继承的肠道微生物群数量Macrotermes subhyalinus(白蚁科)殖民地基金会给洞察共生体的传播
米歇尔·迪乌夫
1
*
__,
文森特Herve
2
__,
苏菲Frechault1,
乔西Lambourdiere
3、4,Abdoulaye Baila Ndiaye5,
爱德华Miambi
1,
阿米莉亚Bourceret
3,
我的粪便Jusselme
1,
Marc-Andre Selosse
3、6
__和科琳Rouland-Lefevre1
- 1部门ECOEVO, d 'Ecologie et des科学研究所de l 'Environnement巴黎(ie,巴黎),巴黎大学完成,完成Cedex,法国
- 2INRAE、benoir UMR表示食物,大学Paris-Saclay, Palaiseau,法国
- 3UMR 7205 - isyeb (de Systematique研究所,进化,Biodiversite、CNRS MNHN, UPMC, EPHE),国家d国立博物馆,巴黎索邦大学,巴黎,法国
- 4UMR北风(ird MNHN cnrs - 7208——207年,巴黎索邦大学,UCN, UA),大学des安的列斯群岛,Pointe-a-Pitre,法国
- 5Laboratoire de Zoologie des Invertebres Terrestres,研究所Fondamental逃往中部角a .迪奥普(如果Ch安踏迪奥普)逃往大学安踏迪奥普de达喀尔(UCAD),塞内加尔达喀尔
- 6植物分类学和自然保护,Gdańsk大学Gdańsk,波兰
白蚁共同演进与一个复杂的肠道微生物群组成的独家居民类群,但关键的力量维持独家合作仍知之甚少。潜在的主要数量能垂直传播他们的肠道微生物群(mycobiome和bacteriome)后代研究使用殖民地从群集field-derived有翼的基础Macrotermes subhyalinus。Metabarcoding基于真菌内部转录间隔区(ITS)地区和细菌16 s rRNA基因被用来描述数量mycobiome和bacteriome殖民地的基础。云集的有翼的不同于工人的mycobiome大白蚁亚科内随机变化和采样时间点之间,强调没有紧密联系与肠道的栖息地。的真菌外共生生物Termitomyces失去了早期肠道的数量,确认没有垂直传染给后代。与真菌、有翼的镜像的bacteriome Macroterminae的工人。属关键和核心辣子鸡继承了母亲的殖民地主要是坚持肠道内繁殖,直到工人的出现,使他们的垂直传播和解释为什么他们后代中发现了工人。这些发现证明了父母的传播可能会大大有助于维护bacteriome及其与白蚁宿主共同进化在短时间尺度。
介绍
白蚁已经建立了非常密切的共生与微生物的相互作用。白蚁肠道微生物群的主要是由细菌和古菌的大家庭白蚁科(也称为“高等白蚁”),和相同的微生物+原生动物放在较低的白蚁。“这些共生体至关重要的是有助于白蚁消化木质纤维素化合物的特殊能力和利用各种资源,从木材到土壤有机质(布伦,2014)。丰富的文学白蚁共生(Bignell 2016尤其是)表明,肠道微生物群的独特性及其与宿主共同进化,可能促进社会组织的白蚁,如社会蜜蜂(邝et al . 2017;苏et al . 2021)。
先前的研究认为肠道微环境条件和饮食如何影响肠道微生物群(Mikaelyan则et al ., 2015,2017年)。与此同时,其他研究强调垂直产业的重要性,因此连接微生物群和主机的发展史(Hongoh et al ., 2005;野田佳彦et al ., 2007;阿卜杜勒·拉赫曼et al ., 2015;迪乌夫et al ., 2015;米肖德et al ., 2020;Arora et al ., 2022)。最全面的研究的主持人类群透露,白蚁微生物群主要是由混合母婴垂直传播的传播方式,它结合了父母的后代和频繁的殖民地水平转移(布吉尼翁et al ., 2018)。重要性水平转移,是一次性事件,它是合理的累积效应在漫长的进化历史的白蚁(约1.5亿年;恩格尔et al ., 2009;布吉尼翁et al ., 2014;Bucek et al ., 2019)。因此,评估的实际传输共生体在每一代应该精确的微进化意义和白蚁微生物群在短时间尺度(da Costa和保尔森,2018年)。
大白蚁亚科的共生白蚁科也称为真菌生长的sub-family白蚁,已被广泛研究,但肠道共生体的传播(在个人层面)和真菌外共生生物记录(在殖民地级别)仍然不佳。大白蚁亚科有一个ectosymbiotic与plant-degrading真菌属的关系Termitomyces(Agaricomycotina;Rouland-Lefevre 2000)。每一代的后代工人经常获得真菌从环境中,导致频繁的主机切换(Aanen et al ., 2002;迪乌夫和Rouland-Lefevre, 2018)。从进化的角度来看,一些理论之间的类比可以混合模式的传播肠道共生体(布吉尼翁et al ., 2018在大白蚁亚科)和真菌。然而,尽管的孢子Termitomyces能生存在自然长时间,细菌共生体的生存,包括许多厌氧血统消化道外,可能会限制水平转移。
理解在真菌生长白蚁肠道微生物群的建立初期的殖民地的基础在colony-to-offspring每一代可能提供有价值的信息传输,因此,持久性的共生体的微进化这些白蚁。新殖民地的基础从群集的飞行有翼的开始,与完整的翅膀(成熟的数量图1)。后形成的夫妻,有翼的翅膀(成为脱翅昆虫),找到一个合适的基础,并开始交配后挖出地下最初殖民地室称为copularium庇护的地方窝。第一批鸡蛋是殖民地开始铺设4至15天后,第一个后代幼虫和工人之间出现21岁和46天,52和80天之间,分别为(格拉斯和Noirot, 1955;Okot-Kotber 1981;Harit et al ., 2016;米切尔,2020)。先前的研究数量的白蚁科发现有翼的一窝蜂地从母亲殖民地和一套完整的主机微生物群(Hongoh et al ., 2006;迪乌夫et al ., 2018)。然而,目前尚不清楚是否gut-specific血统持续和重叠与后代发展足够可靠地传输。首先,启动殖民地之间的长时间延迟基金会和后代的出现可能是一个潜在的障碍这一有效转移。第二,摄食行为的数量在这漫长的时期是不利的。事实上,与较低的白蚁数量不同,在殖民地的基础上,继续喂这些白蚁科停止喂养(上螺母,1969;汉和摘要簿,1982;格拉斯,1984)并画出所需的能量吸收的脂肪体和无用的腋下肌肉。鉴于饮食的关键作用的微生物群(Mikaelyan则et al ., 2015),禁食可能会导致失去最初的微生物群。
图1。简化的发展周期Macrotermes subhyalinus。红色箭头表示生殖种姓的发展途径。后代的出现阶段的时间表从自己的观察和中以粗体显示斜体为Macrotermessp.从文学。
除了有翼的,生殖种姓的微生物群白蚁科只有年迈的国王和王后得到解决(保尔森et al ., 2014;大谷et al ., 2019)。后期阶段,微生物群的一个或很少的主导地位主要细菌血统,防止外推的作用数量传输和持久性的共生体。与肠道微生物群相比,真菌的传播外共生生物大白蚁亚科已收到更多的关注。一种方法是检查真菌无性孢子(分生孢子)摄入的真菌梳母亲殖民地的单性生殖坚持他们的肠道,并允许有效的原始菌接种在lab-founded殖民地库姆斯(金沙,1960;约翰逊,1981;Johnson et al ., 1981;员工1983人)。在几个Macrotermes物种,原始的起始梳子发生约90 - 95天(格拉斯和Noirot, 1955;柯林斯,1977;理和达灵顿,2000年),一旦第一分化工人可以收集植物,这是足够长的时间来危害真菌繁殖体的可行性。最近的研究而不是解决这个问题间接通过host-fungus co-cladogenesis(审查通过迪乌夫和Rouland-Lefevre, 2018)。最后,除了少数物种主要来自属Microtermes和物种Macrotermes bellicosus的真菌共生体水平被认为是获得从周围环境(Aanen et al ., 2009)。
我们的研究的目的是评估潜在的数量,以确保后代的实际转移他们的微生物群。在这方面,我们专注于一系列微生物群数量(mycobiome和bacteriome)在早期殖民地的基础而关注其肠道形态学作为摄食行为的一个代理。真菌生长的白蚁Macrotermes subhyalinus被用作模型来研究一系列消化bacteriome mycobiome,特别注重Termitomyces已报告在这个物种传播水平(Johnson et al ., 1981;Vesala et al ., 2017)。深的扩增子和taxon-specific PCR测序Termitomyces被用来监控mycobiome和bacteriome肠道的数量能从大量的飞行的出现首先分化工人和copularium。
材料和方法
白蚁采样和殖民地的基础
白蚁收集Diamniadio附近,位于达喀尔(塞内加尔)以东30公里。数量能被捕获在蜂拥从两个不同的殖民地的班机Macrotermes subhyalinus(1和2)殖民地殖民地和物种同域的殖民地之一Microtermessp.挤在同一时间。有翼的的Microtermessp,特别是女性携带condidia已知Termitomyces接种的梳子被视为积极的控制。这采样时间,视为零时间称为“有翼的”在这个手稿。对于野生的殖民地m . subhyalinus,工人们也收集比较他们的bacetriome bacteriome有翼的。在大多数Macrotermtinae物种,工人的种姓m . subhyalinus包含两个不同的形态类型有不同的任务和喂养行为:主要人员(更大的工人,开发从雄性幼虫)和次要的工人从雌性幼虫)(小工人开发(Badertscher et al ., 1983)。在实验室(IRD-ISRA研究中心位于洛杉矶,达喀尔),允许有翼的形式对。然后他们折断翅膀,每一对被隔离和转移到一个单独的LAB1盒(60 x45x50 mm, VWR国际,LLC)部分充满滋润non-sterile土壤中收集的研究中心。个人从殖民地基金会中称为“脱翅的手稿。殖民地的基础都是建立殖民地1的使用数量m . subhyalinus。二百三十年殖民地建立和保存在一个适合热带气候的termite-rearing房间。土壤的水分是定期检查,必要时调整通过润湿棉花球放在土壤表面与无菌蒸馏水。没有后代不育种姓(工人和士兵)被发现在殖民地撤回从0到60天,在未经加工的殖民地和没有觅食的跟踪观察到在这个时期。不同的后代种姓(工人和士兵)出现在几乎所有的活跃天60到90之间的基础,和觅食活动的工人通过觅食隧道是可见的。从天90年,殖民地转入LAB2饲养盒(90×60×50毫米)更适合人口规模和美联储non-sterilized小麦吸管。
分子微生物群的分析,三个不同的殖民地撤回在0(有翼的)10、30、45、60和120天。copularoum样本120天并行分析以确保消化共生体排便数量能在周围没有茁壮成长。
肠道的测量尺寸,9殖民地撤回在每个采样时间点,即,at 0, 45, 60, and 75 days, leading to 6–9 properly dissected guts for each sex, except for the sampling time point 60 days where fewer colonies were considered. The sex of the collected individuals was always checked based on the configuration of the terminal sternites of the abdomen (Weesner 1969)。很少有错误的配对。,same sex couples, occurred and were discarded from analyses.
解剖的白蚁数量和工人从母亲殖民地
有翼的喷雾,然后在无菌蒸馏水冲洗三次。脱翅的表面从殖民地基础也打扫干净了。然后,生物安全柜,整个肠道被无菌使用好,无菌剪刀和单独放置到1.5毫升无菌超小型电子管。正如前面指出的,对于每一个性爱,三个复制从三个不同的殖民地基础分子被认为是在每个采样时间点分析。主要和次要的工人,同时收集大量的有翼的相同的殖民地m . subhyalinus,整个肠道的工人被无菌使用无菌钳。对于每一个形态类型,进行DNA提取从池10勇气。
期间肠道菌落的大小测定的基础
评估肠道大小的变化对殖民地的基础的时候,女性和男性数量能被切割如上所述,使用变焦拍摄立体显微镜SMZ1000尼康校准在相同的规模。图像被转移到一个连接电脑通过相机(数字景象,DS-U3,尼康)和处理软件NIS-Element(基础研究,4.0版)从尼康(尼康仪器公司)来衡量整个肠道的长度,最具代表性的肠道部分(后肠段和大肚子小节)。我们也使用的方法岛田et al。(2013)测量的宽度最扩大大肚子的一部分(补充图S1)。
DNA提取
个人白蚁肠道有翼的和脱翅的,或池10勇气职工形态类型来自母亲的殖民地与无菌聚丙烯杵碎1.5毫升超小型电子管包含DNA提取的裂解缓冲工具包(NucleoSpin®DNA昆虫工具包,Macherey-Nagel GmbH & Co .公斤)。然后,肠道匀浆被转移到NucleoSpin®珠管为一个额外的溶解与FastPrep一步bead-beating®-24高速搅拌器(MP生物医学)。随后的DNA提取步骤进行后,制造商的指示。DNA的产量和纯度进行分析以nd - 1000分光光度计(NanoDrop产品,威明顿,美国)。相同的DNA提取协议是应用于copularium最后采集到的样本的实验(120天)。dna分析进行整除10 ngμL调整−1对所有样本。
Taxon-specific PCR针对共生真菌Termitomyces在肠道的数量
我们第一次相比的性能几个聚合酶酶pcr扩增的内部转录间隔区(ITS)的核糖体DNATermitomyces特殊技能底漆ITS1FT (Aanen et al ., 2007)结合ITS4R (白色et al ., 1990)。端点PCR反应是运行在25μl包含0.5μM对于每个引物,根据条件和定义的热循环Aanen et al。(2007)。的Illustra PureTaq (PCR珠子,通用电气医疗集团)是最敏感的,生产检测扩增子浓度低于20 pg。μL−1从纯粹的菌丝体与DNA提取Termitomyces。以下PCR反应扩增子被电泳检查到TAE 0.5 x缓冲琼脂糖凝胶(1.5% (w: v)包含DNA染色染料GelRed (GelRed®核酸凝胶染色,Biotium, VWR国际有限责任公司)。紫外线trans-illuminator (GenoSmart VWR)允许积极PCR-bands的可视化。检查对应的扩增子的Termitomyces,一些乐队被随机切除和测序。对应的序列是在加入数字MN400299-MN400306基因库中引用。对于每个采样时间点,12到16个人m . subhyalinus为每个性进行测试。结果显示积极文章的比例在每个时间点。
比较分析肠道bacteriome的有翼的和工人使用Illumina公司从野生殖民地MiSeq metabarcoding
DNA样本小的内脏和主要员工,和有翼的调整3.5 ng /μL,然后纯化Ampure XP珠子(Agencourt,贝克曼库尔特,美国)。PCR扩增进行每个样本一式三份的引物对28 f / 338 r (张et al ., 2018)核苷酸特定于每个样本的标记组合。这些引物目标v2 v1,超级细菌16 s rRNA的可变区域的基因。PCR反应进行的25μl混合物:10 ng的DNA模板,1 x不完整的缓冲区,0.3%的牛血清白蛋白,2毫米MgCl2, 200毫米核苷酸,300海里的正向和反向引物和2 U的DFS-Taq DNA聚合酶(Bioron,路德维希港,德国)。使用下面的程序:在5分钟95°C,然后30 94°C的周期为1分钟,1分钟55°C, 72°C 1分钟30年代,完成10分钟在72°C。扩增子一式三份的汇集,检查在琼脂糖凝胶(5μl, 2%, 100 V, 20分钟),然后纯化两次Ampure XP珠子。在纯化扩增子确定DNA浓度,等量的25为每个样本汇集ng。最后池又净化了,再集中两次通过Ampure XP珠子之前最后一个量化量子位®dsDNA海关化验设备(表达载体,美国)。MetaFast图书馆准备和排序进行的Illumina公司2×250 MiSeq平台Fasteris SA(瑞士)。
随后,16 s rRNA基因数据进行了分析mothur版本1.39.5 (城堡et al ., 2009),如中描述Herve和洛佩兹(2020)。短暂,16 s rRNA基因阅读运用含糊不清的基地,通过移除任何读取均聚物超过8 bp,长度差280个基点或优于320个基点。然后序列对齐到席尔瓦参考数据库132 (Quast et al ., 2012)和preclustered(前。集群,差别= 1)。使用UCHIME嵌合体检测和删除(埃德加et al ., 2011)。序列与朴素贝叶斯分类器分类(王et al ., 2007)和席尔瓦数据库132。Non-bacterial和未知序列被排除在外。序列被聚集到操作分类单位(辣子鸡)使用OptiClust算法(威斯克和城堡,2017)以97%的序列相似度阈值。最后,单例对象被排除在外,每个样本的大小是稀薄的图书馆(21601读)随机二次抽样(麦克奈特et al ., 2019)。原始序列读取被沉积序列读取存档(SRA)在基因库的加入Bioproject PRJNA347254 BioSample加入SAMN30890275数量。
Metabarcoding数量的肠道mycobiome和bacteriome殖民地的基础
基于ITS-based检测的初步结果Termitomyces肠道的测序mycobiome仅限于60天,舞台,只在窝卵和幼虫被发现。然而,即使缺席数量的肠道,真菌的繁殖体尤其是Termitomyces可以保存在他们的周围环境。因此,copularium样本收集的实验和分析检查这种可能性。整个mycobiome评估与引物PCR扩增ITS2地区对ITS86 / ITS4针对广泛的真菌血统(Turenne et al ., 1999;Waud et al ., 2014),根据PCR循环所描述的条件Schneider-Maunoury et al。(2018)。为每个样本被用于标记引物独特的第二个PCR一步这是在相同的条件下执行。后续步骤的是那些被测序Schneider-Maunoury et al。(2018),使用离子激流音序器(生活技术,卡尔斯巴德,美国)。
细菌的DNA片段,覆盖了v2 v1 16 s rRNA基因高变区放大使用引物28 f - 338 r (张et al ., 2018)。以下应用热条件:5分钟94°C,紧随其后的是25 94°C的周期30年代,56°C 30年代,60年代72°C,最终伸长一步72°C的5分钟。随后的图书馆准备和测序为真菌的步骤是一样的。
测序数据的处理,去复用原始数据首次从bam转换格式使用BEDtools fastq格式版本2.25 (昆兰和大厅,2010)。随后,其独立和16 s rRNA基因数据进行了分析mothur版本1.39.5 (城堡et al ., 2009),上面描述的一个类似的过程。
细菌16 s rRNA基因扩增子运用含糊不清的基地,通过移除任何读取均聚物超过8 bp, phr质量分数< 25,长度差200个基点或优于320个基点。然后引物被移除,序列对齐到席尔瓦参考数据库132 (Quast et al ., 2012)和preclustered(前。集群,差别= 1)。使用UCHIME嵌合体检测和删除(埃德加et al ., 2011)。序列与朴素贝叶斯分类器分类(王et al ., 2007)和席尔瓦数据库132。Non-bacterial和未知序列被排除在外。序列被聚集到操作分类单位(辣子鸡)使用OptiClust算法(威斯克和城堡,2017)以97%的序列相似度阈值。最后,单例对象被排除在外,每个样本的大小是稀薄的图书馆(2220读)随机二次抽样(麦克奈特et al ., 2019)。
真菌其读取运用使用相同的质量参数描述,和每个序列,通过质量过滤后被截断长度以200 - bp去除引物序列(布朗et al ., 2013),然后preclustered(前。集群,差别= 1)。使用UCHIME嵌合体检测和删除(埃德加et al ., 2011)。序列与朴素贝叶斯分类器分类(王et al ., 2007)和联合数据库v7.1 (尼尔森et al ., 2018)。Non-fungal和未知序列被排除在外。真菌其序列两两对齐生成一个距离矩阵被用来计算辣子鸡使用OptiClust算法(威斯克和城堡,2017)以97%的序列相似度阈值。最后,单例对象被排除在外,每个样本的大小是稀薄的图书馆(1282读)随机二次抽样(麦克奈特et al ., 2019)。
原始的序列读取为微生物群落都沉积序列读取存档(SRA)在基因库Bioproject加入PRJNA557705数量。
特定的重点都是放在最具代表性的真菌和细菌类群的持久性。显示的40个属是最丰富的在整个数据集。核心辣子鸡被定义为任何OTU,坚持肠道样本采样时间点为真菌和全部或至少5天6采样时间点的0到120的细菌。
的具体情况Termitomyces(Lyophyllaceae家庭),辣子鸡是由一个系统改进的分类方法。这是结合所有的辣子鸡附属Lyophyllaceae从我们的数据集的序列中引用Lyophyllaceae统一数据库。序列的属Rhodocybe(Entolomataceae)还包括Lyophyllaceae的外围集团。所有这些序列与MAFFT v7.427和L-INS-i方法(Katoh史坦利,2013年)。结果手动对齐是策划和智能模型选择(Lefort et al ., 2017)被用来确定最佳模型的核酸进化(GTR + G)。随后,最大似然系谱树是由PhyML 3.0 (Guindon et al ., 2010)。分支支持使用Chi2-based参数近似计算似然比检验(Anisimova Gascuel, 2006)。
统计分析
的作用时间和性肠道的测量大小被Kruskall-Wallis测试评估。α使用R包多样性进行了研究hilldiv(2019年吸纳吉尔伯特基于abundance-based希尔数字(qD),常用的集成α多样性指数根据q的值。因此,q = 0指的是辣子鸡丰富,和q = 1或2指的是转换的香农指数(香农指数的指数)和Gini-Simpson (Gini-Simpson指数)的乘法逆元,分别为(曹国伟et al ., 2016)。的差异α多样性指数分析了单向方差分析与费舍尔的迷幻药事后在测试中,p< 0.05,确定变量的正态分布。微生物群落结构的变化进行了分析,相似性(ANOSIM)中实现mothur(城堡,2008),使用Bray-Curtis距离和10000次迭代。主坐标分析(PCoA)构建基于Bray-Curtis距离的phyloseqR包(McMurdie和福尔摩斯,2013)。取样时间点的影响的作文bacteriome和mycobiome测试了非参数置换多元方差分析(PERMANOVA)中实现素食主义者函数与10000年阿多尼斯排列(Oksanen et al ., 2007)。所有其他与R v3.4.4分析,生成和阴谋ggplot2(韦翰,2016)。测试之间的关系矩阵的bacteriome mycobiome,壁炉架测试都使用了ecodist包(Goslee和城市,2007年),Bray-Curtis不同矩阵,斯皮尔曼等级相关系数,和10000年随机排列。
结果
比较的有翼的bacteriome bacteriome父母的殖民地
评价bacteriome的有翼的和工人直接从野生殖民地旨在评估的程度的构成有翼的离开母亲的bacteriomes殖民地可以镜像的共生微生物群。
phylum-level分布的细菌类群强调,相当大比例的确定辣子鸡在下降拟杆菌门,厚壁菌门,变形菌门没有种姓之间的不同比例(图2一个)。辣子鸡未成年人之间的类似的分布和主要员工内部和殖民地,男性和女性之间有翼的。这种类似的分布模式更可见在属级,辣子鸡的比例在最具代表性的genus-level类群不同阶层和性别之间几乎没有(图2 b)。
图2。Phylum-level(一)和genus-level(B)肠道细菌分布辣子鸡的女性有翼的(FA),男性有翼的(MA),主要人员(MjW)和次要工人(MnW)Macrotermes subhyalinus从两个不同的野生殖民地。对于分类水平,只有类群覆盖大量的辣子鸡> 0.5%的辣子鸡的总数显示的数据集。相应的分类单元覆盖在每个库> 97%的辣子鸡phylum-level genus-level和> 85%的辣子鸡。“他人”是指剩下的辣子鸡的累积百分比。点的大小是成正比的辣子鸡的相对数量为每个库中相应的分类单元。
性效应的大小肠道微生物群的结构
勇气男女数量的解剖在殖民地的基础时期从群集飞行(有翼的)之外的出现,工人被用来评估时间改变肠道微生物群的形态和结构。我们首先检查如果肠道微生物群的规模和结构都受到性生殖的影响。肠道形态学测量的各种参数图像分析解剖内脏的数量(补充数据S1A-C1两性之间)没有显著差异在殖民地时期(基础p肠道长度> 0.910,后肠,大肚子的宽度;和p大肚子面积= 0.761)。同样的,男女之间没有显著差异的结构和分类组成分析的mycobiome metabarcoding基于其真菌和bacteriome分析的metabarcoding基于16 s rRNA基因(ANOSIM,R=−0.026,p真菌= 0.697;R=−0.037,p细菌= 0.759)。因此,下面的结果分析两性生殖的不管。
变化的大小数量的肠道菌落的基础
后肠的面积显著增加(p< 0.001)之间的有翼的(t= 0)和脱翅的收集了45天(图3)。那么这个面积保持稳定,直到一天75天45之间没有显著差异,60岁,75 (p> 0.05)。整个肠道长度、胃区和最大的大肚子在脱翅的宽度也明显高于天60和75年相比,有翼的(p< 0.005)(补充图S2)。超过45天,没有脱翅的这些参数的变化。此时的大肚子出现膨胀与soil-like物质(补充图S1D)。这些肠道形态总体措施相关,后肠面积与整个肠道长度呈正相关(r= 0.734;p< 0.0001),胃的面积小节(r= 0.988;p< 0.0001)和大肚子的最大宽度(r= 0.835;p< 0.0001)。
图3。箱线图表示整个后肠的面积的变化m . subhyalinus数量能在殖民地的基础。对于区域测试,图中的值代表总数的一半(见表面补充图S1)。酒吧顶部有p值< 0.05连接与统计时间点不同的测量。
从离子激流metabarcoding数据多样性分析
对真菌、优质的集群读入3439辣子鸡分配给3 phylum-level类群从25类和165 genus-level类群(电子表格”S1_fungi。”补充表S1)。关于α多样性,OTU丰富性(q = 0)和多样性(香农指数的指数q = 1)天0到30之间保持稳定,但在45至60天显著增加(补充表S2)。同样,这两个指数都显著的高于copularium比肠道样本。关于β多样性PCoA执行评估取样时间的影响的结构mycobiome没有显示出明显的集群(图4一)。全面的采样时间点出现了显著影响PERMANOVA测试(R2= 0.275,p< 0.0001)。的ANOSIM成对测试结果显示显著差异之间30和45天之间的0和45天(补充表S3)。
图4。基于Bray-Curtis PCoA距离显示mycobiome的结构的变化(一)和bacteriome(B)肠道内的m . subhyalinus数量能在殖民地时期,基础与copularium相比在120天。真菌每天0到60,120 0到天指肠道细菌样本在相应的时间点。
细菌、优质的16 s rRNA基因集群读入8030不同的辣子鸡,分配给27 phylum-level类群,74类和479 genus-level类群(电子表格”S1_Bacteria。”补充表S1)。丰富度指数没有肠道60-first天样品之间的不同(补充表S2)。关于多样性,香农指数的指数,(问= 1)的乘法逆元辛普森指数(问= 2),有一个显著的减少一次性天30到45。这三个α多样性指数在termite-gut copularium环境高于样本。bacteriomes的结构评估PCoA显示集群的肠道库每个采样时间点(图4 b)。分开copularium样品中的细菌社区集群的肠道样本。这个集群bacteriomes根据采样时间得到PERMANOVA测试(R2= 0.425,p< 0.0001),表明时间解释mycobiome bacteriome方差的多。因此,ANOSIM成对测试表明几乎所有之间有着显著的不同时间点之间除了天10和30天30和45 (补充表S3)。mycobiome之间的整体,有不同的模式和bacteriome,这是进一步支持的两个群体之间没有显著相关性(壁炉架测试,r年代= 0.06,p =0.26)。
分类组成的微生物群
有翼的的肠道mycobiome co-dominated子囊菌类和担子菌类(图5一个)。从第十天,担子的相对丰度降低的非保密真菌(即。,fungal sequences that could not be taxonomically assigned below the fungal kingdom level) except at 30 days. Ascomycota accounted for about 90% of the copularium libraries. At the genus level, of the 40 major taxa of the dataset, only four clearly identified ones, from Ascomycota (曲霉属真菌,Retroconis青凤蝶属,Mortierella随着时间的推移)守恒(图5 b)。另一种守恒的血统被非保密组可能从各种不同的类群。ectosymbiotic真菌的Termitomyces存在于肠道脱翅的,直到30天,但不能超越。
图5。Phylum-level(一)和genus-level(B)的肠道真菌类群的分布m . subhyalinus数量能在殖民地时期,基础与copularium相比在120天。genus-level,只有40最丰富的类群的数据集显示。点大小正比于对应的分类单元的相对丰度在每个库和没有点表示的非探测给定库中相应的分类单元。“他人”是指不丰富的类群的相对丰度的总和。
在细菌中,拟杆菌门,在较小的程度上厚壁菌门有翼的肠道是最代表phylum-level类群(图6;补充表S1)。拟杆菌门仍然是占主导地位的门随着时间的推移,但是逐渐减少观察从第0天到45天。与此同时,的相对丰度Epsilonbacteraeota增加了。的比例Fibrobacteres肠道是比以前更高的120天。的相对丰度放线菌随着时间的推移逐渐增加,超过7%的读取60和120天。在copularium环境中,变形菌门占主导地位,其次是放线菌和厚壁菌门。genus-level,所有主要的数据集在肠道的细菌类群有翼的坚持脱翅的60个殖民地的第一天的生活,和只有4没有发现的实验(图6 b)。这些主要属主要在肠道库,覆盖> 94%的肠道图书馆从天0到60和120一天的88.2%。他们从copularium覆盖56.2%的图书馆。这些关键属主要了Bacteroidia,各种血统的变形菌门和梭菌属的,在著名的血统的白蚁肠道内Campylobacterales(Epsilonbacteraeota),Chitinivibrionia(Fibrobacteres),螺旋体科和Sphaerochaeta(螺旋体属)。的相对丰度明显增加Campylobacterales,其中Arcobacter观察从0天,45天。
图6。Phylum-level(一)和genus-level(B)肠道的细菌类群的分布m . subhyalinus数量能在殖民地时期,基础与copularium相比在120天。genus-level,只有40最丰富的类群的数据集显示。点大小正比于对应的分类单元的相对丰度在每个库和没有点表示的非探测给定库中相应的分类单元。“他人”是指不丰富的类群的相对丰度的总和。
微生物辣子鸡和核心Termitomyces
核心真菌辣子鸡肠道内发现的那些数量的采样时间点的有翼的60天。他们只有12个辣子鸡(3439;表“核心辣子鸡真菌。”补充表S1)。在一起,他们占5 - 10%的肠道库从天0到30岁,稍微在45至60天(≈24%)。这相对增加45岁和60天主要是由单个OTU(非保密毛壳菌科)copularium最丰富。核心真菌辣子鸡更代表copularium的内脏样品。
关注ectosymbiotic真菌Termitomyces,系统发育推断表明,辣子鸡Lyophyllaceae的数据集都是属Termitomyces(补充图S3)。男女有翼的,他们的平均相对丰度低于10%,标志着inter-individual可变性(补充表S4)。随着时间的推移他们的比例急剧下降为零以外的30天。从copularium Lyophyllaceae缺席的成员(补充表S1)。taxon-specific PCR, 75%的测试是积极的有翼的男女从两个不同的殖民地m . subhyalinus第十天之后,但是没有测试是积极的。属的物种外共生生物Microtermes垂直传播通过肠道的女性数量。有翼的分布区重叠的物种Microtermessp.比较分析(n每个性别= 8),导致100%阳性(数据没有显示)。
考虑细菌,419不同的辣子鸡下跌在核心组成的辣子鸡辣子鸡,持续的或至少在5 6取样时间点从天0到120(表“核心辣子鸡的细菌,”补充表S1)。他们占了65%以上的辣子鸡、每个库从0到60天≈60%至120天(图7)。也是如此的丰富,因为他们占73%以上的读入所有勇气库60天(图7 b)和代表实验结束时依然很高。内脏样品相比,核心辣子鸡覆盖,只有一小部分的辣子鸡和读取copularium的数量。他们的分类任务反映整个库的分类组成。除了细菌(即非保密。,bacterial sequences that could not be taxonomically assigned below the Bacteria rank),拟杆菌门,厚壁菌门,Proteobateria是最代表类群。只有少数核心辣子鸡属于Epsilonibacteraeota,但这些代表了相当一部分的肠道库,尤其是在10到60天。
图7。分类分布的核心的肠道细菌辣子鸡库m . susbhyalinus数量能在殖民地时期,基础与copularium相比在120天。核心辣子鸡图书馆的意义表达辣子鸡的数量的比例(一)或读取的数量的比例(B)。
讨论
变化的大小数量的肠道菌落的基础
gut-resident微生物的生存,从而他们坚持数量在殖民地的基础上,认为是依赖于它们的摄食行为,由肠道形态近似。总肠道长度和后肠的各个维度没有男性和女性之间的差异数量,像在远亲白蚁(岛田et al ., 2013)。同样,微生物群的结构,异性之间没有差别。缺乏两性异形的微生物群一直观察原生动物群落较低的白蚁在第一个月的殖民地基金会(岛田et al ., 2013;米肖德et al ., 2020),表明两性在这个阶段也同样参与喂养的任务。父母双方的参与(双亲的照顾)在几项研究证明低白蚁(岛田et al ., 2013;Benjamino伯爵,2016年;Inagaki et al ., 2020;Velenovsky et al ., 2021;Chouvenc 2022),最近Macrotermes natalensis(Sinotte et al ., 2022),可能是继承了白蚁的共同祖先(Nalepa 2015)。
值得注意的是,肠道的大小m . subhyalinus脱翅的扩大在殖民地的基础,而不是缩小如预期的假设下禁食。见补充图S1,他们的大肚子充满soil-like材料。目前尚不清楚土壤物质的摄入脱翅的是自然的,或者说是由颗粒有机质的需要补偿不可用木材料需要维持肠道微生物组。增加肠道内大小(岛田et al ., 2013)或相对体重(Nalepa et al ., 2001)常见的第一个殖民地期间基础较低的白蚁。肠道的扩大似乎与湿重的增加数量在此期间(Nalepa et al ., 2001;Chouvenc 2022)。然而,干体重和营养的内容储备减少在同一时间(约翰斯顿和惠勒,2007年;Chouvenc 2022),可能表明增加肠道在脱翅的大小反映了补液的肠道,而非摄食行为。尽管大多数研究评估摄食行为的担忧降低白蚁,充血的脱翅的在第一次周的殖民地的基础可能是无处不在的,可以观察到的一个组成部分,扩大肠道在当前的研究中。进一步的调查考虑体重指标和分析肠道内容应该明确这个物种的摄食行为的数量在这一时期。
细菌和真菌之间的对比与数量有关
我们是整个肠道mycobiome大白蚁亚科的数量以及殖民地的基础。肠道的有翼的m . subhylanus拥有主导性子囊菌类和担子菌类,其中Lyophyllaceae集群内的所有辣子鸡Termitomyces。尽管有翼的高频率的检测(75%的有翼的,无论性),Termitomyces意外覆盖较低比例的肠道mycobiome(< 10%的读取),从工人阶级截然不同,这是由Termitomyces在几个大白蚁亚科物种(> 98%的读取;Makonde 2017)。
相比之下,bacteriome的有翼的m . subhyalinus相似的工人。它主要包括拟杆菌门,厚壁菌门,变形菌门如其他工人Macrotermes物种和其他一些大白蚁亚科(Hongoh et al ., 2006;迪特里希et al ., 2014;大谷et al ., 2014;胡锦涛等人。,2019年)。有翼的和工人bacteriomes之间的相似性,而且似乎普遍(Hongoh et al ., 2006;迪乌夫et al ., 2018),表明主人的有翼的bacteriome也代表物种。在大白蚁亚科的殖民地,主要和次要的工人完成不同的任务和有不同的喂养行为(员工的电邮,1981)。然而,没有显著差异的组成bacteriome之间主要和次要的工人从野生殖民地,与先前的报道是一致的其他物种Macrotermintinae (大谷et al ., 2019;Vidkjær et al ., 2021)。因此Within-colony交哺可能使一个合适的同伴之间传输的主要细菌类群。值得一提的是,我们的研究提出了读取指定为非保密的一小部分细菌(图6)和非机密的真菌(图5)。可以解释缺乏分类解决这里使用的测序技术(即。,short-read sequencing of a few hundred base pair amplicons, which limits the amount of information) and by the origin of our samples (i.e., termite guts and copularium) which are not investigated as much as human gut or soil for instance. Regarding the former point, the use of shotgun metagenomic combined with the reconstruction of metagenome-assembled genomes has been successfully used to explore at the genome level the prokaryotic diversity associated with termites (Herve et al ., 2020;Arora et al ., 2022)。进一步的研究可以使用这种方法来监控在应变级别(微生物传播苏et al ., 2021)。关于后者,确实有演化支与白蚁尚未被识别或特征,和真菌(尤其如此Větrovsky et al ., 2020)。这是进一步支持的事实,为真菌(图5)和细菌(图6)的数据集,我们不断发现更少的非保密copularium由土壤中细菌和真菌序列比白蚁的勇气。
除了有翼的,繁殖的微生物群种姓白蚁科只研究在国王和王后的大白蚁亚科“成熟”殖民地几年后的基础。不同微生物群是明显不同的,低于在工人的肠道,只有一个或很少的细菌类群在工人察觉(保尔森et al ., 2014;大谷et al ., 2019),成分变化可能解释为trophallactic食物。这激烈的分歧杜绝任何推断在共生体传播他们的贡献的程度。微生物群的继任下面部分填充有翼的之间的差距,这些旧数量。然而,把注意力集中在过渡阶段,国王和王后从喂食器(亲代抚育)依赖所提供的营养资源的后代工人(alloparental保健)应该改善我们的理解的过程导致侵蚀bacteriome多样性在肠道的老国王和王后。
继承的微生物群的基础
肠道内的细菌和真菌微生物群在殖民地的基础是不同的模式,这可能反映了不同的紧张关系。的αmycobiome的多样性,没有明显变化的30天,这可能反映了真菌的维护血统进口在飞行。超过30天,丰富性和香农指数的指数增长连同内脏维度,可能由于过渡脱翅的摄食行为的,修改后的群落结构。广泛的变量的模式βmycobiome的多样性,甚至复制之间,表明其主要是由瞬态的真菌从土壤中吸收而非居民,尤其是第一个月。子囊菌类的主导地位,这也是主要的殖民者copularium支持土传真菌的发病率。同样,大多数Sordariomycetes核心辣子鸡是无处不在的腐生的真菌(Zhang et al ., 2006)。除了外共生生物,几乎没有严格的大白蚁亚科和真菌之间的关联信息。Taxon-specific PCR检测Termitomyces75%的男性和女性有翼的m . subhyalinus。相比之下,100%的阳性记录的有翼的男女同域的物种Microtermessp.孕生的梳子和分生孢子Termitomyces在肠道的女性数量(约翰逊,1981;Johnson et al ., 1981;诺et al ., 2011 a,b)。而缺乏两性异形的物种可能表明放大DNA包括从食物丸材料,在较低分数m . subhyalinus能反映不同传输模式。垂直传播的突出Microtermes种虫害和Macrotermes bellicosus在实验室是基于分生孢子丸的存在Termitomyces前肠的有翼的,然后成功受精真菌梳子没有接种的操纵者用梳子材料从一个成熟的殖民地(约翰逊,1981;Johnson et al ., 1981)。这不是理由m . subhyalinus(Johnson et al ., 1981),不过这里使用的分子生物学方法不能够区分真菌材料的性质,疲惫的分子信号Termitomyces出现之前的后代,即使敏感metabarcoding,提供了额外的环境采集的真菌外共生生物的证据m . subhyalinus即。,the inoculation with sexual spores harvested from the environment by the first foraging workers, as in the vast majority of Macrotermitinae. The success of the colony foundations by reproductives in this case is conditioned by the prior or simultaneous presence ofTermitomyces在疏散区(诺和Aanen, 2010)。这种传输模式,这是最原始、最广泛的大白蚁亚科可能导致他们的限制只有非洲地理分布(原产地非洲大陆)和亚洲(Aanen Eggleton, 2005)。大流行的水平传播Termitomyces也导致宿主特异性的缺失。而lineage-specific模式可以在更高的分类水平,主机开关频繁的分类水平较低,没有种Termitomyces是专门关联到一个白蚁主机(Aanen et al ., 2002;Osiemo et al ., 2010)。相关差异相对确定细菌。细菌与真菌、丰富指标保持不变在第一个月的研究中,这是兼容的假设许多细菌类群不瞬变与食物摄取而是肠道居民。一个原始的方面我们研究分析了每个单独的肠道,保留inter-individual可变性。尽管如此,肠道bacteriomes集群通过年龄和不同于copularium bacteriome,加强肠道细菌血统栖息地的特有现象。希尔的暂时减少数字问= 1,问= 2天30和45在不断丰富恰逢肠道形态学的变化。作为肠道内容没有分析,我们是否可以归因于饮食过渡。这一时期也伴随着增加的相对丰度Epsilonbacteraeota,单个OTU专门分配给属Arcobacter24%的读取(21.27 - 24日在30至45天,分别);这可能减少abundance-related多样性指数。Arcobacter是一种常见的真菌生长的核心细菌社区白蚁属(大谷et al ., 2014,2019年)。虽然对代谢功能和驱动因素白蚁的丰度,增加的相对丰度Epsilonbacteraeota和特别的Arcobacter可以与原生动物肠道内脉冲低白蚁第一时期的殖民地基金会(岛田et al ., 2013;Benjamino伯爵,2016年;Inagaki et al ., 2020;Velenovsky et al ., 2021),可能造成重启wood-feeding脱翅的活动来维持原生动物的动物。除了这里执行的成分分析,量化细菌密度应该澄清如果扩张为原生动物发现应用于肠道的微生物bacteriome高等白蚁。
然而,这种转变并不显著影响核心bacteriome以来最丰富genus-level类群和核心辣子鸡持续60第一天,表明细菌共生体高保护的关键。这些相同的监控的关键类群坚持到最后,因为只有少数人失踪的内脏样品在120天,他们仍然占主导地位。总而言之,肠道细菌来自母亲的殖民地是持久和克服潜在的饮食转变与殖民地的基础上,与真菌。后代出现白天幼虫45和积极觅食工人2个月后,他们与bacteriome从而使垂直传播的核心在这些共生体的殖民地主要是适应肠道环境。的传播真菌exosymbiont相比,bacteriome可能通过相同的社会交往支持原生动物的传播和获得的自祖先群居的白蚁的出现(Nalepa 2015;Chouvenc et al ., 2021)。这种垂直传播可能解释termite-specific集群的存在在许多原核的血统,指示一个共同进化的过程,白蚁主机(Hongoh et al ., 2005;阿卜杜勒·拉赫曼et al ., 2015;布吉尼翁et al ., 2018)。与肠道bacteriome相比,收购的外部培养真菌共生有机体是派生特征,获得了一次大白蚁亚科的祖先。原生动物的损失是否引发了白蚁科进化首先soil-feeding行为或者说一个外部化消化在梳子还讨论了(Bucek et al ., 2019;Chouvenc et al ., 2021)。肠道bacteriome相比,真菌共生有机体的延迟收购在殖民地的基础似乎支持这一假说的远期出现的祖先大白蚁亚科相对于原生动物的损失。所建议的Bucek et al。(2019),真菌生长白蚁可能摆脱soil-feeding祖先通过降级对木材喂饮食,培养驯化的腐生的真菌倾向于trive虫粪基质(van de Peppel et al ., 2021)。
结论
共生体的传播在白蚁之前解决了原生动物特有的低白蚁和真菌外共生生物特有的大白蚁亚科。据我们所知,这是第一个研究解决肠道共生体的传播在白蚁科,被认为有明显的摄食行为降低白蚁相比,在殖民地的基础应该禁食。迄今为止,繁殖的微生物群的信息种姓有翼的白蚁科是有限的,与员工分享类似的微生物群,年迈的国王和王后,有一个独特的微生物群。我们的研究描述了失踪的步骤在这两个极端之间的动力学阶段,但从我们的研究进一步调查,老国王和王后,和主要的变化发生在过渡从双亲alloparantal保健在未来将提供一个更完整的画卷。肠道细菌的持久性的第一期殖民地的生活,增加肠道大小和土传真菌的存在证明了在这个研究并不支持殖民地期间禁食的存在基础。我们的研究结果显示真菌和肠道之间没有亲密关系生境与早期的疲惫Termitomyces在肠道证实这种共生有机体从环境中获得的。相反,坚持肠道细菌的数量在整个殖民地时期,基础直到后代工人出现了。这些类群的存在在后代工人没有任何可能的外部源支持的角色数量能在肠道微生物群和垂直传播,因此,在共同演化的历史细菌共生体和白蚁的主机。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
作者的贡献
医学博士、CR-L和必备的构思和设计研究。CR-F进行现场取样。科幻,MD, CR-L实验室饲养实验,进行解剖,形态分析。科幻,医学博士杰、AB和m进行分子实验。VH,乔丹和EM进行统计和metabarcoding分析。MD和VH起草了手稿。必备的,CR-F、一个乔丹,AB批判性的修订手稿的知识内容。最后的手稿的内容编辑和批准所有作者。他们宣布同意负责所有的方面的研究。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项研究是由程序家乐福绿党/科学de l 'Environnement巴黎索邦大学(CARESE-SU)。
确认
作者要感谢的服务de Systematique Moleculaire(2700年口头语,MNHN CNRS)授予访问其技术平台,研究团队Laboratoire de Zoologie des Invertebres Terrestres(如果Ch。安踏迪奥普)LEMSAT (ECO&SOLS)人力和物流资源的分配在该领域的使命。我们也感谢斯蒂芬妮·马克西姆GIUSTI-MILLER和费雷拉的技术和后勤支持。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2022.1055382/full补充材料
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关键词:白蚁数量能大白蚁亚科,肠道微生物群,Termitomyces、传输、殖民地的基础
引用:迪乌夫M, Herve V, Frechault年代,Lambourdiere J, Ndiaye AB, Miambi E, Bourceret, Jusselme医学博士Selosse必备读物和Rouland-Lefevre C(2023)继承的肠道微生物群数量Macrotermes subhyalinus(白蚁科)殖民地基金会给洞察共生体的传播。前面。生态。另一个星球。10:1055382。doi: 10.3389 / fevo.2022.1055382
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*通信:米歇尔•迪乌夫✉michel.diouf@u-pec.fr
__ORCID:米歇尔•迪乌夫https://orcid.org/0000 - 0002 - 6263 - 8216
文森特•Hervehttps://orcid.org/0000 - 0002 - 3495 - 561 x
Marc-Andre Selosse,https://orcid.org/0000 - 0003 - 3471 - 9067