评论文章

前面。性。，09 December 2022
第二节转化内分泌学
卷13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fendo.2022.989844

糖尿病血管病变的表观遗传学基础

Theja Bhamidipati¹，

Manishekhar库马尔 ²，

Sumit S. Verma²，

Sujit K. Mohanty²，

塞达特Kacar ²，

钻石里斯²，

米歇尔·m·马丁内斯^3.，

Malgorzata M. Kamocka^3.，

肯尼斯·w·邓恩 ^3.，

查丹·k·森^{2 *}而且

Kanhaiya辛格 ^{2 *}

¹美国宾夕法尼亚州费城杰斐逊-爱因斯坦医学中心血管外科
²美国印第安纳波利斯印第安纳大学医学院再生医学与工程中心外科
^3.美国印第安纳州印第安纳波利斯，印第安纳大学医学院肾内科

2型糖尿病(T2DM)导致周围血管疾病，因为一些血源性因素，包括重要的营养物质不能到达受影响的组织。组织表观基因组对慢性高血糖敏感，已知引起微血管和大血管并发症的发病机制。T2DM的这些血管并发症可能使器官功能障碍的发生延续。糖尿病的负担主要是由于广泛的并发症，其中不愈合的糖尿病溃疡是一个主要组成部分。因此，目前的研究有助于发现更有效的诊断和治疗早期血管损伤的方法是非常必要的。本文综述了表观遗传过程如DNA甲基化和组蛋白修饰在T2DM大血管和微血管并发症演变中的意义。

简介

遍布人体的血管器官系统包括动脉、静脉和淋巴管，它们灌注在活体的其余部分。然而，由于其广泛的位置，脉管系统是非常容易受伤的。在细胞水平上，周围的环境，通过血管结构种子对维持持续的血液供应是不可或缺的。即使是对血管外空间最轻微的改变也会引起从缺血到神经病的一连串病理后果。血管病变是一个广泛的，包罗万象的术语，用于描述血管异常，从代谢紊乱到栓塞/嗜血栓性和功能障碍(1)．这个术语与“血管炎”相混淆，后者指的是一种涉及动脉和静脉壁的更具体的炎症过程(2)．血管炎通常有皮肤表现，与临床症状联系更密切。虽然这两个术语都用于血管病理学的命名，但它们在血管大小和位置以及炎症状态方面有所不同。命名在很大程度上是非特异性的，但表示病理的广阔领域，可以影响血管系统。在这篇综述中，术语血管病变将被用来包括所有与血管相关的病理。

血管病对全球的影响不容低估(3.)．几乎每一种慢性疾病都会造成细胞外空间紊乱，从而影响血管健康。血管疾病的发展是广泛的，在世界范围内代表着生命年的巨大损失(3.)．在涉及临床血管病变时，川崎病、高洋动脉炎和巨细胞动脉炎等疾病分别是儿童、日本老年人和欧洲老年人获得性心脏病的最常见原因(4)．在静脉领域，慢性静脉疾病占西方国家医疗保健分配的近2% (5)．尤其在病情最严重的患者中，如免疫功能低下或移植后，血管病变是移植移植物在一年时间内丢失的主要原因(6)．水痘、带状疱疹等传染性病原体也是主要的血管调节剂，在疫苗问世之前，95%的年轻人感染了这种病毒(7- - - - - -9)．

在众多类型的血管疾病中，包括上述血管疾病，就健康影响而言，最常见的血管疾病是2型糖尿病(T2DM)相关的微血管病变和大血管病变。它是美国死亡和发病率的主要原因之一，近50%的人死于某种形式的心血管疾病(10)．糖尿病的血管并发症横跨全身，同样仍然是导致死亡的第一大原因(11)．随着与血管疾病相关的文献的不断扩大，有一个明确和当前的需要全面了解血管疾病过程发展的原因、影响和潜在机制。近期文献(12- - - - - -24)证明了表观遗传机制的关键作用，如DNA甲基化和组蛋白修饰长期高血糖在糖尿病组织中基因和环境之间的复杂相互作用。启动子DNA甲基化诱导的基因沉默是糖尿病血管病变中最广泛的表观遗传修饰(22，25- - - - - -28)．众所周知，这种高血糖诱导的基因启动子高甲基化有助于“代谢记忆”，即使在实现血糖控制后，也会导致糖尿病血管功能障碍(15，23，29)．然而，这一观点已被大幅修改，包括小的非编码rna或microRNAs (miRNAs)和大的基因间非编码rna作为额外的表观遗传成分(23)．在这篇综述中，与糖尿病血管病变的发病机制相关的表观遗传机制将被讨论。

血管生理学与病理学

血管系统是由连接心脏和全身其他器官和组织的血管组成的器官系统。血管按主题分裂成动脉侧(30.)，后者为组织提供来自心脏的含氧血液，而静脉侧则将未含氧的血液送回心脏，用于肺氧合。第三组血管包括淋巴管和毛细血管，它们管理淋巴液和细胞外液。然而，对于这篇综述的要点，重点将是动脉和静脉血管系统，主要强调动脉。

血管系统的病理生理学

静脉和动脉的结构是毫米或更小的尺度。因此，在受伤或病理的情况下，全身血管中可能发生系统性紊乱，同时影响这些结构。血管疾病病理生理学的广度令人印象深刻。广义上可分为动脉瘤性疾病及闭塞性疾病(31)．动脉瘤病是动脉瘤发展或血管病理性增大的一种分类。这种肿大可以影响任何血管，但最引人注目的是死亡率很高的主动脉瘤。然而，在扩大的基础上，是一个引起动脉壁减弱的分子过程。同样，闭塞性疾病可以广泛地归因于动脉粥样硬化过程和这些血管中斑块负担的发展。这种斑块不仅可以改变血流动力学，甚至可以完全闭塞并阻止远端灌注。动脉粥样硬化的发展又有一个复杂的分子级联。

血管病和血管炎

血管病理的另一种描述可以称为血管病。虽然差异很大程度上是语言上的，但由于临床意义的差异，区分这两者很重要。血管病理学常被称为“血管病”，更适用于前面提到的闭塞性和动脉瘤性疾病，血管炎是其重要的现有临床综合征。广义上讲，血管炎的定义是炎性细胞浸润血管壁，导致结构完整性丧失。此外，2012年国际教堂山共识会议根据血管大小、器官功能障碍和已知病因组织了血管炎(32，33)．最常见和研究的血管炎概述在表1．这些情况比术语血管病变更具有症状概括和临床相关性。在几乎所有从血管炎到动脉粥样硬化的血管病理病例中，内皮层的作用都被大量涉及(34)．

表1

表1根据血管大小和症状表现组织的血管炎。资料来自2012年国际教堂山共识会议^13、14。．

内皮和内皮功能障碍

内皮层是血管腔最内层的一层薄薄的细胞[称为内皮细胞(ECs)]。内皮最初被认为只不过是一种有选择性的可渗透膜，用于营养转移，但它的作用已在很大程度上扩展到心血管生理学的几乎所有方面(34)．先前的研究描述了ECs在血管生成、稳态和免疫反应中的作用(35)．这些细胞通常排列在血管器官的内层，与潜在的血管紊乱直接接触。在这一作用中，它们可以控制血管张力，白细胞粘附，以及亲凝和抗凝环境之间的紧密调节(36)．ECs最初被描述为与基底膜细胞一起的单分子层，但它一直扮演着不同的角色，不仅仅是一个简单的惰性屏障(36)．新的文献表明，这种内分泌器官具有影响因子和效应因子特性，可维持全身的内稳态(37)．更重要的是，稳态机制可以进一步分为(i)凝血和溶栓机制，(ii)白细胞相互作用，和(iii)血管收缩剂/血管扩张剂调节机制(37)．重要的是，血流动力学、粘度或斑块形成的任何改变都会直接影响内皮细胞。因此，这些严格控制的机制中的任何功能障碍都可能导致整个血管系统的毁灭性下游影响。任何偏离上述ECs作用的转变在很大程度上被定义为内皮功能障碍的一个实例。血管舒张减少，炎症标志物增加，血栓形成是内皮层功能障碍的标志(34)．在最严重的情况下，这种功能障碍可能是致命的，导致冠状动脉事件、肾衰竭、糖尿病和自由基的形成。内皮功能障碍的原因是多因素的，并已被归因于糖尿病，吸烟，高血压和一般不活动(38)．糖尿病是一种多因素病理，可导致内皮功能障碍长达数十年。

糖尿病和血管疾病

影响

根据2020年国家糖尿病统计报告，3000万18岁以上的人患有2型糖尿病，另有6800万人被诊断为“前驱糖尿病”。然而，比目前的发病率更令人担忧的是，这种疾病的流行率不断上升。糖尿病在年轻人群中呈指数级增长，正成为现代医疗保健系统中寿命损失最大的疾病之一。T2DM本身的特征是胰岛素反应性和血糖控制紊乱。这就造成了慢性炎症和自由基氧化的环境，损害大小神经血管束，即糖尿病血管病变。更重要的是，动脉粥样硬化负担的因素会导致动脉腔内斑块发展的增加。同样的过程也发生在冠状血管中，使冠状动脉疾病成为糖尿病患者死亡的主要原因(39)．在周围血管中，这种疾病过程被称为外周动脉疾病(PAD)，其成本超过2000亿美元(40，41)．PAD最常见和最病态的结果是截肢。5岁时，近50%的截肢者死亡(40，42)．

糖尿病性血管病变是一个包罗万象的术语，用于描述与糖尿病患者出现的全身高血糖和高血压相关的血管并发症。糖尿病性血管病变的特征包括对大血管的损伤，如主动脉和冠状血管，以及更多的外周损伤，如视网膜病变和肾病。冠状动脉血管易受斑块负荷影响，其病理生理特征与视网膜小血管有很大不同。不受控制的高血糖所产生的环境对血管的影响因血管大小而异。因此，存在二分法，我们可以探索糖尿病对大血管(大血管病变)和小血管(微血管病变)的影响。

糖尿病性血管病变的病因

糖尿病血管病变的巨大影响，创造了一个需要了解疾病过程的分子机制。早期提出的这种血管疾病的病因源于不同的药物疗法的治疗，然后追溯应用的原因。例如，由于ACE抑制剂和AT1受体拮抗剂的有益作用，肾素-血管紧张素-醛固酮系统已牵涉到这一过程。11)．同样地，用内皮素抑制剂治疗血管病表明血管增生是血管病的原因之一。Marano等人已证明这些抑制剂可减少颈动脉腔内增生(43)．然而，真正阐明这些机制需要进行全面的调查。

关于糖尿病血管病变机制的文献分为两种类型:物理和分子，前者经过多年慢慢积累。代谢因素与血流动力学改变一起导致细胞因子和血管因子的异常释放(44)．细胞因子如促硬化细胞因子转化因子B (TGFβ)在肾小球和肾脏中过表达，见于糖尿病肾病(45)．同样，生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR2在视网膜中也被发现增加(11)．这一过程的下游效应导致血流改变、异常重塑和斑块发展，引起与血管病变相关的大多数物理变化，如细胞外基质积聚和动脉粥样硬化。

外周组织依靠更小口径的血管进行灌注。因此，管腔直径的任何变化都可能极大地改变相关器官的生理特征。例如，传入的肾小球血管由于细胞因子和炎症标志物导致整个肾单位灌注增加而失去血管张力。下游可破坏肾小球基底膜，引起足细胞消失和蛋白尿。除了滤过器的丧失，原纤维化信号的细胞外基质的扩张导致小管间质纤维化(46，47)．这就形成了糖尿病肾病的临床图景。同样，在视网膜组织中，活性氧的增加和血小板衍生生长因子(PDGF)信号的丢失导致血管生成因子如Tie 2的增加，导致血管增生和典型的增殖性糖尿病视网膜病变(46，47)．糖尿病血管病变的三个主要方面是大血管动脉粥样硬化、肾病和视网膜病变(46)．

如前所述，糖尿病引起的高血糖环境加剧了大血管和小血管恶化的机制。具体来说，持续高血糖可导致三种状态。高血糖被用作失控的胰岛素抵抗/衰竭2型糖尿病的标志(48，49)．晚期糖基化是由于血流中存在过量的糖，导致糖被添加到脂质或蛋白质等分子上，产生晚期糖基化终产物(AGEs)。50)．这些AGEs可引起下游并发症，在基膜和下游级联中产生交联，导致活性氧含量增加(50)．这些因素加在一起，可导致血管通透性受损及血管病变(图1)．糖尿病的第二种代谢紊乱是蛋白激酶C通路(PKC)的激活(50)．这种化学级联主要调节血管平滑肌的收缩力。在糖尿病中，前面提到的AGEs和活性氧过早激活PKC通路，导致血管扩张剂功能障碍和大血管和小血管下游病变(52)．最后，山梨醇在多元醇途径中的积累是糖尿病的第三种代谢紊乱，可导致血管病变(52)．多元醇途径是将葡萄糖转化为果糖的两步途径。这一过程中的一种中间体是山梨醇，它是独特的，因为它不能通过细胞膜，而是留在细胞外产生渗透应力。在糖尿病的情况下，如过量葡萄糖，越来越多的山梨醇积累，导致渗透梯度增加和血管氧化损伤(53)．总而言之，所阐明的机制进行了大量研究，并构成了目前糖尿病的教条，因为它与血管功能障碍有关。然而，值得注意的是，这些机制都是已知分子途径的化学级联。缺乏对在基因组外水平上指示这些机制的模型的全面审查。

图1

图12型糖尿病相关血管并发症与内皮功能障碍相关的主要生化和细胞通路在T2DM受试者中，慢性高血糖激活不同的途径，导致内皮功能障碍，从而导致eNOS活性降低和线粒体ROS过度生成增加。这将通过激活几种改变内皮表观基因组的介质来产生促炎环境，随后是调节炎症反应、巨噬细胞浸润、凋亡和纤维化的基因的异常转录，导致糖尿病血管并发症。转载已得到Elsevier的许可。以下原始报告署名:Dhawan et al. (51)．

糖尿病性血管病变和周围神经病变

周围神经病变是一个包涵性术语，用于定义周围神经系统损伤，如麻木、刺痛、灼烧和疼痛(54)．周围神经病变的病理生理学发展是复杂的，有许多重叠的病因，从系统自身免疫性疾病到物理压迫(54)．然而，糖尿病是引起周围神经病变最常见的原因之一，占病例总数的50%以上(55)．这种发病率如此之高，世界卫生组织甚至创造了糖尿病周围神经病变(DPN)一词，以解释大量的共病(55)．糖尿病DPN患者最显著的神经损害包括神经纤维损伤、轴突损失和神经内膜微血管病变(56，57)．基于这些发现，Malik等人的研究显示临床神经病变症状与微血管改变呈正相关(58)．Yagihashi等人(2010)进一步研究了这种相关性，他们表明糖尿病的高血糖环境确实会导致微血管病变损害和下游神经病变症状(59)．他们的研究表明，高血糖导致多元醇通量紊乱，导致神经元细胞质中的山梨醇高渗，并最终裂解(60，61)．

此外，糖基化终产物如AGEs在DPN病理生理学中的作用也在研究中。AGE代谢物在糖尿病患者的动脉中大量积累(62)．然而，这些最终产物也被发现存在于胞浆和雪旺细胞中，对周围神经产生损伤作用。其他信号通路，如蛋白激酶C (PKC)通路在糖尿病血管病变期间也被不适当地激活(图1)．最值得注意的是PKC通路与神经功能的控制密切相关(63)．最后，由糖尿病血管病变(由慢性高血糖引起)引起的氧化应激和促炎状态增加细胞衰老并促进DPN的发展(64)．氧化应激产生的自由基已被证明可降低神经传导速度(65)．因此，糖尿病性血管病变是神经病变症状发展的主要诱因。上述多层面的病因意味着高血糖状态下血管结构的损伤不是孤立发生的。周围的神经和轴突也容易受到糖尿病紊乱的影响。对糖尿病血管病变的研究也提供了关于血管损伤在DPN发展中所起作用的重要信息。在这篇综述中，我们将进一步探讨在糖尿病条件下产生血管功能障碍的表观遗传成分。

表观遗传学和糖尿病血管病变

表观遗传修饰是一个广泛的术语，指的是基因转录的变化，而不是由于DNA序列的变化(66)．这些修饰主要调控DNA周围的核小体排列，控制基因的激活或失活。本文将讨论的五个典型例子包括1)DNA甲基化，2)组蛋白修饰，3)染色质重塑4)microRNAs和5)长非编码rna (67，68) [图2，详见Singh et al.， 2020 (24)]。这些不同的情况指出了基因组调控的一个独特方面，即DNA序列领域之外的外部因素可以调节复杂的疾病过程(69- - - - - -72)．T2DM具有非常复杂的遗传模式，遗传和环境因素之间存在复杂的交集。这种相互作用模拟了表观遗传修饰的功能，并在糖尿病和糖尿病性血管病变的发展中具有强烈的表观遗传作用(51，73) (图3)．

图2

图2高血糖诱导的表观遗传机制在代谢记忆和糖尿病内皮功能障碍中的作用。DNMTs, DNA甲基转移酶;组蛋白甲基转移酶;HATs(组蛋白乙酰转移酶);eNOS，内皮型一氧化氮合酶;NO、一氧化氮、AGE、晚期糖基化终产物;PKC，蛋白激酶;NF-κB，核因子-κB。

图3

图3高糖诱导内皮细胞的表观遗传重编程，并影响与其(dys)功能相关的基因。DNA甲基化和去甲基化、组蛋白修饰、mirna和lncrna调节与血管生成相关的各种基因的活性，并刺激病理生理途径，导致炎症反应，随后导致血管并发症。转载已得到Elsevier的许可。以下原始报告署名:Dhawan et al. (51）．

糖尿病血管病变的表观遗传机制

在前面提到的血管功能障碍的范式下，我们可以进一步探索发生在糖尿病血管病变中的特定表观遗传修饰，以及它如何适应微/大血管病变的图景。目前的文献是多样化的，因为它涉及糖尿病血管病变。Chen等人2016年进行的一项大型全面研究(74)研究了血糖控制不良在糖尿病微血管并发症中的作用。通过DCCT试验[糖尿病控制和并发症试验(1983-1993)]，研究人员发现严格升糖组和对照组之间的微血管变化显著(75)．没有血糖调节的对照组出现了前面提到的血管病变并发症(视网膜病变、肾病)的增加迹象。有趣的是，在对照组和葡萄糖限制组之间，DNA甲基化的部位是不同的(76)．这项研究为表观遗传学在糖尿病中的作用奠定了基础，并证实了先前的研究，即不受控制的高血糖在血管紊乱中的作用。

Nakatochi和研究人员发现，在心肌梗死(其中糖尿病共病率超过40%)领域，有三个独特的部位(77)．这些沿着DNA的独特位点被发现具有DNA甲基化的特征(24，78，79)．对日本男性的相关分析表明，这些位点的DNA甲基化不仅是心肌梗死的预测因素，而且与BMI和血脂水平无关。这表明了大血管疾病的独立调控通过表观遗传学。更进一步，贝尔等人，2010 (80)在192名爱尔兰患者中，与对照组相比，发现19个CpG位点与糖尿病肾病相关。正如Nakatochi等人2017年报道的那样，我们已经在大血管水平上看到了表观遗传调控(77)以及Bell等人2012年报道的微血管水平(81)在不同的人口统计群体中进行，并根据年龄和共病进行适当匹配。

糖尿病视网膜病变属于糖尿病的微血管并发症，但由于视网膜侧支的严重，因此更加复杂。Berdasco 2017等研究人员检查了视网膜血管的渗出性和缺血性损伤(82)．这两种变化都与糖尿病视网膜病变的慢性问题以及未控制的糖尿病通过促血管生成因子导致失明的发展相一致(83，84)．在一个三步模型中，研究人员发现，与渗出性和缺血性损伤一致的增殖性视网膜病变有46个CpG岛甲基化标记的基因(85)．更重要的是，整个MAP3K1通路，这超出了本文的范围，被发现在启动子附近低甲基化。调节基因的低甲基化与基因表达增加的教条是一致的。该途径的基因表达增加与增殖性视网膜病变的增加相关。更有甚者，Argadh等人，2015 (85)调查了与该疾病有关的全面DNA基因组。研究小组检测了300多个CpG位点的DNA甲基化率。研究结果不仅与糖尿病视网膜病变患者甲基化率水平升高一致，而且甲基化率甚至可以作为视网膜病变严重程度的预测算法。

目前，组蛋白修饰和染色质重塑在糖尿病和血管疾病发病机制中的作用研究有限。在高血糖状态下，胰岛特异性转录因子Pdx1招募共激活因子p300和组蛋白甲基转移酶(hmt) SET7/9来增加组蛋白乙酰化和H3K4me2 (23)．这种募集导致在胰岛素启动子处形成开放染色质并刺激胰岛素的产生。另一方面，在低糖条件下，相同的转录因子Pdx1可以招募辅抑制因子HDAC1/2，导致胰岛素基因表达受到抑制(23)．糖尿病组织中持续的炎症，通过组蛋白赖氨酸乙酰化升高内皮细胞中的炎症基因表达(86，87)．例如，H3K9/14Ac和组蛋白乙酰转移酶(HATs) CBP/p300在糖尿病组织炎症基因表达中起关键作用(88)．综上所述，这些发现表明，糖尿病刺激可以触发启动子甲基化和染色质结构的变化，从而对靶基因的表达产生长期影响。

糖尿病伤口无法愈合的表观遗传学基础

T2DM慢性并发症的一个不属于血管病变的领域是由血管病变引起的相关溃疡。虽然不是直接的血管损伤，但不愈合的糖尿病溃疡是与动脉功能不全和灌注减少相关的缺血的直接结果。特别是，由于糖尿病氧化应激和异常的基因-环境相互作用，创伤愈合的皮肤机制是不平衡的(89- - - - - -97)．如前所述，ECs功能障碍和糖基化产物的积累对疤痕形成和愈合的逐步过程造成损害(68)．在皮肤伤口愈合过程中观察到几种表观遗传机制，特别是DNA甲基化和组蛋白修饰(98)．具体的例子包括小鼠真皮伤口中H3K27 (H3K27me3)三甲基化的减少。这与H3K27特异性赖氨酸去甲基酶Jmjd3和Utx的表达增加有关。此外，多梳抑制复合物2 (PRC2)的组成部分:Eed, Ezh2和Suz12，甲基化H3K27，被发现在小鼠伤口愈合过程中下调(99)．另一个仍然受到严格表观遗传控制的基因是eNOS。在生理条件下，内皮细胞表现出持续的eNOS激活通过沿对称链和CpG二核苷酸的大量低甲基化启动子区域。Yan et al.， 2010的研究表明，内皮细胞与非内皮细胞之间eNOS的染色质结构也不同。特别是，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂甚至被证明可以上调eNOS水平(One hundred.)．因此，糖尿病伤口中eNOS水平的失调显示了表观遗传调节在伤口愈合中所起作用的直接途径。

巨噬细胞的作用也受到了质疑，因为在未愈合的伤口中看到的功能障碍与一种称为单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)的基因水平直接相关。在链脲佐菌素诱导的糖尿病巨噬细胞中，MCP-1基因显示与对照组小鼠相比增加。这种表达的增加是直接的表观遗传控制通过MCP-1启动子区域被单甲基化(68)．染色质重塑是一种重要的表观遗传修饰，参与调节炎症相关基因的转录，这些基因影响巨噬细胞极化和成功伤口愈合所必需的其他特性(101)．具体来说，HAT和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)激活炎性单核细胞分化和巨噬细胞表型。组蛋白修饰酶对巨噬细胞相关基因的改变与伤口愈合受损相关(102)．此外，atp依赖性染色质重塑(SWI-SNF)复合物在巨噬细胞发育中发挥作用。SWI-SNF与HDAC1相互作用，调节组蛋白乙酰转移酶(H3K27ac)和调节对细胞发育和分化很重要的基因(103)．

基于非编码rna的糖尿病伤口愈合疗法

MicroRNAs是短的单链，它不被翻译成蛋白质，而是与影响基因表达的mRNA强烈结合。miRNA的治疗潜力值得探索，因为:i)单个miRNA可以通过调节多个功能收敛的靶基因作为放大器，ii) miRNA是稳定的小生物分子，可以用新兴技术进行操作，iii)它们可以以可控的方式精确递送。治疗效果可以通过特异性miRNA的过表达或沉默来实现。潜在治疗性生物分子的递送是通过病毒或非病毒方法实现的，用于基因治疗，使用新兴的基于纳米技术的方法(104)．研究表明miRNAs功能的失调与糖尿病的发病机制和并发症有关(图4) (105)．例如，内皮细胞在严重高血糖中有特定的miRNA上调，在糖尿病足溃疡的血浆中也有类似的上调(105，106)．根据Madhyastha et al.， 2011年的研究，与对照组小鼠相比，另外14种mirna在糖尿病患者中具有可变的表达(107)．具体而言，研究发现，在糖尿病伤口愈合过程中，miR-146b上调了近30倍(107)．另一方面，MiR-21在糖尿病伤口愈合过程中降低(107)．Li等人，2009年发现miR-221抑制剂治疗降低了miR-221水平并改善了高血糖条件下的细胞迁移(108)．

图4

图4miRNAs在内皮细胞表型、功能和血管疾病中的作用及其直接靶点MicroRNAs参与:(一)血管生成,(B)血管炎症和动脉粥样硬化性血管疾病(C)血管张力和内皮细胞屏障(D)分泌的microRNAs和生物标志物。根据爱思唯尔发布的创作共用CC BY许可条款进行转载。以下原始报告署名:Chamorro-Jorganes et al. (105)．

MiR-200b长期以来被认为在糖尿病血管病变中起作用。既往文献表明miR-200b在糖尿病创面血管生成中具有调节作用(109)．然而，miRNA在高血糖中的调节作用存在问题。我们探讨了高血糖对miR-200b启动子的作用通过表观遗传修饰(18)．我们发现，在严重高血糖的糖尿病创伤部位内皮细胞中，miR-200b启动子区存在明显的低甲基化。这项工作首次证明了miR-200b的低甲基化状态(18)．此外，甲基供体s -腺苷- l-蛋氨酸通过重新甲基化启动子区域来挽救内皮功能也证实了这一事实。因此，控制特定mirna的表达可能是克服糖尿病相关并发症的有效治疗方法(110)．特异性基因的过表达和下调调控了主要由mirna调控的伤口生物学。阐明异常调控的mirna在皮肤伤口愈合中的过程将有助于开发新的靶向疗法。OxymiRs是响应组织氧合状态的mirna (111)．广泛的oxymir已被研究，它们在伤口愈合过程中有差异表达(112)．缺氧敏感的mirna被称为“低氧mirs”(113)．慢性非愈合伤口，如糖尿病足溃疡、静脉溃疡和压疮，其特征是缺血/缺氧(112)．在这方面，miR-203 miR-210和miR-21是深入研究的低氧mir，积极参与伤口愈合(114)．同样，在伤口愈合过程中，miRNAs在炎症控制中起着非常重要的作用(112)．miR-155, miR-146a和miR-132是一些与伤口和炎症相关的miRNAs (115)．例如，miR-155调节参与对抗病原体的免疫反应的蛋白的表达，这在慢性感染伤口中具有临床意义(116)．它还通过其他信号介质参与调节TNFα (117，118)．mir - 125 b (119)、miR-31、miR-17-3p (120)和miR-124a (121)是其他参与伤口愈合炎症调节的mirna。在皮肤伤口再上皮化过程中，miRNAs在维持屏障功能方面也起着关键作用(112，122)．mir -210依赖通路损害缺血创面再上皮化(123)．此外，皮肤角质形成细胞中miR-1的过表达会损害细胞迁移，最终影响再上皮化和皮肤屏障功能(124- - - - - -126)．在伤口愈合过程中，miRNAs通过引导血管化在血管生成反应中起着非常重要的作用(127，128)．一系列miRNAs参与血管生成过程的不同阶段——内皮细胞的增殖、迁移和形态发生。一些参与血管生成的mirna也被称为血管肿瘤，包括miR-15b, miR-16, miR-20, miR-21, miR-23a和其他(112，129)．上述mirna可通过调节其表达应用于临床环境通过基因疗法。然而，现有的挑战是以活性形式传递到相关组织/器官的有效性和特异性(130)．在理想情况下，细胞摄取传递的miRNA应该是高的，没有内体逃逸(131)．另一个限制是，针对一个miRNA的治疗方法可能会有不希望的脱靶效应，因为它对多个基因的下游影响。

长链非编码rna (Long non-coding RNAs, LncRNAs)是另一组在血管信号传导中起重要作用的非编码rna。LncRNA通过调控染色质动态和转录活性来调控基因表达。lncrna在心血管疾病、糖尿病和原发性开角型青光眼(132- - - - - -134)．例如，lncRNA ZEB-AS1作为miR-200b海绵调节细胞迁移、侵袭和增殖(135)．然而，这些lncrna也可能促进T2DM疾病或其他相关糖尿病相关并发症的进展(134)．越来越多的证据表明，多个lncRNA参与糖尿病并发症，多个血管生成miRNA‐lncRNA对与成熟阶段的伤口愈合有关。在伤口愈合过程中LncRNAs GAS5, IGF2AS, MALAT1, ANRIL, H19, MIAT和lncEGFL7OS被报道调节血管生成过程(136)．此外，有报道称，T2DM患者中循环lncRNAs NKILA、NEAT1、MALAT和MIAT表达的增加可能会影响T2DM患者的病情程度和严重程度(134)．因此，糖尿病创面血管生成是在严格调控的表观遗传控制下进行的。

血管组织成像方式

全球糖尿病患病率的上升预示着在糖尿病血管疾病的管理中纳入无创成像方式的重要性。无创血管成像继续为监测糖尿病患者的病理生理并发症提供功能参数。超声(USG)是一种有用的成像方式，可用于描述解剖性血管病变在非冠状动脉(137)．USG也是一种有价值的非侵入性成像方法，用于说明周围血管病变有助于糖尿病皮肤溃疡的发展(138)．此外，彩色多普勒美国技术使用稍微不同的频率，可以测量血管的血流(18，139，140)．脉冲波多普勒速度测量有助于提供相对精确的动脉大小测量，这是识别供血血管的基础(18，139，140)．确定糖尿病溃疡周围组织的血流率差异对于预防可能最终导致截肢的进一步并发症至关重要(137)．其他非侵入性3D成像设备，如热成像、微距摄影、激光散斑灌注成像和激光多普勒血流测量模式在临床上也与血管疾病的管理相关(141，142)．

除了测量血流灌注作为组织脉管系统的病理诊断测量外，无创成像模式还提供了易于使用的工具来监测血管组织微循环。计算机断层扫描(CT)是一种基于x射线的技术，用于表征微血管形态的变化。磁共振成像(MRI)是另一种用于评估啮齿动物模型中T1DM和T2DM的组织血管体积、微血管流量和生物标志物的渗透性的方法(143)．此外，高光谱成像已被用于量化糖尿病足部伤口护理应用中的组织氧合(144)．评估糖尿病足溃疡周围组织中氧和脱氧血红蛋白的空间图可以确定早期医疗干预的负担，减少截肢的可能性。然而，这些成像方式缺乏特异性，使得很难区分具有不同病理来源的细胞类型(137)．靶向成像技术的临床诊断应用将为医疗保健提供者提供细胞水平上血管过程的详细信息。为此，在低等哺乳动物的混合成像技术中，含有多种生物分子靶标的纳米颗粒在激活的内皮细胞中产生分子对比(145- - - - - -147)．此外，研究人员在单光子发射计算机断层扫描(SPECT)分析中使用核标记技术来测量白细胞的定位(148)．然而，核成像有限的空间分辨率会导致解剖定位不佳(137，148)．活体显微术(IVM)是一种成像技术，可以提高小动物血管组织的分辨率。

活体镜检在糖尿病血管病变评估中的应用

IVM是一种可以实时和亚细胞水平跟踪活体动物的生物学变化、细胞功能和细胞反应的显微技术。它结合了三维现实原位亚细胞水平的实时详细分析(149)．IVM提供了所观察的生物体活结构的整体动态性质。除其他优点外，IVM (i)与大量的标记方法兼容，(ii)实现原位时间过程动态成像，(iii)不排除完整的相互作用。在活的有机体内系统，(iv)提供了高空间分辨率，(v)甚至可以在分子水平上检查亚细胞环境，(vi)定量数据，(vii)随着时间的推移分析减少了研究中使用的动物数量(150)．IVM中使用的所有对比方法与激光扫描显微镜和任何多模态显微镜都能很好地工作。

在伤口愈合的背景下，IVM技术的应用可以获得高分辨率图像，并揭示伤口的组成、迁移细胞的通量以及血管组织元素如何对潜在的药物和治疗做出反应。2光子- ivm (2P-IVM)和越来越多的带有荧光报告细胞的小鼠品系的组合，为评估特定真皮元素如毛囊、腺体、血管和神经在真皮免疫反应中的参与和影响铺平了道路(151)．2P-IVM可以通过二次谐波(SHG)来发现皮肤中的胶原蛋白，从而简化细胞和入侵生物的追踪。类似于这种常见的纤维可视化，有几种试剂染色血液(埃文斯蓝，右旋糖酐)，淋巴(抗lyve -1)和真皮细胞(如CellTracker™CMTMR, CMTPX染料)(151)．

在IVM中，最常用的模型是背侧耳、侧腹、足底和背侧皮肤成像(图5）．由于不同的皮肤部位在环境、反应、细胞组成、纤维成分、神经和血管网络等方面存在差异，因此研究人员根据自己的具体研究选择成像模型或根据自己的需求对模型进行调整。总的来说，这些变量会影响皮肤研究(153)．耳廓成像是一种适用于感染、损伤、过敏及超敏反应相关研究的方法(154)．根据研究的需要，开发了不同的皮肤成像模型。对于感染皮肤表皮部分的HSV-1病毒，需要比耳廓模型所呈现的更大的表面积。因此，皮肤侧翼成像模型开始被使用，这是一个很好的模型，可以探索病毒病变和真皮外层的反应(151)．它连接最小的手术，更好的再现性，和病变部分的接入而不烧灼。在侵入性和纵向研究中，包括微血管再生、伤口愈合(155)，以及皮肤肿瘤(156- - - - - -158)，而不是与感染有关的研究。背侧皮肤成像是纵向和非侵入性成像，适用于感染相关的研究。与皮肤折叠背部皮肤腔模型(155)，可重复拍摄活体影像(150)．

图5

图5IVM用于皮肤和脂肪组织可视化的光学窗和成像室。非侵入性方法包括(一)耳廓成像和(B)脚垫成像。半侵入式方法(C)包括背侧皮褶腔，这需要手术植入两个钛或聚合物框架，可以固定一个带玻璃盖的环，通过玻璃盖进行成像。一种侵入性方法是生成皮瓣(D)，从而生成皮瓣，暴露出较大的成像区域。这个手术是侵入性和终末期的。一种较不常用的IVM成像方法是皮肤侧翼(E)这需要在背外侧位置开一个切口，直接成像或安装在不锈钢圆盘上以获得稳定的图像采集。脂肪组织成像有各种类型的窗口，可以看到各种各样的仓库(用X标记)。对阴部脂肪组织成像有一个下腹部末端窗口(F)是生成的。根据创作共用CC BY许可条款，由John Wiley及其儿子发布。以下原始报告署名:De Niz et al. (152)．

在这篇文章中，我们检查了阳离子亲脂性荧光染料罗丹明123 (RH123)作为线粒体特异性染色剂来测量IVM中的线粒体膜电位(159)．此外，使用Dextran, Texas Red™，40,000 MW (40kDA)标记成年小鼠皮肤中的血管元件。简单地说，C57BL/6小鼠在诱导室中使用5%异氟醚麻醉2-3分钟。之后，将小鼠固定在2-3%的鼻锥上。在达到手术麻醉水平后，将小鼠放置在一个塑料板上，上面有一个覆盖着手术悬吊的加热垫，以保持体温在~37.5°C。采用脚趾夹痛法测定麻醉深度。为了观察脉管系统并跟踪动态变化，首先，动物被注射20mg/ml溶液，其中含有溶解于1X PBS中的40kDA右旋糖酐德州红™，然后通过颈静脉注射20mg/ml含有RH123的溶液。Z-stack图像与延时成像所观察到的视野相同，并使用Imaris软件进行处理(牛津仪器)(图6)．

图6

图6成年小鼠皮肤血管双光子显微成像的活体标记。(一)德州红40 KDa右旋糖酐标记灌注的血管，罗丹明123标记存在于血管附近的含有线粒体的细胞质。比例尺= 80µm。(B)利用Imaris软件从面板上的感兴趣区域(ROI)重建三维血管结构(一)灰色代表二次谐波(SHG)，表示皮肤组织中的胶原蛋白。

在目前阶段，IVM有一些局限性，如(i)进入组织的深度只有几百微米，(ii)荧光染料的清除，(iii)通过全身注射进行昂贵的标记，需要高剂量的探针，(iv)未知且难以估计达到目标的标记物数量，(v)无法利用不同的动物疾病模型，(vi)主要基于小鼠模型和(vii)麻醉持续时间。这些问题需要在活体动物的糖尿病血管病变的组织水平分析中得到解决和优化。

结论

血管病理学的范围从急性疾病到慢性衰弱性疾病。2型糖尿病和糖尿病性血管病变有大量的文献，围绕复杂的化学级联反应和基因组发现，暗示遗传在疾病过程中的作用。从大血管粥样硬化到小的外周内膜增生和内皮功能障碍，糖尿病血管病变是一种广泛的多器官病理，治疗干预有限。然而，目前缺乏对糖尿病血管病变调控机制类型的全面综述。具体来说，发生在DNA外部的糖尿病调节过程还没有被充分探索。由于糖尿病的多面传播，表观遗传学的这一维度对糖尿病特别有趣。长期以来，糖尿病不仅被认为是一种遗传疾病，而且是一种依赖环境信号进行表达的疾病。这种复杂的相互作用可以在T2DM的遗传模式中看到。同样的教条也适用于我们之前研究过的表观遗传调控，表观遗传调控类似于产生糖尿病表型的环境压力源。虽然糖尿病的分子作用已经在很大程度上得到了探索，并概述了数十种化学级联反应，但仍然缺乏专门针对糖尿病调节机制的文献。 This article reviews not only the regulatory mechanisms of diabetes, but also the epigenetic regulations of diabetic vasculopathy. These regulatory processes occur exclusively outside the domain of DNA structure and order and thus are appealing for their potential therapeutic targets.

特别是，对糖尿病血管病变的表观遗传调控的研究表明，所涉及的表观遗传调控具有多重作用。血管新生障碍不仅会影响糖尿病创面，还会导致血流灌注受限、全身性高血压和皮肤创面愈合。另一方面，糖尿病视网膜病变中血管生成的增加与此相反，过度的血管增生会导致视网膜病变恶化。因此，仍然需要阐明表观遗传修饰在全身变化时的具体作用。同样，microRNAs的作用具有很强的调节功能，但这种功能在很大程度上依赖于高血糖等环境。有趣的是，表观遗传学的作用提供了自己作为药物干预的主要疗法。由于这些机制在基因组外运作，没有下游级联，改变这些甲基化蛋白或组蛋白修饰剂可以对糖尿病血管病变的治疗产生深远的影响。当然，这将建立在充分了解这些监管机构如何工作以及具体在什么条件下工作的基础上。这可能会造成一种情况，即治疗指征在一定的阈值(如糖化血红蛋白百分比)，但禁忌在较低或生理水平。

作者的贡献

TB, MK, SV, SM, SK, DR, CS和KS撰写了手稿。SV、SK、KS、MM、MK、KD参与小鼠皮肤活体显微镜实验。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项工作得到了美国国防部授予KS的W81XWH-22-1-0146和KS的W81XWH-21-1-0033的支持。这项工作得到了国家普通医学科学研究所向CKS授予的GM077185和GM108014的部分支持。这项工作也得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所向CKS授予的DK128845和DK125835的部分支持。由CKS领导的研究项目得到了礼来捐赠INCITE(印第安纳州人才培养合作倡议)项目的支持。CKS的研究项目还得到了约翰邓普顿基金会ID-61742的资助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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参考文献

1.血管病变谱在血管炎鉴别诊断中的应用。Semin神经(1994) 14:370-9。doi: 10.1055 / s - 2008 - 1041097