利用商业胶原为共焦显微镜准备人类β细胞分化良好型的

1介绍

1型和2型糖尿病的结果从功能性胰腺β-细胞质量的损失由于自身免疫攻击或营养应激与遗传易感性的(1,2)。致糖尿病的压力下,自适应和不适应的反应发生在β细胞内的内质网,线粒体,溶酶体,和其他细胞器,往往与细胞器的变化相关的质量、形状、动力学和高分子分布(3- - - - - -6)。除了细胞器、细胞骨架结构的扰动与β细胞在糖尿病(失败7)。因此,形态学评估β细胞和亚细胞周围的细胞是重要的理解胰腺β-细胞生理学和β细胞失败糖尿病的发病机理。技术进步在高分辨率荧光显微镜和各种荧光标记的发展现在提供了一个机会来获得大量的信息关于细胞的形态和功能状态的变化反应条件刺激和疾病。然而,高分辨率荧光显微镜的应用对人类主要β细胞是有限的由于玻璃表面上的困难准备细胞适合高分辨率成像。人类β细胞分散不传播在玻璃表面(8色散(后),显示可怜的生存9),并接受epithelial-to-mesenchymal过渡迅速组织培养皿(10)。

在活的有机体内人类β细胞存在于一个小岛,是一个三维聚合组成的内分泌细胞,non-endocrine细胞(如内皮细胞、周)和细胞外基质(ECM) (11)。除了信息接触,β细胞依赖与ECM生存和正常功能的交互由分子生物学胰岛素分泌(GSIS) (12)。在人类的小岛,~ 15%每个β细胞表面直接与ECM的形式位于β细胞和毛细血管之间的基底膜(12)。基底膜提供结构支撑和作为生长因子的支架包括纤维母细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF) (11)。此外,附件ECM激活整合素受体和其他信号通路,导致粘着斑复合物的形成和确定β细胞的极性(13,14)。人类胰岛有双层基底膜与小鼠胰岛单层的基底膜(15)。ECM的产量是有限的,由β细胞蛋白质的内皮细胞和周是主要负责生产为一个完整的基底膜ECM胰岛在活的有机体内(12,16)。考虑ECM的重要性,其损失在人类胰岛的色散,涂层与ECM组件玻璃表面是一个逻辑方法来改善人类β细胞的生存和功能播种在玻璃表面(14,17)。作为一个主要的进步,菲尔普斯等人最近制定的协议准备一个人类胰岛细胞单层玻璃表面,适用于共焦和超分辨率显微镜使用商用IV型胶原(IV)上校和培养神经介质(8)。除了它的简单性,细胞的协议显示更大的附件与层粘连蛋白相比,polyornithine, ECM HTB-9细胞。此外,人类β细胞保持高度分化状态由mono-hormonal表达胰岛素和核的表达NKX6.1 / PDX1文化(超过4天8)。研究采用这个协议也报道glucose-responsive (Ca^{2 +}]_我、耗氧量和胰岛素分泌,共同支持保护β细胞功能使用协议(18,19)。有趣的是,人类胰岛细胞在协议形成一张细胞保持信息接触也可能有助于保护β细胞功能(8)。

新协议(有非常有前景的结果8,18,19),我们的目标是解决适应性协议的V型胶原蛋白(Col V)在人类胰岛(最丰富的胶原蛋白20.)和基底膜的重要组成部分,第四坳一直得到广泛的研究和报道支持生存,成熟,和功能的β细胞,胰岛细胞,干细胞beta-like细胞(15)。然而,其他islet-associated胶原蛋白可能会影响胰腺β-细胞健康,但他们并没有研究影响人类β细胞搪玻璃材料。V是一个上校low-abundance fibril-forming胶原蛋白。坳V是丰富的胰岛ECM和β细胞功能的关键;然而,它在隔离过程中丢失,只有最低限度由β细胞复制(16,21- - - - - -23)。它有三个不同亚型对3α链的组成构成三重螺旋:α1 (V)₂α2 (V),α1 (V)₃或α1 (V)α2 (V)α3 (V) (20.,21)。α1 (V)₂α2 (V)影响胶原纤维的几何和力量,和突变COL5A1 COL5A2相关的经典恰当牵拉(20.)。COL5A3存在于脂肪组织,紫河车,胰岛细胞(21,24)。全身删除Col5a3在小鼠体内葡萄糖不耐受引起胰岛素抵抗和胰岛质量和胰岛素分泌的减少(21)。添加坳V基底膜基质提升人类多能干细胞的分化(万能)胰岛瀑样和增强glucose-responsive胰岛素和胰高血糖素分泌从瀑样(22)。坳V也显示在INS1增加胰岛素分泌细胞(25)。然而,坳V人类β细胞附着的影响,功能和分化目前未知。

这里,我们比较两个商业准备坳IV和一个上校V作为涂层材料的准备保护β细胞功能和人类胰岛细胞的形态。第四坳坳V是有效与健壮的GSIS培养分化良好型的β细胞。然而,广泛的形态学评估后,第四坳优越在创造人类有限的胰岛细胞层细胞堆积而坳诉这些数据强调坳IV的优势作为共焦显微镜的一个平台。令人担忧的是,一个第四坳制备包含小坳IV当评估通过质谱和collagen-binding粘附蛋白(CNA35)。人类胰岛细胞培养和成像时严格验证坳IV,共焦成像成功显示动态变化在两个细胞器(如。、线粒体和脂滴在β和α细胞(像))。

2材料和方法

2.1涂层的玻璃表面人类胰岛细胞的胶原蛋白和播种

7-mm-diameter玻璃底共焦菜(MatTek生命科学)涂上50μg /毫升坳IV (C5533和C6745σ)和V(σC3675)上校稀释汉克斯的平衡盐溶液与Ca(哈佛商学院)^{2 +}和毫克^{2 +}在37°C 2 h。洗后15分钟有1.5毫升的哈佛商学院四次,每道菜是晾干紫外线照射下细胞播种前2 h。爱荷华大学的机构审查委员会认为,实验用人类胰岛不是一个人类的研究。人类从非糖尿病胰岛器官捐赠者的可行性报告和纯度在80%以上从集成胰岛分布程序,获得阿尔伯塔糖尿病研究所或Prodo实验室公司(补充表1一夜之间)和培养到达1066年CMRL中有1%的人血清白蛋白,青霉素和链霉素L-glutamate 1%, 1%在37°C和5%的公司₂从航运复苏。分散、播种和培养人类胰岛细胞基本上遵循与少量修改菲尔普斯等人发表的方法(8)。简而言之,人类胰岛与PBS洗,孵化与Accutase (SCR005,微孔σ,圣路易斯,密苏里州)在37°C 5分钟,由温柔的移液分散,通过40-μm过滤器使单细胞悬液。把分散的胰岛细胞resuspended 10% HI-FBS CMRL在140000细胞/毫升。细胞悬液添加到预镀共焦菜在大约35000个细胞/厘米²。6 h后37°C和5%的孵化有限公司₂,2毫升神经介质被菲尔普斯et al。(8)是应用于每道菜。在一夜之间,3μM阿糖胞苷(ARA-C)添加到纤维母细胞培养基消除最初由菲尔普斯等报道。8),细胞被培养为额外的3天。

2.2免疫细胞化学

后删除旧培养基,细胞被固定在一个1:1混合8%的多聚甲醛和新鲜的神经介质在37°C 15分钟并存储在4°C沉浸在PBS直到分析。细胞被permeabilized Triton-X 0.1%,孵化主要抗体混合物准备PBS含有0.1% Triton-X一夜之间在4°C,洗了三次在PBS 5分钟,并与二次孵化抗体1 h在黑暗中在室温(RT)。所示使用的抗体补充表2。洗后二次抗体与PBS一次5分钟和水两次3分钟,细胞核被添加可视化1μg /毫升4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,从热费希尔)3 - 5分钟。DAPI删除了用水洗一次3分钟和PBS两次5分钟。后去除多余的液体,细胞被覆盖着180μl延长安装解决方案和一个18×18毫米盖玻片放置在细胞。

2.3评估细胞的身份,在z轴胰岛集群的核数,细胞区域

细胞应用胰岛素(INS)、胰高糖素(GCG),分析了NKX6.1使用通过油63×710年蔡司显微镜镜头获得z-stack图片的间隔0.3µm覆盖整个集群每个单元格的高度。伊万里瓷器分析软件(牛津仪器)被用来创建一个表面INS和GCG阳性细胞。为核软件准确区分太近,一个“点”是手动放置在每个核的中心。面具的地方然后创建留下饱和球体中心的每一个细胞的核表面。然后,伊万里瓷器的机器学习组件是用来自动识别以下标准:INS⁺NKX⁺,INS⁺NKX^{- - - - - -},INS⁺GCG⁺,GCG⁺NKX⁺,GCG⁺NKX^{- - - - - -},INS^{- - - - - -}GCG^{- - - - - -}NKX^{- - - - - -}。为每个新捐赠者,三到五个图像进行正确识别视觉测试。在z轴计算核的数量,伊万里瓷器软件是用来获得集群的3 d视觉几何聚焦核DAPI染色。XZ、YZ正交的飞机被用来确定原子核在z轴的最大数量为每个集群。

β细胞边界确定,人类胰岛细胞与NTPDase应用3,突触融合蛋白1,NKX6.1。980年蔡司显微镜的扫描63×油通过一个镜头在一个通风的扫描模式是利用收购z-stack图片的间隔0.15µm覆盖整个高度的胰岛细胞集群。伊万里瓷器软件被用来创建一个三维图像,和XY平面扫描从底部选择飞机,包含每个细胞的β细胞的最大足迹集群。ImageJ的绘图工具是用于个人β细胞边界轮廓测量周长,面积胰腺β-细胞和细胞核。

2.4区域和细胞集群的数量

DAPI信号细胞集群的胶原蛋白被使用徕卡DM6B epifluorescent显微镜在20×空中目标集中在每个集群的基础直接捕获细胞坚持涂表面。当细胞更倾向于把对这道菜的中心,我们从最内层的2-mm-diameter圆系统捕获了三张图片的菜。一个额外的三张图片2 -和4-mm-diameter圈这道菜时被抓获超过三个字段进行了分析。获得的图像分析ImageJ(见补充的方法、宏观细胞粘附区域)的数量来衡量集群,每个集群的面积。

2.5 SDS-polyacrylamide凝胶电泳

空泡变性在4×NuPAGE摩门教的样品缓冲(NP0007英杰公司)20μM德勤在80°C的10分钟和解决4% - -12%梯度NuPAGE Bis-Tris +凝胶(NP0326BOX,英杰公司)。页面凝胶染色使用皮尔斯银染色为质谱(24600年,热科学)制造商的指示。亲和力的蛋白质与collagen-binding粘附蛋白35 (CNA35)共轭Alexa萤石(CNA35) (48826,27)测试通过孵化凝胶CNA35在PBS 1:4,000渐变为0.5% (PBST) 120分钟在RT其次是洗水24 h。CNA35质粒是作为一种礼物从马格努斯博士提供钩德州A&M大学的健康。绿色荧光成像是iBright(表达载体)。C6745决定SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)凝胶也转移到硝化纤维膜,孵化与anti-rabbit IgG-HRP抗体(圣克鲁斯SC2357下)在4°C一夜之间,可视化和ECL免疫印迹基质(32106年,费舍尔科学)柯达IM2000成像仪。

2.6点污点

不同的商业胶原蛋白的浓度调整到0.3µg /µl,表示数量的胶原蛋白是用移液器吸取到硝化纤维膜作为个体点。膜在空气干燥30分钟,随后与PBST洗一次。然后,细胞膜是孵化与CNA35下在PBST RT在黑暗中50分钟。之后,膜与PBS为15分钟洗了三次。膜上的荧光信号成像是使用一个iBright FL1500成像系统(表达载体)荧光模式。

2.7 GSIS

人类胰岛细胞培养5天涂层材料在Krebs-Ringer preincubated 1 h缓冲区(KRB)含0.25% BSA和2.8毫米葡萄糖。顺序之后,细胞被孵化的1 h每个KRB含有葡萄糖2.8和16.8毫米。洗后,人类胰岛细胞中可溶性里帕缓冲区(σ)含有蛋白酶抑制剂和存储在-20°C总胰岛素测定。与STELLUX Insulin-secreted和胰岛素含量测定化学发光人类胰岛素酶联免疫试剂盒(ALPCO)根据制造商的协议。

2.8全内反射荧光显微镜

人类胰岛细胞与4%多聚甲醛固定染色INS,钙和DAPI如2.2节。post-staining洗后,1.5毫升PBS添加水成像媒体。细胞用莱卡全内反射荧光成像(TIRF)在TIRF显微镜油100×目标模式的穿透深度100 - 150 nm。TIRF胰岛素颗粒的图像进行了分析使用一系列ImageJ宏(见补充的方法TIRF宏)。TIRF钙粘蛋白最早创建的图像感兴趣的区域(ROI)消除细胞集群之外的任何背景。当地的汽车阈值(Bernsen方法,https://imagej.net/plugins/auto-local-threshold)测量胰岛素颗粒不同强度。Bernsen方法被选为有一个很大的变化在胰岛素颗粒像素强度。这种方法允许暗淡和明亮的颗粒的选择。胰岛素在每个颗粒强度测量和分配到背景(0-29)、低(30 - 100),中(101 - 179),(180 - 255)强度高。颗粒与胰岛素强度小于30或颗粒面积大于0.5µm被排除在数据。

2.9形态测量学人类胰岛细胞的线粒体和像对待FCCP和高葡萄糖+油酸加载

人类胰岛细胞培养在玻璃表面涂布的胶原蛋白制剂。细胞转导与CellLight Mitochondria-GFP BacMam 2.0(热费希尔),在50粒子每单元(PPC)前2天的收获。2μM Bodipy 558/568 C12 (Bodipy C12)添加在最后16 h的文化想象triglyceride-rich摩门教(28)。的一部分人类胰岛细胞培养的神经元中含有20毫米葡萄糖和0.5毫米油酸(OA)在过去的48 h的文化。FCCP添加2.5μM过去6 h的文化。

固定后,β细胞和α细胞应用如2.2节。980年蔡司显微镜的扫描2老在一个通风的扫描模式是利用收购z-stack图像通过一个63×油镜头的间隔0.15µm覆盖整个胰岛细胞集群的高度。两组连续5片Z-stack形象被选来代表每个胰岛的下半部分,上半部分集群。5到10胰岛集群为每个条件进行了分析。此后,连续5片是通过最大强度投影图像合并成一个插件ImageJ /斐济。投影图像从而为线粒体形态创造了评估使用预定程序的宏脚本ImageJ /斐济(1.53 v, NIH) (29日,30.)。简而言之,图像被转换为二进制图像的线粒体粒子和自动执行线粒体粒子的形态测量学获得线粒体(周长长度和形式因素²/(4π×区))(29日,30.)。像的大小和数量是衡量发表(31日)。β细胞(INS的面积⁺)也通过ImageJ /斐济。

2.10统计

数据提出了均值±SEM图传说,除非另有说明。两组之间的差异的数值参数评估学生的t。韦尔奇的校正应用在两组之间差异有显著不同的方差齐性检验。多组比较与一个单向方差分析使用因果测试显示。棱镜9 (GraphPad拉霍亚,CA)是用于统计测试,除非另有指定。p < 0.05被认为是显著的。

3的结果

3.1人类β细胞培养商业坳IV和v准备尽显高核NKX6.1的本地化

我们测试了三个商用胶原蛋白制剂,两个坳IV (C5533从人类胎盘和C6745 coculture成纤维细胞和上皮细胞)和一个山坳V(从人类胎盘)为共焦成像外套覆盖的眼镜。经过5天的文化,人类胰岛细胞形成的单细胞悬液群岛包含~ 10细胞平均覆盖玻璃上涂上坳IV和V上校准备(图1一个)。胰岛集群上比C5533 C6745含有较高数量的细胞,而细胞的数量在集群坳V相当于C5533 (图1一个)。INS的比例⁺和GCG⁺胰岛细胞集群相似的所有三个胶原蛋白制剂β-α细胞比率3:1左右,略高于报道在成人胰岛β-α细胞比率(图1 b, C)(32)。在所有三个胶原蛋白制剂,INS⁺核NXK6.1细胞显示出接近100%的积极性,表明β细胞保持分化良好型的地位在所有三个胶原蛋白制剂(图1 d, E)。Non-beta细胞染色NKX6.1是微不足道的(数据没有显示)。

3.2形态学的胰岛集群和β细胞扩散两个不同商业坳IV准备

在所有三个胶原蛋白类似的INS的比例⁺细胞和核NKX6.1β细胞积极性高,我们指出显著差异在胰岛集群的数量和规模两坳静脉制剂(C6745和C5533)当相同数量的细胞被播种(图2一个)。除了包含每个集群数量略低的细胞(图1一个),胰岛细胞C5533形成更多的胰岛集群(图2 b,补充图1 a, B),每个小面积粘附到玻璃表面(图2 c,补充图1 c, D与C6745相比)。之间没有统计上的显著差异C5533坳诉除了形成细胞集群和小玻璃表面附着区域,胰岛细胞被堆放在C5533而C6745发现沿z轴的细胞核数量较低(图2 d-f,补充视频)。核沿z轴的平均数量在四个捐助者为2.03±0.38 C5533核,C6745核3.19±0.45,2.81±0.24核坳V (±SEM,图2 d)。

之前,菲尔普斯等人报道,第四列的β细胞有较大的细胞比polyornithine区域和层粘连蛋白,这表明坳IV附件结果奉承β细胞(8)。比较这三种胶原蛋白制剂之间的β细胞区域,我们定义了边界的β细胞免疫反应性NTPDase 3和突触融合蛋白1,两种蛋白质优先分配给β细胞的细胞膜(图2 g, H)(33,34)。所示图2 h,β细胞的核表达NKX6.1显示强烈的NTPDase 3和突触融合蛋白1表达细胞边缘。虽然细胞的形状和大小多种多样,β细胞C5533和坳V明显大细胞区(图2 g)和细胞区/核区(补充图1 e与C6745相比)。总的来说,人类胰岛细胞集群C5533坳IV制备形成单一的双层细胞含有β细胞和大细胞区。人类胰岛细胞镀上坳V比C5533显示更多的细胞堆积,但其余的参数包括细胞地区坳V和C5533之间是相似的。

3.3第四坳内容两个商业制剂之间也有明显的差异

依恋行为之间的巨大差异两坳静脉制剂(C6745和C5533)是令人费解,我们分析了肽的分子量分布在胶原蛋白sds - page后准备使用银染色(图3一)。V显示微弱的上校乐队主要在高分子量。C5533显示适应蛋白质主要以上60 kDa,而50 C6745产生了两个主要的乐队和25 kDa (图3一)。液相色谱串联质谱(质/ MS)分析50-kDa乐队出现在第四C6745坳准备确定兔子免疫球蛋白重链的主要蛋白(补充图2一个)。C6745兔免疫球蛋白的存在是不限于一个很多准备,作为另一个很多(很多# 2)C6745受到免疫印迹也包含了兔免疫球蛋白,尽管比很多# 1(在较小程度上图3 b)。此外,没有针对性的质谱C5533坳IV的碎片,而这些没有C6745中发现,进一步表明C6745不包含可观的坳IV与C5533 (补充图2 b)。

提供一个额外的确认存在与否的胶原蛋白,准备三个胶原蛋白的亲和力与荧光标记collagen-binding粘附蛋白CNA35 (35)进行了测试。点污点分析显示强烈的C5533绑定和CNA35坳V,而两个单独的很多C6745最低绑定(图3 c)。孵化的sds - page凝胶CNA35表明,高分子量在V和C5533上校与CNA35乐队(图3 d)。再次,C6745显示最低绑定。我们的研究结果表明,胶原蛋白制备的认证是重要和CNA35绑定提供了一个简单的实验室技术快速认证的胶原蛋白。

3.4三胶原蛋白分泌β细胞的功能是类似的准备

尽管不同的依恋行为(图2)和低内容C6745坳IV的所有三个涂层材料允许分化良好型的INS的培养⁺细胞保持核NKX6.1表达式(图1 d)。因此,我们接下来相比人类胰岛胰岛素分泌的胶原蛋白在三个准备。低胰岛素细胞C6745显示趋势内容时纠正细胞种子的数量与C5533 (图4一,补充图3),可能反映了不同数量的β细胞附着在玻璃表面和/或胰岛素含量/β细胞。GSIS纠正胰岛素内容往往是高细胞C6745 C5533比(图4 b)。然而,刺激指数GSIS为所有三个准备包括C6745相当,表明β细胞功能保持同样不管胶原蛋白的类型和质量,整合高核表达NKX6.1 INS⁺细胞(图4 c,补充图3 b)。

自从C5533趋于平缓INS⁺细胞和增加附件在涂层表面的面积,我们执行TIRF显微镜比较胰岛素颗粒三个附件表面的涂层材料。胰岛素颗粒数量每个细胞在C5533趋势从最高到最低,V,上校和C6745低葡萄糖(图4 d, E),但没有达到统计学意义。葡萄糖暴露30分钟没有结果在统计上的显著差异在颗粒之间的数三涂层材料(图4 d, E)。

3.5第四C5533坳准备允许成像人类β细胞的线粒体和脂滴

最后,我们测试了两个细胞器的形态(即。,mitochondria and LDs) changes in human beta cells on C5533 in response to stimuli known to alter their morphology in a wide range of cells; FCCP is known to cause fragmentation of mitochondria, and nutritional load increases LDs (31日,36)。FCCP和高葡萄糖+ OA缩短了线粒体长度和减少β细胞的形成因素,提供证据表明,两种情况下人类β细胞线粒体片段在文化和支持协议获得的效用的形态学数据(图5 a - c,补充图3氟)。虽然还没有达到统计学意义三个捐助者,线粒体在α细胞倾向于较长的管状比β细胞的线粒体和更高形式的基线。同时,α细胞线粒体显示更少的改变与FCCP孵化后或葡萄糖+ OA (图5 a - c)。Bodipy C12荧光脂肪酸模拟是优先纳入triglyceride-rich摩门教(28)。培养高葡萄糖+ OA 48 h的摩门教的数量增加β细胞在所有三个捐助者研究(图6 a, B)。6小时孵化FCCP增加数量或大小的摩门教的捐助者,表明损伤的线粒体呼吸促进LD积累在人类β细胞(图6 b, C)。据报道,LD形成β细胞是有限的在少年β细胞(37)。在协议中,我们指出,β细胞捐赠1(16岁)有更少的摩门教的基线,不增加LD大小,以应对FCCP或葡萄糖+ OA相比其他两个成人的捐助者。

4讨论

在这项研究中,我们比较商业准备IV和V上校上校的涂层材料,文化人类胰岛细胞在玻璃表面。我们指出β细胞表型是保持同样的准备,但是准备使用严格验证坳IV支持人类β细胞附着在玻璃表面成像特点优势:更少的细胞堆积和一个大胞质区。另外,我们称之为注意验证的重要性,商业胶原蛋白制剂和胶原蛋白的一个简单的方法验证报告利用荧光胶原蛋白结合蛋白CNA35。最后,人类胰岛细胞的共焦显微镜坳IV-coated玻璃允许评估反应人类胰岛细胞的线粒体和摩门教的刺激。集体,我们提供信息,艾滋病对人类主要应用先进的成像胰岛细胞应对人类胰岛细胞的病理生理学。

坳IV和层粘连蛋白是基底膜的主要结构成分,用于连接人类β细胞玻璃表面(8,34)。在这里,我们测试是否non-basement膜胶原坳V是一个有益的涂层材料对人类胰岛细胞。坳V存在于胰岛ECM和支持基于β细胞质量和功能在一个基因敲除小鼠的学习和研究iPSC-derivedβ细胞和INS1细胞(16,21- - - - - -23)。在这里,我们发现坳IV (C5533)和坳V之间的差异作为涂层材料是相对较小;β细胞的功能状态和β细胞面积玻璃之间没有显著不同的胶原蛋白。之间的主要区别我们观察到IV和V上校上校是更大的细胞堆积在胰岛集群玻璃涂上坳诉这突显出坳IV是首选的涂层材料细胞堆积并不是理想的。

捐助者之间变化明显时,人类β细胞GSIS显著增加在所有三个涂料水平可比刺激指数是对人类文化完整的小岛。甚至C6745没有包含重要的第四层次的坳,允许人类β细胞的文化高核NKX6.1的表情。维持胰岛β细胞功能的集群在我们的研究中就像pseudoislets由reaggregation保护β细胞表型的分散的胰岛细胞在文化(38,39)。维护三维接触人类胰岛细胞在胰岛的文化可能占的功效三涂层材料的保护β细胞表型。令人鼓舞的是,压扁的细胞和减少C5533 mono -双细胞层不损害β细胞对葡萄糖的反应或分化,在当前研究和其他(如图所示8,19)。除了涂层材料、培养基配方由菲尔普斯et al。(8刺激神经组织的),这是低(即氨基酸。,L- aspartate, L-glutamate, and L-cysteine) and supplemented with antioxidant-rich B-27, might play an important role in maintaining the differentiated phenotype of human beta cells in prolonged culture.

商业制备坳IV简化其利用率研究但显然需要调查人员来执行身份验证。第四坳有高度复杂和异构结构原生ECM。坳IV是由细胞的绳子三重螺旋原体3α链的六个亚型存在(40)。胎盘主要用于隔离C5533包含COL4A1和COL4A2α链。第四坳原体分泌的细胞进行广泛的多聚体形成创建一个高分子网状基底膜。隔离坳IV的生物材料通常是由蛋白酶消化释放一个绳子的中央triple-helical域空留下域(即。7 s和NC1)胶原螺旋连接创建一个高分子网(40)。因此,源材料和方法的隔离可以创建大的变化在两个坳IV的组成和大小片段。显然,一个准备(C6745)严重污染了兔免疫球蛋白当我们获得的,在非还不明显的sds - page。我们表明,荧光标记的胶原蛋白结合蛋白CNA35证实胶原蛋白的存在是很有用的。也,我们详细描述人类胰岛细胞的形态学坳IV将作为参考人类胰岛细胞坳IV的预期行为从人类胎盘。当播种在35000细胞/厘米²人类胰岛细胞形成mono-double包含~ 10细胞层细胞集群。

我们演示了坳IV涂料的实用工具来可视化细胞器的变化人类主要通过共焦显微镜和胰岛细胞获得了一些有趣的发现。线粒体的分裂FCCP和营养负荷似乎更加突出比αβ细胞的细胞。因此,我们的数据提供的证据原则,人类胰岛细胞坳IV的行为作为一个平台比较β和α细胞同时在相同的条件下,当他们有身体接触。摩门教的大小或数目的增加FCCP人类β细胞表明损伤的线粒体呼吸足以导致人类β细胞LD积累。β细胞的少年人捐赠未能扩大LD大小FCCP和营养负荷。显然,还需要进一步的研究来证实发现更多的捐赠小岛和地址如何年龄和细胞类型不同调节线粒体动力学和摩门教。

这个协议对collagen-coated种子人类胰岛细胞玻璃是有利地简单;然而,一些局限性值得讨论。色散和培养可能改变人类胰岛细胞表型的表现型完整的小岛在活的有机体内。虽然这些胶原蛋白让压扁的β细胞与其他材料相比8)(Col V在当前的研究中),β细胞在坳IV (C5533)仍然比β细胞立方形的线条和啮齿动物β细胞(未发表的数据)和显示一个异构、复杂形状(图2 c)。因此,它是必要的样例胰岛细胞集群的多个飞机捕捉变化β细胞的不同亚细胞的域。另外,多光子显微镜使荧光成像与更好的渗透和被用来监视胞外分泌和生物能学完整的胰岛细胞(41,42)。提高空间分辨率,适用性细胞器的多光子显微镜成像已经增加(43,44)。然而,这种成像技术是高度复杂和昂贵相比,共焦显微镜。同时,试剂的渗透性和光散射仍然作为厚样品的潜在问题。电子显微镜的发展提供一个额外的方法来获得生物信息在亚细胞水平也受到自己的限制(45)。最终,这将是重要的结合多个成像和非模式生物问题解决一个特定的讨论在最近的一个评论(45)。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

作者的贡献

易受孕的研究,负责所有手稿的内容。BB(各个方面),UY(各个方面),SL (GSIS和蔡司980成像),FI(的形态学分析),BI(的形态学分析),AJ(的形态学分析),路(的形态学分析),SP(人类胰岛文化),SR(胰岛素ELISA), SBS (TIRF试验),ES(胶原蛋白分析),学生(线粒体形态),TM(由显微镜图像采集和图像分析),和JA(的形态学分析)负责收购和/或数据的分析。易和BRB设计研究,起草了手稿,至关重要的知识内容的修订后的手稿。所有作者修订和批准的最终版本的手稿。

资金

彝族是由美国国立卫生研究院(R01-DK090490),美国退伍军人事务部(I01 BX005107),和异卵的鹰糖尿病爱荷华大学的研究中心。SBS支持国防部国会指导医学研究项目拨款w81xwh - 20 - 1 - 0200。人类胰岛细胞的一部分提供的NIDDK-funded集成胰岛分布程序(IIDP) (RRID:可控硅_014387)在城市的希望,NIH的# U24DK098085。蔡司LSM710共焦显微镜(1 S10 RR025439-01)位于爱荷华大学中央显微镜研究设施(CMRF)在指定的国家卫生研究院购买团体资助。

确认

爱荷华大学的蛋白质组学分析蛋白质组学工具支持卡佛的养老基金会和r·马歇尔博士由教皇。我们感谢托马斯博士早间(CMRF副主任)爱荷华大学的技术支持。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2023.1187216/full补充材料

引用