪氨酸pre-converted O-methyl-L-tyrosine O-methyltransferase功能,编码的kk1A(图11 b),由域识别和结合nrp第十模块、编码的kk1B(图11)。

四个orf KK-1集群中,kk1C,kk1E,kk1G,kk1J,被认为是参与KK-1生产以某种方式通过促进或帮助生产力,因为他们KK-1生产力维持在一定水平,尽管它是低于野生型菌株(图9)。的kk1E234个基点的基因是一个假定的基因编码一种蛋白质的小分子量8.1 kDa,显示高同源性n端序列已知的GDP-mannose转运蛋白(表1)。每个应变的RNA-Seq数据表明,尽管转录的kk1E观察轨迹,测序读只能从5 'utr映射到该地区大约160英国石油下游的起始密码子(数据未显示),这表明其3 '末端不转录。它是可能的kk1E不是从这个轨迹的功能基因和转录调节某些基因的表达,参与KK-1的生产,如非编码rna。编码的蛋白质,kk1G预计是一个磷酸腺苷磁带(ABC)转运蛋白(表1),包括两个跨膜域和两个nucleotide-binding域。因为这与其他集群基因通过基因调控kk1F编码转录因子,它可能作为KK-1-specific运输车,负责KK-1产生的细胞外的流出。转运蛋白的功能是假定对KK-1但赋予自我耐受性kk1G删除对真菌生长没有影响(数据没有显示)。也认为KK-1的积累在细胞流出系统由于缺乏会导致集群基因表达的抑制但KK-1的最终产品kk1G删除病毒只有20 - 30%低于野生型菌株(图9)。这些发现表明,蛋白质编码kk1G扮演一个角色在促进KK-1流出。这类似于ABC转运蛋白基因的功能,sirA在真菌毒素的生物合成基因簇sirodesmin,植物病原体产生的Leptosphaeria maculans(嘉丁纳et al ., 2005)。也有可能有另一个流出系统外KK-1集群,例如atrD,编码一个ABC转运蛋白功能的多重耐药因素Aspergillu nidulans(安德拉德et al ., 2000)。编码的蛋白质,kk1J预计属于α/β-hydrolase总科,并包含了搜索显示,它包含thioesterase守恒的域(表1)。这样thioesterases单独呈现的次生代谢产物的生物合成基因簇称为II型thioesterases(告诉;Kotowska·鲍里克,2014)我thioesterase区别类型,将其集成到酶复合物如nrp和酮化合物合酶(PKS)释放合成产品(户珥et al ., 2012;Duban et al ., 2022)。虽然在大多数情况下,告诉并不是必不可少的相应的次生代谢产物的生物合成,它们被认为是重要的高效生产,因为他们的角色在纠正所合成的产品nrp和繁荣正义党(施耐德和Marahiel, 1998;泽et al ., 2002;Kotowska·鲍里克,2014)。众所周知,酰基残留,不正确地加载到卡式肺囊虫肺炎域块随后肽链伸长,导致模块的中断函数nrp但告诉可以删除它们的水解来恢复正常的模块函数(泽et al ., 2002;叶et al ., 2004)。因此,KK-1生物合成的,告诉编码kk1J可能是参与肽链合成的纠正机制。

目前,尚不清楚如何去做kk1C和kk1D参与KK-1的生产。特别是,蛋白质编码的功能kk1D完全是未知的,因为没有类似的蛋白质与已知函数,但它的作用是非常有趣的,因为它被认为是必不可少的KK-1生物合成基于删除应变KK-1生产率(图9)。

虽然进一步研究文化的代谢物在每个基因缺失或超表达突变需要更精确地了解函数的10个orf KK-1集群被发现,据透露,他们至少在某种程度上参与KK-1生产。主管Yoshimi et al。(2018)成功地KK-1的异种的生产米曲霉八的这10个orf(除了kk1F的特定的转录因子,它编码KK-1通路,和kk1E,这可能不是一个基因)都介绍的控制下maltose-inducibleamyB启动子。这提供了进一步的支持,这些基因是KK-1生物合成所必需的。这些结果表明,有效的生产KK-1可能通过适当的学习不同的主机和利用合成生物学方法构建代谢途径,适合KK-1生产在这些主机。在这项研究中,c . clavatabaua - 2787突变体中kk1F过表达的控制下Ccnmt1子显示大约两倍KK-1生产野生型菌株经过7天的培养。因此,这表明启动子表达的进一步优化kk1F可能导致KK-1大幅提高生产率。因此,成功识别KK-1生物合成基因簇使得不同方法对未来实现KK-1的大规模生产。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/LC371755,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83956.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83957.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83958.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83959.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83960.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83961.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83962.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83963.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BBC83964.1,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,BBC83965.1。

作者的贡献

SY、TF卡,MM和KK的构思和设计实验。SY、TF和TK真菌的基因组序列。SY和TF进行建设的真菌菌株。SY执行必要的实验和分析数据。μ分析数据。SY, AY, KA和KK写道。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

本研究委员会的支持下发展人工基因合成技术用于创建创新的生物材料,日本经济,贸易和工业。

确认

我们感谢博士五郎毡帽的技术支持基因发现和秋田犬Konno有限公司有限公司提供的真菌菌株。

的利益冲突

作者SY, TF, KK受雇于Kumiai化工有限公司有限公司和TK受雇于Fermlab Inc .)

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/ffunb.2022.1081179/full补充材料

引用