基准测试一个快速和简单的现场检测试验的橡树枯萎病菌Bretziella fagacearum
艾米莉Bourgault
1 __,
Marie-Krystel附近
1 __,
天使爱美丽波特凡1,唐•斯图尔特1,
Karandeep查哈尔
2,
Monique l . Sakalidis
2、3和
菲利普Tanguay
1 *
- 1加拿大自然资源,加拿大森林服务,劳伦林业中心,魁北克,加拿大的QC
- 2植物、土壤和微生物科学,密歇根州立大学东兰辛,MI,美国
- 3林业部门、密歇根州立大学东兰辛,MI,美国
橡树枯萎是橡树的血管疾病引起的真菌Bretziella fagacearum。一旦感染,树木会死在几个星期。尽管这种疾病目前只发现在美国,据报道只有几百米内Canada-USA边界。限制的建立和传播橡树枯萎在加拿大,一个现场的发展,快速和可靠的检测方法b . fagacearum是至关重要的。在这项研究中,我们开发和验证一个新的qPCR TaqMan®检测能够检测b . fagacearum在实验室环境中以极大的特异性和敏感性。使用这个测试作为参考,我们也开发和验证一个新的DETECTR试验检测b . fagacearum从各种环境样品在1 h,菌丝体垫和昆虫等,使用最小的实验室设备。虽然仍有一些局限性的敏感性分析,我们相信它的易用性、灵活性和准确性将提供一个重要的工具在努力减少橡树枯萎的传播。
1介绍
橡树枯萎是橡树的血管疾病(Quercusspp)由真菌引起的Bretziella fagacearum,以前被称为长喙壳属fagacearum(啤酒et al ., 2017)。在1940年的第一次描述了(1944年亨利,;亲眼见识,1953),疾病症状出现后,病原体进入边材和扰乱了木质部船只,因此防止水和养分运输(1980年法国和Stienstra)。受影响的树木最终死亡,有时在短短几个月的感染。例如,红橡木(部分Lobatae)非常容易受到疾病和可以在几周内死亡,永远改变城市景观,种植园和自然生态系统(吉布斯和法国,1980年)。
分散的b . fagacearum健康的树木发生地下和地上的传播。地下传播涉及的运动b . fagacearum通过天然根移植和占短距离传播和创造扩大橡树枯萎的口袋。根的连接木质部血管移植让真菌从受感染的树邻近健康的橡树。地上发生传播主要是通过孢子传播通过昆虫,主要由露尾甲物种(sap甲虫)等Colopterus truncatus和Carpophilus sayi(停止Juzwik, 2001年)。Sap甲虫被芳香吸引形成孢子真菌垫子上形成树皮裂缝橡树的树干枯萎死亡树木或垫轴承柴火(Juzwik et al ., 2008)。之后他们可以传播孢子受伤健康树木,600米一年内(Shelstad et al ., 1991)。
目前,橡树枯萎病是只发现在德克萨斯州,在美国中西部和东部州(农业部林服务北部研究站,和森林健康保护,2019年很多年前),这是潜在的介绍(Juzwik et al ., 2008)。然而,有一个持续的向北传播的疾病,与越来越多的感染县报告Canada-USA边界(Jensen-Tracy et al ., 2009)。
世界上现有的200种橡木,只有10可以在加拿大,主要位于加拿大安大略省和东部(Lacoursiere 2015)。它们包括物种从红橡木,白橡树(部分Quercus)和栗子橡树(部分Quercus),他们都容易b . fagacearum感染不同层次(吉布斯和法国,1980年;OWTAC 2019)。
随着气候变化的发展,昆虫能携带真菌越过边境,最终蔓延到加拿大东部,面积现在气候上适合b . fagacearum和许多潜在的向量。事实上,安大略省南部的气候已经找到适合b . fagacearum,c . truncatus,c . sayi(小贩et al ., 2020)。此外,尽管监管措施已经到位,橡树要进入加拿大的交通污染日志(CFIA 2020)。橡树枯萎的传播到加拿大可能导致大规模死亡的城市树木,自然生态系统的破坏,可能会削弱橡树日志行业,CDN的估计经济损失4亿美元(小贩et al ., 2020)。
自不可能治愈感染树,橡树枯萎的管理重点是防止进一步传播,包括建立根嫁接壁垒和海沟插入、删除潜在产孢的树木,预防注射杀菌剂,柴火不同地区之间交通禁令和限制橡树受伤活动的特定时期(O ' brien et al ., 2000;威尔逊,2001;科赫et al ., 2010)。欧盟也收紧限制交易与树皮从美国橡木原木(欧洲食品安全署et al ., 2020)。对于这些努力成功,快速确认感染是至关重要的。
病树初步可以确定由于枯萎的叶子和落叶。不幸的是,这些早期症状是常见的其他非生物和生物问题,如橡树叶子泡和干旱(加拿大自然资源[NRCAN], 2015;摩尔et al ., 2022)。因此,实验室的识别b . fagacearum从有症状的植物样品需要确认橡树枯萎。需要实验室确认导致延迟实施减缓措施和增加相关费用。b . fagacearum可能出现在日志或柴火从橡木树枯萎死亡,也可以坚持减少病树的根系多年和被忽视(Juzwik et al ., 2008)。需要开发一个现场,快速和可靠的检测方法b . fagacearum现在是越来越紧迫为了限制橡树枯萎的建立和传播。
实时定量PCR (qPCR)已成为黄金标准的病原体检测在许多领域,包括病原体侵入性外来树,促进无穷小的目标DNA的检测在大量的环境材料(Heid et al ., 1996)。然而,尽管qPCR高度特异、敏感,它是耗时的,昂贵的,需要专门的设备,例如、实时PCR机器和技术专长。一直努力使小型化的设备,以及各种公司商业化便携式实时PCR仪器像富兰克林™Biomeme(美国Biomeme、费城、PA),促进即时检测。在最近的一项研究中,富兰克林™机器,被证明可靠地探测森林害虫和病原体等Sphaerulina musiva,疫霉的大量,Lymantria dispar,柱锈菌属sp.领域(卡普纶et al ., 2020)。其他研究也表明分子检测现场使用各种便携式机器和样本类型(布朗et al ., 2020;Zowawi et al ., 2021)。这些便携式机器是健壮的,允许多路复用和还可以使用以前开发的lab-validated化验(卡普纶et al ., 2020)。然而,价格在10美元0000,便携式实时PCR机的成本可以阻碍它的部署。
近年来,一种新的技术重组酶聚合酶放大(战)开发,可以成倍地放大DNA目标与敏感性,特异性和可靠性与标准的聚合酶链反应(Piepenburg et al ., 2006)。战反应利用重组酶的活性蛋白质绑定到寡核苷酸引物和扫描的双链DNA互补序列。然后再插入引物的重组酶通过链交换,,带着一长串DNA结合蛋白结合取代链稳定循环。引物的聚合酶可以启动聚合如果目标序列。公司像TwistDx包装战反应非常方便冻干管,使技术更加容易(TwistDx,剑桥,英国)。则是快速和在一个恒定的低温工作,两个特性使这种技术高度理想的户外部署以来,使用一个简单的热块现在可以考虑。战已被用于病毒的快速检测(欧拉et al ., 2012 a;博伊尔et al ., 2013;杨et al ., 2017)、细菌(欧拉et al ., 2012 b;艾哈迈德et al ., 2014)和真菌(艾哈迈德et al ., 2015;Karakkat et al ., 2018)。
它最近被证实,则可以结合CRISPR / ca技术导致了不同的检测方法。DNA endonuclease-targeted CRISPR反式记者(DETECTR)是这些新检测方法之一。DETECTR使用狙击枪的酶结合Cas12a酶从集群定期中间短回文的重复序列(CRISPR)平台(陈et al ., 2018)。这个创新的检测工具利用了抵押品反式-将分裂活动的激活Cas12a, dsDNA目标序列的识别,打通ssDNA流感在多个随机的网站。通过添加修改ssDNA记者在反应中,一个积极的信号。,the presence of the original target DNA sequence, can be detected by various methods, such as lateral flow assays or fluorometry (陈et al ., 2018)。DETECTR化验已经被用于各种病原体的检测和/或诊断和癌症(Arora et al ., 2020;Zhang et al ., 2020),其中最显著的是betacoronavirus严重急性呼吸系统综合症(SARS) -CoV-2 (布劳顿et al ., 2020;丁et al ., 2020;露西娅et al ., 2020)。最近也有类似的化验测试,在较小程度上,细菌和病毒的植物疾病(罗et al ., 2021;辛格et al ., 2022)。
因此本研究旨在开发和验证一个DETECTR试验针对内部转录间隔区(ITS)基因的fagacearum。这个检测的特异性和灵敏度测试进行评估和比较新设计qPCR TaqMan®分析各种环境样品的类型,即菌丝体的垫子和昆虫样本。小组的参与者也用于优化DETECTR试验现场部署。我们希望未来实现检测的测试与植物检疫检查人员和其他最终用户将有效地限制橡树枯萎的传播在加拿大和美国。
2材料和方法
2.1隔离,DNA提取和样品制备
DNAb . fagacearum和密切相关的物种从先前发表的研究中获得(Lamarche et al ., 2015)和上市补充表1。确认所有样品的物种的身份,其基因,被认为是普遍的真菌DNA条形码(Schoch et al ., 2012),是放大和测序。一个genus-specific SYBR Green-based qPCR试验(表1)在其基因的保守区域设计执行绝对量化(拉特里奇,2011)所有的菌株和规范他们的浓度在必要的时候。
表1。引物和探针用于genus-specific qPCR SYBRGreen,特有的qPCR TaqMan®,DETECTR化验。
新鲜的文化b . fagacearum从木材各种感染的组织也被孤立Quercus种虫害在密歇根半岛2020年低。隔离是生长在酸化马铃薯葡萄糖琼脂(PDA;Difco™,火花,医学博士,美国)在室温下2周,hyphal-tip净化。一毫升的乳酸,85%(美国新泽西州Phillipsburg JT Baker)被添加到1 l的PDA。菌丝体收获,在液态氮冷冻,用研钵和研杵。随后的DNA提取跟踪之前描述的协议(Parada-Rojas Quesada-Ocampo, 2018)。所有样品都是量化使用SYBR绿色分析和列出补充表1。
2.2小说有针对性TaqMan®基于实时PCR试验设计
基准DETECTR化验,我们首先开发了一个TaqMan®基于实时PCR分析。共有37发表的序列b . fagacearum和密切相关的物种是一致的(补充文件2)。一组引物和探针被设计在展示区域b . fagacearum特殊核苷酸多态性。所有引物设计使用标准和放大描述之前描述的条件下进行Lamarche et al . (2015;表1)。积极的(使用b . fagacearum从纯培养分离C520 DNA,补充表1)和消极的(没有DNA模板)控制被包含在所有qPCR运行。
2.3小说有针对性DETECTR试验设计
执行DETECTR试验用狙击枪放大真菌DNA TwistAmp基本设备(TwistDx,剑桥,英国),和LbaCas12a(美国新英格兰生物学实验室,MA) DETECTR试验的一部分。战引物(IA集成DNA技术Inc .)、珊瑚镇,美国)改编自TaqMan®qPCR化验后TwistAmp基本设备手册和中列出表1。实现放大一些修改制造商的指示。短暂,每个反应是准备使用29.5μL TwistAmp补液缓冲区,2.75μL正向和反向引物(10μM)和10.8μL nuclease-free水。混合物被用来resuspend提供的反应颗粒TwistAmp基本装备。然后,1μL DNA模板和3.2μL 280毫米醋酸镁的添加在最后一卷50μL。管很快被漩涡和孵化37°C 20分钟,其次是失活10分钟的65°C。
LbaCas12a (Cas12aLachnospiraceae细菌ND2006)反式-乳沟试验进行类似于那些先前描述(陈et al ., 2018;Zhang et al ., 2020)。Cas12a目标序列选择根据Lba Cas12a PAM的存在(TTTV) (Zetsche et al ., 2015)。指导RNA和ssDNA FQ-reporter中列出表1从内和设计建议(美国新英格兰生物学实验室,马)以及之前的研究(Zetsche et al ., 2015;Zhang et al ., 2020)。都被命令从DNA集成技术(美国IA IDT公司,珊瑚镇)。DNA检测的目标通过荧光,Cas12a消化反应是准备使用1 x NEBuffer 2.1, 50 nM LbaCas12a 50 nM指导RNA和250 nM FQ-reporter 60μL在最后一卷。在室温下混合是pre-incubated 10分钟。然后,6μL unpurified战产品添加到反应和转移到96 -黑色optical-bottom板(美国马热费希尔科学)。荧光测量在37°C每5分钟1 h(激励:485 nm,排放:535海里)使用Fluoroskan提升板读者(Labsystems)。
2.4验证的特异性和灵敏度qPCR TaqMan®分析
验证新设计的特异性qPCR TaqMan®为b . fagacearum31日,我们跑一式三份的测定b . fagacearum菌株从纯粹的文化以及一组密切相关的物种(部分“纯文化的DNA,”补充表1)。密切相关的物种的DNA样本标准化约5000册,SYBR绿色化验。因为高DNA浓度已知有时抑制放大,我们想要确保,如果样品没有检测到,这将是由于试验的特异性,而不是因为潜在的抑制。
为了评估的灵敏度qPCR TaqMan®分析,我们建立标准曲线用连续稀释b . fagacearum其合成DNA的目标序列,计算的极限检测(LOD),这是最小的数量能被探测到的目标DNA与试验(95%的时间参赛et al ., 2009)。简单地说,系列稀释10倍b . fagacearum它的副本由gBlocks™基因片段(美国珊瑚镇,IDT公司IA)组成的b . fagacearum它的序列,包括两个TaqMan®分析引物(表1)(ref基因库:KC305152.1)。每个稀释的浓度使用TaqMan计算®引物和SYBR绿色试剂。的qPCR TaqMan®试验在每个稀释一式三份,然后运行一个标准曲线绘制得到的Ct值对日志的副本数量的价值。LOD决心通过运行20复制的最小的稀释标准曲线给3积极的结果。
2.5两种提取DNA的方法使用效率qPCR TaqMan®分析
评估两个DNA提取方法的效率,标准曲线也使用DNA提取2协议的串行稀释b . fagacearum分生孢子。分生孢子的悬架是由日益孤立MIFCC41酸化PDA在室温下2周(查哈尔et al ., 2019)。分生孢子被洪水收获纯文化,70%的乙醇,紧随其后的是两个过滤使用的双层Miracloth (EMD微孔,Miracloth Billerica,妈,美国)。分生孢子的浓度的悬架决心使用血细胞计数器(6.18×107分生孢子每毫升)。分生孢子被镀到酸化PDA确认non-viability,离心沉淀,然后发送到Tanguay实验室劳伦林业中心,加拿大。分生孢子被resuspended 1毫升无菌蒸馏水,分解通过不断推动他们通过24-gauge针和血细胞计数器的计数。浓度调整到10E6分生孢子/ mL,和股票的解决方案是稀释后的一系列10倍稀释在水里,每毫升1000分生孢子。整除的10μL每个浓度使用SpeedVac干,然后提取使用两种不同的方法。首先,加速和促进现场检测过程中,样品沉浸在100μL QuickExtract™植物DNA提取解决方案(美国WI强光油灯),立即就被加热到65°C 6分钟,其次是98°C 2分钟。提取样本存储在−20°C到使用。作为对比,我们也从分生孢子中提取DNA稀释使用QIAamp DNA微工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的建议。的qPCR TaqMan®试验是在一套分生孢子稀释和运行得到的标准曲线绘制的Ct值对日志值分生孢子的数量。
2.6 DETECTR和TaqMan的性能®在环境样品qPCR化验
我们跑DETECTR随着qPCR TaqMan®(一式三份)在同一样品材料的来源是否会影响性能的测定。所有环境样品的列表,和他们的起源,用于验证我们的新分析,所示补充表1。DNAb . fagacearum菌丝团样本,从发展阶段0到5 (查哈尔et al ., 2021)提取200μL QuickExtract™植物DNA提取解决方案(强光油灯,威斯康辛州,美国)。各种昆虫携带的DNA样本b . fagacearum孢子(Carpophilus sayi,Epuraea corticina,Glischrochilus sanguinolentus)获得Lamarche et al。(2015)。与其他昆虫样本没有携带DNAb . fagacearum孢子也包括确保的特异性测试(Bergeron et al ., 2019)。
2.7适应DETECTR协议现场部署
为了方便现场部署DETECTR试验,进行了一些修改来简化其使用实验室以外的设置(图1)。最值得注意的是,每一步的协议进行超小型电子管的一个特定的颜色,孵化时间减少到最小和反应是冻干。使用强光油灯缓冲区的DNA提取步骤和上面描述的一样,除了只有100μL prealiquoted缓冲区的红色超小型电子管。战反应组件(TwistAmp补液缓冲区,正向和反向引物,MgOAc ddH2O)整除绿色超小型电子管的5%海藻糖。Cas12a消化反应是在蓝色的超小型电子管组装一些修改:反应是准备在最后一卷50μl FQ-reporter浓度增加到500 nM和5%的海藻糖是补充道。狙击枪和Cas12a反应是冻干隔夜−50°C FreeZone 2.5升冷冻干燥器中脱(Labconco,堪萨斯城,密苏里州,美国),储存在−20°C到使用。
图1所示。总结新和简化现场DETECTR化验。放大目标DNA的狙击枪,和检测反式-乳沟释放的荧光ssDNA FQ-reporter后CRISPR / CAS12a识别目标的DNA。每一步执行在一个特定的颜色的超小型电子管。所有液体处理完成通过一个简单的转移吸管。试剂在室温下稳定或之前冻干方便的部署测试。执行测试所需要的设备很小,便于携带到田野。协议的完整描述是可用的补充文件3。
在使用之前,每个区域规划和Cas12a冻干反应管与水(约水化。48μL或3滴)使用1.5毫升扩展细尖转移吸管(Samco™细尖转移吸量管,231 pk,热费希尔科学,妈,美国)。一小块菌丝体垫插入红色超小型电子管包含QuickExtract™缓冲区,然后样本孵化在65°C 6分钟,其次是2分钟98°C的便携式mini16热循环(miniPCR生物、剑桥、马、美国)。使用相同的传输吸管,提取的DNA是稀释10倍时转移到绿色的超小型电子管。整个绿色超小型电子管的内容被用来再水化TwistAmp基本工具包提供的战反应颗粒(TwistDx,剑桥,英国)。样本在37°C孵化10分钟没有进一步的失活。(约战反应的一部分。8μL)然后转移到蓝色的超小型电子管。样本在37°C孵化20分钟,和荧光与多样的可视化™分子荧光查看器(miniPCR生物、剑桥、马、美国)。每个样本的荧光比较消极的控制,这是运行试验。 The complete protocol for the on-site DETECTR assay is illustrated in图1和上市(补充文件3)。
2.8人体试验来验证简化DETECTR化验
评估的困难水平实现DETECTR现场试验与non-laboratory终端用户,我们组织了一个实验组成的22个具有各种背景的志愿者(从非科学基本/先进的实验室技能)。每个参与者都有详细的现场版本协议事先阅读(补充文件3),从DNA提取荧光读出。示范以及澄清了当天的审判。总共3个随机样本(真菌垫积极或消极真菌)以及负面的(没有模板)DNA控制给出了每个志愿者。参与者被告知要使用现场DETECTR试验检测的存在b . fagacearum在他们的样品。完成各种参数进行调查,包括时间和结果的准确性。提出改进和建议从参与者也被认为是在设计最后的书面版本简化现场协议(补充文件3)。
2.9统计分析
分析了使用R (R核心团队,2014年),RStudio (R工作室团队,2018年)。代表之间的关系的标准曲线,结果(Ct值)和预测(其副本或提取的分生孢子的数量)被简单回归使用评估lm函数在R统计软件包。
DETECTR的性能试验与qPCR引用通过构造为每个类型的样品混淆矩阵。python包pycm(Haghighi et al ., 2018)是用于生成表和计算精度。都使用了统计比较mcnemar检验法的函数statsmodels包(Seabold Perktold, 2010)使用默认参数。
3的结果
3.1设计和验证一个新的b . fagacearum黄金标准qPCR TaqMan®分析
我们首先设计一个新的qPCR TaqMan®分析专门检测b . fagacearum而且还作为一个参考我们的新分子DETECTR化验。使用密切相关的物种中列出补充表1(参见“纯文化”的DNA的一节),我们的数据显示只放大b . fagacearumDNA。没有任何姊妹物种隔离放大,使这个新qPCR TaqMan®分析识别特定的100%b . fagacearum其他密切相关的物种之间的选择。值得注意的是,一些非常高度集中的DNA样本纯文化必须先被稀释可以被探测到,很可能由于抑制剂的存在或DNA浓度太高了。尽管如此,放大结果成正比的DNA样本中。
然后,我们评估的敏感性qPCR TaqMan®分析并计算其LOD。首先,我们跑在一式三份分析系列稀释gBlocks™的基因片段。标准曲线绘制得到的Ct值对日志值数量的副本显示了一个平方校正系数(R2)的0.98和LOD 2份(图2一个)。重新运行的LOD决心最后稀释20倍给3阳性检测结果,给予积极的检测18/20运行。在所有情况下,Ct值成正比的量模板DNA用于qPCR反应。
图2。灵敏度的新qPCR TaqMan®检测测试b . fagacearum和比较的DNA提取方法。Ct值获得运行qPCR TaqMan®分析策划反对的日志值的副本(gBlocks™基因片段)和分生孢子。方程系数R2是显示在图。(一)新设计的LOD qPCR TaqMan®分析其副本(gBlocks™基因片段)2份。(B)比较新的qPCR TaqMan®检测测试(黑)和旧qPCR TaqMan®微软目前地区设计(灰色)检测b . fagacearumDNA提取不同的分生孢子量使用强光气柜(圆圈点)和QIAamp(三角形点)程序。
3.2比较DNA提取方法使用qPCR TaqMan®分析和以前设计的分析
试验也运行在两个系列稀释的分生孢子DNA提取QIAamp和强光油灯DNA提取试剂盒。图2 b显示了标准曲线得到,R2从0.93到0.95不等。两个DNA提取方法的区别显然是由3.4 Ct显示向上与强光油灯的方法,使其少大约10倍比QIAamp敏感的方法,但容易部署。
同时,设计时另一个目标b . fagacearum其qPCR TaqMan®化验是取代之前qPCR检测化验,我们实验室已经开发和出版于2015年(Lamarche et al ., 2015),而具体,缺乏敏感性。前面的检测分析目标转录延长因子1 a(微软)基因,而不是它的地区。图2 b显示了两个检测化验使用比较上述两个DNA提取方法。显然在图上可以看到,确认我们的新结果b . fagacearumqPCR分析使我们获得调低速档6.6 Ct (QIAamp提取),它对应于一个97倍增加灵敏度,当运行在分生孢子稀释。这个结果预计因为微软是单拷贝基因,而它是多拷贝。敏感性的增加表明b . fagacearum基因组拥有大约100册的核核糖体DNA。
3.3设计和验证的新分子DETECTR化验
DETECTR试验的特异性评估相同的姊妹物种隔离使用qPCR TaqMan®试验(见“DNA来自纯文化”,补充表1)。这个新的分子测试并不意味着是量化的,因此只决定如果样本是“积极的”或“消极的。“至于我们qPCR TaqMan®化验,DETECTR测试只给了一个积极的结果b . fagacearum密切相关,而其他物种出现负后荧光板的读者阅读。因此,新的DETECTR测试特定的100%b . fagacearum根据物种的面板测试。
估计这个非量化的敏感性测试,我们在各种跑它b . fagacearum样本类型可能是自然环境中发现,例如,真菌垫和昆虫携带病原体的孢子(见样本补充表1)。我们也调查了分生孢子稀释组与试剂盒法提取,以及来自纯文化的DNA样本(补充表1)。图3代表一个散点图比较敏感的qPCR TaqMan®和DETECTR化验样本类型的总和。结果表明,DETECTR化验不跨越相同的探测范围的参考qPCR TaqMan®化验。所描述的参赛et al。(2009),灵敏度是指样品中最小数量的副本,可以测量准确测定,通常表示为LOD。虽然我们没有预定义的副本上运行DETECTR试验我们的qPCR TaqMan®化验确定LOD,策划从这项研究中所示的所有数据图3表明DETECTR测试敏感1000倍小于qPCR TaqMan®化验。如上所述,LOD只是依赖目标拷贝数,我们能够获得的所有类型的样品。然而,样品类型和DNA制备影响样品中目标存在副本的数量。
图3。比较qPCR TaqMan®当检测各种样品类型和DETECTR化验敏感性。这里的散点图中表明的检测下限DETECTR测试远高于qPCR TaqMan®。
为了进一步验证和比较我们的新DETECTR化验qPCR参考,我们看着各自的这些样本的检测结果。补充表1显示了相同的结果与测试样本,和表2总结了使用混淆矩阵的结果比较。对化验结果完全相同的DNA在调查从纯粹的文化和病媒昆虫的DNA,用积极和消极的结果完美匹配,在这两种情况下给一个精度1。在混乱的表,所有正确的预测的准确性表示数量除以总数量的数据集。因此,最好的情况是一个1和准确度的确显示了纯这里DETECTR结果DNA文化和昆虫完全匹配qPCR“参考”的结果。然而,尽管qPCR TaqMan®试验检测到一个积极的信号,每菌丝团测试,后期的DETECTR测定错过5样品,因此给5假阴性结果。这稍微降低了测试的准确性,至0.84375,但微不足道的差异(McNemar检验法精确测试,P= 0.0625)。这些垫子也晚期垫(阶段4和5),提取的DNA数量和质量的期望将低于新鲜的垫子。SYBR绿色量化的样品确实证实,很少有它的副本。因此,DETECTR测试时仍然可以被认为是一个可靠的试验应用于年轻和新鲜菌丝体的垫子。
表2。混淆矩阵显示检测测试的比较不同样品类型。
3.4评估用户友好的现场试验是如何使用一组参与者和改善它
为了方便的部署新DETECTR试验设计在这里,几个修改了原来的协议,“2.6节中描述的性能DETECTR TaqMan®在环境样品qPCR化验。“确保每个终端用户与任何体验这部小说背景可以处理现场检测试验,我们运行了一个试验结合22参与者有或没有以前的实验室经验。完成的平均时间为66.6分钟,人们有科学背景的表现略好关于花费的时间来执行测试。结果准确度的测试参与者相比qPCR TaqMan®结果显示在底部的混淆矩阵(表2)。DETECTR分析估计的准确性略高于80%的水平相比,qPCR参考。然而,共有12个假阴性和假阳性结果(从操作交叉污染)记录,降低PMcNemar检验法测试的价值低于0.05。
试验也被用来收集反馈参与者为了使现场DETECTR测试更用户友好的和容易部署。他们的建议和评论强烈影响的最终版本的协议(补充文件3)。最常见的因素和挑战所指出的参与者的措辞和命名协议(即。,replace technical terms like “microtube, resuspend, incubation,” etc. with non-scientific terms) and the manipulation of the transfer pipette. All participants agreed that performing the protocol a second time would be much easier and that mistakes would most certainly be avoided then.
4讨论
在这项研究中,我们报告一个新的领域使用DETECTR技术检测分析,可以确认的存在b . fagacearum现场在1 h。我们首先开发和验证一个传统qPCR TaqMan®试验检测具体b . fagacearum和测试新的试验时作为参考。然后我们设计和优化新DETECTR化验,基准测试我们的黄金标准qPCR TaqMan®化验。此外,我们使用一个小组的参与者从不同的科学背景估计的易于部署DETECTR使用不同的用户测试。
我们坚信,入侵森林害虫的生物监控现场将受益于DNA测试能力,因此需要开发部署、快速和可靠的检测测试。不幸的是,快速检测目前受到要求将样品发送到实验室确认。与橡木的持续传播要在美国和加拿大担忧它的引入,快速、现场检测b . fagacearum是至关重要的。
的qPCR TaqMan®分析这是特定于开发b . fagacearum,没有cross-amplification,比我们之前报道敏感试验(Lamarche et al ., 2015)。与嵌套PCR报道杨和Juzwik (2017),这种分析是定量的,允许一个目标物种的生物量负载估计在给定的样本,并且不需要放大后一步可视化结果。麦克劳克林et al。(2022)最近发表的一个非常有趣的研究,杨的double-nested PCR成功探测到橡树枯萎菌从昆虫被困在不同地点在纽约州,我们。然而,如前所述,这个方法不仅需要排序的内容事先陷阱,它还需要更多的时间比我们qPCR TaqMan®试验获得的结果。尽管如此,虽然这测试高度敏感和非常准确,它可以在实验室进行设置或使用昂贵的部署和脆弱的设备。
现场DETECTR试验设计可以从无菌检测DNA纯化文化b . fagacearum与相同的特异性qPCR TaqMan®化验。我们成功地验证了DETECTR测定环境样品的菌丝体的垫子,新鲜和旧产品,以及昆虫。尽管DETECTR试验的敏感性不如的qPCR TaqMan®测试非常古老的菌丝体垫,我们仍然认为它可以作为一个有用的工具来部署和屏幕明显症状。实际上,当前最好的方法来识别b . fagacearum昆虫是一个及时的培养方法需要2 - 4周b . fagacearum可以确认。虽然确认b . fagacearum是直接从新鲜垫(唯一的诊断标志),很难从老,衰变垫,也需要费力文化工作和显微镜。此外,由于菌丝体的垫一次开发树已被杀害b . fagacearum感染,早期检测在木材等仍然住植物组织和枯萎的树枝会增加测试的有效性,减少疾病传播和树的损失。工作已经开始在我们的实验室评估这种可能性。
此外,结果从昆虫和连续稀释的孢子清晰显示孢子负载和检测结果之间的关系。我们发现目标病原体DNA浓度低于10E4副本最常使用DETECTR时产生假阴性检测结果分析。努力增加DNA提取的数量和质量可以绕过这个限制。然而,大多数协议都是漫长的,需要更多的时间比这里的强光油灯提取方法,和需要笨重的实验室设备,如涡流或离心机,它不容易部署的领域。最近的一项研究表明,b . fagacearumDNA可以从橡树必发现感染木屑使用一个简单的碱性DNA提取过程(摩尔et al ., 2022)。其他简单的兼容性和可部署协议的报道从有症状的植物DNA提取病原体(卡普纶et al ., 2020;保罗et al ., 2020这里发达)DETECTR方法也被测试在我们的实验室。
方便和速度,易用性和降低成本的DETECTR测试,我们简化整个过程通过使用彩色管,脱水打包试剂,一次性转让滴管连同一个负担得起的电池加热块和一个简单的(见蓝色盒子补充文件3)。由此产生的工具很容易可用在任何环境中带有一个小平面。
测试参与者的面板,从来没有执行这个分析,多数人缺乏实验室经验,能够使用工具和正确识别样本作为一个积极的80%b . fagacearum目标标本或消极的非目标样本。这些结果表明,通过提供最小的植物检疫人员培训,他们可以实现非常精确的现场检测的橡树枯萎病菌。先前的调查人员精简检测仪器现场检测由最终用户(卡普纶et al ., 2020)。然而,这项研究是一种罕见的例子的准确性测试确定一组未经训练的和没有经验的参与者。我们发现评论收到小组提高了试验和相关的协议,主要是通过简化非科学人的措辞和添加一些额外的解释。
简化分析通过减少步骤的数量将进一步方便易用性和时间,但也可能增加精度(步骤导致错误更少)。目前,狙击枪的放大和Cas12a乳沟荧光ssDNA调查正在进行连续在两个不同的管。然而,最近的出版物已经成功这两个反应的试剂合成为一个管和同时进行两个反应(陈et al ., 2020;de Puig et al ., 2021)。我们测试了一步反应与纯粹的DNA陈et al。(2020)协议。在这个初步工作,荧光信号很弱,需要增加数量的DNA模板以及更长的潜伏期时间,使得该方法更适合现场快速检测(数据未显示)。
基于DETECTR检测的一个主要好处是容易设计分析组件的能力。事实上,摘要,底漆F1,用于雷达分析,包括更长的版本的底漆用于TaqMan®试验(引物延伸几个基地5′),底漆R2是相同的化验,gRNA直截了当的设计是基于PAM站点内放大区域。因此,我们相信,需要较少的努力实现从可用TaqMan DETECTR化验®化验含有歧视性的核苷酸。特别是如果引物包含目标具体的单核苷酸多态性,并与目标序列扩增包含PAM网站中的特定多态性crRNA的3′末端。另一方面,与TaqMan不同®多个检测技术、多路复用到一个反应管由于ssDNA新款是不可能的反式-RNP复杂的核酸酶活动在绑定到目标crRNA网站。
总之,我们在这个研究报告的开发和验证一个新的DETECTR试验检测的存在b . fagacearum在菌丝体的垫子和昆虫,常见的环境样品类型。这个可靠和具有成本效益的测试进行了优化现场快速部署。我们希望培训前线人如木材工业工人和植物检疫人员如何使用DETECTR领域分析将有助于防止建立橡树枯萎在加拿大和在美国减少其传播。的qPCR TaqMan®分析并行设计是可靠的,具有很高的灵敏度和自信可以用来确认结果在实验室设置。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
作者的贡献
PT、M-KG和EB设计研究。DS进行了生物信息学分析。据美联社、EB和M-KG实验室进行实验。KC收集材料。PT和EB进行了统计分析。M-KG PT起草了最初的手稿和EB的贡献,美联社,KC,女士都促成了这篇文章,作者批准提交的版本。
资金
发现收到的这个项目是通过加拿大自然资源扩大市场机会和虫害风险管理项目。KC是入侵物种通过密歇根拨款计划,密歇根州立大学项目GREEEN和福勒斯特强烈的禀赋。KC和女士都支持孵化项目MICL02505从美国农业部国家粮食和农业。
确认
我们要感谢所有22个审判的参与者进行了优化现场DETECTR协议。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/ffgc.2022.1068135/full补充材料
引用
•艾哈迈德。,Linden van der, H., and Hartskeerl, R. A. (2014). Development of a recombinase polymerase amplification assay for the detection of pathogenic leptospira.Int。j .包围。Res。11日,4953 - 4964。doi: 10.3390 / ijerph110504953
艾哈迈德,s。,Sande, W. W. J., van de, Desnos-Ollivier, M., Fahal, A. H., Mhmoud, N. A., et al. (2015). Application of isothermal amplification techniques for identification of madurella mycetomatis, the prevalent agent of human mycetoma.j .中国。Microbiol。53岁,3280 - 3285。doi: 10.1128 / jcm.01544-15
Arora, R。,Gupta, K., Vijaykumar, A., and Krishna, S. (2020). DETECTing merkel cell polyomavirus in merkel tumors.前面。摩尔。Biosci。7:10。doi: 10.3389 / fmolb.2020.00010
啤酒,z。,de, Marincowitz, S., Duong, T. A., and Wingfield, M. J. (2017).Bretziella,一个新的适应橡树枯萎菌属,长喙壳属fagacearum(Microascales子囊菌类)。Mycokeys27日-。doi: 10.3897 / mycokeys.27.20657
Bergeron蔡明俊。合,N。,Stewart, D., Tanguay, P., and Hamelin, R. C. (2019). Genome-enhanced detection and identification of fungal pathogens responsible for pine and poplar rust diseases.《公共科学图书馆•综合》14:e210952。doi: 10.1371 / journal.pone.0210952
博伊尔,d S。,Lehman, D. A., Lillis, L., Peterson, D., Singhal, M., Armes, N., et al. (2013). Rapid detection of HIV-1 Proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification.mBio4,e135-e113。doi: 10.1128 / mbio.00135-13
布劳顿,j . P。邓,X。Yu, G。,Fasching, C. L., Servellita, V., Singh, J., et al. (2020). CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2.生物科技Nat。》。38岁,870 - 874。doi: 10.1038 / s41587 - 020 - 0513 - 4
Brown, a . T。,McAloose, D., Calle, P. P., Auer, A., Posautz, A., Slavinski, S., et al. (2020). Development and validation of a portable, point-of-care canine distemper virus qPCR test.《公共科学图书馆•综合》15:e0232044。doi: 10.1371 / journal.pone.0232044
参赛,s。贝奈斯,V。,Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., et al. (2009). The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative Real-Time PCR experiments.中国。化学。55岁,611 - 622。doi: 10.1373 / clinchem.2008.112797
卡普纶,。,Stewart, D., Hrywkiw, K., Allen, K., Feau, N., Bilodeau, G., et al. (2020). In situ processing and efficient environmental detection (iSPEED) of tree pests and pathogens using point-of-use real-time PCR.《公共科学图书馆•综合》15:e0226863。doi: 10.1371 / journal.pone.0226863
停止,k . R。,Juzwik, J。(2001). Predominant nitidulid species (Coleoptera: Nitidulidae) associated with spring oak wilt mats in Minnesota.可以。j。Res。31日,635 - 643。doi: 10.1139 / x00 - 201
CFIA (2020)。d - 99 - 03:植物检疫进口需求,防止橡树枯萎病的条目(Bretziella fagacearum(亲眼见识)Hunt)从美国大陆。网上:https://inspection.canada.ca/plant - health/invasive species/directives/forest products/d - 99 03/eng/1323852753311/1323852875523(2022年4月11日访问)。
查哈尔,K。,Morris, O. R., McCullough, D. G., Cregg, B., and Sakalidis, M. L. (2021). Sporulation timing of the invasive oak wilt fungus,Bretziella fagacearum在密歇根,(Abstr)。植物病理学111:S2.51。doi: 10.1094 / PHYTO111-10-S2.1
查哈尔,K。,Morris, O., McCullough, D. G., and Sakalidis, M. L. (2019). Biology, epidemiology and detection of oak wilt in Michigan. (Abstr).植物病理学109:S2.33。doi: 10.1094 /发朵- 109 - 10 - s2.1
陈,j·S。,妈,E。,Harrington, L. B., Costa, M. D., Tian, X., Palefsky, J. M., et al. (2018). CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.科学360年,436 - 439。doi: 10.1126 / science.aar6245
陈,Y。,Mei, Y., Zhao, X., and Jiang, X. (2020). Reagents-loaded, automated assay that integrates recombinase-aided amplification and Cas12a nucleic acid detection for a point-of-care test.肛交。化学。92年,14846 - 14852。doi: 10.1021 / acs.analchem.0c03883
de Puig H。,一个。,Lee, R., Najjar, D., Tan, X., Soeknsen, L., Angenent-Mari, N., et al. (2021). Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants.科学。睡觉。7:eabh2944。doi: 10.1126 / sciadv.abh2944
叮,X。,Yin, K., Li, Z., Lalla, R. V., Ballesteros, E., Sfeir, M. M., et al. (2020). Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.Commun Nat。11:4711。doi: 10.1038 / s41467 - 020 - 18575 - 6
欧洲食品安全署,P。,On, P. H., Bragard, C., Dehnen-Schmutz, K., Serio, F. D., Jacques, M., et al. (2020). Commodity risk assessment of oak logs with bark from the US for the oak wilt pathogenBretziella fagacearum在一个集成的系统方法。欧洲食品安全署J。18:e06352。doi: 10.2903 / j.efsa.2020.6352
欧拉,M。,Wang, Y., Nentwich, O., Piepenburg, O., Hufert, F. T., and Weidmann, M. (2012a). Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of rift valley fever virus.j .中国。性研究。54岁,308 - 312。doi: 10.1016 / j.jcv.2012.05.006
欧拉,M。,Wang, Y., Otto, P., Tomaso, H., Escudero, R., Anda, P., et al. (2012b). Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of土拉杆菌内。j .中国。Microbiol。50岁,2234 - 2238。doi: 10.1128 / jcm.06504-11
Haghighi, S。Jasemi, M。,Hessabi, S., and Zolanvari, A. (2018). PyCM: Multiclass confusion matrix library in Python.j .开源Softw。3:729。doi: 10.21105 / joss.00729
Heid, c。,Stevens, J., Livak, K. J., and Williams, P. M. (1996). Real time quantitative PCR.基因组Res。6,986 - 994。doi: 10.1101 / gr.6.10.986
Jensen-Tracy, S。、Kenaley年代。Hudler, G。,Harrington, T., and Logue, C. (2009). First report of the oak wilt fungus, ceratocystis fagacearum, in New York state.工厂说。93年,428 - 428。doi: 10.1094 / pdi - 93 4 - 0428 b
Juzwik, J。,Harrington, T. C., MacDonald, W. L., and Appel, D. N. (2008). The Origin of长喙壳属fagacearum,橡树枯萎真菌。为基础。启Phytopathol。46岁,13 26。doi: 10.1146 / annurev.phyto.45.062806.094406
Karakkat, B, B。,Hockemeyer, K., Franchett, M., Olson, M., Mullenberg, C., and Koch, P. L. (2018). Detection of root-infecting fungi on cool-season turfgrasses using loop-mediated isothermal amplification and recombinase polymerase amplification.j . Microbiol。冰毒。151年,90 - 98。doi: 10.1016 / j.mimet.2018.06.011
科赫,k。,Quiram, G. L., and Venette, R. C. (2010). A review of oak wilt management: A summary of treatment options and their efficacy.城市。城市绿色。9,1 - 8。doi: 10.1016 / j.ufug.2009.11.004
Lacoursiere,大肠(2015)。橡树,加拿大的百科全书。网上:https://www.thecanadianencyclopedia.ca/en/article/oak(2022年6月15日访问)。
Lamarche, J。波特凡,。,Pelletier, G., Stewart, D., Feau, N., Alayon, D. I. O., et al. (2015). Molecular detection of 10 of the most unwanted alien forest pathogens in Canada using real-time PCR.《公共科学图书馆•综合》10:e0134265。doi: 10.1371 / journal.pone.0134265
露西娅,C。,Federico, P.-B., and Alejandra, G. C. (2020). An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12.bioRxiv(预印本)。doi: 10.1101 / 2020.02.29.971127
罗,M。,Meng, F.-Z., Tan, Q., Yin, W.-X., and Luo, C.-X. (2021). Recombinase polymerase amplification/Cas12a-Based Identification of黄arboricolapv。pruni桃子。前面。植物科学。12:740177。doi: 10.3389 / fpls.2021.740177
麦克劳克林,K。,Snover-Clift, K., Somers, L., Cancelliere, J., and Cole, R. (2022). Early detection of the oak wilt fungus (Bretziella fagacearum)使用困nitidulid甲虫向量。对。病理学研究。52岁。doi: 10.1111 / efp.12767
摩尔·m·J。Juzwik, J。,Saiapina, O., Ahmed, S., Yang, A., and Abbas, A. (2022). Use of sodium hydroxide DNA extraction methods for nested PCR detection ofBretziella fagacearum边材的橡树物种在明尼苏达州。植物的健康食物。23日,132 - 139。doi: 10.1094 / php - 03 - 21 - 0057 - rs
加拿大自然资源(NRCAN) (2015)。红橡树。网上:https://tidcf.nrcan.gc.ca/en/trees/factsheet/66(2022年7月21日通过)。
OWTAC (2019)。加拿大橡树要响应框架。网上:https://inspection.canada.ca/plant-health/invasive-species/plant-diseases/oak-wilt/response-framework/eng/1563898431188/1563898479048(2022年7月21日通过)。
Parada-Rojas, c . H。,Quesada-Ocampo, L. M. (2018). Analysis of microsatellites from transcriptome sequences of疫霉capsici人口研究和应用。科学。代表。8:5194。doi: 10.1038 / s41598 - 018 - 23438 - 8
保罗,R。,Ostermann, E., and Wei, Q. (2020). Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases.Biosens。Bioelectron。169年,112592 - 112592。doi: 10.1016 / j.bios.2020.112592
小贩,j . H。,McKenney, D. W., Hope, E., Reed, S., and Sweeney, J. (2020). Assessing the climate suitability and potential economic impacts of Oak wilt in Canada.科学。代表。10:19391。doi: 10.1038 / s41598 - 020 - 75549 - w
Piepenburg, O。,Williams, C. H., Stemple, D. L., and Armes, N. A. (2006). DNA detection using recombination proteins.公共科学图书馆杂志。4:e204。doi: 10.1371 / journal.pbio.0040204
拉特里奇,r . g . (2011)。Java程序LRE-based实时qPCR,使大规模的绝对量化。《公共科学图书馆•综合》6:e17636。doi: 10.1371 / journal.pone.0017636
Schoch, c . L。,Seifert, K. A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J. L., Levesque, C. A., et al. (2012). Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.Proc。国家的。学会科学。美国109年,6241 - 6246。
Seabold, S。,Perktold, J. (2010). “Econometric and statistical modeling with Python skipper seabold 1 1,” in学报》第九python在科学会议奥斯汀,得克萨斯州。
Shelstad D。女王,L。,French, D., and Fitzpatrick, D. (1991). Describing the spread of Oak Wilt using a geographic information system.Arboric。J。17日,192 - 199。doi: 10.48044 / jauf.1991.047
辛格,M。,Bindal, G., Misra, C. S., and Rath, D. (2022). The era of Cas12 and Cas13 CRISPR-based disease diagnosis.暴击。启Microbiol。48岁,714 - 729。doi: 10.1080 / 1040841 x.2021.2025041
农业部林服务北部研究站,森林健康保护(2019)。陌生的森林害虫explorer-Species地图。网上:https://www.nrs.fs.fed.us/tools/afpe/maps(2022年4月11日访问)。
杨,一个。,Juzwik, J。(2017). Use of nested and real-time PCR for the detection of ceratocystis fagacearum in the sapwood of diseased oak Species in Minnesota.工厂说。101年,480 - 486。doi: 10.1094 / pdi - 07 - 16 - 0990 re
杨,Y。,Qin, X., Song, Y., Zhang, W., Hu, G., Dou, Y., et al. (2017). Development of real-time and lateral flow strip reverse transcription recombinase polymerase Amplification assays for rapid detection of peste des petits ruminants virus.性研究。J。14:24。doi: 10.1186 / s12985 - 017 - 0688 - 6
Zetsche B。,Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Slaymaker, I. M., Makarova, K. S., Essletzbichler, P., et al. (2015). Cpf1 is a single RNA-Guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.细胞163年,759 - 771。doi: 10.1016 / j.cell.2015.09.038
张,Y。,张,Y。,张,Y。,Xie, K. (2020). Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice.摩尔。品种。1 - 12。doi: 10.1007 / s11032 - 019 - 1092 - 2
关键字:DETECTR,分子检测、橡木枯萎,Bretziella fagacearum,TaqMan®分析
引用:Bourgault E, Gauthier m K,波特凡,斯图尔特D, K,查哈尔Sakalidis毫升和Tanguay P(2022)基准测试一个快速和简单的现场检测试验的橡树枯萎病菌Bretziella fagacearum。前面。对。水珠。改变5:1068135。doi: 10.3389 / ffgc.2022.1068135
收到:2022年10月12日;接受:2022年11月30日;
发表:2022年12月15日。
编辑:
Benoit Marcais,Nancy-Lorraine INRA中心,法国审核:
Jaime Aguayo安全范围,国家防疫线de l 'Alimentation de l 'Environnement et du阵痛(ans),法国路易莎Ghelardini意大利佛罗伦萨大学
版权波特凡©2022 Bourgault附近,斯图尔特,查哈尔,Sakalidis Tanguay。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:Philippe TanguayPhilippe.Tanguay@nrcan-rncan.gc.ca
__这些作者对这项工作同样做出了贡献,分享第一作者