探索皮肤微生物之间的相互关系和皮肤挥发物:一个试点研究

1。介绍

而使用的化学信息已经长期被认为是动物行为的一个重要因素,人类直到最近被认为只有小依赖他们的化学感应系统(罗伯茨et al ., 2020)。这个概念正在被不断修正的功能越来越多的证据证明人类社会环境的化学信号(Lubke和停顿,2015;暂停,2017)。例子是情感的沟通(de Groot et al ., 2012)、发展型国家(Ferdenzi et al ., 2010;Schaal et al ., 2020;谢弗et al ., 2020),或健康状态(奥尔森et al ., 2014)通过身体的气味。在所有这些情况下,化学从所谓的发送者发出的信息传播给所谓的接收器,因此,接收机显示适应性行为——例如,从腋窝汗液被证实能够减少焦虑信号信任和风险行为的女性(迈斯特和停顿,2021)。身体气味和挥发物另外在当前研究的焦点由于其效用在医学和法医的应用程序,例如,对诊断或鉴定个人(波,2011;Cuzuel et al ., 2018;辛克莱et al ., 2021)。因此,已经多次阐明排放和气味的化学成分来自不同网站的人体,和化合物在人类发现volatilome最近编译(阿曼et al ., 2014;Drabinska et al ., 2021)。volatilome从而描述实体的挥发物的环境中找到一个有机体,包括挥发物来源于内源性代谢和外生来源。从人体样本挥发物,有不同的方法,从在线质谱(Hartungen et al ., 2004)使用专用吸附剂材料(Cuzuel et al ., 2018;Uebi et al ., 2019)与纺织品抽样(Preti et al ., 1987;霾et al ., 2001)。尽管人类化学通讯和volatilome研究进展,然而,分子的信息编码的原则仍然是未知的多数社会化学通讯到目前为止的疑似病例。人体释放的挥发物的成分和体液取决于个人的解剖学、生理学和遗传学(马丁et al ., 2010),在行为和环境因素如营养、使用化妆品,卫生习惯或大气条件(哈夫利切克和Lenochova, 2006;Havliček et al ., 2017;倍科et al ., 2020)。其中的一些影响因素,比如个人的皮肤护理常规和饮食习惯,直接确定发射皮肤配置文件(例如,使用除臭剂或摄入大蒜),但另外也影响人类微生物组的组成(菲勒et al ., 2008),因此影响人类volatilome质量通过微生物作为调停者(科斯特洛et al ., 2009;歌et al ., 2013)。确定这些更复杂的关系,有必要描述volatilome和微生物的个体,做例如腋窝和阴道的气味(自耕农et al ., 2013;麦克米兰et al ., 2015;Troccaz et al ., 2015)。腋窝的气味从化学的角度理解(詹姆斯et al ., 2013;Starkenmann 2017)和腋窝化学信号在社会交往中的作用在几个研究已经证明(奥尔森et al ., 2014;暂停,2017;史密兹et al ., 2020)。相比之下,挥发物和气味发出颈部无一例外只有最近建议涉及人类化学通信(Ferdenzi et al ., 2020)。在目前的研究中,我们描述挥发性有机化合物(挥发性)和微生物从腋下和颈部,因为讨论两个站点之间的化学信息来源在日常交互。在长期,因此了解感兴趣的个人因素的影响如前所述在皮肤微生物和volatilome这些网站,以及它们的相互关系。这里探险的调查报告,我们的目的是,一方面,(我)相对特征的一般组成挥发物和微生物出席这些机构网站,(2)确定individuum——或者性别特征存在于VOC和微生物组数据,和(3)评估提示是否向microbiome-driven VOC成分存在。另一方面,我们旨在评估方法论的几个方面相关采样和挥发物和皮肤微生物分析。其中包括(i)标准化的洗涤过程的影响,(2)使用两种不同的分析列一维气相色谱分析-质谱法(gc - ms)分析,和(3)使用两种不同的方法测定皮肤微生物(文化与16 s排序)。达到这些目标,十人(五个女人,五个男性)被要求参加两会。每一次会议期间,微生物和挥发物被采样的脖子和腋窝的皮肤表面。统计分析仅限于选择最丰富的细菌和挥发性有机化合物的仪器,以避免多个比较问题,除了一个分类方法,所有项目的数据集。由于我们研究的探究的性质,其中包括有限数量的参与者,焦点只放在最突出的个人团体之间的差异以减少误报的可能性。 Furthermore, our experiments indicated that both the ten most abundant bacteria and VOCs accounted for more than 99% of the total respective abundances. Insights into the influence of the different methodological choices on the quality of the data were obtained and recommendations for future research are derived therefrom. It was possible to classify with the different data sets the respective body site (axilla and neck) and the sampling round.

2。材料和方法

2.1。参与者

2.1.1。一般信息

十个志愿者(男性,5女性;年龄:20 - 30年,米±SD:24±3年)招募了两轮抽样更详细的信息(见2.3)。所有与会者都健康,不吸烟,没有慢性病,不摄入药物或药物,怀孕和哺乳。伦理的道德委员会批准了Friedrich-Alexander-Universitat埃(171 _19b)。研究发生在埃朗根和根据赫尔辛基宣言进行医学研究涉及人类参与者。参与者被告知这项研究的目标和程序以口头和书面形式并提供书面同意参与这项研究。

2.1.2。说明关于饮食和卫生

参与者是卫生和饮食协议之前的研究。辣的食物、洋葱、大蒜、韭菜和类似的蔬菜、芦笋、卷心菜和酒精、香水、香水化妆品、和除臭剂前48小时内不允许。所有纺织品在直接接触腋窝或颈部,例如,衣服,床上用品,毛巾,应该用perfume-free洗涤剂洗净。参与者提供perfume-free产品(“地中海Balea洗发水超灵敏,”“地中海Balea Duschgel超灵敏,”“Denkmit Vollwaschmittel超灵敏”;从dm-drogerie markt GmbH & Co .)购买公斤,德国卡尔斯鲁厄)。访问一个室内游泳池或其他公共场所可能高气味的背景,例如,酒吧或俱乐部,应该避免前48小时内。参与者必须进一步避免体育和亲密的身体接触。日志对他们的饮食,运动,和卫生是参与者和提供的一份调查问卷填写注册一般生活条件/人口数据和习惯。止汗剂不应使用10天前的研究。

2.2。化学物质

1-Tetradecanol(纯度:99%)从穿越有机物,购买部分的热费希尔科学(Geel、比利时)。1-Dodecanol(98%)、壬醛(95%)、正烷烃(C₆- C₃₄)和十四酸(98%)从丙烯酰胺,购买的一部分Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。2,4-Di -叔丁基苯酚(99%)、二辛基醚(99%)、二丙二醇甲醚(同分异构体的混合物),2-ethylhexanol(99%)、香叶基丙酮(> 97%),异丙基月桂酸盐(厦门市),十四烷酸异丙酯(98%)、棕榈酸异丙酯(≥90%),甲醇(≥99.8%),角鲨烯(≥98%),2-ethylhexyl水杨酸(99%)和erucylamide(> 85%)从西格玛奥德里奇(Steinheim,德国)。二氯甲烷(DCM)和无水硫酸钠买来VWR化学品(达姆施塔特,德国)。为进一步的信息关于中科院参考化合物的数量和IUPAC命名法用于识别挥发物,明白了补充表S1。

2.3。一般程序

每个参与者参加了两次。所有样品都完成从皮肤的表面。在第一个会话中,洗涤的影响调查的抽样程序执行之前和之后皮肤微生物和挥发性有机化合物的仪器参与者各自洗身体网站(腋下和颈部)一次性浴巾浸泡在水里(“ebelin Einmal-Waschlappen,“dm-drogerie markt GmbH & Co .公斤,卡尔斯鲁厄,德国)。实验步骤的顺序是:(1)微生物的采样,(2)抽样的挥发性有机化合物的仪器,(3)清洗皮肤表面面积,(4)抽样的挥发性有机化合物的仪器,(5)微生物的采样。在第二次会议,进行了平均5.8±1.5个月第一次会议后,皮肤的抽样程序微生物采样之后的挥发性有机化合物的仪器只进行一次。没有清洗的步骤在第二次会议完成。

2.4。微生物:采样和测量

2.4.1。抽样程序

每个身体网站使用两个棉签(腋下和颈部)。在第一步,Mastaswabs MD 508 (Reinfeld,桅杆Diagnostica GmbH德国),一直用热压处理过的水湿。标准化样本的大小的皮肤区域,2×2厘米箔模板(PrintLine Overheadfolie, Vleveka帐面价值Deurne,荷兰)被放置在各自的皮肤区域。,拭子中上下移动旋转运动和常数,30年代的光压力,然后转移到运输管(Mastaswabs,见上图)。样本保持在2 - 8°C运输。在第二个步骤中,DNA采样使用FloqSwabs(科潘诊断,Murrieta美国)在无菌水湿,是参与者的皮肤上擦了30年代使用箔模板,随后储存在−20°C病原体裂解管(试剂盒、希尔登,德国)。微生物采样从腋窝的占主导地位的手臂和脖子,尽可能,取样是在同一皮肤表面区域的棉签用相似的立场箔采样模板。

2.4.2。细菌培养和鉴定细菌的MALDI-TOF质谱分析

Mastaswabs飞跑到琼脂板在无菌条件下在生物安全柜(热科学、Schwerte、德国)在2 h后取样。对于每一个样品,一个哥伦比亚血琼脂板(胰蛋白胨4%大豆琼脂,6%去纤维蛋白的羊血,在浅绿色的民主党。试剂从Oxoid GmbH德国Wesel)和一个血琼脂板包含维生素K (VK板块;胰蛋白胨4%大豆琼脂,5%去纤维蛋白的羊血,1%维生素k的解决方案,在浅绿色的民主党。试剂从Oxoid GmbH德国Wesel)被裸奔接种擦拭整个表面的琼脂板上。为厌氧菌的生长提供最佳条件,VK盘子是pre-incubated在厌氧条件下至少4 h之前使用。哥伦比亚琼脂板在37°C 5%孵化有限公司₂厌氧的文化氛围,VK盘子是用锅(默克公司,达姆施塔特,德国)37°C。48 h的孵化后,细菌菌落的数量统计在两个盘子。

确定细菌物种,殖民地代表使用牙签,不锈钢目标板上发现和覆盖1μl HCCA矩阵(10毫克/毫升α-cyano-4-hydroxycinnamic酸在50%乙腈/ 2.5%三氟乙酸)。在环境温度下干燥后,识别是由Matrix-Assisted激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)的基础上,240年累积光谱使用Microflex LT™(力量Daltonik GmbH,德国)。光谱的细菌蛋白质比较MBT罗盘库(RUO, 2019年修订F)数据库(力量Daltonik GmbH,德国)含有8468种参考光谱从2969(210 2716个细菌,酵母,43丝状真菌)。匹配的数据库条目排名根据他们的相似性得分,得分> 2.0指示可靠的识别。分数在1.8和2.0之间接受识别如果匹配的数据库条目属于同一个物种。

2.4.3。DNA处理

基因组DNA从FloqSwabs孤立使用QIAamp跟单信用证DNA微设备根据制造商的协议(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)和量化量子位2.0 dsDNA海关化验工具包(表达载体,Schwerte,德国)。V4地区(515 f - 806 - r)的细菌16 s rRNA基因放大使用NEBNext Q5热起动Hifi PCR反应混合液(新英格兰生物学实验室,法兰克福,德国)使用协议成立于地球微生物——协议和标准(2022)项目(Prot16S)¹。扩增片段与AMPure纯化XP珠子(贝克曼库尔特公司、Krefeld、德国),汇集在克分子数相等的比率和分析2×250 paired-end测序Illumina公司MiSeq设备上(美国圣地亚哥Illumina公司Inc .)。生fastq文件然后进口分析QIIME2 v2021.2 (Bolyen et al ., 2019)与Dada2 (卡拉汉et al ., 2016)作为质量控制的方法、dereplication和sub-operating分类单位/扩增子序列变异(国情咨文电视/ ASV)表生成。席尔瓦(Quast et al ., 2013)小亚基数据库发布138年99%相似性截止用于分类的分类。

2.5。挥发物:采样和测量

2.5.1。抽样程序

Gazin®纱布垫(5×5厘米,8层,17线程)从罗曼& Rauscher获得国际GmbH & Co . KG (Rengsdorf,德国)。这种测试织物的预处理有必要提高分析质量的测量与气相色谱分析-质谱法(gc - ms)。基于初步实验选用甲醇预处理Gazin®纱布垫。垫放入烧杯中,30毫升的甲醇添加和在室温下搅拌10分钟。后来,溶剂提供了和过程重复两次。垫终于干在环境温度和储存在密封的琥珀色玻璃瓶直到使用。

抽样的挥发性有机化合物的仪器进行腋窝的每个参与者的主导的手臂和脖子上。在每种情况下,一个Gazin®网垫是用医疗胶带固定(Hansaplast®, Beiersdorf AG)、汉堡,德国)。参与者应该放松20分钟避免任何有压力的活动或运动。然后,垫在起飞和存储在一个琥珀色玻璃−80°C最多30天,直到工作了。箔模板用于微生物采样并不是用来限制取样皮肤表面积在挥发物的抽样。

2.5.2。隔离的挥发物Gazin®纱布垫及气相色谱分析-质谱法分析

的Gazin®网垫是在室温下搅拌30分钟和50毫升的DCM提取挥发性化合物。后来溶剂辅助味道蒸发[安全;(恩格尔et al ., 1999在55°C)进行。蒸馏是在无水硫酸钠干燥,最后集中的总量100μl 50°C Vigreux蒸馏和微蒸馏所描述的Bemelmans (1979)。比较的目的,一个未使用的Gazin®网垫处理按照相同的检查程序的体味样本。馏分油然后储存在−80°C最多7天直到进一步分析。

气相色谱分离进行了使用安捷伦7890 A GC(安捷伦,圣克拉拉、钙、美国)配备以下毛细管列:DB-FFAP或DB-5 (30 m×0.25毫米,膜厚度0.25μm, J&W科学、安捷伦科技,圣克拉拉,CA,美国)。氦用作载气流速为1.0毫升/分钟的恒流模式。馏分油注入cold-on-column模式在40°C使用多功能autosampler MPS2(陈健民GmbH & Co.KG Mulheim der鲁尔,德国),与注射1μl的体积。下面的温度程序使用:(i) 2分钟40°C,加热到240°C的坡道8°C /分钟,控股240°C FFAP-column 10分钟,(ii) 2分钟40°C,加热到300°C的坡道8°C /分钟,控股300°C DB-5列5分钟。质谱数据记录在扫描模式(40 - 400 m / z)的电离能70 eV使用安捷伦5975 \ u00B0C MSD(四极;美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。保留指数(RI-value)计算每个化合物如前所述Kovats使用C₆- c_30.n烷烃(Kovats 1958)。

2.6。数据分析:预处理和个人数据分析

2.6.1。DNA数据分析

为了避免不恰当的统计推断由成分数据,我们从ASV表转换数据集中log-ratios (CLR)变换(艾奇逊说,新书《女子1982),如在之前完成工作(麦克米兰et al ., 2015)。CLR转换选择而不是添加剂日志转换(规律),由于缺乏一个预先确定的参考分类单元。零值在ASV表是由使用乘法置换算法(Martin-Fernandez 2003)。由此产生的矩阵$D_F\in {ℝ}^{\mathrm{年代}x\mathrm{一个}}$被用于进一步分析,在哪里$\mathrm{年代}$的样品和数量吗$\mathrm{一个}$是不同的数量、在吗$D_F$。在所有进一步的实验中,α和β多样性值是根据香农和Bray-Curtis计算,分别为(香农,1948;1957年布雷和柯蒂斯)。作为$D_F$由组成数据、意义分析使用微分丰富测试分析成分的微生物(安共体;Mandal et al ., 2015)。在这种情况下,没有p值报告。

2.6.2。文化数据分析

文化可以概括的数据矩阵$C_F\in {ℝ}^{\mathrm{年代}xB}$,在那里$\mathrm{年代}$的样品和数量吗$B$确定是不同的细菌的数量。这个矩阵中的每一个值代表一个特定的细菌总数属或物种各自的样本被发现。ASV表相比,细菌数的绝对值可以考虑不同样本之间的文化上的数据。我们应用没有规范化的文化数据保护定量细菌数样本之间的差异。在所有进一步的实验中,α和β多样性值是根据香农和Bray-Curtis计算,分别。

2.6.3。气相色谱质谱数据分析

gc - ms数据过滤Savitzky-Golay过滤器(Savitzky戈利,1964)来消除高频构件(Lommen 2009)。随后,基线工件被使用大礼帽基于数学形态学滤波器(Angulo塞拉,2003)。产生的信号是deconvoluted使用提出的方法比勒和Biemann (1974)和与参考烷烃。提取的山峰是另外所有不同样本之间的对齐每个参与者根据他们的保留指数和质谱相似动态规划方法(罗宾逊et al ., 2007)。Hyperparameters选择根据原始论文的地方。奇异的山峰,只有一个样本中发现了类似的山峰被发现在所有其他样本被丢弃的进一步分析。整个管道实施在Python中使用宾库(奥卡拉汉et al ., 2012)。结果是一个矩阵$G\in {ℝ}^{\mathrm{年代}xP}$在哪里$\mathrm{年代}$表示的样品和数量$P$峰的数量。在每一行$\mathrm{年代}$描述了气相样品的提取的山峰和每个单元格的列$P$包含一个峰值或没有峰值。每个峰值依次由群众与强度有关。挥发物相比最初初步确认NIST 14标准参考数据库(国家标准与技术研究院,盖瑟斯堡,美国)并随后被证实与真实的标准(如果有)。挥发物不能证实与一个真正的标准,但初步确认NIST 14数据库标注(*)的象征整个手稿。此外,挥发物只考虑如果匹配因素是700以上。所有挥发物可能污染物(如硅氧烷、邻苯二甲酸盐)没有考虑进一步分析。物质在空白样品中检测到没有减去之前从样本的数据统计分析。统计分析和机器学习方法我们计算功能$G_F\in {ℝ}^{\mathrm{年代}xP}$。具体来说,我们每一个峰的峰面积计算$G$每一行和归一化峰地区的所有峰值区域各自的行(称为归一化峰地区的其他手稿)。我们省略了这个正常化当比较总峰面积的gc - ms个体参与者之间运行。在补充图S1DB-5脖子上的一个例证色谱测量显示。

2.7。统计分析

统计分析是在Python中使用Pingouin包(Vallat 2018)。情节都是使用seaborn创建的库(Waskom 2021)。显著差异评估使用多个比较使用Benjamini Wilcoxon-signed-ranked测试和纠正其错误发现率。成分的测序数据,一个微分丰富测试执行使用安共体(Mandal et al ., 2015)。正常执行转换的数据,允许参数统计测试,但不成功。只有十个最丰富的细菌以及挥发物与最高的平均峰面积被认为是进行进一步的统计分析。这样做是由于多重比较的问题,发生在一个同时考虑一组统计推断,可能导致错误的统计数据(米勒,1981)。

3所示。结果

3.1。洗涤的影响

洗采样站点来规范身体气味和挥发物的捐赠是用于一些研究(Curran et al ., 2007;Hara et al ., 2015;Hierl et al ., 2021)。这里,我们评估的影响与滋润皮肤洗各自网站一次性毛巾(没有洗涤剂)单独人体腋下和颈部,考虑到微生物和挥发性有机化合物的仪器。采样进行微生物和挥发性有机化合物的仪器,一旦身体洗后各自的网站,在第一次采样。统计比较局限于十个最丰富的细菌和挥发性有机化合物的仪器。这样做是为了避免报告错误的重要结果将来自多个比较的结果。给我们研究的探索自然和小样本大小,我们故意选择关注最突出的群体之间的差异,以获得一个假阳性结果的可能性最小化。

3.1.1。微生物-文化数据

个人为每个参与者所示结果图1。腋窝样品总丰度之间的显著差异之前和之后获得的所有细菌样品观察清洗(p< 0.01,共同语言效果(cl) = 0.67;图1一个)。脖子样本显示,总细菌丰度无显著差异之间的洗涤条件(数据未显示)。避免过度多个测试和修正,只有十个最丰富的细菌类群在脖子和腋窝样品被认为是进行进一步的统计分析。无显著差异的十个最丰富的个体细菌类群被发现(数据未显示)。

3.1.2。微生物- DNA数据

我们观察到一个明显降低α多样性的asv洗后脖子样本(p< 0.01,cl = 0.64;图1 b)和无显著差异的腋窝样本(数据未显示)。centered-log比例的转换值、丰度洗涤前后没有显著差异的十ASV显示最高的相对丰度在所有样本(数据未显示)。

3.1.3。gc - ms数据挥发物。

只有最高的前十个峰值归一化峰面积对所有参与者考虑统计分析由于多重比较的问题。我们并没有发现任何显著差异之间的归一化前后十峰的峰值区域清洗,不管期间使用的列类型的GC (FFAP或DB-5)。α多样性没有实质性的差异和差异绝对细菌数不应与实验相关,所有进一步的实验样品获得采样之前没有洗皮肤各自的网站。

3.2。检测微生物的一般描述和挥发物

概述的相对丰度整体十最丰富的细菌类群(在属级)和挥发物中发现腋下和颈部的样本个体参与者了图2,3。

3.2.1之上。微生物-文化数据

腋窝和脖子的细菌组成样品主要是革兰氏阳性属葡萄球菌和Cutibacterium。我们分析了α多样性,β多样性和细菌计数。我们没有观察到任何重大差异身体网站α和β多样性。然而,细菌总数明显高于腋样品相比,脖子样本(p< 0.01,cl = 0.96;所示补充图S2A)。十个最丰富的细菌在物种水平在所有样本被认为是为进一步统计分析(我们在属水平显示细菌S3A补充数据,B)使比较DNA数据。我们观察到更高的丰富葡萄球菌epidermidis(p< 0.05),葡萄球菌hominis(p< 0.05)Cutibacterium avidum(p< 0.05)腋窝样品比脖子样品和更多Cutibacterium曼秀雷敦(p< 0.05)相比,脖子样本腋窝样本(图4一)。

3.2.2。微生物- dna数据

腋窝是由样品葡萄球菌和棒状杆菌,而脖子样本更加多样化,葡萄球菌和Cutibacteria是最丰富的属。我们分析了α多样性,beta-diversity, asv的相对丰度。脖子上的α多样性明显高于样品与腋窝样本(p< 0.05,cl = 0.77;看到补充图S2)。十个最丰富的属所有样本被认为是进行进一步的统计分析。颈部显示明显高于大量的样品Lawsonella(p比腋窝样本(< 0.05)图4 b)。

3.2.3。gc - ms数据挥发物。

最高的化合物归一化峰地区腋窝和颈部样本,分别所示补充数据S3C-F。高峰发生在腋窝和颈部样本归一化峰地区及其相对最高的个人参与者所示图3。

样品在颈部,十个最高,归一化峰地区总体平均,两列,二辛基醚、异丙基月桂酸盐,十四烷酸异丙酯,2,4-di-tert-butylphenol和香叶基丙酮。FFAP柱,2-ethylhexanol、十六烷、十七烷、二十烷和1-dodecanol另外在最高的前十个分子规范化区域,而对于erucylamide DB-5列就是如此,角鲨烯,二十四烷,二十五烷和二十七烷。

最高的归一化峰地区腋窝相关样本二辛基醚、异丙基月桂酸盐,十四烷酸异丙酯和2,4-di -叔-butylphenol两列。FFAP柱三种不同的同分异构体的一缩二丙二醇甲醚(RI FFAP: 1456、1467和1506年),1-dodecanol, 1-tetradecanol和2-ethylhexanol此外十规范化地区最高的山峰,而在DB-5列erucylamide、角鲨烯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸,通过乙醛*和水杨酸2-ethylhexyl另外与归一化峰高的地区发生。

分析一个未使用的Gazin®网垫表明这些化合物的几个也存在。评估结果FFAP-column, 2-ethylhexanol和香叶基丙酮挥发物发现的一部分,而对于erucylamide DB-5列就是如此,辛酯醚、异丙基月桂酸盐,十四烷酸异丙酯,2,4-di -叔-butylphenol和十七烷。相比我们还是统计相关个人挥发物的归一化峰地区最高的前十个峰值归一化峰面积在整个数据集。FFAP柱,正十八烷(p< 0.01)和二十烷(p< 0.05)显示颈部样本归一化峰地区明显高于腋窝样本。DB-5列异丙基月桂酸盐(p< 0.001)、香叶基丙酮(p< 0.01),二十五烷(p< 0.05)、十七烷(p< 0.01)明显高于颈样本归一化峰地区与腋窝样本而erucylamide的归一化峰面积(p< 0.05)明显高于在腋窝样本。腋下和颈部之间的差异在归一化峰地区样本所示图4 c,D。

3.3。Multi-omic微生物和挥发性有机化合物的仪器分析

我们进行距离相关分析发现一般微生物和挥发性有机化合物的仪器之间的关联。相关测试的距离是一种非参数的方法,从而使得任何关于数据的分布假设,可以用来探测非线性高维变量之间的依赖关系。我们发现重要的相对细菌丰度之间的相关性排序数据的归一化峰地区所有山峰FFAP柱(p< 0.01,r= 0.83)。

我们进一步分析了multi-omic交互在个体水平上的数据细菌类群和挥发物图5。在这里,我们使用mmvec (microbe-metabolite向量)方法分析microbiome-metabolome交互通过计算单个细菌类群和挥发物之间的同现概率,这已被证明比multi-omic分析统计方法(莫顿et al ., 2019)。进一步的细节中给出的方法补充S1的额外信息。我们应用mmvec方法事先正常化以来预处理已经列入mmvec管道。数据从腋下和颈部样本组合来增加数据的总量和探索潜在的抽样的一般关系的独立网站。此外,我们限制我们的分析挥发物,发生在至少50%的样本。这导致共有16个不同挥发物的DB-5满足条件,而在FFAP柱2挥发物满足条件。其中,十个化合物(十四烷、十六烷、十七烷,正十八烷,二辛基醚、异丙基月桂酸盐,十四烷酸异丙酯,erucylamide, 2, 4-di -叔-butylphenol和13-epimanool *)也发现在空白样品(未使用Gazin®纱布垫)测量在DB-5列上。没有与空白,以FFAP-column,被发现。此外,我们认为只有那些细菌,与任何16挥发物的相当大的同现DB-5列或2挥发物能找到FFAP柱,分别。这相当于六个最丰富的细菌、数据和文化数据的三个最丰富的细菌(这些弥补超过90,占总数的99%相对丰度,分别)。

3.3.1。Multi-omic分析:文化数据

我们发现高之间的同现葡萄球菌和Anaerococci。DB-5专栏中,我们没有发现同现的挥发物十六烷、二十烷、香叶基丙酮、角鲨烯和erucylamide。最强大的互动葡萄球菌13-epimanool *。2,4-di -叔-butylphenol二辛基醚,异丙基月桂酸盐,十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、十四烷,十七烷、正十八烷和金合欢乙醛*显示一个温和的互动Cutibacteria和Anaerococcus。FFAP柱,我们没有发现同现为十六烷和正十八烷和温和的同现Cutibacteria。

3.3.2。Multi-omic分析:DNA数据

我们发现高之间的同现葡萄球菌和Cutibacteria和Peptoniphilia并没有很大的共生Anaerococcus,棒状杆菌属和Lawsonella。DB5跑车的专栏中,我们没有发现共生角鲨烯,2,4-di -叔-butylphenol、二十烷通过乙醛*,erucylamide和异丙基月桂酸盐。我们发现之间的共生棒状杆菌属,葡萄球菌十四烷、十六烷、十七烷、正十八烷二辛基醚、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、香叶基丙酮。我们进一步发现十九烷和之间的同现Anaerococcus和Peptoniphilus以及一个温和13-epimanool *和之间的同现Lawsonella。FFAP柱,我们没有发现同现同现十六烷和正十八烷和温和棒状杆菌和Lawsonella。

3.4。不同的元数据的分类类别

我们评估是否不同的元数据类别可分为使用单独的数据源。我们考虑性别、主体身份,和身体作为元数据类别的网站。我们训练随机森林分类器的第一轮抽样和评估性能第二采样。我们选择这个设置,因为它最接近代表真实的分类条件,数据不断收集和分类。培训的设置过程中详细解释补充S2的额外信息。

此外,我们探讨是否有可能以分类抽样的样本是否一个或两个。因此,我们评估的精度识别不同的采样分析交叉验证所有40主题和平均结果。给出更多的细节补充S3的额外信息。

我们使用文化数据的数据源$C_F$DNA数据$D_F$,gc - ms数据$G_F$。这里我们使用的所有特性(即。,all the volatiles and bacteria) from every data source. For the GC–MS data we considered both the FFAP and DB-5 column and either used the relative normalized peak areas or the peak areas directly. Furthermore, we explored if combining the individual data sources improves the classification accuracy. Therefore, we trained a logistic regression on the classification decisions of the individual models on the first sampling round to combine the data sources. The results are summarized in表1。

第一和第二轮抽样的样本可能与模型训练分类准确率达到了90% - ms或DNA数据。这2个样品确认,收集到的数据之间的差异对于这些数据,而不是文化数据(见补充S4的额外信息和补充图S4)。然而,歧视不同的元数据类别远远比随机猜测所有类别。这表明,虽然有两轮采样系统的差异,与身体的网站的主要差异,性别,身份留在抽样轮。所有元数据分类模型训练的DNA数据实现最高精度。gc - ms数据,实现最高精度与DB-5列,没有规范化。结合不同数据源改善所有元数据分类的准确性除了参与者的身份,保持不变。图6显示的平均特性重要性区分身体网站随机森林模型的个人数据源(世鹏科技电子)值(基于夏普利添加剂解释Lundberg et al ., 2020)。与统计分析相比,世鹏科技电子值是一个游戏理论解释的方法来显示数据的非线性关系,可以用来区分不同的网站。此外,功能(例如,挥发物、细菌或asv)不属于十最丰富的被认为是在这个分析。的总结发现以下命令根据世鹏科技电子(特性值降低相关性从上到下)。

3.4.1。微生物-文化数据

分析表明,丰度高葡萄球菌haemolyticus Cutibacterium avidum,和葡萄球菌hominis最重要的识别腋窝样本。相比之下,丰度高Cutibacterium曼秀雷敦,葡萄球菌,和微球菌危害显示颈部样本。

3.4.2。微生物- DNA数据

在这里,三个最重要的细菌分离颈部和腋窝样本链球菌,Cutibacterium,Lawsonella。丰富的脖子上都大大超过在腋窝样本。然而,大量的高Anaerococcus和棒状杆菌属表明了腋窝样本。

3.4.3。挥发物- FFAP数据

高峰月桂酸异丙酯、十六烷、十七烷和正十八烷指着脖子样本。相比之下,丰度高α甲基苯乙烯,二丙二醇甲醚(国际扶轮1456),和二十一烷被指示的腋窝样本。注意,所示的特性图6 c,α甲基苯乙烯*、香叶基丙酮以及壬醛也发现与未使用的空白测量获得Gazin®纱布垫。

3.4.4。挥发物DB-5数据

高峰十六烷、正十八烷,异丙基月桂酸盐和十九烷暗示了脖子样本,而9-hexylheptadecane *丰度高和13-epimanool *表示腋窝样本。注意,所示的特性图6 d、十六烷、十七烷、正十八烷,二辛基醚、异丙基月桂酸盐以及13-epimanool *也挥发物的一部分的空白Gazin®纱布垫。

另外,我们预计个人数据源与PCoA二维流形算法。补充图S5显示了集群根据身体的DNA样本,文化数据和gc - ms。

3.5。方法:比较排序和文化的方法

评估如果测量细菌使用文化或测序方法类似,我们比较的相对丰富的细菌计数、数据表和文化属水平。我们没有比较物种丰度的测序方法只使用水平提供了可靠的匹配在属的水平。在图7所有细菌发现文化和测序方法排名根据他们的相对丰度腋下和颈部单独样品。数据源和腋下和颈部最丰富的细菌样本观察葡萄球菌。腋窝的样品(图7),葡萄球菌(排名1)Micrococci(等级5)排名同样为数据源。所有其他细菌的相对排名至少两个不同等级的除外Anaerococcus, Cutibacterium和Pantoea。脖子上的样品(图7 b),文化之间的排名和测序方法更相似。在这里葡萄球菌(排名1)Cutibacteria(排名2)排名都是一样的。此外,微球菌,Kocuria,假单胞菌,Pantoea、放线菌和Dermabacter只有一个等级不同。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查的样本是否身体不同的部位,也就是腋下和颈部,可以通过训练一个杰出的线性和非线性分类器使用VOC和微生物组的数据。通过包括总共40样品的挥发性有机化合物的仪器和微生物从颈部和腋窝获得10个研究参与者在两轮,我们成功地实现了这两种不同身体部位的分类准确率高达90%。

皮肤微生物的分析揭示主要细菌的正常、健康的皮肤菌群,如葡萄球菌,棒状杆菌或Cutibacteria与以前的工作,在协议(格赖斯和塞格雷,2011;伯德et al ., 2018;林et al ., 2018)。不足为奇的是,我们发现在腋窝绝对菌落计数显著高于颈部。在他人,这可能是由于顶浆分泌汗水和皮脂腺的高密度腋窝导致微生物的良好培养基(莱顿et al ., 1981;格赖斯et al ., 2008)。此外,我们观察到细菌的识别在属级,完成测序的方法,是在某些情况下,不足以得出明确结论关于身体的网站,由于同一属的丰度高的级别(例如,葡萄球菌)发生在腋窝和颈部。只在物种水平分析(文化方法)对各自的身体允许一个精确的结论。例如,一个丰富的高Cutibacterium avidum是腋窝样本和特征Cutibacterium曼秀雷敦样品的脖子。

抽样皮肤挥发物从两个不同的主体网站使用Gazin®纱布垫结合溶剂萃取允许各种挥发性化合物的检测,其中最丰富的高峰地区获得酯(异丙基月桂酸盐,十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯2-ethylhexyl水杨酸)、醚(二辛基醚、二丙二醇甲基醚)的同分异构体,酚类(2,4-di -叔-butylphenol)、醇类(2-ethylhexanol、1-dodecanol 1-tetradecanol),酮(香叶基丙酮)、醛(通过乙醛*,壬醛),一个三萜烯(角鲨烯)酰胺(erucylamide)、脂肪酸(肉豆蔻酸)和烷烃/碳氢化合物(C₁₆- c₂₇)。这些化合物在先前的研究已发现人类皮肤排泄物感到(圆粒金刚石et al ., 1989;曾庆红等人。,1991年,1996年;霾et al ., 2001;Curran et al ., 2005;佩恩et al ., 2007;加拉格尔et al ., 2008;Vaglio et al ., 2009;布朗et al ., 2013;马丁et al ., 2014;Rathinamoorthy Thilagavathi, 2016;达菲et al ., 2018;Tavares et al ., 2019;Vautz et al ., 2020)。一些确定的挥发物被称为天然挥发性有机化合物的仪器,如角鲨烯及其降解产物香叶基丙酮和金合欢乙醛。角鲨烯,作为人类的主要组件之一皮脂(格林et al ., 1970;Picardo et al ., 2009)是影响氧化降解由于环境空气中臭氧浓度。从而退化发生的不同阶段:香叶基丙酮是最突出的臭氧分解的产品之一,而通过乙醛(C17-trienal)是一个主要的前体(Wisthaler和韦斯勒,2010年)。在我们的研究中,我们观察到明显高于峰值区域香叶基丙酮的脖子样本,而通过乙醛属于最丰富的山峰在腋窝样本。这个观察可以解释为一个更高的博览会的脖子对环境空气中的臭氧,而腋窝是覆盖着衣服大部分时间。在这一点上,它应该提到通过乙醛没有在腋窝报告样本,。作为一个真正的标准不是商业化,在接下来的步骤中识别与合成标准有待确认。

此外,几个确定化合物可能放置在人工污染的分类因为它们用作化妆品成分,例如,在香皂,洗发水,洗涤剂或奶油色华达呢(见也补充表S1)。然而,一些成分,用于水分的皮肤可能会采用天然成分在皮肤上,在这种情况下很难评估化合物来自的地方。使用护肤品不同身体部位的腋下和颈部,可以预期不同的(大量的)残留在不同的皮肤区域。例如,在腋窝样本,erucylamide明显更高的峰面积和一缩二丙二醇甲醚是重要的识别身体的部分在其他事物之外。这些物质是乳浊和粘度控制和用于香化中定义的,在化妆品中用作溶剂欧洲委员会数据库信息美容物质和成分(2022)(因为)。²异丙基月桂酸盐和烷烃的C₁₆- c₂₅有很多明显高于在脖子上样本和使用的随机森林分类器识别脖子部位,分别。根据因为这些化合物用于皮肤调节和润肤剂。2-ethylhexanol,进一步发现在腋窝和脖子样本,作为香化代理和二辛基醚也是根据因为用作化妆品原料¹。因此,这些物质的几个应该被视为人类volatilome外源性的化合物。关于烷烃,调查的圆粒金刚石et al。(1989)表明烷烃在人类表面脂类环境污染物。摄入的物质通过的食物也可能导致外源性化合物的排泄通过皮肤。例如,2,4-di -叔-butylphenol称为复合从食品接触的材料,因此迁移已经包含在第一个总膳食研究在德国(BfR-MEAL-Study)来评估可能的风险相关的食物摄入量(Kolbaum et al ., 2022)。在人类尿液2 4-di -叔-butylphenol已经报道(刘和Mabury, 2019年)和排泄通过人的皮肤也可能是可能的。总之,我们的结果表明,使用方法示例皮肤挥发物导致各种外源污染物的检测人类volatilome不同起源的一部分。在这方面,它也必须指出,几个提到的化合物也被检测到的空白的测量。因此,它不能排除这部分物质的报道这里有来自Gazin®纱布垫,由于在预处理提取不足或由于化合物进一步吸附后从环境中提取。然而,莫明其妙地化合物被发现在空白的测量没有出现在所有的体味样本。在其他实验中进行两轮抽样后,发现可再生的结果与未使用的空白测量Gazin®纱布垫时检查后直接测量。与以前的比较结果从闲置Gazin®纱布垫,然而,表明物质最初被发现的空白,如2-ethylhexanol和香叶基丙酮,没有出现在新准备的空白。十四烷酸异丙酯等物质相比,2,4-di -叔-butylphenol二十烷,并没有出现在空白的在第一次检查,发现FFAP柱。DB-5测量获得了类似的结果。物质,如辛酯醚、异丙基月桂酸盐和2,4-di -叔-butylphenol再也不能被探测到的第二检查未使用的Gazin®纱布垫。这些差异可能源于不同的存储时间或纱布垫的批处理的变化。为了进一步解决这一问题,应该执行相应化合物的定量分析和多个空白应该分析来评估潜在的量变空白样品中相应的化合物。此外,纱布垫应该覆盖在抽样为了防止吸附室内空气的挥发物,和一个室内空气空白应该并行测量。未来研究建议评估是否适合抽样方法的挥发物的皮肤可以使用。

评估潜在的调制作用的微生物挥发性的网站,有必要确定两者之间的关系。事实上,皮肤微生物的影响身体气味和排放是一个众所周知的事实(费迪李希et al ., 2013;Kusano et al ., 2013;伯德et al ., 2018;贾斯瓦尔et al ., 2021)。特别是新一代文化的持续发展独立的DNA测序技术开辟了一个巨大的数据关于人类皮肤微生物的分类组成。微生物的组合数据和VOC数据及其联合评估是一项复杂的任务。在这项研究中,我们使用统计方法是最近提出的莫顿et al。(2019)研究以探究的方式潜在的微生物之间的相关性和VOC在这项研究中获得的数据。四个不同的数据集(DNA数据,文化数据,FFAP和gc - ms数据DB-5)被用于分析和四个mmvec进行了分析,结合不同的数据集。从理论上讲,结果应该描述挥发物和类似的模式的共生细菌。然而,这只是事情的一部分,而大部分co-occurences只重要的四个分析,这可能是最相关的不同类型的方法,以及特征选择的方法。中获得的见解mmvec分析本研究无法连接到共生的细菌和挥发物在文学。目前研究的一些局限性阻止我们进一步解释结果。微生物组数据用于mmvec方法是在属的分类水平。因为同一属的两种代谢可以不同,这可能会导致错误的假设的共生细菌和挥发物。进一步限制与低数量的参与者,缺乏内部标准,确定的部分模糊的起源挥发物(见上图),和身体不同部位相结合的分析方法。为了克服跟踪研究的局限性是明智的增加样品的数量,把注意力集中在单个采样站点,使用内部标准(s)定量测定的挥发物,识别细菌在物种水平上和使用二维气相色谱法等先进的分析技术。

在这项研究中,我们更感兴趣的是评估不同的方法论的方法的影响。一个方面是为了测试是否洗采样站点的标准化调查导致不同的结果相比,取样一个平民百姓的皮肤区域。不同的标准化程序已经使用到目前为止抽样前皮肤散发。身体部位是用水洗或另外采样前用肥皂(布朗et al ., 2013;Mochalski et al ., 2014;Grabowska-Polanowska et al ., 2017;达菲et al ., 2018)。我们的抽样程序包括地区用潮湿的一次性毛巾擦拭身体,所以只有水使用。这个过程没有影响十最丰富的挥发性有机化合物的仪器。关于文化数据,洗了一个影响绝对腋窝菌落计数,但不是脖子。在其他的研究中使用不同的洗涤政权,但有时也减少细菌类群被发现的掺假(菲勒et al ., 2008;Steglińska et al ., 2019)。未来的研究需要进一步阐明不同的洗涤程序的影响,例如,有或没有肥皂,对微生物和VOC样本的质量。

第二个解决方法方面是用于GC分析柱的选择。一般来说,全面的二维气相色谱可以被认为是最先进的领域的volatilomics (聚苯胺,2006;Winnike et al ., 2015)。然而,这些工具可能并不总是可用的。使用适合列在一维系统就更加重要。在目前的研究中,因此,我们针对评估的影响分析柱的选择结果。考虑到十峰地区最高的山峰,部分发散结果两列。而有些物质在前十都列上,像十四烷酸异丙酯、月桂酸异丙酯、二辛基醚、2,4-di -叔-butylphenol和香叶基丙酮(在脖子样本),剩余的物质不同。FFAP柱特别是醚类和醇类中排名前十,而在旁边的DB-5列高度丰富的erucylamid和角鲨烯、正烷烃或长链异丙酯为主。随机森林分类器的结果本研究表明,一般的分类中使用更好的工作从DB-5测量获得的数据相比,FFAP数据。为未来的一维的gc - ms分析,也可以考虑使用多个列类型。适合数据分析方法可以建立使用额外的信息(例如,保留指数)推动自动识别的物质。

第三本研究方法论方面考虑的是微生物分析使用的类型。当比较的结果文化和DNA测序方法,这是明显的葡萄球菌种虫害和Cutibacterium种虫害主导文化的评价数据,而葡萄球菌种虫害和棒状杆菌属种虫害特别是主要被发现在DNA数据。一个可能的解释是,棒状杆菌长得少好文化,因此低估了这个方法。伯德等人报道,修养葡萄球菌比这更容易的吗棒状杆菌(伯德et al ., 2018)。另一方面,发生明显降低Cutibacteria在DNA样本可能是由于使用的引物序列。尤其是使用引物序列V4地区,这是共同使用MiSeq平台时,常常会导致识别中存在的问题Cutibacteria(刘振前et al ., 2016;Castelino et al ., 2017)。出于这个原因,这里的文化相关的方法有优势。本着这种想法,Namdari et al。(2020)解决贫困的识别Cutibacterium曼秀雷敦在肩部手术使用下一代测序(上天)相比,古典培养(Namdari et al ., 2020)。另一方面,Lawsonella被发现的DNA分析更丰富的脖子比腋窝样品,但没有检测到文化,可以解释为没有文化(数据库条目和不可靠的增长戈登伯格et al ., 2019)。这样知名的方法论的差异方法规划时应考虑进一步的研究旨在描述个人皮肤微生物。在未来,宿主DNA去除,例如,通过使用benzonase (阿玛et al ., 2021),结合浅鸟枪测序有潜力成为一个高度相关的替代Illumina-based皮肤微生物的性格特征。然而,目前在许多情况下,微生物生物量较低的皮肤样本,与宿主DNA“污染”和高成本高,主要原因是防止更频繁使用猎枪测序(Ranjan et al ., 2016;骑士et al ., 2018)。

最后,数据分析方法的选择进行研究时发挥了核心作用。我们分析了挥发物的成分和微生物对不同网站,主题,性别,和抽样程序。由此产生的数据量可以比较,结合相对较少的研究参与者进行有效的统计分析(即在功能层面上存在问题。,个别细菌和挥发物之间显著的相关性;米勒,1981)。先前的研究解决这个问题通过预选的特性,从而减少比较的数量(Trivedi et al ., 2019;黄et al ., 2021)。我们跟着这个方法和有限的特性统计比较的十个最丰富的挥发物和细菌不同的采样。因此,我们只有了解这个选择的分析的一部分挥发物和细菌。然而,我们选择这种方法是因为我们预期信号和噪声之间的关系是最常见最稳定的特征,因此最一致的相关性被发现。进一步,可能之间的共生特性(即。,VOC and microbiome interactions) are also most probable for features that occur often in the data. Alternatively, features can also be selected using supervised models and bootstrapping (Trivedi et al ., 2019)。在这里,大量的监督模型的训练,即每个模型只使用一个随机子集的特征。后来,每个模型的性能评估。这导致人口感兴趣的数据(例如,分类精度)的功能重要性分数和非参数置信区间可以计算为每个单独的功能。最后,最重要的功能可以被认为是为进一步统计处理。然而,这种方法可能会导致高度的区别的特性,只存在于一小部分参与者之间的共生和不考虑以后分析的数据源。我们将探索引导和abundance-based特征选择未来的工作。

5。结论

总之,这项研究增加了微生物的构成和VOC证据样本来自颈部和腋窝。它表明这两个样本的身体网站可以分化和确认和扩展了范围的细菌和挥发物象征身体对这些网站。虽然微生物,属水平信息并不足以分类不同的身体部位,物种水平足以腋窝之间的分类信息(例如,表皮葡萄球菌和Cutibacterium avidum)和颈部(例如,Cutibacterium曼秀雷敦)。重要功能分化的身体部位被erucylamide旁边,一缩二丙二醇甲醚(腋下)也正十八烷、香叶基丙酮和二十烷(颈)。未来的研究有更多的参与者,微生物分析在物种水平上,和更高级的VOC抽样和GC技术是必要的进一步推进我们的理解在这些身体潜在的微生物之间的相互关系和volatilome网站,有关个人特征和底层机制,和化妆品和饮食习惯。

数据可用性声明

在本文中给出的数据并不容易获得,因为参与者的隐私。请求访问数据集应该指向霍奇金淋巴瘤(helene.loos@fau.de)。

道德声明

这些研究涉及人类受试者的伦理委员会审查和批准Friedrich-Alexander-Universitat埃(能力)。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

作者的贡献

LS, TH, CH, RL,西南,HL概念化和方法论。LS和可视化软件。TH, CH, LS正式的分析和调查。TH, CH资源。TH, CH, SW数据管理。TH,做,LS、CH和HL原创作品草稿准备。TH、HL、RL、西南和writing-review和编辑。HL、SW RL,监督和项目管理。HL融资收购。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究是由新兴领域倡议的Friedrich-Alexander-Universitat埃(能力)。

确认

我们感谢所有的参与者为研究做出了贡献。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2023.1107463/full补充材料

脚注

引用