肌肉再生乌颊鱼海鲷:影响内分泌和地方监管因素和相声的骨头

1介绍

乌颊鱼海鲷(黄aurata林奈1758)是最重要的一个物种在地中海水产养殖的最后几十年,因为它代表一个源的能量和蛋白质的质量高,因此,它具有很高的商业价值(1)。然而,仍然有其生理学领域没有描述;因此,还需要更多的研究来优化他们的成长和发展的农业。

与其他脊椎动物群体相比,一些鱼类具有不确定的增长,这意味着它们可以生长在长度和重量超出了成熟阶段,只要他们住(2)。这种增长是由于大多数体细胞组织的增加,特别是骨骼肌,意味着新的肌肉细胞招聘增加肌肉纤维的数量(增生),以及增加的大小的纤维(肥大)。这些现象被认为是一个重要的决定因素肉纹理的特点,从水产养殖的角度来看,肌肉质量的主要兴趣(3,4)。

生长激素(Gh)和胰岛素样生长因子(igf)轴内分泌系统是最重要的控制身体的许多生理过程(5)。体增长的Gh是中央监管分子在脊椎动物,包括硬骨鱼类的鱼,虽然它的主要目标是肝脏可以施加显著的直接影响骨骼肌等其他组织。然而,众所周知,大多数Gh对经济增长的影响是间接的,通过igf (6)。的大型组织分布Igfs-producing细胞包括它们的受体,连同广泛分布的Gh受体(Ghrs),使该中介成为可能。许多研究,包括几个在鱼,具有系统性影响以及当地的旁分泌和自分泌的存在行为Gh和igf (7,8)。在肌肉,igf直接刺激各种信号包括卫星细胞增殖和分化(SCs),成肌细胞肥大,抑制细胞萎缩。在乌颊鱼海鲷,表明Igf-2似乎是一个重要的刺激增殖,而igf - 1与Gh似乎有协同作用的活动,在肌细胞生成的控制(扮演不同的角色9)。此外,在同一物种,描述了三种拼接变体(igf-1a,igf-1b和igf-1c)和微分反应取决于生理或刺激条件(10)。igf发挥这些行动通过绑定和激活的细胞受体和多个胞内信号转导级联,包括磷脂酰肌醇3-kinase (Pi3k) -Akt-Tor级联,控制一个重要基因表达程序(11)。

肌肉生成的过程,称为肌细胞生成,由SCs,肌肉干细胞可以被认可的表达Pax3/7 (12),增殖并分化为成肌细胞融合在一起(即。(即,增生)或与预先存在的纤维。,hypertrophy) to form multinucleated myofibers. Myogenesis is regulated by the myogenic regulatory factors (Mrfs), a set of four transcription factors that are expressed sequentially being Myf5 and MyoD the first to be activated controlling SCs activation and proliferation, and later Myogenin and Mrf4 that coordinate myoblasts differentiation and fusion (13)。在成年后,这些过程也可以发生在应对挑战威胁到肌肉内稳态的条件。由于肌肉细胞的能力来修改,数量和类型的蛋白质合成,定义为肌肉可塑性,可以应付任何刺激,破坏生物体的正常状态(14)。在这个框架中,肌肉监管意味着蛋白质周转,以确保正确的肌纤维的函数,即蛋白质合成和降解之间的平衡。控制肌肉蛋白质水解的主要分解系统还描述了在乌颊鱼海鲷,ubiquitin-proteasome复杂(UbP);钙蛋白酶,Ca的家庭^{2 +}端依赖蛋白酶催化和监管形成的小单元;自噬溶酶体组织蛋白酶,其中一些相关系统;还存在,细胞凋亡蛋白酶系统(15,16)。

的一个现象可以改变正常的肌肉功能和身体内稳态等离子体膜中断引起的肌肉收缩以及严重的创伤所造成的损害或肌肉疾病,导致所有这些过程纤维断裂。然而,骨骼肌提供了内在机制能够再生整个收缩受损系统。肌肉再生的基本作用是由SCs居民的肌肉,之前被激活,以应对各种刺激可能来自于生物组织本身或从其他系统(17)。受影响的肌纤维坏死发生时由于创伤,炎症反应是发起与不同的细胞因子的释放,白细胞介素,从中性粒细胞等免疫细胞(18,19)。这些诱导巨噬细胞浸润和激活的蛋白水解系统删除所有死者材料,其次是一个激活的SCs产生新纤维或融合的纤维。最后,新形成的纤维化脓和改造再生肌肉恢复其正常功能(20.)。

除此之外,还有其他因素也有重要角色在肌细胞生成。增殖SCs具有增殖细胞核抗原(Pcna)的存在,这是经典被刺激的进入SCs细胞周期(21)和肝细胞生长因子受体(之外),也在骨骼肌细胞增殖(22,23)。另一方面,两个小说阳性fusogens, Myomaker Myomixer,描述和可能发挥着基础性的作用成肌细胞融合的阶段。事实上,这两个阳性膜蛋白质的缺乏一些会导致一个不完整的肌细胞生成,因为细胞不能融合,因此多核肌纤维不成立(24)。其他因素与一个重要的角色是小窝,作为信使的质膜内陷函数中心组织,包括骨骼肌、控制信号转导。跨膜蛋白,使这些结构的形成是窖蛋白家族的成员(25)。Caveolin-1 (Cav-1)是描述和被确定为第一个成员被表达在静止SCs但不是在成熟肌纤维细胞开始扩散时,表达下调(26)。另外两个家族成员是Caveolin-2 (Cav-2)和Caveolin-3 (Cav-3)。描述前透露,colocalizes Cav-1和是在相同的情况下发生。否则,Cav-3 Cav-1不同,参与成肌细胞分化和肌管融合,因此,缺乏Cav-3导致细胞不成熟(27)。最后,另一个家庭的蛋白质必不可少的骨骼肌内稳态的维持成年人实际上wnt,虽然在鱼信息这些分子的作用是非常有限的。规范Wnt信号调节成肌细胞的分化,而非规范途径控制SCs的自我更新和肌肉纤维的发展(28,29日)。

在一些硬骨鱼类的鱼,像乌颊鱼海鲷,和与哺乳动物,骨骼系统被定义为非细胞自由软骨细胞骨架生成和维护,成骨细胞和破骨细胞,但它缺乏骨细胞在钙化的细胞外基质(ECM) (30.,31日)。骨血统决心和分化成骨细胞的间充质干细胞(msc)意味着各种关键监管演员包括特定的转录因子,矿产资源可用性和环境条件(32)。转录因子表达模式控制骨阐明在乌颊鱼海鲷在几年前,这是证明有保护的记录相比,哺乳动物(33)。事实上,Runx2至关重要的承诺osteoprogenitor msc的细胞和成骨细胞的分化;除了它协调其他基因的表达,如骨桥蛋白(人事处),骨粘连蛋白(在),骨钙素(ocn),其中,关键因素调节ECM矿化(34)。此外,有必要指出,骨是唯一的组织,有一个细胞类型,其主要作用是破坏自己的组织,破骨细胞(35)。这个函数被称为骨重建和保证矿物质体内平衡是至关重要的,在其他组织监管影响也如骨骼肌(36)。

骨头是骨骼肌的附件位置,因此这一组织应对威胁条件也很重要。因此,肌肉骨骼系统是一个复杂的相互关联的结构(37)。在一起,肌肉骨骼系统使运动和一个重要的代谢作用,和肌肉和骨骼组织的互动超越了机械和涉及大量的生化通信(38,39)。组织都是一个相关的源代码可以在一个自分泌的信号分子,旁分泌或内分泌的方式。正是因为这些原因,每个组织的功能和过程是由另一个(40,41)。

在这种情况下,这项工作的主要目的是执行在活的有机体内研究骨骼肌再生的特点在乌颊鱼海鲷。为此,将产生的机械损伤肌肉和变化的关键基因的转录参与骨骼肌的生长调节,包括上面提到的不同的系统和分子将被评估。此外,一些骨头基因标记将被研究,以确定这种密切相关组织调节肌细胞生成的影响。

2材料和方法

2.1实验设计

肌肉再生研究,140乌颊鱼海鲷(黄aurata)未成年(初始体重= 15.4±3.5克;初始长度= 8.7±0.6厘米(均值±SEM))从一个商业孵化器(Piscimar、Borriana、西班牙)和被放置和适应鱼设施的生物学(巴塞罗那)大学的教员。海水鱼被随机分布在三个200 L坦克(45-47鱼/罐)。每个柜都有一个常数通量700 L / h的海水半封闭式循环系统每周更新的20 - 30%和第35 - 37的盐度‰的恒温23±1°C。在水箱的房间,有一个光周期12 h光明/黑暗。鱼被喂食随意每天3次与商业饮食(珍珠,Skretting、布尔戈斯、西班牙),在描述他们适应环境条件在实验前2周。研究开始后,所有的动物继续被美联储在适应期间相同的协议。进行了研究后,欧盟的建议和程序建立的西班牙语和加泰罗尼亚政府。批准的协议是伦理和巴塞罗那大学动物保健委员会(CEEA 37/20)。

本研究旨在更好地理解成人受伤后肌肉再生。要做到这一点,140年乌颊鱼海鲷被分成两组:受伤的鱼(I)和控制鱼(C)和随机分布在三个坦克。具体来说,在每个海水箱,33的鱼受伤组与对照组14鱼。首先,所有的乌颊鱼海鲷青少年与MS222麻醉(100 mg / L),然后称量。识别鱼,一个被动综合应答器(坑)标签(id - 100(1.25)纳米应答器;Trovan电子识别系统,马德里,西班牙)皮下注射插入左前轴上的肌肉下面第一个半径。随后,受伤了,一个直径2.108毫米(14 g)针垂直插入左轴上的肌肉在第六半径1厘米的深度。在未来知道天针了,第六的尖端半径被切断,同时控制鱼比较目的。然后,伤口愈合与碘酒精溶液和鱼被允许恢复独立的小坦克之前回到了200 L坦克。

组织样本得到天0,1,2,4,8,16 - 30在受伤后。在每一个时间,16鱼被研究随机选择组。进行取样、鱼第一次麻醉,确定阅读坑标签,体重要注意体重的变化,然后抽血液样品,以确保残酷的死亡。受伤的鱼(I),部分的轴上的肌肉被撤左腰(受伤的肌肉)和右腰为每个鱼作为自我控制。肌肉中提取的组织大小0.5厘米宽,1厘米半径略低于第六次下调。脊柱也切除计数作为一条鱼的骨骼样本与伤害。此外,一个样本的脊柱也从控制鱼(C)中提取获得骨控制样本。所有组织样本被放置在RNase-free埃普多夫管取样过程中储存在液氮然后在-80°C到基因表达分析的性能。

2.2组织学分析

轴上的肌肉切片被安装在组织学磁带和脱水乙醇分级系列和嵌入在石蜡。部分7 - 10µm被削减的切片机(烤瓷,扶轮3003年科隆,德国)和苏木精和伊红染色和天狼星红胶原染色(42)。一切准备工作就绪光学显微镜下观察和拍摄(奥林巴斯PM10SP自动显微摄影系统)。所有试剂从默克公司购买了组织学染色(默克、Mollet del水手、西班牙)。

2.3基因表达

2.3.1 RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

总RNA提取100毫克的轴上的肌肉或椎体骨1毫升的三试剂的解决方案^®(应用生物系统公司、Alcobendas、西班牙)和均质Precellys^®进化耦合Cryolys冷却装置(贝尔坦公司仪器、Montigny-le-Bretonneux、法国)。RNA提取的制造商的指令执行三试剂的解决方案^®。每个样本获得的最终浓度使用Nanodrop 2000(热科学、Alcobendas、西班牙)和RNA完整性确认在1%琼脂糖凝胶(w / v)沾SYBR-Safe DNA凝胶染色^®(生命技术、Alcobendas西班牙)。

RNA-complementary DNA(互补)合成2μg总RNA是DNase对待我放大级^®(生命技术、Alcobendas西班牙)删除所有基因组DNA。进行逆转录合成第一链cDNA Transcriptor工具包^®(罗氏,桑特Cugat▽水手,西班牙)后,制造商的协议。

2.3.2定量实时PCR

的mRNA转录水平的基因组织分析实时定量PCR (RT-qPCR)使用CFX384™实时系统(El屁股de Llobregat Bio-Rad,西班牙)。为每个组织中列出所使用的引物表S1和扩增的特异性,缺乏特异性引物的绑定进行测试在网上。首先,稀释曲线与样品池运行确认底漆效率和为每一个试验来确定适当的cDNA稀释。一式三份的所有分析井使用384孔板和2.5µL iTaq普遍SYBR绿色Supermix (El屁股de Llobregat Bio-Rad,西班牙),0.25μL向前(250海里)+反向引物(250海里),1.25μL DEPC水和1µL稀释cDNA对于每一个样本,在最后一卷5µL Salmeron et al。(描述的条件后16)。此外,三个消极的控制还包括,跑一式两份:没有模板控制(NTC),没有逆转录酶控制(RTC)和聚合酶链反应(PCR, MilliQ水)控制。每一个基因的表达水平与ΔΔCq计算方法考虑每一对引物的效率(43),并分析了相对于几何平均数s18参考核糖体蛋白基因的美国(rps18),核糖体蛋白l27a (rpl27)和延长因子1α(ef1a)。参考基因,在不同条件下最稳定,被证实与geNorm算法。,参考基因的稳定性和目标基因的相对表达测定使用Bio-Rad大型管理软件CFX 3.1 v(美国大力神,CA)。最后,具体确定相对基因表达的变化是由于受伤,受伤的表达式结果样本(即。受伤的鱼,左腰和列)是由基因表达值归一化(即相应的控制样品。,对腰受伤和列控制鱼)。

2.4统计分析

使用IBM数据进行了分析^®SPSS^®统计v。25(IBM, Armonk, NY, USA) and were presented as mean ± standard error of the media (SEM). Normal distribution was analyzed using the Shapiro-Wilk test and homogeneity of the variances (homoscedasticity) was assessed with Levene’s test. Differences were tested by one-way analysis of variance (ANOVA) and the因果图基HSD。必要时,非参数测试和克鲁斯卡尔沃利斯因果Games-Howell。此外,单向方差分析进行验证坦克不影响测量的参数。统计差异p < 0.05时被认为是重要的。数据绘制使用GraphPad棱镜^®诉7 (GraphPad软件、拉霍亚CA、美国、www.graphpad.com)。

3的结果

3.1在肌肉再生组织学特征

受伤的肌肉组织样品的定性分析表明,第一天可以观察死纤维的存在开始坏死的过程发生在受伤的地方(图1 a, B)。此外,增加胶原蛋白在受伤部位的myoseptum (图1 e)。之后,在16天,再也不可能找到任何受伤的纤维,而新的健康的纤维被观察到,除了减少myoseptum胶原蛋白的量(图1 c、F)。最后,在肌肉样品在30天有受伤的迹象和myoseptum增加胶原蛋白。此外,它可以看到新纤维形成的受伤部位更相似的大小影响区域的纤维显示细胞进入成熟阶段(图1 d、G)。

3.2基因的表达在Gh-Igfs轴肌肉再生

总igf - 1 mRNA水平(igf-1abc)显著减少从天0到1,随后,具有抑制受损恢复正常水平延伸从第四天增加,维持在30天(图2一个)。关于igf - 1拼接变异,igf-1bmRNA水平天1和2之间有显著提高,在第八天恢复,而其他两个变量(igf-1a和igf-1c)没有任何清晰的表达模式或显著差异(图2罪犯)。相反,igf-2基因显著调节从0到天1之后,表达减少第二天和特别剩下16天低到30天(图2 e)。生长激素受体(Ghrs)报道明显下降的情况ghr-1表达式在第一天,一个引人注目的随后的复苏后16天受伤,尽管它是不可能确定paralogue任何重要的表达变化ghr-2(图2 f, G)。至于下游信号分子,akt2基因表达的mRNA水平仍不断的通过实验和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶tor显示与倾向于减少每天0和1之间(图2 h,我)。

3.3蛋白水解系统基因表达在肌肉再生

Calpain-1 (capn1)及其管理单元(capns1a和capns1b)显示基底mRNA水平没有变化在不同天的研究(图3 a - c)。相反,capn2显示在mRNA水平显著增加一天1然后减少直到第八天(图3 d)。然后,capn3从0到天表达下调4受伤后然后恢复最初的表达水平白天8 (图3 e)。组织蛋白酶L (ctsl)提出了一个重要的瞬态增加mRNA水平2天,但是没有变化cstda基因表达观察(图3 f, G)。关于ubiquitin-proteasome系统成员,mafbx显著增加从每天4到8以后减少16天,而murf1显示明显高于mRNA水平相比30天1和4,和的mRNA水平n3在这项研究中没有改变(图3 h-j)。

3.4基因表达的其他地方标记在肌肉再生

Pax7和肝细胞生长因子受体(之外)mRNA水平低到第8天然后显著增加16维护表达升高,直到天30 (图4 a, B)。的pcna表达式不出现重大变化(图4 c)。窖蛋白的基因,cav1保持在基底表达式只显示一个重要upregulation相比天16天1和2 (图4 d)。此外,cav3显示类似的形象,但在这种情况下,基因表达强烈增加从8到16天持续高企,直到损伤后30天图4 e)。关于肌肉增长的消极监管机构,mstn1mRNA水平增加逐步从第四天到30天,在显著差异具有抑制受损(延伸16天图4 f)。同样的,mstn2信使rna水平显示upregulation从8到16天持续高企,直到研究结束的(图4 g)。分泌的因素wnt5b从Wnt家庭,逐渐增加的mRNA水平从第四天到30天,在16天开始显著上升(图4 h)。的小富亮氨酸蛋白聚糖osteoglycin,肌肉mRNA水平ogn1从第八天到30,同样显著增加ogn2从第八天增加到16,然后依旧很高,直到天30 (图4 i, J)。最后,对于vasoendothelial生长因子(vegfa),小波动的mRNA水平观察,只有在表达显著增加天4和16之间的比较(图4 k)。

3.5炎症标记物基因表达在肌肉再生

促炎细胞因子的基因表达白介素6 (il - 6具有抑制受损,然后延伸在第一天)显著增加逐渐下降到第八天当表达式返回显著降低基底的水平(图5一个)。的il-15表达同样略增加在第一天被那些水平明显高于与16 - 30天(图5 b)。集落刺激因子受体(1csf1r)基因表达显著提高从2到4天,直到30天(高图5 c)。此外,tnfα显示一个重要upregulation在16天持续高企,直到研究结束的(图5 d),il-1β表达式没有任何明显的变化(图5 e)。

3.6骨标记基因表达在肌肉再生

骨形成蛋白2 (bmp2)提出了一个重要的mRNA水平减少具有抑制受损,延伸从1天8天之后,一个重要的恢复白天16 (图6)。关于骨osteoglycin mRNA水平,ogn1显著增加从第0天到第四天,然后水平下降的一个主要方式,直到天16最后,再次提出了重要的是30天(图6 b)。的ogn2表达,显示一个平行但延迟模式显示其在第8天显著mRNA水平最高(图6 c)。骨钙素mRNA水平的主要矿化标志(ocn从2到4天)略有增加,然后下降明显在第8天终于恢复在30天(图6 d)。转录因子的分析runx2表达式显示显著增加mRNA水平在4和8天,然后再稍微减少虽然不显著(图6 e)。骨粘连蛋白(在)mRNA水平逐步增加长期从0到每天30只有两者之间呈现显著差异,初始和最终天(图6 f)。关于肌肉生长抑制素在骨,mstn1没有表达和mstn2mRNA水平显著降低从0到4天,然后稍微恢复了表达式在16天(图6克)。最后,蛋白水解的mRNA水平标记组织蛋白酶k (ctsk)显著降低肌肉受伤后第二天到8天之后维护(图6 h)。

4讨论

少年乌颊鱼海鲷在轴上的白色肌肉受伤,14 g针。然后,肌肉组织学分析+评估变化的关键基因的转录肌肉和骨骼组织在一个30天的再生周期。组织学评估显示在第一天纤维坏死的过程中,虽然在受伤后16天没有损坏的痕迹或坏死纤维观察乌颊鱼海鲷。我们的结果同意Rowlerson et al。(44),他发现在同一物种,具有抑制受损,延伸肌肉再生弱被探测到七天仍有坏死性纤维,但在21天乳腺肿块许多地区再生,和年轻的纤维可以观察到。事实上,在我们的研究中,在30天肌刀显示一个完整的正常形态和许多新小肌肉纤维。

Gh-Igfs轴肌肉生长的主要监管机构,导致组织损伤后再生的过程在脊椎动物(20.,45)包括鱼(46)。从这个意义上讲,igf - 1在组织修复的贡献已经认可(47),但Igf-2并不那么广为人知的作用虽然对肌细胞生成的贡献是提出通过展示igf - 1受体结合,激活Akt通路,然后MyoD (48,49)。此外,通用电气等。50)在老鼠身上发现igf-2在早期的肌肉再生mRNA水平也大幅提升。在这项研究中,峰值igf-2开始时的肌肉修复(即。,day 1) is consistent with this early and pre-Igf-1 function at the onset of myogenesis. In fact, it has been previously observed in gilthead sea bream myocytes that Igf-2 contributes to muscle regulation mainly in the early stages of development and before Igf-1 (9,51)。事实上,igf - 1行动发生稍晚对成肌细胞分化的初始阶段(52)。同意,在目前的研究中,igf - 1在第一天表达降低,恢复表达水平在4天,8,16 - 30受伤后,可能主要是由于接头的upregulation变体igf-1b具有抑制受损。延伸在第二天关于受体,ghr-1表达类似配置的igf - 1迅速减少受伤后第一天和渐进和缓慢增加之后,返回到初始水平在16天动物从受伤中恢复过来时,同意其合成代谢作用的响应在这个物种(8,53)。

骨骼肌在受伤后的重建需要罚款蛋白酶表达的调节。在这个意义上,钙蛋白酶、组织蛋白酶和UbP肌肉蛋白降解的主要系统,他们可能有助于重塑骨骼肌的再生(54)。以前,我们发现这些蛋白水解基因的重要转录反应乌颊鱼海鲷受到持续运动,不同的饮食,或两者的组合因素(15,55,56)或在21天的禁食(57)。在这项研究中,我们发现至少一个基因表达的每一个再生期间三个蛋白水解系统在不同的时间。事实上,的表达capn2和ctsl分别为1和2天增加,而mafbx增加具有抑制受损和延伸在第八天murf1在30天与早期相比。在研究老鼠注射0.75% bupivacaine,药物浓度产生化学伤,Capn1 Capn2是最大的酶活性具有抑制受损,延伸第五天的组织蛋白酶L和D在第三天,和蛋白酶体达到第五天逐步回归控制水平21天(54)。这个基因表达的蛋白水解可以比得上这一研究获得的表达谱的乌颊鱼海鲷,表明肌肉再生过程中蛋白水解基因的激活序列通过脊椎动物似乎很好保存。具体来说,钙蛋白酶似乎更相关的角色在扩散乌颊鱼海鲷培养细胞和细胞分化(UbP系统58)。此外,它已被证明mafbx与myod调节它的表达式;因此,在这项研究中mafbx可能是抑制myod过早地表达在第8天,以确保正确的磁流变液的活动从16日起(59)。总之,这些蛋白水解基因可能是必要的在我们的研究物种,调节肌细胞生成,如前面观察到在哺乳动物(60)。因此,这些基因可能参与成肌细胞增殖和分化(61年,62年成肌细胞融合(所需),但也63年,64年)。

符合这一点,作为描述的一部分最近发现fusogens Myomaker和Myomixer乌颊鱼海鲷,旨在评估他们的功能、基因表达的分子除了mrf不同肌发生条件下研究了包括肌肉再生(这个模型65年)。所有这些分子显示低表达值直到第8天,然后开始增加达到一个峰值在16天post-wound随后慢慢减少恢复初始水平30天。最近,Manneken et al。(66年)综述了斑马鱼肌肉再生的过程(鲐鱼类),关注差异脊椎动物肌发生期间,发展,和维修。值得注意的是转录形象不同的磁流变液的相似性,研究与分析了乌颊鱼海鲷。此外,Rowlerson et al。(447天)显示,在乳腺肿块疲软反应肌间线蛋白抗体只出现在大的纤维而不是假定新形成的纤维;在21天的再生在许多肌肉领域很先进。Forcina et al。(67年)和Musaro (14)也回顾了肌肉再生的调节机制在哺乳动物中,表明磁流变液参与过程具有抑制受损,延伸4 - 7天到达的成熟和功能恢复肌肉天10至15。概要文件是又非常类似于我们之前的研究中,观察到乌颊鱼海鲷(65年)虽然快肌原性的再生过程可以解释哺乳动物的鱼相比更高的体温。事实上,在虹鳟鱼(雄鱼mykiss),一个物种生长在一个较低的水温比乌颊鱼海鲷,完整的肌肉再生的时间(即以类似的实验。,一天30)和myomaker和myomixer16 - 30天之间确实达到顶峰后,受伤后(68年)。

其他监管肌肉增长的因素pax7,之外,窖蛋白,wnt5b、ogn vegfa或肌肉生长抑制素遵循相同的趋势,与小波动到第8天16岁但是显著的表达的增加和/或乳腺肿块30天。的确,这些基因的表达谱之间的并行性和磁流变液的意义在哺乳动物肌细胞生成过程中由于其公认的角色。例如,很少有人了解窖蛋白在鱼的角色,但增加中观察到cav1和cav3表明他们的参与鱼肌发生激活SCs老鼠和人类中描述(26,69年);后pax7和之外已知因素,刺激细胞周期激活和SCs扩散(21,22)。此外,进步的表达增加wnt5b表明其潜在作用的肌肉再生在成肌细胞分化和融合虽然从这个更大的贡献或Wnt家族的其他成员可以预期在早期阶段(28)。然而,鱼的信息非常稀缺,可能他们的角色不一样在哺乳动物(29日)。的表达ogn1和ogn2从第八天的肌肉增加。在先前的研究中,科斯塔et al。70年)的表达ogn在初级文化乌颊鱼海鲷细胞,观察到显著增加他们的表情在文化发展的第八天,在细胞的分化和融合阶段形成肌管。在目前的研究中,可以考虑ogn肌肉的成绩单也参与融合的新形成的纤维。有关的表达vegfa,观察到的峰值具有抑制受损是一致的延伸16天新的肌肉纤维形成的主要时期加成熟,因此,增加血管生成和肌原性的因素最高的表情;支持的角色之前证明这个因素在乌颊鱼肌肉重建海鲷(56)。最后,在的情况下mstn1和2,他们的基因表达增加了30天,这符合他们已知作用乌颊鱼海鲤肌发生的负调控,因此帮助完成这个场景(再生的过程71年)。因此,天在受伤后8和16之间的时期似乎在这个物种的主要时期激活诱导肌肉再生肌原性的因素。这是哺乳动物中描述的时间晚一点,但速度比观察虹鳟鱼(67年,68年,72年,73年)。

愈合过程的组织、急性炎症和免疫细胞发挥重要作用在几乎所有阶段的再生。受损的肌肉纤维坏死引起许多类型的免疫细胞的渗透(74年,75年)。因此,帮助清除死细胞的浸润细胞受伤部位以及不同类型的细胞因子分泌招募更多的免疫细胞除了生产细胞反应调节肌细胞活化、增殖和分化(19)。在我们的研究中,可以观察的第一波il - 6和il-15在早期损伤后表达增加。在cardiotoxin-induced肌肉损伤的小鼠模型,Zhang et al。(76年)展示了高水平的il - 6发现从受伤后第一天(24小时),表明这对巨噬细胞浸润细胞因子是至关重要的,并且缺乏基因敲除小鼠模型抑制成肌细胞增殖。此外,一些研究也支持这一事实il - 6产生蛋白质水解的肌肉细胞激活和调节蛋白水解系统(77年,78年)。另一方面,il-15是哺乳动物的肌肉中高度表达,相信,除了其炎症功能在炎性环境下,它可能是一个myokine促进肌细胞生成响应运动以及促进肌肉再生(79年,80年)。我们研究的结果可以显示这些提到的功能,和再生在乌颊鱼海鲷il - 6和Il-15可以代理促炎症阶段除了有利于肌发生,虽然我们无法区分如果特别表现在肌肉细胞,这些细胞因子的免疫细胞,或两者兼而有之。此外,Tnfα报道中发挥重要作用的肌肉再生在哺乳动物(81年,82年)。这种细胞因子可以吸引肌肉SCs受损的网站推广其增殖和分化(83年)。表达的增加tnfα在乌颊鱼海鲤肌肉损伤后16天可以说明这个函数upregulation以来发生的同时,整个肌原性的程序被启动。事实上,整个连续的促炎细胞因子的释放受伤的肌肉刺激单核细胞的浸润,继续表现出炎症进行吞噬,然后切换到抗炎巨噬细胞刺激肌细胞生成(84年- - - - - -86年)。集落刺激因子1 (Csf1)控制生产、分化、巨噬细胞和功能及其受体(Csf1R)介导的生物效应(87年)。在我们的研究中,强烈的增加表达的检测csf1r从第四天可能意味着到达波后的肌肉巨噬细胞炎性白细胞介素。此外,这种受体的表达仍然是提升到30天,这可能意味着维护人口的抗炎与myogenesis-supporting巨噬细胞,直到结束的再生过程。

指基因表达在骨,小富亮氨酸蛋白聚糖ogn1和ogn2一直在为乌颊鱼海鲷在吗在体外发展不同的细胞类型包括骨骼和肌肉70年)。因此,他们在骨组织中显著增加表达式接近具有抑制受损,延伸肌肉伤天4和8分别在最近的研究中,同意他们的报道upregulation发病的成骨细胞以及细胞分化。此外,田中et al。(88年)也证明了监管的骨骼和肌肉之间的串扰的作用ogn在鱼非常贫穷,但引用。在这项研究中,早期的表达ogn在晚些时候在骨骼和肌肉可以从骨头表明刺激提高受伤的肌肉的恢复。同样的,ocn表达在再生调制与水平增加第四天与第八天,支持其作为一种很有前途的osteokine参与调节肌肉反应在受伤后的鱼,正如已经证明在哺乳动物(89年)。的确,Ocn已被证明能增加重要的是老年小鼠的肌肉活动个人(90年),直接促进肌管的蛋白质合成,解释为什么这种荷尔蒙负责肌肉衰老期间维护(91年)。因此,增加的ocn具有抑制受损之前,延伸在第四天upregulation mrf支持其在鱼肌肉太刺激的作用。的bmp2和ctsk显示早期激活的基因表达具有抑制受损,延伸在天1和2分别,虽然bmp2表达减少在第8天恢复基础水平的实验。这种早期的upregulationbmp2可能与这个分子的最高表达发现在乌颊鱼胚胎发育的开始海鲷(92年),而且情况下,骨骼和肌肉增长刺激,如例如在大西洋鲑鱼(大西洋鲑)饲养水温升高(93年)。此外,表达的高峰ctsk在第二天像表达的增加观察经过20天的禁食(57)表明ctsk因此,骨吸收,可能有一个角色在肌肉重建压力条件。成骨的关键因素runx2在第四天下跌后,在第八天达到高峰,保持类似的水平直到实验结束的时候,这个时候也许暗示一个诱导骨生成支持随后的肌肉发展。此外,inter-tissue抑制肌肉生长抑制素的作用已经在哺乳动物特征(89年,94年)。在我们的模型中物种,禁食和重新喂料的一项研究证明了肌肉生长抑制素如何行动协调肌肉骨骼增长,建议其潜在作用osteokine鱼(57)。在这个再生研究中,肌肉生长抑制素也可以猜测的监管作用,由于骨质减少mstn2表达到了第四天的肌肉拉伤可能允许适当的肌肉重塑,从而使更多的见解的重要性肌肉生长抑制素在鱼骨头和肌肉之间的串扰。最后,ECM标记在再生期间会增加进步最大的表达达到30天恰逢的最高表达观察在结束的时候在体外和在活的有机体内骨在乌颊鱼海鲷根据其关键作用调节组织发展的后期阶段(33,92年)。总之,这些结果的研究打开一个有希望的新行研究鱼的骨骼和肌肉之间可能的串扰调节骨骼肌发展和增长。

5的结论

在乌颊鱼海鲷,伤口的生成和受损和死亡的肌肉纤维首先激活炎性基因il - 6和il-15导致清洗受伤组织和刺激肌肉再生过程(图7)。蛋白水解的因素,第一capn2和ctsl,后来UbP系统成员mafbx允许一个有效的受损组织的退化。

具有抑制受损,延伸的非常早期的阶段,以明显的增加igf-2的减少ghr1和总igf - 1表达式。第八天的恢复到基础水平igf-2是平行的吗igf - 1同时许多其他基因的诱导表达参与肌细胞生成的监管pax7,之外,cav1,cav3,wnt5b,表明肌肉重建的开始。事实上,vegfa还显示一个明确的表达式在16天乳腺肿块,磁流变液和fusogens相似myomaker和myomixer的表达模式之前描述(65年),从而表明肌细胞生成和血管生成的进展发生导致新纤维的形成。

此外,它可以假设一些bone-derived基因等bmp2,ogn1,ocn和mstn2可以通过发送信息到肌肉参与主要在再生过程的早期阶段控制谐波肌肉骨骼增长,因此可能呈现作为osteokines鱼。

总的来说,这项研究显示了如何策划不同的机制来恢复受伤的肌肉和允许知道第一次乌颊鱼海鲷的及时贡献不同的分子损伤骨骼肌纤维的再生过程。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

道德声明

这项研究是根据指导方针进行的欧盟理事会指令(欧盟2010/63)和巴塞罗那大学的伦理委员会批准(协议代码CEEA 37/20)。

作者的贡献

詹概念化的研究。AO-T、MP-A VJ-P IG-P, m和詹进行抽样。AO-T、MP-A VJ-P、调频和IG-P进行实验室分析。AO-T、MP-A VJ-P和詹分析和解释数据。EC, JB和詹获得资金。AO-T, MP-A, EC、JF-B DG、JB和詹起草和批判性回顾了手稿。所有作者阅读和批准了期末论文。作者宣称没有利益冲突。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这份出版物是R + D +我的一部分项目agl2015 - 70679 R和rti2018 - 100757 b - i00詹和JB和agl2017 - 89436 R和pid2020 - 116172 - rb - i00和EC由西班牙“Ministerio de Ciencia e Innovacion”(MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 /)和“ERDF让欧洲的一种方式”,“欧洲联盟”,和“Xarxa de Referencia D或+ D +我en Aquicultura”和2017 - sgr1574“Generalitat de加泰罗尼亚”。MP-A和IG-P支持博士前的奖学金(bes - 2016 - 078697和pre2019 - 089578)分别从MCIN AEI / 10.13039 / 501100011033和“养投资你的未来”。FM支持部门的资助的奖学金和学生事务在国外的科学研究和技术的起始点伊朗。

的利益冲突

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