集成多通道数据的发展中牙齿显示候选人监管位点驾驶人类牙原性的表型

背景

牙齿发育畸形的范围从罕见的症状如釉质发生或牙质生成天空”(1- - - - - -5等)相对常见nonsyndromic表型异常齿数(6- - - - - -10)或釉质发育不全(11,12)。畸变从正常牙科发展可能使个体牙科疾病(13,14)可能需要昂贵和复杂的干预措施。系统性健康牙齿健康是众所周知的影响(15,16),异常牙科发展构成重大公共卫生负担和确定特定表型的原因是当务之急。虽然环境因素发挥作用的发生率很多nonsyndromic表型,正常和异常的遗传性牙表型已经报道的范围从40%到90% (17- - - - - -23)。这意味着一个强大的遗传因素,然而人类基因组的部分导致这些结果尚未全面识别。

在大多数哺乳动物乳牙开始发展在早期胚胎发生和硬牙科组织形成前牙喷发到口腔出生后不久。牙网站的模式在早期牙科发展,确定齿数,和牙齿的形成根源在牙科发展后期,导致牙爆发,发生为主在子宫内。因此,许多牙齿畸形和疾病的潜在遗传原因可能在开发过程中施加的影响。因此,这些遗传程序协调这一过程是特别的兴趣识别司机的牙齿畸形。而罕见综合症影响牙齿与特定的基因突变(24- - - - - -27等),大多数情况下常见的牙科表型异常牙喷发(28)和齿数(29日- - - - - -31日)没有与大型DNA拷贝数变化或有害的单个基因的突变。他们的遗传相对较高,缺乏共同因果变异的蛋白编码基因,这些表型的tooth-isolated性质表明,风险可能是由于有缺陷的基因调控基因调控区域的变化引起的。

增强子序列与转录因子结合图案丰富,可以调节目标基因表达在spatiotemporal-specific上下文中长基因距离(32- - - - - -36)。中断的增强剂可以调节基因表达的时间和地点,增强器通常是活跃,通常导致tissue-isolated异常(35,37,38)。人类共同单核苷酸多态性(SNPs,或变异)与颅面等表型nonsyndromic orofacial裂和颅面形态变化丰富增强子序列活跃在人类颅面胚胎组织。这些基因组审讯成千上万的增强剂在数以百计的组织因此表明颅面增强剂专门为颅面表型(39- - - - - -41)。然而,发现大部分人脸没有扩展到研究的贡献颅面或牙科增强剂在牙齿形态发生或疾病。因此,增强剂仍很多发展中牙齿。

理想情况下,识别和描述的增强子序列将主要发展人的牙齿。然而,人类牙科发展是一个长期的过程;乳牙的发展始于怀孕6周,出生后数年才完成。由于妊娠时期牙科模式和形态发生(42- - - - - -46)和缺乏明确的人类在体外使用小鼠模型、牙齿发育主要是研究。开发的早期阶段鼠标生齿主要是形态学和分子类似于人类牙科发展(42- - - - - -44),许多罕见的人类牙齿综合症小鼠modelable (42,44,47- - - - - -49)。而一群曾发现了一个地区的上游嘘中断的演示了一个牙科小鼠的表型,系统化的描述非编码基因的活动在发展中哺乳动物的牙齿没有执行(35,50)。因此,增强子的作用在牙原性的表型和非编码的保护司机的牙科发展人类和小鼠基因组尚未研究。

我们证明了颅面增强子活跃在大部分人类颅面组织和守恒的老鼠是丰富的变异与牙齿发育表型有关。我们延长这些发现通过识别和验证增强剂的发展同的ChIP-seq帽阶段牙齿,染色质状态标注管道(40,51,52)。我们表明,增强积极帽阶段小鼠切牙原性的负担最高phenotype-associated变异与所有其他组织相比,表明牙科增强子的作用在人类牙原性的表型。我们对增强进一步优先这些位点未来调查的基础上,预测他们的假定的目标基因在牙科发展的重要性。为此我们利用多个数据形式包括散货RNAseq co-expression网络分析、单细胞RNAseq,先前生成的全基因组关联研究(GWAS)数据,和ChIPseq-based增强器调用。我们提出这项广泛分析的结果作为一个优先列表的基因位点增强剂预计为常见,nonsyndromic人类牙原性的畸变。我们希望这个列表是有用的为未来深入实验分析特定区域对小鼠正常的牙齿发育及其影响。此外,tooth-specific增强我们确认这是特别感兴趣的是他们为牙齿提供精确的分子工具具体淘汰赛和记者基因表达,正如我们以前描述的老鼠大脑的特定区域(53)。

材料和方法

染色质免疫沉淀反应和染色质状态分割

帽阶段E13.5鼠标下颌切牙从∼10混合孤立的双边性C57BL / 6 j亩骶胚胎(杰克逊实验室),池,用1%甲醛交联(如前所述)(54,55)。动物是和牺牲符合IRB批准(协议ap - 200061 - 0723)。隔离核和剪切,可溶性染色质是平均分割多个管免疫沉淀反应(如前所述)(104年,105年)和抗体H3K4me1 [Abcam ab8895(很多GR276935-1)], H3K4me2 [Abcam ab7777(很多GR102810-2)], H3K4me3 [Abcam ab8580(很多GR273043-2)], H3K27ac [Abcam ab4729(很多GR276930-1)], H3K27me3(微孔07 - 449(2736613)很多),和H3K36me3 [Abcam ab9050(很多GR273247-1)]。组织的可用性的目的,一个复制的标志。后续的测序,比对、归责的信号和染色质状态模型进行分割使用15和18如前所述(40)。生Fastq文件和p值跟踪这些染色质标记GSE197645地理上可以找到。相同的染色质信号在鼠标编码(从所有可用的数据检索5612)多个复制组织和10个时间点和估算产量1316不同的染色质的信号。这些估算信号被分割与上面相同的模型导致染色质状态分割(154https://genome.ucsc.edu/s/emmawentworth/mm10_all_18state)。牙齿是否确定使用bedtools [v2.29.0(特定的增强剂57增强器注释部分)][18个国家染色质分割;8、9、10;(52)和其他non-craniofacial鼠标相比,组织(样品没有任何牙科组织)和相同的染色质状态段。老鼠强增强剂被转换为hg19坐标(kent-tools v1.04.00;GWAS的最低保护25%)序列分析(见下文)。目标基因的增强子被确定使用rGREAT [v1.26.0 (58,59mm10)],使用默认设置。

GWAS富集分析

克罗恩氏病、牙爆发和odontogenesis-associated变异得到从GWAS目录(EFO_0000384, GO_0044691 GO_0042476)。变异识别在东欧军团p≤5×10⁻⁸保留了每个类别。格雷戈尔(v1.4.0 (60)被用来审问浓缩疾病有关的变异在强大的增强剂(18个国家分割,州8 - 10)的每个biosample,东欧的对照组背景变异。人类富集分析国家发表的样本来自分割(18日40,52)和127年人类表观基因组细胞异形的路线图(51,61年)。鼠标富集分析状态分割从18日发表老鼠组织从编码的项目和我们E13.5鼠标切样品,如上所述。

大部分RNA-seq

从散装散装RNA-seq fastqs颅面样品(n= 4;E13.5 E14.5) (56)、臼齿(n= 30;3-E12.5、7-E13 7-E14、3-E15.5 7-E16 3-E17.5)和门齿(n= 3,E12.5) (62年,63年使用Kallisto)从地理和对齐(Kallisto v0.46.2) mm10基因组(64年)。库进口DESeq2对齐(v1.26.0) (65年)使用tximport (v1.14.2) (66年)和一个复制的E13省略了作为一个局外人。基因筛选的最低记录数5至少3复制。获得差异表达基因的牙帽阶段,我们使用DESeq2与建议参数对non-batch纠正E14灯头臼齿(7)复制相比E13.5和E14.5散装颅面过程(4)复制。基因与日志褶皱变化大于2在牙齿和Bonferroni调整p≤0.05的值被保留,认为差异表达。WGCNA,只有牙齿样本使用。批处理效果被移除PC1纠正和PC2变异来源使用RUVseq (v1.20.0) (67年)。剩下的32个样本处理使用DESeq2 WGCNA输入。对所有样本方差稳定变换计算矩阵导入WGCNA管道(v.1.70-3) (68年)。总之,样本过滤异常值和基因过滤质量。权力得到每个文件和一个阈值0.85是用来定义8的力量。WGNCA网络使用无符号构建的汤姆,最小模块大小的基因系统树图合并减少高度0.25,和deepSplit 2。相关性和intramodule连接被确定为每个模块。基因本体论浓缩度分析和后续的数据和WGNCA模块生成使用EnhancedVolcano GOplot, clusterProfiler,与“enrichGO”和“enrichDGN”模式在基因和1:1人类直接同源(clusterProfiler v3.14.3, org.Hs.eg。db v3.14.0 org.Mm.eg。db v3.10.0, EnhancedVolcano v1.4.0, GOplot版)(69年- - - - - -73年)。

单细胞RNA-seq

生fastqs检索从地理(GSE142201) (62年),对齐mm10基因组(GRCm39)使用Kallisto / bustools (Kallisto v0.46.2, bustools v0.40.0) (64年),和Kallisto散装RNA-seq库。Kallisto / bustools用于过滤和修对象生成。修(v3.2.0) (74年)被用来合并复制。mtDNA细胞过滤(< 5%,> 200 nFeatureRNA)和日志标准化。细胞周期阶段被分配用鼠标从已知的人类细胞周期基因直接同源。数据是按比例缩小的使用所有的基因。最近的邻居被分配使用维度1:15通过鲁汶算法。集群生成分辨率= 0.3。UMAPs生成与维度1:15。上皮分析集群在分辨率= 0.2,使用维度1:15。标记基因与DESeq2使用logfc > 0.5, min.pct = 0.25。SymIDs被转换为EntrezID clusterProfiler。clusterProfiler是用来计算词浓缩与背景。clusterProfiler“简化”结合类似的条款,和z分数截止0.5。标记注释的细胞类型的基因被确定后删除所有细胞与身份的“骨祖细胞”分析,用DESeq2 logfc > 1.0, min.pct = 0.25, max.cells.per.ident = 400。

标记基因的验证

原位杂交图像EK标志基因验证得到GenePaint在线资源和文献检索的特定基因在发展中牙(74年- - - - - -79年)。

地区的优先级

优先考虑潜在牙发生的位点,我们看牙齿增强剂的假定的目标基因的相关性。从WGCNA基因分析,除了基因属于灰色模块(低表达模块),被认为是优先级。基因是一个“分数”基于很多因素。基因是一个点作为标记基因scRNA-seq带注释的细胞类型。额外点了dental-specific标记基因的细胞类型(搪瓷结,上皮、间质和血管周的细胞)。我们获得hg19 GWAS的坐标变量与颅面和牙科表型(EFO_0009892、EFO_0600095 GO_0044691, EFO_0009331, Orphanet_141136,和HP_0000175),确定了人类基因位于500 kbp的至少一个变量(补充表S22 S23)。鼠标直接同源的基因有一个额外的点。基因被给予额外的点的数量根据tse预测有关的:0的传染性海绵状脑病= 0分,1 - 2 tse = 1点,3 - 4 tse = 2分,5 - 6 tse = 3分,7 + tse = 4分。基因属于tooth-relevant WGCNA模块(图2 e)被给予额外的点被浓缩为TE目标基因,牙科表型本体类别,和度。我们使用mm10坐标的VISTA +牙内识别所有基因的增强子1 mb的每个增强剂(补充表S24)。这些基因附近VISTA验证增强子有一个点。基因预测目标的至少一个牙齿增强器有一个额外的点。最后,基因也出现作为一个帽阶段tooth-specific基因有一个额外的点。这些分数总结为每个基因,基因相同的分数进一步基于目标的预测数量的传染性海绵状脑病的优先。

位点由总分排序第一,其次通过集的数量预计将TSS基于伟大的目标。

统计显著性富集分析被分配使用随机排列分析(n= 10000)Benjamini-Hochberg修正所有的测试。

数据生成使用GOplot v1.0.2, ggplot2 v3.3.3,和是ggsignif v0.6.1。ShinyCell (v.2.0.0) (80年)包被用于门户网站的发展。详细的脚本的分析可以发现在github (https://github.com/cotneylab/scRNA_EnamelKnot)。

本研究利用数据生成的破译社区。中心的完整列表的生成的数据可用https://deciphergenomics.org/about/stats和通过电子邮件contact@deciphergenomics.org。解读项目资金威康(格兰特WT223718数量/ Z / 21 / Z]。

结果

颅面增强剂导致牙齿发育和表型

很好的描述,强烈的监管区域活跃在颅面早期发育中扮演重要角色orofacial裂和正常人类的面部变化(39- - - - - -41,81年)。的证明遗传因素nonsyndromic牙原性的表型,如延迟牙喷发hypodontia,我们假设颅面监管区域也可能发挥作用在这些相对共同的表型。为了验证这一点,我们列出了“牙发生”相关的常见变异从GWAS目录(n= 32;GO_0042476,“牙数”,“第一颗牙喷发时间”;补充表S1)(82年- - - - - -88年)。我们审问这些牙齿的浓缩phenotype-associated变体(dv)以前生成的强增强剂发展中人脸(CS13-CS20;5 - 7周后概念)(40)强有力的增强剂相比,数以百计的其他组织(51),使用一个方法控制人口遗传结构和包括常见变异在连锁不平衡的报道导致变异(方法)(60)。我们观察到的一个浓缩与牙原性的表型相关的变异在人类胚胎颅面组织活性增强剂,相比,数以百计的其他组织类型的路线图表观基因组项目(图1一个)。我们另外研究了变异的全基因组富集与这些snp专门与牙齿有关的一个子集喷发(nGWAS目录GO_0044691 = 14日,“永久牙齿发育”,“主要牙齿发育”;补充表S2),发现了类似的趋势(图1 b)。值得注意的是,浓缩并不是在颅面增强剂与疾病相关的变异不知道颅面组件,如克罗恩氏病(EFO_0000384) (补充图S1)。综上所述,这些结果表明强烈活动的增强子的作用在发展中人类颅面装置在人类牙齿发育特征。

因为人类牙齿发生发展的关键方面在子宫内是具有挑战性的获得组织和极难执行的冷冻实验小学组织样本(可用40,43- - - - - -45)。因此,鼠标已经成为一种广泛使用的模型对牙齿发育的关键方面。虽然许多牙齿发育的特点是守恒的,老鼠和人类之间的数量和形状这些物种之间的牙齿是非常不同的。因此目前还不清楚如果遗传散装充实我们观察到人类颅面将转化为鼠标监管区域。为了解决这个问题,我们利用数以百计的公开ChIP-Seq收集的数据集从多个鼠标鼠标编码项目组织跨多个发展阶段,包括发展中颅面突出(56)。我们应用相同的归责和染色质状态分割方法用于识别人类增强鼠标数据生成154个独立的染色质状态注释。我们发现这种方法确定49990的,可再生的颅面增强剂生成E10.5-E15.5假定的老鼠。这些增强剂系统丰富附近基因被认为与颅面发育和疾病,结果一模一样我们报道人类颅面组织(补充图S2)(40)。

我们下一个确定的增强剂所有老鼠组织人类保守序列层面上,使我们系统地确定浓缩的牙原性的变异在老鼠组织(方法)。类似于人类颅面剂,我们观察到一个特定的浓缩牙发生(图1 c)和牙喷发(图1 d)相关的变体在守恒的鼠颅面增强剂高于所有其他老鼠组织。值得注意的是,当我们直接比较这些变异在人类颅面增强剂的浓缩保存鼠标颅面增强剂,我们观察到的最高浓缩保存鼠标颅面地区从发展阶段中牙齿,现在和一个可观比例的颅面装置,特别是E13.5-E15.5 (图1 e, F)。重要的是要注意,相当于人类的颅面发育阶段预测[CS23或妊娠8周后(42,46)含有类似牙原性的组织没有化验。这些发现在人类和一些常见的鼠标支持我们的假设,non-syndromic人类牙原性的表型可能受到变化活跃在颅面发育的增强剂。具体来说,牙齿爆发的持续时间和数量的牙齿在人类可能直接影响远端基因调控序列活动发展中颅面仪。这些发现还表明,这些监管区域可能影响守恒orofacial发展的过程。

发展牙增强剂和疾病负担

虽然这些发现牙发生监管的地区发现了一个角色,他们是基于批量老鼠和人类颅面组成的组织发展中也牙齿和许多其他类型的细胞。我们假设这浓缩的牙原性的变异是由增强子活跃在牙齿,在周围组织而不是增强子活跃,但是没有现有的数据来测试这种假设。然而,正如上面所讨论的,主要的人类胚胎的稀缺和条件样本包含齿使这非常困难。因此,我们开始着手实验确定增强子活跃在哺乳动物牙齿为了确定增强子的作用造成的牙齿而不是其周围组织。的最高浓缩牙原性的变异在增强剂从批量生成E13.5-E15.5颅面样本,下颌和上颌牙齿继续通过限制阶段。我们隔离帽阶段牙齿很容易地识别和访问的位置,即下颌切牙,一次邻间质并不太矿化,防止手工解剖。因此,确定齿在帽增强子活跃阶段,我们孤立和汇集E13.5鼠标下颌切牙和执行染色质免疫沉淀反应和测序(ChIP-seq)电池与各种功能相关的翻译后组蛋白修饰整个基因组染色质状态。这数据是分析了使用一种标准化的数据分析管道将芯片信号归责和染色质状态分割,使其直接与之前的人类和小鼠功能染色质注释(图2一个;方法)(40,51,52)。我们确认134875假定的增强剂,其中25358预测强增强剂在牙齿(集)。当我们比较这些强有力的增强剂数以百计的其他老鼠样本,我们发现6236增强剂的独特的发展中牙(tooth-specific增强剂的传染性海绵状脑病;方法)。确认我们发现真正的增强剂,我们审问集的全基因组重复验证VISTA增强剂(图2 b)(89年)。我们观察到显著富集的VISTA颅面增强剂在我们验证集(p< 2.2×10⁻¹⁶;优势比= 3.55,Fisher精确检验)。坐标文件的强大帽阶段增强剂(补充表S3)和tooth-specific增强剂(补充表S4)和交互式VISTA-validated牙齿在我们的网站上特定的增强剂(表https://cotney.research.uchc.edu/tooth/)。

增强积极的组织经常展示浓缩转录因子的结合主题显示的动态表达式在开发组织(52)。因此我们研究进一步验证这些增强剂通过询问集浓缩的所有可用的椎转录因子结合主题(方法)(90年)。集显示绑定主题规范最大的浓缩牙科转录因子家族Pitx Runx,扭转6和Tcf,其成员是已知的牙齿中高度表达(补充表S5,图2 c)(91年- - - - - -95年)。除了主题浓缩,之前的出版物表明,增强子活跃在附近的一个组织丰富基因功能或规范中重要作用的组织(52,96年,97年)。因此,我们研究进一步验证牙增强剂使用预测目标基因的这些区域。我们集分配给假定的目标基因和审问这些基因富集基因和疾病本体(方法)。我们观察到显著的浓缩tooth-relevant基因和疾病本体,包括已知齿牙齿发育异常等疾病的爆发,taurodontia和牙齿数目异常(图2 d)。许多规范牙齿发育基因的存在既是STE目标和丰富绑定图案集服务,进一步验证我们的帽阶段牙齿增强器的注释。tse演示类似这样转录因子结合的强化主题和本体类别的预测目标基因,表明集和tse中发现类似的基因位点和绑定相似的转录因子家族。

这些积极的结果集的有效性,我们旨在测试我们的假设,这浓缩的牙原性的变异是由增强子活跃在牙齿本身,而不是增强子活跃在周围组织。为了达到这个目标,我们获得了同源人类鼠标的坐标序列保护牙齿增强剂至少25%,导致22001守恒的集和4127守恒的传染性海绵状脑病。尽管它们在组织中的重要性,守恒的传染性海绵状脑病的相对较低的数量相比,所有守恒集(22000∼4100年与∼)防止全基因组变异的可靠计算浓缩的传染性海绵状脑病。因此我们审问集浓缩的人类牙原性的变异使用相同的方法实现。我们观察到的最高和最重要的浓缩(2.84 log2褶皱丰富;padj = 5.66×10⁻⁶在守恒的集)odontogenesis-associated变体(补充表S6,图2 e)。这对牙齿是戒律喷发(3.28 log2褶皱浓缩,padj = 4.4×10⁻⁴,补充表S7,补充图S3)。这些发现表明,增强剂强烈积极发展中牙齿在牙发生可能重要和牙原性的表型。这些发现另外建议发展中老鼠的牙齿是一个适当的模型系统增强子的作用在人类牙原性的表型。然而,大量的增强子我们确定了全基因组所需的优先级。

在串联,我们试图进一步确认这个浓缩的增强是由于牙齿本身,而不是周围的颅面环境。计算解剖,我们减去tse从我们先前确定可再生的颅面剂,导致46708年通用颅面增强剂(非牙具体增强剂)。我们审问这些一般颅面增强子去做他们的预测目标基因的富集,并指出降低tooth-related本体类别的浓缩比集和的传染性海绵状脑病(补充表S8)。例如,浓缩的“负监管dentin-containing牙齿的牙发生”减少从19.25倍浓缩的传染性海绵状脑病和3.97折浓缩集2.61折浓缩颅面增强剂。同样的,当我们计算人类odontogenesis-associated变异的浓缩在这些一般的颅面增强剂,我们观察到减少3.2倍浓缩non-tooth增强剂与牙增强剂。我们观察到类似的结果相比降低浓缩当我们牙齿eruption-associated变体(减少5倍浓缩)。这些结果,我们得出这样的结论:人类牙原性的表型是丰富的风险在增强积极发展中牙齿本身。

转录组分析揭示网络中的特定细胞类型牙原性的基因

正如上面我们有详细的,增强操作通过促进目标基因的表达。我们推断基因预测受集可能未知的球员在牙齿发育。因此,我们试图区分假定的牙原性的增强剂根据他们的预测目标基因。为了达到这个目标,我们分析了转录组数据来自发展中牙三倍过程:(1)识别差异表达的基因在帽阶段牙相比,周围的大部分颅面装置;(2)识别特定基因的细胞类型的帽阶段牙;和(3)识别的基因发生在牙齿发育的基因从1到2。

识别基因富集在帽阶段老鼠牙,我们利用批量RNA-seq发表的数据全颅面装置(56)和孤立的臼齿(62年)协调发展时间点(方法)。我们观察到852个基因差异表达在帽阶段牙齿相比大部分颅面装置(padj≤0.05, log2FC≥2,补充表S9)。这些tooth-biased基因富集在预测STE目标基因(1.28 log2褶皱浓缩,p< 0.0001、排列测试)和预测的目标平均每个基因的3集,和位于中位数93.3 kb远离他们的预测增强剂。这些差异表达基因同样丰富谢霆锋靶基因预测,平均距离为135.4 kb谢霆锋的目标基因。度也丰富统治有关“牙发生”等术语,和人类做类别“小牙”和“Hypodontia”(图3一)。在一起,这些发现表明,确定tooth-biased基因对牙发生至关重要,往往是位于靠近,和可能的目标,增强剂优先活跃在牙齿。

然后我们研究发现基因丰富的细胞类型牙帽阶段。我们再加工发表高质量scRNA-seq数据从帽阶段臼齿(方法)(62年)。基于聚类方法(98年)显示33886细胞分离成16个转录截然不同的细胞状态(补充图S4)。使用pseudobulk方法(99年)我们发现4821标记基因,每个集群平均301。我们利用重要去做浓缩在每个集群分配每个集群生物身份(图3 b),确认作业规范标记基因(图3 c)(方法)。值得注意的是,我们发现一个上皮subcluster属性符合规范的特点主要搪瓷结(补充图S5);我们标注这些细胞作为公认的搪瓷结(油漆,图3 b)。有注释的细胞类型E14灯头鼠标摩尔包括之前注释后的油漆,我们发现每个细胞类型的标记基因。我们一共发现了2065独特的标记基因,每个集群平均为295,其中包括317油漆基因(补充表S10)。

然后我们看验证油漆标记基因的相对EK-specificity在发展中下巴,但大量的基因必须依靠公众原位数据库。我们进行了文献调查和确认的GenePaint资源原位杂交(ISH)图像。这个资源系统生成原位超过17000个基因杂交数据跨多个鼠标的发展阶段。绝大多数的这些实验进行E14.5整个山的胚胎,这特别适用于我们在这里工作的下颌切牙和磨牙的近似帽阶段(74年- - - - - -77年,79年)(方法)。采矿这个数据库显示1135个基因注释用牙齿在这个阶段表示在NMRI或C57BL / 6 j小鼠。当我们询问所有制造商基因在我们的分析中,我们发现286 2065被注解为牙齿和明显偏向油漆中表达的基因在所有其他集群(n2.28 = 77,log2折叠浓缩,padj < 0.0001)。然而许多油漆基因我们确定已经化验但没有注释,供GenePaint表达式的位置。当我们仔细检查前20%最高纯度油漆基因(n= 63),其中包括8规范EK基因和55个基因以前未识别结构,我们在很大程度上证实了单细胞RNA-Seq结果。特别是我们发现大多数的基因被GenePaint化验(49/58化验)显示强大和牙齿紧密镜像中的特定杂交结果规范EK标记嘘,Wif1,或Wnt10b(补充表S11,https://cotney.research.uchc.edu/tooth/)。这些发现强烈我们进行验证在网上油漆作业和支持他们善意的EK基因。

虽然传统是一种强大的方法来识别基因差异表达的基因表达的变化在生理条件下,测试每个基因单独和独立于所有其他基因(65年)。或者基因co-expression方法明确尝试确定表达多个基因之间的关系。这些方法可以揭示生物的基因和疾病相关的模块有相似的表达模式在发展轨迹,浓缩细胞特定类型的基因,导致tissue-relevant表型(52,One hundred.- - - - - -102年)。从而得到一个更全面的观点在牙齿发育的基因表达,基因coexpression加权网络分析(WGCNA) (68年)进行公开的散装RNA-seq孤立的臼齿和门齿从时间点数据生成起始矿化的牙(方法)(62年,63年)。分析发现了28个独特的模块coexpressed基因,跨越22016表达基因(补充表S12)。这些模块的大小不等,从63到5330个基因与平均361个基因/模块。许多这些模块(19/28)丰富了去还是发展中牙齿相关生物过程,这些过程的相互依赖是在inter-module完成相关(图3 d)。

来确定哪个WGCNA co-expression模块可能专门为牙齿发育相关,我们审问WGCNA模块进行浓缩的细胞类型特定的基因签名,并观察14个模块可能细胞类型的活动(图3 e)。进一步分类这些潜在tooth-relevant模块,我们另外审问他们的浓缩帽stage-specific基因,直接同源已知的人类牙原性的表型,并预测目标基因的假定的集和tse(方法)。19模块演示了浓缩的至少一个类别(图3 e)。正如预期的那样,我们观察到模块丰富的标记基因的细胞类型符合条件去丰富模块(图3 d, E)。例如,深蓝模块丰富了上皮条款,标记基因的上皮和epithelial-derived油漆,和假字与人类搪瓷表型相关的基因。红色集群演示了一个类似的发现,因为它是丰富的骨架上,间质标记基因,直接同源的基因与延迟人类牙齿爆发有关。结合,这些发现表明,优先模块中的来自散装RNA-seq反映特定细胞类型的基因的表达模式在发展中牙齿。特别是,模块丰富的基因差异表达假定的搪瓷结牙科发展可能是重要的。

数据集成重视牙科增强剂在预测牙原性的位点

这些层的转录组数据涉及几个基因模块可能重要的牙科发展。基因在这些模块以及监管区域控制他们因此强有力的候选人调制牙发生在人类身上。我们试图利用这些数据来通知我们的候选人优先级对增强牙原性的位点下游分析,整合多个数据模式(批量和单个细胞转录组,GWAS ChIP-seq)来生成一个位点的优先列表。因此,基因优先使用以下大类:(1)差异表达的牙帽阶段,(2)预测STE目标,(3)scRNAseq标记基因,(4)在有关WGCNA模块,(5)接近人类直接同源craniofacial-relevant变体从GWAS目录(6).Number预测牙齿具体的增强剂,和(7).Proximity VISTA-validated集(方法)。当我们这种滤波方法应用于发展中牙齿我们优先1668 16322个基因表达的基因(补充表向)。这些基因和它们的侧翼非编码风景特别感兴趣的未来调查的牙原性的表型。当务之急基因通过这种方法被发现Runx2,规范牙原性的因素与已知的哺乳动物(角色牙齿形态发生和爆发103年- - - - - -106年)。排名前20的基因(表1)还包括已知牙原性的基因Twist1和Msx2导致表型,如牙齿形态异常,异常矿化,和牙齿发育不全(107年,108年)。

也在前20名Wif1(WNT抑制因子1),规范搪瓷结标志基因也是注释作为油漆标记在我们的单细胞转录组分析。这个鼠标轨迹演示了颅面增强活动(图4一),包括许多集预计目标Wif1。当我们检查WIF1在人类基因组景观,我们观察到的一个变种与齿数和延迟降低牙喷发(rs12229918)从人类GWAS位于上游基因的内含子MSRB3(图4一)。变体rs12229918在强大的连锁不平衡的许多其他odontogenesis-associated变体重叠人类颅面剂,以及守恒的集来自发展中牙(83年)。人类从人类颅神经嵴细胞染色质构象数据文化线(109年)(图4一)演示了一个拓扑关联域(少量),包括整个WIF1基因和多个rs12229918周围增强剂。这些发现暗示这些守恒的集直接目标WIF1在一个相关的人类发展背景。这在人类和小鼠包含轨迹Wif1、Lemd3 Msrb3,和Hmga2;其中,只有Wif1演示了一个tooth-specific或牙科小鼠细胞特定类型表达式模式(图4 d、G;补充图S6)(75年)。Wif1众所周知,扮演一个角色在正常老鼠牙齿形态和强烈的表达在搪瓷结,我们已经证实在我们scRNA-seq分析(图4)(110年)。而破坏的基因与老鼠牙原性的表型有关,尚未涉及牙原性的人类表型。这些发现表明,变异在rs12229918可能改变监管区域相互作用WIF1,导致风险升高nonsyndromic牙科表型。

这个发现在Wif1促使我们去寻找其他小说牙原性的基因在我们的优先列表。我们研究概要高优先级基因被鼠标敲除化验项目(可没有重要的早期死亡率(111年),以前从未被描述在发展中牙齿。最高优先级小说牙原性的基因是满足这些标准Agap1(Arf1 GTPase激活蛋白1)。AGAP1在人类中包含的最高得分顺序人类基因组中加速守恒的背景,叫做HACNS1 (chr2:236773456 - 236774696) (112年)。这个序列位于内含子的基因,实际上是在一个人类颅面superenhancer区域(图5一个在颅面装置),表明其作用。尽管它接近已知的颅面监管区域,HACNS1提出了规范Gbx2在鼠标肢体(113年)。然而,这种基因表达在人类颅面组织相对较低的水平(97年摩尔比)和老鼠Agap1。此外,Agap1在帽阶段差异表达牙齿比散装颅面装置。这些发现表明,AGAP1可以在面部发展发挥重要作用和形态和潜在人类特有的方式规定在牙齿发育。1 mb区域周围Agap1包含了许多可能的目标集和7的传染性海绵状脑病Agap1,因为它是唯一tooth-specific基因在该地区(图5一个)。值得注意的是,虽然内变异AGAP1蛋白质编码序列没有涉及人类疾病,intronic变体AGAP1与例有关矮小(rs3754648p= 5×10⁻¹³),一种疾病影响的模式的脸,常常伴随着牙科表型(114年)。这个变体位于一个人类颅面superenhancer地区,并在连锁不平衡的守恒tooth-specific增强器验证VISTA (图5 a, B)。

尽管存在相关的基因变异,AGAP1没有报道人类牙科表型,并没有与任何特定的人类综合症有关。有趣的是,gnomAD条目AGAP1演示了一个LOEUF得分(0.23)(115年最差的所有基因,表明该基因对健康人失去功能的突变,因此有可能在人类极其重要。Agap1也被证明表达上下门齿和臼齿E14.5 (74年- - - - - -77年,79年),它似乎被限制在前面描述的近似搪瓷结区(图5 c, D,补充图S7)。支持这一发现是其高表达的牙齿比大部分的脸,特别是油漆;Agap1出现在我们的单细胞分析作为一个油漆标记基因,与0.7 log2褶皱浓缩在油漆相比,所有其他细胞类型(padj = 1.51×10⁻⁷⁰)(图5 d)。许多基因特定于艾克导致牙科表型当淘汰了专门的牙齿(116年,117年),这个基因的特异性内油漆我们的数据表明可能有相似的表型。来确定这种情况下,我们把鼠标敲除项目(可辨别牙科相关的表型是否明显中断Agap1。勘探数据库条目的纯合子的损失函数Agap1老鼠显示清晰,描述了颅面表型的鼻子畸形和咬合不正(上颌和下颌牙齿不当会议)(图5 e,补充图S8)。结果也可引用的患病率增加“不正常牙形态”(p= 9.12×10⁵)。

不幸的是,这些老鼠从KOMP目前不容易获得,从而排除头骨和牙齿的详细分析。开始确定AGAP1可以参与我们试图调查破译人类orofacial异常(118年),一个数据库的拷贝数变异患者的发育异常。我们发现两个错义突变患者AGAP1都有报道,颅面和骨骼异常没有提到相关表型的牙齿。当我们调查患者完整的损失或收益AGAP1(n= 140)我们观察到患者的颅面畸形包括低位的耳朵,小颌畸形和高口味。有趣的是,其中有3例,据报道少牙。Oligdontia报道影响高达0.2%的普通大众,这是证实破译群整体的79例报道少牙31843例(0.25%)。然而2.1%的拷贝数变异患者生成AGAP1据报道,少牙代表增加8.9折(p= 0.0052;双尾Fisher精确检验)(119年- - - - - -125年)。总之,这些研究结果表明AGAP1是一个未被欣赏的球员在牙科发展在人类和老鼠,和调节其表达增加了颅面和牙科表型的可能性。

讨论

前外遗传性发现大部分发展中人类颅面地区表现出角色活跃的监管区域在颅面形态学和疾病。我们已经表明,监管区域活跃发展中面临的也可能影响牙科表型和疾病。使用公开可用ChIP-seq数据(56)我们在数以百计的鼠标功能染色质注释生成组织包括颅面样本,我们用来证明守恒的监管区域活跃在早期发展中鼠标面临类似的系统的丰富变异与人类牙原性的表型相关。我们提供这种资源的统一分析小鼠基因组功能注释生成发展的许多组织作为一个交互式UCSC基因组浏览器会话可以从我们的网站。

这个角色的增强子牙表型之前未被证明,在牙齿发育和增强子的作用作为一个整体还有待于开发。因此,我们执行ChIP-seq隔离帽舞台上鼠标门齿为了理解增强子的作用从牙齿本身在这些牙原性的表型。我们发现这个组织展示了的最高浓缩odontogenesis-associated变异,表明失调的增强子活跃在牙齿本身,而不是周围组织,导致这些tooth-isolated表型。这些发现地区守恒的跨物种还表明,老鼠牙是一个可行的模型在牙科早期发育增强剂的作用和某些牙原性的表型。这次调查还用来识别超过25000牙齿强烈的增强剂,包括超过6000特别活跃的22000增强牙齿和守恒的人类。我们免费提供这些区域的坐标在这个手稿,从我们的网站,下载,包括功能性染色质注释UCSC的会话的增强器可视化。优先区域的增强可能是导致这些表型,我们优先考虑他们的靶基因预测基于他们的可能性与牙齿发育相关。而集成外遗传性和转录组数据已经被证明是有用的识别人类疾病候选基因来自发展中组织(52,98年),这种方法尚未应用到发展中老鼠的牙齿,也没有被推断表明位点可能与人类牙发生有关。

在这个手稿,我们也提出了一个有关公开scRNA-seq E14灯头下颌磨牙的数据,我们已经确定了小说的假定的搪瓷结基因签名。使用规范EK标记基因,我们注释先前未被发现的上皮subcluster特性符合埃克(补充图S4)。我们发现317 PEK-specific基因和演示的相对EK特异性的大多数60最具体的油漆基因通过比较表达式近似帽内阶段下颌磨牙原位模式规范EK标记嘘,Wnt10a Cdkn1a(补充表S8)。通过利用GenePaint数据库系统生成的E14.5整个山原位图像,其中许多复制了好几次,我们可以验证这些基因的相对特异性的EK E14.5下颌骨。给定的已知作用的结构模式和形态发生牙(126年- - - - - -128年这部小说),油漆签名表明未来的研究目标在牙齿再生和形态,并可以在我们的网站上作为一个交互式表进行进一步的探索。

此外,我们证明了推断的能力多通道数据来自发展中老鼠牙人类牙科发展和畸形。先前的调查人类牙齿发育是有限的由于缺乏组织,但他们证明了保守的表达重要的牙科RUNX2等因素,实际上wnt和每个位置(42- - - - - -46)。许多tooth-specific基因,这些基因作为帽出现阶段牙齿细胞类型的基因标志,高优先级的牙原性的基因位点(补充表S10)。这说话的健壮的性质之前人类的调查和分析,并指出这优先列表的位点的有效性。我们详细的研究结果WIF1位点还建议老鼠牙作为模型的有效性增强子的作用在人类牙齿发育和牙原性的表型。集成后的所有在这项调查研究里,我们获得的数据形式,这种基因出现在前二十的我们列出的候选人牙原性的位点。我们观察到一个变种与齿数和延迟下降高度相关牙齿发育位于上游的WIF1,一个已知的牙原性的因素。这种变体守恒的牙增强剂,标志着一个地区的许多预测的目标WIF1(图4)。而WIF1没有直接参与人类牙发生,它属于WNT途径,都是至关重要的正常小鼠牙模式和根的形成(105年,129年- - - - - -131年)。协会模式和爆发这种基因缺陷与牙齿增强预测目标表明,有增强剂在这个轨迹stage-specific方式活跃的牙齿。我们预测,WIF1轨迹包含增强剂激活不同的牙齿在模式和根的形成。中断将导致这些不同的区域的两个截然不同的表型异常齿数和喷发,分别。总的来说,WIF1作为一个例子轨迹守恒的牙原性的增强可能调制守恒的牙原性的基因的失调可能会导致人类malodontogenic表型。

最后,我们使用我们的集成数据概要小说假定的牙原性的基因,AGAP1。这个基因还没有与任何人类牙齿发育异常有关,和此前还没有化验哺乳动物的牙齿。我们的优先级过程说明AGAP1,差异表达的牙釉质中表达,特别是结,是哺乳动物牙发生的关键因素。这些发现被发现老鼠缺乏支持Agap1演示牙科异常表型(图5,补充数据S5, S6)。然而,缺乏详细的描述这些表型阻止任何特定的解释(即。、搪瓷缺陷尖端模式差异)(111年)。有趣的是,人类的最高得分序列的存在加速基因组中守恒的背景(HACNS)在这个基因表明可能存在一种人类特有的不同角色AGAP1在牙齿发育。这些结果一起显示Agap1作为一个小说牙原性的基因为进一步的调查是一个有吸引力的目标,尤其是特有的机制。

下游实验和分析将需要解开的具体角色的优先候选人地区增强子牙原性的表型。此外,tooth-specific增强我们已经识别出可能有吸引力的分子工具驾驶高度特定的报告基因的表达或Cre重组酶为我们展示了精确的老鼠大脑区域(53)。我们提供了一个方便的门户来探索我们所有的结果https://cotney.research.uchc.edu/tooth/通过最少的计算工作为方便研究社区。

贡献字段声明

牙齿发育问题,如牙齿数目异常和延迟牙爆发,影响全世界数以百万计的人。这些问题都需要广泛的和昂贵的牙科治疗包括括号,手术,或植入物。此外,他们可以增加患牙科疾病及其并发症的风险。虽然这些牙齿发育问题出现的症状,如orofacial裂,很多情况下发生在不影响身体的其他部位。这些病例还没有与任何基因,尽管他们似乎遗传特征。我们在这里展示,这些牙齿问题可能不是由于基因突变在自己,而是监管区域控制基因的表达在牙科发展。我们确定了22001个守恒的监管地区全基因组的牙帽阶段,生产的第一个完整列表增强剂在这个阶段在这个组织。我们表明,监管区域的牙齿特别有可能导致牙齿表型,和这些地区可能保存在哺乳动物物种。通过结合这外遗传性数据和基因表达数据,我们可以优先考虑这些地区基于活动的可能性在发展中牙齿,因此他们可能对牙齿发育的影响。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE197645。

道德声明

动物研究回顾和批准康州大学健康IACUC协议号码ap - 200412 - 0324。

作者的贡献

恶导致概念、设计、数据采集和解释,写作,修改和创建数据手稿。啊了数据采集和修改。JC导致概念、设计、修改和创建数据手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

我们支持国家卫生研究院的基金5 t90de021989 1 r01de028945 1 r03de028588 f30de031149 5 r35gm119465, 1。

确认

我们想给我们的深刻的感谢Mina Mina康州大学牙科学院的医学博士为她的工作提供胚胎小鼠组织中使用的主芯片实验。这项工作可以在预印本形式(132年)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fdmed.2022.1009264/full补充材料。

引用