个体发生ependymoglial细胞衬里第三脑室老鼠

介绍

mediobasal下丘脑控制着不同的生理过程和行为必不可少的生活,从喂养(1)到生殖(2,3)。

围绕第三脑室(3 v),下丘脑mediobasal发达从发芽的神经上皮在胚胎发育(4)。胚胎心室区主要由径向神经胶质细胞。这些神经干细胞是双祖细胞产生神经元和神经胶质和作为支架新生神经细胞脑实质内到达目的地5,6)。经典,地幔层形式连续3波的神经发生,领先的外侧,内侧,最后运动前区,melanin-concentrating激素的起源(MCH)外侧下丘脑中的神经元(方面)(7,8)或其他神经元在腹内侧核(VMH) (9,10)。后来,心室区发展给室管膜层(11)。

沿着3 v mediobasal下丘脑室管膜层的特点是异构的室管膜细胞的存在。首先,纤毛和立方形的细胞在不同的大脑区域−−典型线路的上部3 v和参与脑脊液循环(12)。第二个细胞类型,特点是一个漫长的过程,存在的只有一个或两个纤毛,线条的侧壁和底部3 v。这些特殊的室管膜细胞称为tanycytes被认为是让人联想到放射状胶质细胞在大脑和目前分为四个不同的亚型,α1,α2β1,β2 (13,14)。在哺乳动物(限于circumventricular器官15),tanycytes扮演一个角色在许多神经内分泌功能,如葡萄糖体内平衡,能量平衡和繁殖(16- - - - - -18)。

而下丘脑神经发生啮齿动物(地幔层是有据可查的19,20.),个体发生学mediobasal下丘脑内的室管膜仍有限公司(13,19,21- - - - - -23)。在这里,我们使用BrdU公司提供一个时空特征的鼠标gliogenesis室管膜层。此外,分析了神经元生日的弧形(ARH)、腹内侧(VMH),下丘脑背内侧核(DMH)比较的角度来看。我们首先确认一旦生成的室管膜主要是邻近的神经元。然而,这一代是高度异质细胞亚型。事实上,我们决定不同的时空梯度rostrocaudal室管膜的生成和背腹侧的轴。使用公开scRNAseq数据集,我们最后强调了转录拟时间发展轨迹形成成熟的tanycyte和典型的室管膜细胞的数量。

材料和方法

动物

C57Bl / 6 j小鼠(最初来自查尔斯河)被用于这项研究。雄性和雌性老鼠放在一起下午5点左右,检查和阴道栓的第二天(在9点之前)。在这种情况下,时间的概念被认为是记录和胚胎日0时(E0)。出生的日子被认为是0 (P0)产后的一天。所有动物在洛桑大学的程序进行,综述了通过广州德沃州的兽医办公室。

溴脱氧尿苷注射剂

BrdU晶体(5-Bromo-2-deoxyuridine BrdU,罗氏应用科学,# 10280879001)溶解在0.07 M氢氧化钠溶液加热到65°C。怀孕的老鼠(妊娠9到18天)和雄性幼崽(P0 P8)都被赋予了一项单一的ip注入大约10点。(50毫克/公斤)。

组织准备。21到23天出生后(P21-P23),雄性小鼠灌注和异氟烷麻醉BrdU-injected transcardially 0.9%氯化钠溶液,紧随其后的是一个冰冷的0.1磷酸盐缓冲剂,4%的多聚甲醛溶液pH值7.4。大脑很快被移除,后缀相同的固定剂两个小时在4°C,沉浸在20%蔗糖在0.1 m磷酸盐(PBS)一夜之间在4°C。10月的大脑终于可以嵌入在冰冷的介质(最佳切削温度包埋剂,组织Tek,樱花)和冷冻液体nitrogen-cooled异戊烷(产后大部分注入动物)或直接冻结在了干冰没有10月(所有产前注射的动物)。不同组每组(n = 3 - 7)被称为“E9”,“E10”、“P1”…:这些发育时间点对应于单一i.p。BrdU注入。

免疫组织化学

大脑使用低温恒温器切成25-μm-thick日冕部分为免疫组织化学和加工如前所述(24)。短暂,slide-mounted部分在沸腾1)孵化10毫米柠檬酸缓冲溶液,pH值6.0,12分钟;2)阻塞1小时使用解决方案包含2%正常山羊血清和0.3% Triton x - 100;3)孵化一夜之间在4°C主要抗体(表S1)之后,两个小时在室温下的鸡尾酒二级Alexa Fluor-conjugated抗体(1:50 0、分子探针、表达载体,圣地亚哥,CA) (表S2);4)安装与DAPI Fluoromount-G(南方生物技术;裁判:0100 - 20)。

抗体特征

列出使用的所有中小学抗体补充表S1,S2。兔多克隆抗体BrdU (Bio-rad猫# AHP2405 RRID: AB_2922993)认识到合成胸苷模拟溴脱氧尿苷(BrdU)。VIM(波形蛋白)的鸡多克隆抗体(微孔猫# AB5733 RRID: AB_11212377)生产的染色模式与tanycytes,室管膜细胞,内皮细胞,其他地方文献中所描述的相似(25)。鼠单克隆抗体NeuN(特异性神经元核蛋白质)(微孔猫# MAB377 RRID: AB_2298772)生产的染色模式与神经细胞,其他地方文献中所描述的相似(26)。

显微成像

照片是获得使用蔡司Axio成像仪。M2显微镜,配备ApoTome。2和a Camera Axiocam 702 mono (Zeiss, Germany). Specific filter cubes were used for the visualization of green (Filter set 38 HE eGFP shift free (E) EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50), red (Filter set 43 HE Cy 3 shift free (E) EX BP 550/25, BS FT 570, EM BP 605/70), and blue (Filter set 49 DAPI (E) EX G 365, BS FT 395, EM BP 445/50) fluorescence. Different magnifications were selected using a Zeiss x20 objective (Objective Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 (FWD=0.55mm)) and a 63× oil immersion objective (Objective C Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 (FWD=0.14mm)). To create photomontages, images were acquired using ZEN 2.3 pro software using Z-Stack and Tiles/Positions ZEN modules for each fluorophore sequentially. Quintuple-ApoTome frames were collected stepwise over a defined z-focus range corresponding to all visible fluorescence within the section. Multiple-plane frames were collected at a step of 0.3 µm while using the x63 objective (between 43 and 60 frames per image) and 1 µm while using the x20 objective (between 11 and 18 frames per image). Weak deconvolution was finally applied to images following the acquisition. All images were saved in.czi, processed to get maximal intensity projections, and finally exported in.tiff. for the processing steps (即调整亮度和对比度和合并通道)使用Adobe Photoshop (Adobe Systems,圣何塞,CA))。

数据分析

BrdU使用AxioImager D1显微镜进行了量化。两个调查人员确定ependymocyte生日通过计算BrdU-positive和vimentin-positive细胞的数量。vimentin-positive Tanycytes是从典型的室管膜细胞分化的基底的过程。一个侦探量化神经发生通过计算BrdU-positive和NeuN-positive细胞的数量。感兴趣的区域(即。心室层,ARH, VMH、DMH)被确定基于DAPI染色。ventrodorsal分析,心室分为七个亚区对应区域tanycyte进程发送(即。内侧正中隆起,侧正中隆起,腹内侧ARH、背内侧ARH, VMH、DMH)和层组成的典型的室管膜细胞(图1)。rostrocaudal轴,该地区被划分为四个亚区,对应区1(从前囱-1.2到-1.5毫米),区域2(从前囱-1.6到-1.75毫米),带3(从前囱-1.8到-2.1毫米),和带4(从前囱-2.15到-2.5毫米)(图1)。从神经解剖学的角度看,这些细分定义基于心室的形状和下丘脑核的存在/缺席3 v。这些细分已经描述和使用前的研究(27,28)。

量化进行3 - 7动物每个时间点,在大脑5 - 12节/(平均每1到3部分区域),以及两个半球。BrdU-positive细胞的总数是计算区域和规范化的数量分析部分(表S3)。BrdU标记模式显示低变异性之间的动物注射在同一年龄。

单细胞RNAseq数据分析

公开scRNAseq数据集分析中描述与一些修改原来的论文(26,29日)。发展时间点(E10-E16 E18, P4、好和下岗通知)scRNAseq数据集从金et al。(26)(GSE132355)独立分析使用修以下4.4.1识别的发育年龄tanycyte-like细胞可以作为一个独立的集群。后生成一个SeuratObject从原始数据和分裂发育时间点的矩阵(“orig.ident”),我们筛选细胞包含至少200的特性,和所有数据集是规范化和推广使用scTransform(30.)。UMAP降维后(保持第一个50 PCA变量),我们聚集细胞使用的分辨率1.7最大化集群分离。此外,我们使用微分集群之间的基因表达(DGE)分析确定主要下丘脑细胞类型使用已知的细胞标记基因从原来的出版。基因本体论分析使用ShinyGO (v0.76)去获得丰富术语使用特性表达tanycyte集群在每一个发展时间点进行了分析。ShinyGO将得到的生物过程命令错误发现率(罗斯福)阈值为0.05。

识别室管膜的发展轨迹,下丘脑数据集从E11下岗通知(P8除外)从金et al。(26)是综合使用和谐(31日)。正常化,降低维度,和集群进行如上所述。细胞类型识别后,集群包含祖细胞(npc)、室管膜、tanycytes在修拉的子集。由此产生的对象被转换为修CellDataSet计算拟时间轨迹从npc室管膜并使用Monocle3 tanycyte人群。差异表达基因分析单细胞轨迹对面npc室管膜和tanycyte人群使用graph_test函数。

识别tanycyte亚型在发育时间点,我们分析了柳et al。(29日)(GSE160378)使用修scRNAseq数据集。原始数据集的子集包含P8从野生型老鼠完全发育的时间点。数据归一化、空间的减少,和程控识别进行如上所述。所有分析RStudio使用以下4.4.1 (v1.4.1103)。的版本。

结果

分析内部的室管膜细胞和神经元的诞生mediobasal下丘脑室旁区,怀孕的大坝(从E9 E18)和雄性幼崽(P0 P8)都被赋予了一项单一的ip BrdU注入,然后它的标签是日冕上执行从21 - 23-day-old雄性老鼠大脑的部分。波形蛋白(图2 a - c)和NeuN (图2 d-f)co-stained可视化室管膜细胞和神经元,分别。我们第一次观察到一个微分模式BrdU标记的心室(图2 a, C)。事实上,在年轻的时候,BrdU合并心室,但其标签不填写整个细胞的细胞核(图2 c之后,双箭头),这意味着额外的细胞分裂和突出高生殖能力。另外,BrdU整个细胞核染色填写(图2 c箭头),表明没有额外的细胞分裂,因此,细胞的诞生。分析,我们致力于全面BrdU-staining室管膜细胞(图2 a - c)和神经细胞(图2 d-f)。室管膜细胞进一步细分为典型的长方体室管膜细胞与tanycytes基于基底的存在vimentin-positive过程(图2 a, B)。

充分评估ependymoglial细胞和神经元的异质性生日在3 v,系统的分析了ventrodorsal和rostrocaudal轴(图1,2 g-j)。3 v第一次被分为七个亚区ventrodorsal轴:室管膜层面临的内侧正中隆起β2 tanycytes,腹侧的侧正中隆起β1 tanycytes,背的腹内侧ARH (vmARH)β1 tanycytes,背内侧ARH (dmARH)α2 tanycytes,吻侧的VMHα1 tanycytes,紧凑的部分DMH (cDMH)尾α1 tanycytes,和背DMH的一部分典型的室管膜细胞(图1)。此外,该地区是沿着rostrocaudal轴分为四个亚区,对应区1(从前囱-1.2到-1.5毫米),区域2(从前囱-1.6到-1.75毫米),带3(前囱-1.8到-2.1毫米)和带4(从前囱-2.15到-2.5毫米)(图1,2 g-j)。最后,新生神经细胞的分析是基于一个BrdU注射执行在不同的时间点从E9 P8来推断时间梯度在BrdU标记模式(图3和文件S1)。因此,“E12汽油”大脑(即。、大脑是从P21-22雄性幼崽的母亲怀孕期间收到一个BrdU注入E12汽油)显示高代的神经元和室管膜细胞的低利率在这个时间点(图3一)。相比之下,室管膜主要起源于E13 (图3罪犯)在不同代节奏根据室管膜细胞亚(文件S1)。事实上,典型的室管膜细胞、α2和α1 tanycytes E13显示更高的一代,分别E14灯头和E15 (图3罪犯括号)。

神经元生日mediobasal区内主要E11和E13之间发生在老鼠

在室周的(即ARH DMH)和内侧核(即VMH), BrdU / NeuN-positive神经元被发现在动物注射E9和E18 (图4一和表S3)。没有观察到产后神经发生。因此,神经源性生殖峰值主要发生E11和E13之间集中生成的细胞总数的75.6%在整个时期(图4一)。然而,BrdU / NeuN标签模式揭示了地区差异(图4 a, B)。首先,多数BrdU / NeuN dmARH细胞被发现,DMH, mVMH,路易威登为24.0%,22.7%,20.9%,和15.9%的细胞生成(即整个发展窗口。分别从E9 P8) (图4 a, B和表S3)。一代水平较低在vmARH观察(8.2%)和cDMH (8.3%) (图4 a, B和表S3)。其次,BrdU / NeuN标签模式确认VMH lateral-to-medial梯度的一代(9,10)。事实上,大多数观察新生神经元的横向VMH E11的生成,而在内侧VMH起来一天后E12汽油(图4 b和图S1)。然后,在室旁核神经元生成峰(即ARH和DMH地区)都集中在几天内E12汽油和E13之间没有lateral-to-medial梯度(图4 b,S1)。第三,一些核另外显示rostrocaudal梯度的神经一代(图4碳氢键)。具体来说,在vmARH新生神经元的生成,主要出现在E11 E13(与图4 b,S1),实际上开始吻侧区1 4 E10尾地区和结束区E13 (图4 c)。在dmARH,大多数神经元从E11 E14灯头(出生图4 b),从吻侧区1 4 E10尾地区和结束区E16天(图4 d)。相比之下,VMH神经元之间生成E11和E12汽油(图4 b)没有rostrocaudal梯度(图4 e, F)。DMH神经元之间生成E11 E14灯头,《创世纪》的第一个峰值区域2和3,第二个尾区4 (图4 g)。然而,神经一代开始第一个和持久带3和4 (图4 g)。在cDMH,大多数神经元生成区3 E13 (图4 h)。总而言之,这些不同模式的神经发生显示lateral-to-medial梯度VMH和轻微rostral-to-caudal室旁ARH方向,DMH细胞核。

典型的室管膜细胞代E13山峰,而tanycytes生成在一个扩展的时间窗口

室管膜细胞生成(即。,典型的室管膜细胞和tanycytes)发生在一个长时间窗口,出现高度异构(图5,6和表S3)。全BrdU-positive细胞的分布在3 v显示不同的时间,背腹侧的,rostrocaudal梯度(图5和文件S1)。

首先,作为观察神经元(图4沿着3 v (), BrdU掺入不同图6)。而αtanycytes显示高水平的一代,代表62.0%(α1 = 33.0%,α2 = 29.0%)新生儿室管膜细胞内(即整个时期。,from E9 to P8), typical ependymal cells, β1, and especially β2 tanycytes, had low levels of generation, representing 9.5%, 26% (β1ventral = 7.3%, β1dorsal = 18.7%), and 2.5% of generated ependymal cells, respectively (图6 a, B和表S3)。因此,没有明确的一代峰观察β2 tanycytes,而不是显示低一代E11和E18之间(图6 b)。

跨越发展,典型的室管膜细胞在短时间内生成窗口E12汽油和E16天之间达到E13 38.5%的细胞一代在整段时期(即。从E9 P8) (图6 a, B和表S3)。相比之下,tanycytes生成在一个扩展的时间窗口从E10 P8 (图6 a, B)。具体地说,我们第一次发现BrdU公司β1 tanycytes大多E11和E18之间,发生的峰值在E12-13腹β1 tanycytes和E14灯头背β1 tanycytes (图6 b)。接下来,α1和α2 tanycytes起来更扩展分布在整个开发、主要E12汽油和P3之间(图6),两代山峰E14-15和E17 (图6 b)。α2 tanycytes开始生成前一天α1 tanycytes (图6 b)。因此,这些结果表明“由外向内”一代模式3 v的沿着背腹侧的轴。的确,细胞第一次生成典型的室管膜细胞和βtanycytes E12汽油和E14灯头之间的背侧和腹侧区域然后在αtanycytes位于中部地区之间E14灯头和P3 (图6 b)。

进一步理解长时间窗口和室管膜生成的多个峰值,我们接下来分析BrdU公司沿着rostrocaudal轴(图6碳氢键;S2根据室管膜),揭示附加不同的亚种。室管膜细胞生成的主要在每个区没有rostrocaudal梯度(E13图6 c)。关于αtanycytes,我们观察到一个强大发展rostral-to-caudal梯度的一代。事实上,α1和α2 tanycytes首先生成的吻侧区域1和2,其次是3和4在发展以一种更加有效的方式图6 d, E)。本强梯度解释观察到的两座山峰的一代E14灯头和E17 rostrocaudal轴时不考虑(图6 b)。相比之下,β1 tanycytes面对vmARH(β1d)没有显示清晰的rostrocaudal梯度一代(图6 f)。有趣的是,一代的腹侧β1 tanycytes(β1v)更多的扩展区域1和2−从E11 E18−,而它的峰值在E12-13区3和4 (图6克),建议稍微caudal-to-rostral梯度。同样,β2 tanycytes,尽管我们观察到低BrdU合并在这个细胞亚型,生成模式显示轻微caudal-to-rostral梯度与延长P1区2代与较早和较短的窗口区域3 (图6 h)。

总而言之,我们的研究结果表明,典型的室管膜细胞(E13)和βtanycytes (E12-14)是第一个峰值后不久产生神经元生日(E11-13) (图7)。但是,这一次的区别是不太清楚当你考虑rostrocaudal梯度观察神经元生成(图7 b)。的确,以前出生的神经元是室管膜细胞和βtanycytes吻侧区,但与此同时出现在尾地区(图7 b)。相比之下,很少或没有重叠神经元和αtanycyte生日。具体来说,在神经元的高峰期出生的时机E11和E13之间,只有一小部分的α2 tanycytes生成。αtanycytes出现之后,一个健壮的rostral-to-caudal梯度(图7 b)。

Tanycyte-like细胞成为一个独立的细胞群E14灯头,但被认为是成熟的P4和好之间

我们的分析显示,神经元在E11-E13生日主要山峰,室管膜细胞在E13,β和αtanycytes有更广泛的分布式发电与多个生殖山峰之间E12汽油和E18 (图7)。探索发展模式的差异室管膜细胞生日,我们分析了公开发展下丘脑scRNAseq数据集(26,29日)。通过使用整个间脑的或下丘脑外植体在胚胎和产后的时间点,金等。26)确定tanycytes形成一个独立的集群从P4。此外,他们证明tanycytes偏离轨迹的室管膜细胞E13当他们开始表达tanycyte和室管膜特异性标记,如递交和Foxj1分别为(图S3A)。

同意他们的研究结果,分析发展scRNAseq数据集在每个时间点分别证明了人口tanycyte-like (递交艾滋病患者)细胞可以识别为一个独立集群从E14灯头(图7 c)。不过,tanycyte-like细胞不共享相同的转录形象在不同发育时间点。的确,DGE tanycyte-like细胞分析在每个发育时间点首先表明tanycytes特性通常存在于成熟,等Col23a1,Frzb, Slc7a11,Thrsp好,只是观察和数据集(下岗通知图7 d和表S4)。相比之下,参与细胞分裂的基因,如Cdca8和Ccnb1表达,特别是在E14灯头(图7 d)。同样,tanycyte-like细胞胚胎时间点表达Dlk1和到E18 (图7 d和表S4),符合其增殖能力在早期开发(6,32)。的细胞周期蛋白依赖性激酶到是有丝分裂的主监管机构参与细胞增殖(32),这表明这些产生径向神经胶质细胞可能。有趣的是,基因Sox9,Tox3,Plag1和几个特性NFI家族的转录因子(Nfia, Nifb),被认为与神经发生的负调节(29日)和gliogenesis发作的控制(33- - - - - -35),表示在E16天(图7 d),相应的神经发生高峰和破裂αtanycyte代(图4,6)。一致地,Sox9命运似乎参与neurogenic-to-gliogenic开关(36)。其次,我们的差异表达特性进行了比较分析tanycyte-like集群在发展。具体地说,100年更重要的是表达基因tanycyte-like细胞比较下岗通知tanycyte-like细胞标记的其他发育时间点:大多数好和部分P4 tanycyte-like细胞共享相同的特性相比,成熟tanycytes下岗通知(图7 e),强调在P4 tanycyte成熟的开始。事实上,我们观察到的高水平的表达成熟tanycyte标记Col23a1,Gpr50,Ccnd2。此外,Hes1,一个基因与径向神经胶质和神经内分泌细胞分化,显示表达水平的增加从E18 (图7 e)。第三,进一步探索不成熟与成熟tanycyte-like细胞在发育时间点的状态,我们进行了基因本体分析关注生物过程方面tanycyte-like细胞在下岗通知(图7 f),而第一个50更重要的方面去其他发育时间点(图7 f, G)。符合已知的tanycyte函数(16- - - - - -18),下岗通知条款构成对激素的反应,内源性刺激,或脂质,和运输管理(图7 g)。正如上面报道的,P4和好tanycyte-like集群共享最去的条件相比,年长的产后的数据集(图7 f蓝线)。有趣的是,许多去术语与RNA加工和拼接E14灯头和tanycyte-like下岗通知集群之间共享(图7 g)。总之,这些结果表明,虽然tanycytes-like细胞识别E14灯头开始,这些细胞不完全成熟,直到产后早期发育,可能在P4和好之间。

最后,确认tanycyte在产后发展成熟,我们探讨不同亚型的专门化的发生(即。,α2α1β1,β2 tanycytes) (数字S3B C)。由于下丘脑中发现的高异质性的细胞类型数据集金et al。(26)和相对较少的tanycytes确定每个年龄,tanycyte亚型并不在任何时间点的。为了克服这个问题,我们分析了scRNAseq数据集递交+在野生型小鼠下丘脑细胞P8 (29日)。在协议与原来的文章中,我们分析允许识别tanycyteα1,α2,β1,β2细胞群(数字S3B C),这表明tanycyte亚型已经出现在产后早期发展。

转录开关从gliogenesis tanycyte成熟

探索tanycyte成熟过程中,我们最后做一个综合分析下丘脑发展数据集金et al。(26),专注于发展轨迹的tanycytes未分化的细胞。祖细胞类型识别后,我们子集(npc) tanycytes和室管膜细胞的数量(图8 a, B)和执行拟时间轨迹分析(图8 c)。拟时间分析使我们过渡状态和形象化的时机发展轨迹tanycytes npc与分别为典型的室管膜细胞(图8 c)。人口发展轨迹的tanycyte发现了一个有一个年龄约E16天第一开关对神经胶质细胞命运分化(图8 d-f)。从E11 E16天基因Tubb2b和Rlp10参与神经发生是全国人大集群中高度表达,之后迅速减少(图8 f)。在这个时间点(E16天)基因的表达在神经胶质细胞增殖和分化(即。,Dbi, Ptn Nfix)和神经发生的负调节(即。,Mt3)增加(图8 f)。此外,我们更清楚地观察到从E16天但在P4-P14第二个开关向tanycyte成熟以增加表达tanycyte特定标记(即。,Col23a1)和基因的负调控星形胶质细胞分化(即。,Gpr37l1是)(图8 f和表S5)。最后,室管膜轨迹类似的成熟模式被发现(图S4和表S5)。具体来说,从E16-18和产后期间更清楚点,室管膜开始表达特定的标记等Foxj1、Cdhr4 Pltp、Tm4sf1 Pcp4l1, Tmem212, Stoml3 Hdc(图S4和表S5)。这些标记是与糖脂类运输条款,积极调节胆固醇流出,纤毛,负调节有丝分裂细胞周期。相比之下,E16天,沿着轨迹npc之前,我们观察到的表现不成熟的标志Taf10,Kldhc2,Tead2,Nusap1,Gap43与细胞分裂,放射状胶质细胞分化和胚胎发育。总之,这些结果说明tanycyte-like细胞来源于npc E16天开始在早期发育和成熟。

讨论

这项研究表明,神经元,典型的室管膜细胞,tanycytes出现在胚胎发育期间不同时代的节奏。神经元主要出现在E11-13,典型的室管膜细胞在E13, tanycytes显示来自E12-P3广泛发育一代没有明确的峰值时,不考虑不同的亚型。神经元生日mediobasal下丘脑在时间和空间不同,定义一个lateral-to-medial梯度VMH和轻微rostral-to-caudal ARH和DMH梯度。此外,由外向内的室管膜出现背腹侧的梯度(即,典型的室管膜细胞和βtanycytes之前生成αtanycytes),以及一个标志着α1 rostral-to-caudal梯度等α2 tanycyte人群。

在胚胎发育过程中,神经细胞来源于放射状胶质细胞(37,38等),这显示许多细胞功能(1)神经源性(13,37,39)和转变(40- - - - - -42)能力,(2)帮助新生神经元的迁移,和(3)监测大脑皮层gyrification (43)。首先,同意我们的结果,它主要是描述从E10 E16天神经发生发生在啮齿动物中,峰值之间E12汽油和E14灯头mediobasal下丘脑区域(8,19,24,44,45)。基本上,它通常是确定下丘脑神经发生的峰值在老鼠和老鼠E13-15 (E12-1446)。此外,许多研究使用BrdU方法或其他人−−观察lateral-to-medial梯度在外侧下丘脑神经元生成第一个发生在E11并完成内侧E13下丘脑核(8,44,45),虽然有些没有发现任何变化在时间和神经解剖学的分布(47)。在这里,我们确认VMH lateral-to-medial梯度的一代。此外,我们的结果显示一个轻微rostral-to-caudal梯度ARH和DMH神经元生成的。同意这些结果,这种梯度已经描述(19,45)。值得注意的是,一项研究表明,神经元生日第一次发生在E11 mid-rostral和腹侧地区,其次是尾地区E14灯头(20.)。作者发现mid-rostral神经元主要是growth-releasing激素(GRH)神经元ARH地区的老鼠。这样的神经解剖学的生成渐变参与下丘脑区域化和函数(26)。最后,我们的研究没有揭示产后神经发生mediobasal下丘脑(虽然已经报道4)。的差异可能是由于我们使用的方法(即。单BrdU注入),不允许低利率神经发生的可视化。

在小鼠和大鼠,典型的室管膜细胞和tanycytes也源自放射状胶质细胞(13,43)。在老鼠了,典型的室管膜细胞主要是来自E16天E18,而tanycytes生成在妊娠的最后两天,第一个产后一周(19)。此外,室管膜细胞生日之前tanycyte代(19,21,22),α2 tanycytes先于α1 tanycyte开发(13)。类似的发展生日被发现在灵长类动物tanycyte分化发生mid-gestation (23)。我们的结果表明类似的年表与室管膜细胞的生成,紧随其后的是βtanycytes和αtanycytes。然而,室管膜一代在小鼠早期出现,从E12汽油。此外,我们的数据显示一个健壮的rostral-to-caudal发展梯度为αtanycytes,与尾地区活动更加突出。奥特曼和拜耳也定义了最新tanycyte代尾地区扩展到P8在大鼠(19)。这些发展梯度也与这一事实相一致,在tanycyte亚种群,最背αtanycytes是最后达到成熟度(48)。另外,值得注意的是,略有caudal-to-rostral梯度存在代β2和腹侧β1 tanycytes,正中隆起显示不同的发展模式,但在文献中没有额外的线索。最后,比较tanycyte亚型生殖活动在整个期间透露,αtanycyte代比β更突出的亚种。有趣的是,αtanycytes是主要的亚型维护产后大脑神经源性能力(4,29日)和成年期(49,50)。因此,BrdU合并在这个族群P8可能间接地与他们在产后的大脑干细胞特性。最后,我们在这里提出发展“由外向内”的存在背腹侧的梯度的一代,由细胞位于顶部(即。,典型的脑室的室管膜细胞)和底部(即。一起,βtanycytes)生成第一,其次是细胞中部地区(即。,αtanycytes)。没有我们的知识以前文献中所描述的关于这样一个不同寻常的背腹侧的梯度沿着第三脑室。然而,它也可能依赖于有限区域分析(即。,mediobasal下丘脑)和我们减少脑组织的方式(即。,2 d日冕部分)。还需要进一步的研究来重建整个第三脑室的起源和获得一个立体的室管膜生成渐变的照片。

了解时间和空间异质性的一代mediobasal 3 v室管膜,我们使用一个公开可用的分子图谱的发展中老鼠的下丘脑,使用间脑的生成和下丘脑外植体在胚胎和产后时间点(26)。在这项研究中,作者发现的转录差异在E13 tanycytes和典型的室管膜细胞,细胞类型特异的标记的微分表达式等递交和Foxj1,分别。一致,BrdU分析强调了峰值的典型E13室管膜细胞生成。使用相同的scRNAseq数据集,我们也确定了外观tanycyte-like (递交艾滋病患者)集群从E14灯头:但是,一个成熟的转录概要更清楚地观察到在产后发育时间点P4-14,据其他人(4)。事实上,P4和好之间,tanycytes增加许多成年细胞中描述标记的表达,如葡萄糖(即。,Slc2a1,Slc2a2)和glutamatergic转运蛋白(即。,Slc1a2,Slc1a3)(51- - - - - -53)和生长因子受体(即。,Fgfr1,Igf1)(54- - - - - -59)。这些观察表明,tanycytes P4之间足够成熟,好应对能源可用性的变化。使用不同的方法,Mirzadeh et al。(60)估计tanycytes的成熟后通过检查产后的巢蛋白的表达,径向神经胶质的标志(61年)和GFAP。在产后第十天,作者观察到巢蛋白表达减少和GFAP表达的增加(60),这表明tanycyte P10继续成熟。一致,老鼠和老鼠的形态学和组织学研究表明,tanycytes开始完全成熟在生命的第一个月(19,48,62年)。进一步的研究将额外的时间点在产后发展将有助于拓展我们的知识tanycytes成熟。

生成的分子图谱发展中老鼠的下丘脑金等人也允许我们在开发过程中推断出室管膜细胞的转录轨迹。在tanycyte发展拟时间轨迹,我们认为E16天是另一个关键时间点tanycytes的分化。在这一点上,特定基因的表达增加,特别是Nfia,Nfib,Nfix被称为神经发生的负调控tanycyte人群(4)。事实上,最近的一项研究显示,tanycyte-specific中断NFI转录因子家族的强劲刺激tanycyte去分化,增殖,神经发生(29日)。有趣的是,关于我们BrdU分析,增加表达的神经发生的负调控E16天伴随神经元诞生的结束和破裂的αtanycytes代mediobasal下丘脑。其他转录因子(即。,Hes1、Notch2 Egr1 Id4)和基因(即。,载脂蛋白e、Cd63 Cnih2 Arxes2)也被确认在tanycyte分化(E16天开始)和成熟(P4)开始,和组成优秀的候选人控制这些特殊的下丘脑细胞类型的规范。有趣的是,helix-loop-helix基因Hes1,加上Notch1,响应递交促进穆勒神经胶质细胞分化(63年)。进一步探索这些候选人需要在tanycyte开发更好的理解他们的角色。

总之,ependymoglial细胞的个体发生发散根据细胞类型,时间,神经解剖学的分布。我们最初的细胞和分子方法允许我们证明tanycytes E13周围产生,最早E16天开始分化,达到完全成熟在产后早期发展(P4-14)。在全球范围内,我们的数据使我们能够生成一个综合时空atlas tanycyte诞生和发展和识别分子候选人参与tanycytes的发展。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。

道德声明

动物研究回顾和批准广东德沃州兽医办公室和洛桑大学。

作者的贡献

DL-R导致数据分析,进行了生物信息学分析和写的手稿。AR、ML、MG和参与数据分析进行了实验。SC和FL导致了研究的构思和设计,进行实验,参与数据分析和写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

SC支持由瑞士国家科学基金会(PZ00P3_167934/1)、马克斯Cloetta基金会博士教授,诺华Medical-Biological研究基金会(19 b145)。瑞士国家科学基金会支持的脂肪肝(PZ00P3_174120 PCEFP3_194551)、欧洲研究委员会开始格兰特(探戈,948196),诺华medical-biological研究基金会,美国生物医学科学和洛桑大学生物学和医学教师的。DL-R支持Wallonie-Bruxelles联合会和莱昂Fredericq基础。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

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