造礁珊瑚的伤口愈合和再生鹿角
简徐1、2,
奥利弗·米德
Aurelie火山泥
大卫·j·米勒
Maja Adamska- 1研究生物学院、澳大利亚国立大学、堪培拉,澳大利亚
- 2弧珊瑚礁研究卓越中心,澳大利亚国立大学、堪培拉、法案,澳大利亚
- 3珊瑚礁研究电弧卓越中心,汤斯维尔,昆士兰,澳大利亚詹姆斯库克大学
- 4比较基因组学中心和分子和细胞生物学系,詹姆斯库克大学,昆士兰,澳大利亚汤斯维尔
分支scleractinian珊瑚是niche-constructing生物体,提供持续增长、结构特别珊瑚礁生态系统生物多样性的基础。他们的成功很大一部分在于快速机械损伤后再生的能力。即使是现在,当珊瑚接受大下降由于人为极端天气和风暴,这是令人惊讶的对分子机制管理在这些标志性的生物再生。在这项研究中,我们使用RNA-seq识别基因参与的再生鹿角,从最初的伤口关闭完成重建丢失的结构。许多我们发现的差异表达基因的伤口愈合步骤同系物的基因被认为与伤口愈合和再生的两侧对称动物和其他cnidarian物种,突出包括多个组件FGF和Wnt信号通路。比较基因参与伤口愈合和持续增长的殖民地演示了这两种遗传相似性和特殊性项目控制这些过程。一个引人注目的例子是c-Fos的具体表现,在早期损伤反应与守恒的转录因子的作用,在伤口愈合的早期阶段答:millepora。通过比较结果在不同实验条件包括闭环循环水族馆海洋站的主要材料体系,我们演示了使用的可行性zooxanthellate scleractinian珊瑚作为基础生物学研究的实验模型,包括再生的研究。
介绍
scleractinian珊瑚共生功能体(紧工会的动物宿主,它们相关的黄藻和多样化的原核生物)都取得了巨大的成功在浅热带海洋环境中,创建复杂的许多其他生物的栖息地。然而,这种成功是最近由于人为气候变化受到威胁,导致水温增加不仅导致珊瑚bleaching-related死亡率,而且物理破坏珊瑚礁的风暴强度增加除了直接疏浚和划船的影响(例如,1978年贝克,;Saphier霍夫曼,2005;休斯et al ., 2017)。维护和恢复珊瑚礁很大程度上取决于个人的能力珊瑚快速愈合受伤,覆盖暴露的骨架,然后重建失去的结构。事实上,zooxanthellate scleractinian珊瑚有很高的再生能力,可能与他们的持续增长。对于许多分支珊瑚,碎片是无性繁殖的一个重要方法,允许大量分散和物理干扰(审核后快速复苏Highsmith 1982)。
再生能力的片段似乎也是一个重要的漂白后恢复策略。例如,Diaz-Pulido et al。(2009)看到一个漂白礁珊瑚覆盖减少了70 - 80%和暴露珊瑚骨骼杂草丛生的藻类。事件的令人惊讶的是,在6个月内礁已经恢复到pre-bleaching覆盖率,有可能作为一个快速增长的影响小的碎片珊瑚组织生存基地的殖民地。由于这种能力,重新填充珊瑚礁与fragment-grown珊瑚标本通常被认为是作为礁修复策略面对气候变化(审核通过Schmidt-Roach et al ., 2020)。
虽然一些研究解决生态方面的珊瑚再生(例如,Sabine et al ., 2015),再生的分子机制造礁珊瑚仍可以理解。这与广泛的研究在许多non-skeleton建筑类动物,因为巨大的再生潜力的门和易于栽培的几个物种曾经担任模型系统再生生物学(荷斯坦et al ., 2003)。淡水息肉Hydra尤其如此,甚至有能力形成新的个人小细胞团(审核Vogg et al ., 2019)。再生能力有限——尽管仍然引人注目——明星海葵Nematostella vectensis,它可以再生完成从一个小息肉,对口的部分身体(2017年;波士,汤姆森)。有趣的是,细胞过程和基因参与再生这两个模型的物种差异在很大程度上。水螅再生似乎主要依赖于变形过程(新结构的重排形成现有的细胞),而在Nematostella再生(新结构是由细胞增殖)扮演更重要的角色(Passamaneck马丁代尔,2012;等级et al ., 2014;华纳et al ., 2018)。在许多(如果不是全部的话)动物再生过程,Wnt通路中起着重要作用的再生模型;而参与及通路的记录只有在九头蛇(例如,Hobmayer et al ., 2000;莱因哈特et al ., 2004;Amiel et al ., 2015;彼得森et al ., 2015;谢弗et al ., 2016)。最近,候选基因研究驱动的Tubastraea coccinea证明upregulation几个Wnt和FGF基因在再生azooxanthellate scleractinian (Luz et al ., 2021)。
再生的分子机制的研究珊瑚礁形成珊瑚是一个重要的努力基本生物学和潜在的保护的视角,但非常有限,可能由于实践和技术困难。在这项研究中,我们试图确定基因参与的再生鹿角使用实验室和现场系统。我们的结果显示强烈的相似性转录签名早期伤口愈合的阶段和殖民地的主要边缘蔓延衬底,重新部署符合参与正常生长的分子机制在再生的殖民地。他们也证明Wnt和FGF的参与,但不是在珊瑚再生及途径,符合先前的观察研究珊瑚虫。重要的是,我们的研究结果证明可行性研究的分子和细胞方面的造礁珊瑚在内陆实验室条件下再生。
材料和方法
标本收集、维护和伤害实验
内陆实验:两个殖民地鹿角是来自堪培拉的海洋,采自凯恩斯海洋(昆士兰凯恩斯)和放置在一个闭环海洋水族馆系统研究地球科学学院,澳大利亚国立大学(阿奴),堪培拉。系统中的主油箱测量1.4×2.0×0.4 m,住房是珊瑚,各种同居的海洋生物与摇滚生活”(自然霰石框架作为栖息地范围广泛或海洋生物在海洋水族馆系统)。水运动被迫通过循环泵(波制造商),并通过一个1.2×0.6×0.6 m包含蛋白质回收船底壳,和物理和生物过滤器。自然海水箱保持在27°C, pH值8.1 - -8.4,~ 35毫克/毫升盐度、440 mg / L碳酸钙,磷酸0.23 - -0.5 mg / L。白天/晚上骑自行车(12/12)使用白色和蓝色LED灯照亮。每天的温度波动约±1°C(昼夜温度)。珊瑚被喂以相当于一茶匙的海洋浮游生物(PolypLab礁合成类固醇,美国)悬浮在50毫升的水族馆水每周两次。中断约2毫升是美联储目标每个珊瑚碎片20毫升塑料注射器(HSW Soft-Ject™,德国)又一波制造商被关闭。为实验获得的片段,两个珊瑚殖民地被切成碎片4 - 8厘米高,每个都包含两到三个分支。他们使用金刚石锯切第一殖民地上钻一个小孔®2001 1 - 1/2“EZ锁钻石切割轮(Dremel®,墨西哥)第二殖民地。这些都是粘在插头与礁胶™(Seachem®,美国)。 Fragments were left to recover for a minimum of a week before starting experiments. To create a lesion, one polyp and corallite were cut out from each branch using carbon steel Surgical Scalpel Blade No.15A (Swann-Morton®, England).
海洋站实验:2019年4月,殖民地的鹿角俄耳甫斯岛附近收集从位置、澳大利亚(GBRMPA允许G17/39991.1)。这些殖民地被转移到材料过滤海水坦克与氧气石头和离开前2周恢复实验。
在堪培拉实验相比,俄耳甫斯岛殖民地没有支离破碎。相反,创建病变,一个息肉,珊瑚石/分支切断使用碳钢外科手术刀叶片No.15A (Swann-Morton®,英格兰)。
抽样
组织了在初始伤害操纵被丢弃。为RNA-Seq收集样本分析,病变周围的区域,愈合共肉或息肉再生,以及匹配控制切断后时间轴建立试点期间观察(见图1在结果部分)。获得足够的组织提取,三个样品相同的再生阶段,相同的殖民地被集中在2毫升包含两个3毫米的微型离心机管碳化钨珠(援助后续样品中断,试剂盒猫# 69997),在液态氮冷冻。
图1。实验系统。(A, B)小的分支鹿角胶塞,带有用于抽样表示在图中。(C, D)再生阶段抽样策略(C)之后,(D)息肉形成。(E, F)示例图像单个息肉的跟踪(E)之后,(F)受伤,直到触角的再生息肉变得可见(胃肠道)。比例尺表示1毫米。
RNA提取和质量分析
样本在TissueLyser LT(试剂盒®,荷兰)在50 Hz TissueLyser适配器冷却−20°C。提取了使用试剂盒™试剂使用以下变化:根据制造商的手册样本试剂盒™和氯仿被转移到一个新的1.5毫升微型离心机管含有100μl热压处理过的真空油脂(美国道康宁®)。安捷伦的RNA纳米芯片生物分析仪®2100用于RNA质量和量化分析。
互补脱氧核糖核酸库的准备
互补脱氧核糖核酸数据库准备TruSeq RNA后图书馆装备v2手册(Illumina公司)。总RNA的大约76 - 266 ng /样本被用来准备库,这个范围的下限由RNA之后可用的数量质量和量化分析在初始实验进行补充表1)。图书馆准备后,SPRIselect(贝克曼库尔特)大小的选择是根据用户指南两边大小选择一些变化:Agencourt AMPure XP珠子(贝克曼库尔特)比率0.5×1.2×。库进行分析在安捷伦2100生物分析仪和池获得平等的物质的量浓度。样品被发送到生物分子资源设施(阿奴)单头75个基点测序在高输出flowcells使用NextSeq500 Illumina公司平台。生Illumina公司RNA-Seq读取生成在这项研究已经存入ENA短阅读档案正在研究PRJEB55598 (ERS12852684-ERS12852781样品,ERR10123024-ERR10123121运行)。
差异基因表达分析
读地图
RSEM v1.3.3 (李和杜威,20112)领结v2.5.0短内容调整器(Langmead扎尔茨贝格,2012)被用来映射RNA-Seq读取的答:millepora蛋白质编码基因模型(应et al ., 2019,请参阅补充材料1基因序列的模型用于这个手稿)。从RSEM预期数量的用于执行差异表达基因的检测和分析,侧重于蛋白质编码的基因。
差异表达基因的识别和可视化
分析了在R v4.2.2刨边机v3.40.0 (陈et al ., 2016),Limma v3.54.0 (里奇et al ., 2015)后包协议法律et al。(2016)。实验不完全区组设计实现了样品的类型(阶段1、2、3、4和共肉)设置为固定效应模型中直接矩阵,和阻碍因素(副本和殖民地)设置为与duplicateCorrelation pairing-block Limma()函数。显著性水平的差异表达基因的检测被设定为0.05 (BH调整p使用价值),最低记录2褶皱变化是1 /−1(细节R amil_dge.R补充文件)中提供的代码。
文本注释
翻译答:millepora基因模型被注释的基因名称前blast-p以前功能注释答:digitifera基因模型(Shinzato et al ., 2011)。增加FGF的特异性和Wnt配体注释,答:millepora序列注释等被用来进一步恢复答:digitifera和n vectensis蛋白根据其序列相似性(blast-p)。的智人Wnt或FGF配体从UniProt被添加到cnidarian序列,和两套多重序列比对中创建ClustalX 2.1 (拉金et al ., 2007)。比对被手动编辑删除不同的段。最大似然系统发育树计算RAxML 8.2.11使用PROTGAMMAAUTO模型(允许RAxML选择最好的可用的模型;LG模型选择Wnt和FGF)配体的排列中,快速引导100人。引导的共识树带注释的值显示在Mega7 (Kumar et al ., 2016)。
基因本体论浓缩
去与InterProScan条款与基因模型(Quevillon et al ., 2005),浓缩分析与TopGO v2.50.0 (Alexa et al ., 2006)使用“weight01”与费舍尔统计算法和应用0.05p价值意义切断(细节R amil_topgo.R补充文件)中提供的代码。
基因表达谱的聚类
基因表达谱与Clust集群1.18.0。Clust运行生成的磨边机规范化使用默认参数除了闷参数t log-cpm值设置为0.5和正常化的自动选择方法(选择z分数分位数正常化,代码101 4;Abu-Jamous和凯利,2018)。
结果
分段的伤口愈合和息肉再生
完整,健康鹿角片段有棕色的颜色(由于存在黄藻)和明确的息肉:一个大的和对称的轴向息肉的每个分支,一些小的(最近发达)径向尖端附近的息肉,并充分开发径向息肉沿着分支(均匀分布图1一个,B)。息肉触角可以延伸或收回,根据最近的时间或干扰(图1一个- - - - - -E)。在实验片段连接到插头,共肉在附件地区形成了一个“裙子”;共肉边缘塞表面的生长传播(图1 a, B)。在长期的文化中,息肉也可以形成共肉覆盖插头,但从未直接在边缘(没有显示)。
选择可能的时间点和适当的控制基因表达分析在再生期间,我们最初低放大率进行微观的观察实验受伤的碎片。选址一个径向息肉和它的珊瑚石,大约3 - 5个息肉的分支,被用手术刀叶片创建病变(图1一个,B)。受伤后,第一个小时内没有任何明显变化,暴露碳酸钙骨骼清晰可见伤害的网站(图1 f)。我们非正式地将这个阶段称为“粗糙”反映的外观和将这个阶段称为第一阶段的再生。具有抑制受损,延伸到24小时伤口表面看起来光滑,共肉显然愈合的碎片(图1 g);我们称此为第二阶段。在第三阶段(48小时),从第二阶段没有明显的形态学变化,与半透明(zooxanthellae-poor)覆盖伤口的组织(图1 h)。第一形态变化-形成息肉再生的触角可以观察到3至10天post-wounding (图1我)。
重要的是要注意,最初的半透明的自然再生的珊瑚组织问题时确定触角的存在,所以触角只能确定当黄藻变得足够丰富的触角,使它们清晰可见。因此,实际的触手形成可能发生早于注意到在一些样品。在前三个阶段是由再生时间(分别为6、24、48 h),我们只用息肉触手可见代表第四阶段在我们的分析。在一些分析另外分离阶段4样品到更早的阶段,只有触手可见(4 a)和后面的一个完全再生息肉(4 b)。
鉴于潜在的不同细胞类型(和/或比例相同的细胞类型)构成息肉共肉,以及预期的积极增长之间的基因表达差异及non-growing组织,我们采取了不同的控制样本识别基因在再生(见具体变化的表达式补充表1样品使用的细节)。因此,对于阶段1 - 3(息肉再生成为可见之前),共肉样本息肉之间的区域(我们称之为“共肉”为简单起见整个手稿)样品和积极发展共肉从片段的边缘(“共肉边”)作为控制(图1 c)。第四阶段(当息肉再生的触角是明显)以下样本作为控制:一个完整的从同一水平径向息肉再生息肉,一个年轻的类似大小的息肉再生息肉,完整的息肉之间的轴向息肉和共肉(图1 d)。
在伤口愈合和息肉再生基因表达的变化
我们伤害实验进行片段来自两个殖民地在一个封闭的水族馆系统在堪培拉和两个殖民地在一个开放的俄耳甫斯岛(材料)系统(见部分材料和方法的详细描述这两个系统)。因为小息肉的大小,因此低组织病变周围的卷,三个组织碎片从同一个殖民地(通常,相同的分支)为每个样品池。鉴于每个单独使用的殖民地是来自野外,我们考虑样本来自不同的殖民地生物复制,与样本来自不同片段的殖民地,我们认为技术复制。当我们最初的目的是为每个生成技术和生物复制再生阶段及其匹配控制,需要池导致较低的样本数量的复制。总的来说,我们至少有两个技术复制每个样本生成类型殖民地,和至少三个生物复制为每个样本类型(补充表1和补充图1)。
作为实验的评估质量的第一步,我们把整个基因资料设想为多维定标(MDS)情节。在第一和第二维样品集群由殖民地的起源而不是样本类型(图2)。特别是,堪培拉两样本形成两个独立的集群,而俄耳甫斯殖民地聚集在一起,或许反映出近的遗传相似性(甚至身份)俄耳甫斯殖民地。有趣的是,再生阶段1和共肉边缘样本似乎隔离从殖民地的剩余样品1(我们生成的最多数量的样品)。
图2。多维标度图(尺寸1和2)RNA-Seq样品代表的再生答:millepora。殖民地1和2被安置在一个封闭的系统在堪培拉,殖民地从开放系统三个和四个俄耳甫斯岛。
我们下一个维度的MDS图生成3和4在这些维度型表达式签名是否会推动集群(图3)。引人注目的是,再生阶段1共肉边从剩余的样本似乎隔离的样本尺寸4,表明这些样品是不同于其余的人,或许相似。剩余的样品相互混合,表明缺乏强大的基因表达特征区分样本类型,尽管第二阶段样品都是相对接近的阶段1和共肉样品边缘。
图3。多维标度图(尺寸3和4)RNA-Seq样品代表的再生答:millepora。殖民地1和2被安置在一个封闭的系统在堪培拉,殖民地从开放系统三个和四个俄耳甫斯岛。注意在再生阶段1和共肉边隔离其他样品的样品尺寸4。
找出inter-colony差异是否模糊基因表达变化受伤害,我们还分别为殖民地所生成的MDS图1和2,以及堪培拉和俄耳甫斯岛殖民地。在所有这些情节,隔离或阶段1和共肉边缘其他样本类型样本分别在第一和/或第二维度(补充图1),并没有进一步的分离检测到其他维度(没有显示)。这个结果表明,最早的伤口愈合(阶段1)并积极增长(coeanosarc边缘)是唯一的样品类型明显有别于其他样品在转录组水平。
聚类分析在再生的基因表达谱
洞察分子事件在伤口愈合和息肉再生,我们进行了聚类分析的基因表达谱,紧随其后的是基因本体论(去)富集分析。旨在生成一个简单的表示一个息肉再生时间的课程,我们排除了共肉边缘和轴向息肉样本分析。时间进程始于共肉样品,包括所有再生阶段,处处与径向息肉样本。符合的MDS可视化表示,只有共肉边和再生阶段1样品不同于其他人,只有两个集群配置文件被识别,每个显示显著的基因表达变化的最早阶段再生,和其他稳定表达所有其他的样品(图4)。第一个概要,C0,包括2818个基因由6 h后损伤强烈表达下调(再生阶段1)并返回到以前的水平表达的24 - 48 h后损伤(再生阶段2 - 3)。基因本体论(去)浓缩在这集群包括信号转导以及胞外分泌与DNA修复和复制。这些可能是过程内稳态/维护细胞表达下调在伤口愈合。第二个集群,C1,由2050个基因强烈调节损伤后6 h(阶段1)回到先前的表达水平,24 - 48 h后损伤(阶段2 - 3)。丰富条款与这个概要文件显示增加核糖体生物起源、拼接、翻译和蛋白质折叠,以及蛋白水解作用和细胞骨架重组发生损伤后不久图4)。
图4。基因表达的集群(上)和生物过程确认为基因本体论(底部)在与他们相关的术语答:millepora伤口愈合和息肉再生。黑和蓝线显示单个基因的表达谱中包含集群。第一阶段的基因表达显著不同的突出价值p≤0.05)-低C0和更高的C1 -所示蓝色、黑色和那些不显著不同的表达式。红线代表意味着从所有的基因表达谱计算集群中。
差异表达基因
我们进行下一个直接成对基因表达水平比较再生样品及其匹配的控制(即第一阶段、第二阶段和第三阶段和共肉;第四阶段和形态之间的年轻和径向息肉)以及不同地区的殖民地(共肉边和息肉和共肉,轴向息肉与径向息肉)。符合MDS图的数据可视化和上述聚类分析,我们发现了数以百计的阶段之间的显著差异表达基因1和共肉边共肉相比,只有不到20个基因差异表达每个人的剩余阶段再生(补充表2)。
鉴于再生阶段1和共肉样品边缘出现相似MDS图可视化(图3),我们的检查是否有确认是常见的这些样本之间的差异表达基因。事实上,105个基因被发现在阶段1和共肉(总658)和共肉边和共肉(总404;补充表2)基因列表。值得注意的是,当我们只比较列表在统计上的显著差异表达的基因,有可能共享相同的重叠基因表达趋势没有达到阈值的意义。
了解生物过程发生在再生的最早阶段,我们进行基因本体论(去)浓缩问题的分析。基因调节再生阶段1的出现与转录调节密切相关,信号转导和发展。此外,所确定的条款包括三个具体的信号系统,众所周知参与伤口愈合和再生整个动物王国:Wnt(例如,川上et al ., 2006),FGF信号通路(例如,Maddaluno et al ., 2017)和物联(例如,无性系分株et al ., 2002;图5)。
图5。生物过程识别为基因本体浓缩方面显著调节基因在再生阶段1共肉相比。
我们已经选择下一个39第一阶段调节基因曾基于爆炸发生的有意义的注释(包括转录因子、组件的信号通路和基因与珊瑚骨骼形成,明白了补充表2在所有样本)想象他们的表达谱。
与丰富的条款,其中包括四个FGF配体,一个FGF拮抗剂(sprouty),一个Wnt配体和一个Wnt通路组件(wntless) galaxin(组件有机基体的珊瑚骨骼,例如,Reyes-Bermudez et al ., 2009),ADAMTS metalloproteases,属于一个组蛋白酶发现参与ECM重塑跨门(例如,Kuno Matsushima, 1998)和以前参与cnidarian再生(谢弗et al ., 2016;斯图尔特et al ., 2017),和一些转录因子包括c-Fos监管物联和参与损伤响应(例如,无性系分株et al ., 2002)。热图表示的表达式表明,在多数情况下,言论恰逢峰值再生的第一阶段,尽管许多也调节共肉边(图6)。类似于基因表达聚类分析发现的资料,而显著下降与第一阶段相比,这些基因的表达仍在升高阶段2或者3。
图6。选择基因的表达的热图那些高度调节再生阶段1。样本池根据再生阶段和殖民地的部分。颜色表示(红色)增加或减少在表达式基于z分数(蓝色)。直方图显示的热图上的z分数的分布。
有望从基因差异表达的部分重叠的列表再生阶段1和共肉边(共肉相比),共肉边调控基因的富集分析显示类似的和惊人的对比。在再生的情况下,基因调节共肉边缘与调节转录和细胞信号,可能反映了活跃的增长优势(图7)。然而,尽管共肉的边缘顶部生物过程所示去浓缩分析钙离子跨膜运输(可能与活跃的珊瑚钙基骨架的形成),这个词没有出现在再生丰富。这个结果符合认为转录反应损伤不仅重新部署基因增长。
图7。生物过程识别为基因本体浓缩方面显著调节基因共肉边缘样品共肉相比。
严格的分析(仅限于基因与统计上显著的双重表达变化)显示多个基因可能是调节再生的早期阶段scleractinian珊瑚。然而,我们都知道,小样本大小和批处理(殖民地)可能影响从而排除其他基因检测过程中如果变化的表达式或水平较低和/或更多的变量。我们想知道是否包括所有样品检测分析增加我们的力量的差异表达基因,或者,相反,实验条件之间的潜在差异(和/或殖民地差异)是模糊的表达变化反应损伤。我们因此生成和比较度获得列表只使用封闭的样本(殖民地1和2)和开放(殖民地3和4)实验系统(补充图2)。分析只使用子集的数据导致低数量的差异表达基因检测,特别是当只使用殖民地3和4的最低数量的复制。重要的是,超过68%的度中标识condition-limited分析也发现当使用整个数据集(补充图2),表明越来越多的复制,即使这些生物不同,种植在不同的系统中,增加了检测的分析。
值得注意的是,即使是分析限制在低数量的复制指着FGF的重要性和Wnt通路在最早的一步答:millepora再生。因此,我们决定想象表达这两个核心组件的信号通路答:millepora再生时间和不同地区的殖民地。基于答:millepora转录组注释,我们确定了16种配体(补充图3),三个受体和FGF通路的两个对手。
可以看到在表达式的热图,所有21个基因显示动态表达式在殖民地的再生和/或形态独特的部分(图8)。
图8。表达式的热图的核心组件答:milleporaFGF途径。样品池部分根据再生阶段和形态不同的殖民地。颜色表示(红色)增加或减少在表达式基于z分数(蓝色)。直方图显示的热图上的z分数的分布。
符合前面的分析,第一阶段的再生和共肉刃最强FGF表达途径组件总体而言,与16的组件显示峰值的表达这两个阶段的一个(或两个)。值得注意的是,只有一个(FGFRb的表情图8)的确定三个FGF受体遵循这一趋势,与剩下的两条明显下调在早期阶段的再生和共肉边(图8)。表达的高峰的sprouty拮抗剂在早期再生阶段,共肉边与峰值一致的FGF信号活动在这些阶段中,在其他实验系统的表达sprouty已被证明是积极的监管途径活动(例如,Minowada et al ., 1999)。有趣的是,无论是sprouties,但一些FGF的配体和两个FGF受体调节再生显示三种不同的息肉类型之间的微分表达式我们包含在分析(年轻、径向和轴向)。这个结果的解释必须谨慎,鉴于我们严格的分析未能识别息肉类型之间的显著表达差异,我们还没有看到这些样品隔离在MDS的情节。
接下来,我们的视觉表达的Wnt配体(补充图4),连同Wntless(蛋白质参与Wnt分泌),β-连环蛋白和APC中我们已经发现调节再生阶段1 (补充表2,图6)。除了预期的峰值在再生的第1阶段(6 Wnt配体,其中一个被发现的差异基因表达分析),4实际上Wnt最高表达阶段3,伤口愈合后阶段完成,息肉触须出现之前,可能指示作用模式(图9)。有趣的是,三个Wnt转录调节共肉的边缘,两个也调节的最早阶段再生,但表达Wnt10a-like出现下调。鉴于在Wnt Wntless分泌的重要作用(Banziger et al ., 2006),重要的是要注意,虽然它的表达明显峰值再生的最早阶段,这也是提升共肉边缘和在阶段2和3的再生,与Wnt通路参与增长一致,伤口愈合和再生(图9)。
图9。表达的热图答:milleporaWnt基因和Wnt通路的核心组件。样品池部分根据再生阶段和形态不同的殖民地。颜色表示(红色)增加或减少在表达式基于z分数(蓝色)。直方图显示的热图上的z分数的分布。
我们下一个试图识别基因参与息肉形态发生和那些负责形态差异径向和轴向息肉。没有统计上显著差异表达基因被发现在以下比较:轴向与径向息肉,轴向息肉和共肉,第四阶段(当触手可见)比任何息肉。只有16个基因被发现之间的差异表达阶段4和年轻的息肉和共肉之间共肉和43基因(补充表2)。有一种强烈的这两个表之间的重叠,与9个基因调节两种类型的样本,其中包括编码神经肽RF-amide,也是确定为唯一的基因明显不同表情之间的径向息肉和共肉(补充表2)。RF-amide一样,这是一个值得关注的发现以及在年轻的息肉,LW-amide调节神经肽以前是专门表达的神经系统答:millepora,主要集中在口头地区和触须(阿滕伯勒et al ., 2019)。基因编码的受体肽激素和神经递质也发现调节在年轻的息肉,也可能与神经系统有关,是多种转录因子。在可见的热图表示的表达式(图10),大多数的这些基因也表达高于共肉在再生和成熟的息肉,尽管这upregulation不够显著或高我们可以探测到严格的分析。
图10。选择基因的表达的热图确认为调节在最近成立的息肉(年轻)答:millepora。样品池部分根据再生阶段和形态不同的殖民地。颜色表示(红色)增加或减少在表达式基于z分数(蓝色)。直方图显示的热图上的z分数的分布。
讨论
再生scleractinian珊瑚从生态环境的角度很重要,特别是考虑到增加礁框架破坏事件的强度和频率。也从根本上有趣的从发育和再生生物学的角度,考虑到相互关联的持续增长和再生能力是这个家族的特征。在这里,通过发现基因在再生和比较他们那些参与增长过程,我们旨在了解到再生的分子背景答:millepora。
(有时是唯一)的第一步的再生是伤口愈合。在所有的动物伤口愈合的能力,它是一个相对快速组织损伤后修理/改造的过程,旨在防止感染和接触组织的进一步损失。刺丝胞动物模型系统中,如明星海葵Nematostella vectensis、伤口愈合和再生,包括免疫反应,细胞凋亡和细胞增殖,正如前面记录跨不同两侧对称动物物种(例如,等级et al ., 2014)。等与碳酸钙刺丝胞动物骨骼scleractinian珊瑚,伤害引起的骨架会导致额外的脆弱性霰石溶解在周围海水(Frear和约翰斯顿,1929年)。因此,为了防止损失的骨架以及减少感染的风险,受损的共肉必须迅速扩展到整个伤口表面。重要的是,正常珊瑚生长的关键要素之一是共肉的扩展衬底附件的边缘地带。这种增长是观察年轻殖民地来源于变质幼虫,以及建立殖民地的碎片。共肉边缘的快速增长使珊瑚能够种植在基质和扩展它们的栖息地(Forsman声称通过et al ., 2015)。
我们问是否伤口愈合答:millepora利用同样的基因工具箱中使用共肉边增长,还是一个独立的网络部署愈合特定基因损伤。特殊性的问题再生与正常发展/增长计划仍然是一个令人着迷的超过一个世纪(带来的挑战摩根,1901;看过的Vervoort 2011最近处理等Soubigou et al ., 2020;约翰斯顿et al ., 2021;Sinigaglia et al ., 2022)。
可以预期如果使用一组相似的基因在两个过程,多维标度(MDS)情节表明共肉边(持续增长)和最早的伤口愈合阶段更相似又要剩下的样品(图3)。此外,符合他们先前描述的角色在其他实验系统,包括刺丝胞动物(例如,等级et al ., 2014;斯图尔特et al ., 2017),组件的Wnt和FGF通路都强烈调节共肉边和再生阶段1 (图8,9,补充表2)。
我们已经提出,因为答:millepora标本不断增长的有利条件,重新部署的“增长基因”是一个可能的情况,或许加上额外的基因参与清算和改造受损组织的损伤。令人惊讶的是,我们发现只有16%的基因调控反应伤害也发现差异表达之间的积极增长共肉边和更多的“静态”(而不是扩大)共肉之间成熟径向息肉。相反,有26%的基因差异表达共肉边和between-polyps共肉也发现参与伤口愈合。
正式,这些明显的差异不是由于真正的基因表达的差异,但我们的能力来识别差异表达基因有足够的统计学意义。然而,candidate-centred方法,我们形象化的表达Wnt和FGF路径组件以及特别有趣的基因识别为调节再生的最早阶段建议否则(图6,8,9)。事实上,尽管一些FGF配体,转录因子(例如,NK2)和metalloprotease ADAMTS18-like是调节共肉边和再生的早期阶段,很明显,调节其他基因是独立的在这两个过程。因此,我们得出结论,在调节基因的使用之间存在相似性生长和再生,这些过程显然是不同的。
最引人注目的例子之一的基因的最早阶段再生过程中使用独特的转录因子c-Fos (补充表2和图6)。c-Fos已经涉及到多模型系统的损伤和应激反应,包括n vectensis(科瓦奇,2008;等级et al ., 2014)。除了直接识别c-Fos专门调节再生的最早阶段期间,我们还发现物联与这个过程通过基因本体论(去)富集分析(图5)。这是有意义的,因为已知物联调节c-Fos在两侧对称(例如,无性系分株et al ., 2002)。虽然c-Fos参与cnidarian伤口愈合并不是一个新发现,我们相信,我们能够发现这个在无偏(不是candidate-driven)分析造礁珊瑚证明答:millepora是一个有效的模型再生生物学研究甚至在内陆实验室等我们的。此外,结果在实验室条件下可以与更自然相结合,主要材料海洋站系统,强调在不同的遗传学实验重现性和实验条件。我们希望答:millepora和其他scleractinian珊瑚将进一步提供有用的模型来解决问题在发育和再生生物学,比如基因(和/或表观遗传)机制管理殖民地单位的身份(例如,轴向和径向息肉),不同成员的珊瑚共生功能体之间的相互作用在不断变化的环境条件和角色特定细胞类型的生长和再生。
数据可用性声明
生Illumina公司RNA-Seq读取生成在这项研究已经存入ENA短阅读档案正在研究PRJEB55598 (ERS12852684-ERS12852781样品,ERR10123024-ERR10123121运行)。
作者的贡献
MAdamska, JX, OM、MAdamski和DM:项目设计。JX:实验室实验。JX我:现场工作。JX、MAdamska MAdamski、OM、CC:数据分析和解释。JX、MAdamska MAdamski、CC和OM:手稿写作。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
支持的工作是通过卓越中心弧CE140100020珊瑚礁研究。
确认
我们感谢支持s Eggins m·埃尔伍德o·布兰森,他和我们分享了他们的盐水水族馆系统研究地球科学学院,阿奴,以及优秀的技术人员的支持俄耳甫斯岛研究站。我们感谢耶稣基督荣誉委员会成员:大肠球,a . Fahrer和g . van Dooren刺激讨论整个项目的持续时间和华应分享答:millepora在出版之前基因模型。测序的样品进行生物分子研究设施,阿奴,这是一个服务节点Bioplatforms澳大利亚。项目已经通过卓越中心由弧CE140100020珊瑚礁研究。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2022.979278/full补充材料
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关键词:珊瑚、再生,伤口愈合,FGF信号通路,Wnt信号通路,安全系数
引用:徐J,米德O,莫亚,卡C,米勒DJ,亚当斯基米和Adamska米(2023)造礁珊瑚的伤口愈合和再生鹿角。前面。生态。另一个星球。10:979278。doi: 10.3389 / fevo.2022.979278
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