简短的研究报告的文章

前面。药物。,05 January 2023
秒。抗感染药物
卷2 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fddsv.2022.1082065

药物再利用两种临床药物筛选实验分析验证了识别主要针对SARS-CoV-2蛋白酶

丹尼斯·n·普拉达戈里¹ ^__, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

圣地亚哥Ruatta^2、3 ^__, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

马丁·弗洛^4、5,

卢卡斯n Alberca ¹,

卡罗莱纳·l·Bellera ¹,

Soonju公园 ⁶, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Jinyeong Heo⁶,

Honggun李 ⁶,

Kyu-Ho保罗公园 ⁶,

奥托Pritsch ^4、5, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

大卫Shum⁶,

马塞洛•a . Comini ²*^‡和

艾伦Talevi ¹*^‡

¹实验室生物活性化合物的研究和开发(LIDeB),精确的科学教师,拉普拉塔国立大学(UNLP),拉普拉塔,布宜诺斯艾利斯,阿根廷
²实验室生物氧化还原锥,巴斯德研究所de蒙得维的亚,乌拉圭蒙得维的亚
³Laboratorio de Quimica Aplicada Facultad de Bioquimica y Ciencias Biologicas,所▽沿海地区,圣达菲,阿根廷
⁴实验室Immunovirology,巴斯德研究所de蒙得维的亚,乌拉圭蒙得维的亚
⁵Departamento de Inmunobiologia Facultad药物,乌拉圭的蒙得维的亚大学de la共和党
⁶检查发现平台,巴斯德研究所朝鲜、韩国凭借

COVID-19流行促使一些药物重新定位迅速行动,目的是提供药理候选人能够降低SARS-CoV-2传播和死亡率。一个主要问题的许多共享在网上研究解决发现的化合物或药物针对SARS-CoV-2分子是他们缺乏实验验证结果。这里我们提供一个计算机辅助重新定位药物对抗不可或缺的SARS-CoV-2主要蛋白酶(MPro或3 clpro) ligand-based整体模型的开发和实验测试确定的一个小子集。分子描述符的搜索方法研究了随机子空间来获得线性分类器。最好的模型然后结合选择性集成学习提高他们的预测能力。单个模型和集合体被回顾性验证筛选,后来用于屏幕DrugBank、药物再利用中心和MPro Sweetlead图书馆潜在的抑制剂。从4在网上点击化验,atpenin tinostamustine抑制MPro (IC₅₀分别为1µM和4μM)但不是papain-like蛋白酶SARS-CoV-2(药物测试25μM)。初步动力学特征表明tinostamustine和atpenin抑制MPro不可逆转和具有竞争力的机制,分别。这两种药物未能抑制SARS-CoV-2州立细胞的增殖。这里的虚拟筛选方法报道可能是一个强大的工具来进一步程度的识别小说MPro抑制剂。此外,证实MPro打击可能进行优化或回顾搜索策略来改善他们的分子目标和抗病毒能力。

1介绍

COVID-19爆发(2019)的冠状病毒疾病威胁全球健康,到目前为止,超过5.8亿例确诊病例和650万人死亡,造成无与伦比的人类和经济损失在现代(除了1918年流感大流行的)(陈et al ., 2021;王et al ., 2022)。有效的疫苗的快速发展提高了疾病的预后,导致死亡率大幅下降(相对于估计如果没有疫苗;沃森et al ., 2022)。

侧,科学界已经采取药物再利用(即。,the identification of new therapeutic uses for known drugs) to find therapeutics in an expedite manner (Ashburn和托尔2004)。这个批准了几类药物治疗(如remdesivir favipiravir和地塞米松)在不到2年,与其他再利用候选人仍在管道(Bellera et al ., 2021;Chakraborty et al ., 2021;Venkadapathi et al ., 2021;罗德里格斯et al ., 2022)。

有效的治疗方法,然而,仍然需要,尤其是未接种疫苗的人,或者可能不能完全应对疫苗接种(例如,免疫功能低下的患者),并覆盖病毒突变可能引起疫苗逃脱(Niknam et al ., 2022)。SARS-CoV-2(严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2)主要蛋白酶(MPro)主要受到重视,一个潜在的药物目标,不仅由于其病毒复制的作用,也因为没有人分享其底物特异性蛋白酶是已知的(乌尔里希和Nitsche 2020;Breidenbach et al ., 2021)。事实上,第一个靶向性药物专门开发和批准COVID-19治疗,即ensitrelvir (Mukae et al ., 2022)和nirmatrelvir (羔羊2022),是MPro抑制剂。Ensitrelvir non-peptidic和multi-heterocyclic分子抑制MPro共价,而nirmatrelvir MPro peptidomimetic和竞争性抑制剂。合并施打例如Nirmatrelvir需要一个强有力的抑制剂的主要人类摘要CYP3A4酶(羔羊2022)。

在这里,我们报告一个target-focused计算机辅助药物再利用运动检测新的MPro抑制剂,和实验验证的一个小子集在网上点击。值得注意的,而文学中描述几个类似的努力,许多(如果不是大多数)情况下没有实验确认在网上点击已经报道(Eleftheriou et al ., 2020;大草原et al ., 2021;平齐的et al ., 2021;席尔瓦et al ., 2021;俄梅珥et al ., 2022)。

2方法

2.1模型的开发和验证

2.1.1数据集编译和内容管理

数据集IC报道的化合物₅₀(半最大抑制浓度)对MPro或报道残余酶活性在10,20或50µM浓度是来自不同来源的编译。这些包括18原创文章发现在专业文献(Akshita et al ., 2020;金et al ., 2020;马et al ., 2020;焦点在于et al ., 2020;Shitrit et al ., 2020;苏et al ., 2020;Vuong et al ., 2020;朱文昊et al ., 2020;Zhang et al ., 2020;白et al ., 2021;Chun-Hui et al ., 2021;佛朗哥et al ., 2021;服部年宏et al ., 2021;张洪波et al ., 2021;Isgro et al ., 2021;刘et al ., 2021;Mody et al ., 2021;Rothan销量2021),公开COVID月球探测器数据库(月球探测器2021从我们组)和内部获得的数据。的文献检索和数据编译COVID月球探测器数据库2021年2月进行。化合物与集成电路₅₀< 10µM或比例的酶抑制> 50%,至10µM贴上活性化合物。化合物与集成电路₅₀> 20μM,抑制比例< 80% 20µM 50μM或酶抑制的比例< 50%,10µM贴上不活跃的化合物。数据集化合物,用微笑表示格式,通过使用分子内部脚本验证标准和标准化(MolVS)包(MolVS 2021),通过应用以下行为:最大的有机分子的片段是由fragment_parent选择方法(例如,在有机盐)的情况下,最常见的同位素被分配到的原子isotope_parent方法,结构是由isotope_parent中和方法,立体化学信息是被stereo_parent MolVS法(因为只有conformation-independent分子描述符将被纳入模型,解释后)。内部脚本提供了标准化补充材料(一个Python文件是根据客户要求提供相应的作者)。重复的数据和化合物与不同来源不一致的标签被移除。因为只有0 d-2d分子描述符用于建模,数据关联到不同的光学异构体报道时,只有其中一个一直在两个同分异构体属于同一个类活动,和同分异构体化合物被忽视,如果属于不同的类的活动。共有134个活性化合物和281不活跃的化合物仍在策划数据集。所示的热图补充材料(补充图S1数据集的分子多样性)展品。数据集化合物组成的训练、测试和验证集提供补充材料在csv格式(Training_set_MPRO。csv, Test_set_MPRO。csv和Validation_set_MPRO。分别为csv)。

2.1.2数据集分成训练集和测试集

数据集是典型地分为三个不同:一个训练集,用来训练定量结构活性关系(构象)分类器;一个测试集,用于验证的定量构效关系模型和个体选择模型(以及如何)将组合成一个模型合奏;和一个验证集,用于评估模型的性能集合体。已经观察到数据集分为训练集和验证集的代表性样本往往产生模型有更好的predictivity估计,特别是在大小不同的训练集和验证集样本(Golbraikh et al ., 2003;莱纳德和罗伊,2006年;马丁et al ., 2012),可能是因为这样的作文训练和验证集尽可能多样化。为此,我们采取迭代的随机子空间主成分分析集群(iRaPCA;普拉达戈里et al ., 2022)。短暂,iRaPCA是基于迭代过程相结合的特征装袋的池conformation-independent莫德雷德描述符(森胁et al ., 2018),通过主成分分析(PCA)降维,通过k - means聚类算法。一百年随机抽样200描述符的子集生成从1613莫德雷德描述符;执行功能正常化使用MinMaxScaler scikit-learn的函数(Pedregosa et al ., 2011)。相关描述符(皮尔森系数超过0.4)随后从每个随机描述符子集。对于每个子集进行主分量分析获得前两个主成分。随后,K - means算法应用于每个子集,系统不同集群(K)的数量从2到25。scikit-learn实现算法的屏幕10个不同的随机选择初始质心种子每个集群和选择最小化within-cluster距离。所以形成了集群计算通过计算轮廓的分数(SIL) (Rouseeuw 1987)每个K值和每个描述符子集对:提供最高的SIL的K值被选中。一轮聚类完成后,分子在集群/总聚集的分子比为每个集群计算。集群超过0.4比例值进行一轮新的聚类具有相同的初始参数。集群不超过所选截止保存。从活跃的和不活跃的化合物类别分别是集群。

2.1.3分子描述符计算、建模过程和模型验证

1613 conformation-independent描述符计算使用莫德雷德包(森胁et al ., 2018)。描述符与方差低于0.05整个训练集被排除在描述符池。随机子空间方法(Yu et al ., 2012;El Habib Daho Chikh 2015)是应用于其余的人获得1000 200描述符的子集。观察到,增加随机子集的数量多达10000没有提供任何好处的早期浓缩指标如民国Boltzmann-Enhanced歧视(BEDROC;中华民国:接受者操作特征)和顶尖1%的浓缩因子(EF_0.01)。此外,更高的每个随机子集的描述符数量不允许减少寄生关系的概率(1972年Topliss和科斯特洛)。高度相关的描述符(皮尔逊相关性高于0.85)不允许在给定子集。介绍了一个虚拟的因变量,把值1化合物的活性类和值为0类化合物属于无所作为。1000线性分类器,每个子集,使用向前逐步过程得到。最多16描述符/模型允许防止over-parametrization和过度拟合(只有一个分子描述符每10训练例子被允许到模型)。

虚假的概率相关性,通过随机模型的鲁棒性进行了评估和Leave-Group-Out (LGO)交叉验证。在每个LGO轮,随机分层的子集总数的10%从训练集训练例子被移除。500随机化和500 LGO折叠被认为是。结果报告的平均精度在500发并与模型推断的准确性从原始训练集,并还没有模型错误率(省)(Gramatica 2013)。每个模型的预测能力终于通过外部验证评估。

2.1.4回顾屏幕

估计的浓缩性能模型在一个现实的虚拟筛选设置,两个回顾虚拟筛选实验。回顾的第一页是由播种的测试集生成大量的诱饵使用LIDEB的有用的诱饵(安眠药)工具(Fallico et al ., 2022)。安眠药在概念上类似于目录有用的诱饵增强(Mysinger et al ., 2012),但是额外的过滤器实现了保证之间的拓扑不同诱饵和活性化合物被用作查询。不同浓缩指标计算评估的富集行为模型:接受者操作特征曲线下的面积(AUC ROC) BEDROC,精密召回曲线下的面积(AUPR)和EF_0.01(Truchon Bayly 2007;斋藤和Rehmsmeier 2015)。表现最好的个体模型在第一个筛选结合如以下小节所述,和由此产生的集合体的性能评估使用第二个回顾性屏幕,在验证集被播种在大量的诱饵,也获得了通过安眠药。浓缩指标的分布估计不重复使用分层随机抽样(75%的库用于回顾性屏幕被取样,100倍)。因为常态和/或平等的方差的假设被浓缩的两个指标不满足使用,个别模型和最佳的性能相比,模型整体统计使用Yuen-Welch测试(威尔科克斯,2012)。

2.1.5整体学习

考虑到单个分类器的组合成meta-classifiers经常提供更好的predictivity (2016分钟;Hyun et al ., 2020),我们有选择性地最好的个体分类器相结合,从性能在回顾的第一页。五个不同的组合方案尝试:平均(AVE),最小(最小值)和产品(刺激)分数,平均排名(RANK)提供的整体模型,和平均投票(嗓音起始时间)作为计算张和Muegge (2006)。最小值分配,整体得分,得分最低的整体模型。AVE提供的整体得分的均值的所有分数整体模型。刺激了,分数,每个组合模型的产品的个人成绩。排名计算提供的平均排名整体模型筛选化学库。最后,每个集合模型提供的投票我投票计算复合j_ij= max [0, int(11−排名_ij/ 0.02 n)),等级_ij对应于排名分配模型我筛选化合物j时,图书馆是有序的降序排列我分数,根据模型和N是化合物的数量在整个筛选库。这个过程给了10票排名第一个2%的化合物,9票接下来的2%,等等。最后,对化合物的18% -20%的排名等级,1票。化合物在底部80%的排名列表接收没有投票。每个化合物的票,然后对每个模型是所有模型平均合奏。

2.2未来的虚拟筛选

模型整体显示最佳的性能在第二回顾屏幕用于潜在筛选三repurposing-oriented化学库:DrugBank 5.1.6 (Wishart et al ., 2018),药物再利用中心(Corsello et al ., 2017)和SweetLead (诺维克et al ., 2013)。在每个数据库标准化的化合物如前所述的数据集。整体得分的最优截断值选择通过分析阳性预测值(PPV)的表面(Belgamo et al ., 2020)。最后一个选择标准,我们评估是否在网上属于域模型的适用性,使用杠杆的方法(Yasri Hartsough 2001),3d / n定义为临界值,d被描述符包含在每个模型和数量n被训练集化合物的数量。

2.3 SARS-CoV-2重组蛋白酶的表达和纯化

的表达和纯化的重组形式SARS-CoV-2 MPro和Papain-like蛋白酶(PLPro)进行了基本描述Zhang et al ., 2020和Shin et al ., 2020,分别。MPro, Mono的分数筛选了问列包含重组蛋白与高纯度汇集和接受缓冲区交换(20毫米三,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米德勤,pH值7.8)使用PD-10脱盐列。PLPro,亲和色谱法进行使用(他的陷阱,通用电气医疗集团)代替钴镍(爪)列。

2.4蛋白酶筛选和/或动力学分析

2.4.1 MPro

MPro活动是由de-quenching Edans荧光(5 - ((2-Aminoethyl)氨基)naphthalene-1-sulfonic酸)对蛋白水解的乳沟合成肽(Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E (Edans) - nh2;曼联Biosystems-USA)。执行的试验是在96 -黑色微型板块(化验总额200μl)和阅读使用Varioskan勒克斯标(例/ Em = 340海里/ 490海里)。不同的参数通常控制了验证试验(信号背景比> 7 Z′系数> 0.75和相对荧光单位> 10)。所有样本分析至少一式两份。

化合物筛选、药物(25μM;Haloxon和INT131从σ购买而atpenin的合成和tinostamustine被勒令InvivoChem)孵化与MPro(90海里)的反应缓冲区(三羟甲基氨基甲烷20毫米,液pH值7.8,150毫米氯化钠,1毫米EDTA, v / v 5% DMSO) 60分钟25°C。然后,peptidic衬底(5μM)和荧光监控添加了至少30分钟。空白(反应缓冲+衬底),各种运动(Mpro +衬底)和抑制(Mpro接受25μM ebselen或乙酰胺+衬底)控制并行地运行。由于固有荧光tinotamustine重叠的衬底,蛋白酶抑制评价斜坡的反应,而不是从端点测量。药物,在这种情况下抑制Mpro活动≥50%被认为是打击和IC₅₀价值观决定通过测量酶活性在不同化合物浓度(7 - 8分25至0.0034浓度μM准备在串行稀释),在上述条件。数据拟合最好的线性或非线性方程组使用GraphPad棱镜软件(版本6.0)获取集成电路₅₀。

评估Mpro冲击的影响K_米(米歇利斯´常数:底物浓度的反应速率是其最大价值的一半)和V_马克斯(最大反应速率),初始速度(60)的酶催化反应是决定在六个不同的底物浓度(从3.5到350µM)时的浓度atpenin(50µM), tinostamustine(100µM)和酶(0.1µM)是固定的。试验进行了在同一反应缓冲区用于化合物筛选,一式两份样本,以384 -黑色微型板块(化验总额100μl)。动态测量、校准曲线和inner-filter效应修正后应用程序详细描述(Zhang et al ., 2020)。荧光测量使用Varioskan勒克斯标(例/ Em = 340海里/ 490海里)与Origin-Pro软件和数据分析。

为确定抑制MPro tinotamustine可逆或不可逆,1μM蛋白酶的孵化(1 h 25°C)反应缓冲区没有(控制样本)或存在过量的药物产生酶抑制∼50%。在评估剩余酶活性(第二段中描述的试验条件,上图),这两个样本进行三周期diafiltration (Amicon ultra - 0.5, 10 kDa-cut-off过滤器)在反应缓冲区。蛋白酶浓度是由bicinchoninic酸试验(标准情节与牛血清白蛋白的准备:1:2系列稀释100 - 6.25μg /毫升)。MPro活动评估如上所述,除了执行的反应是在石英试管和信号读取卡里Eclypse荧光光谱仪(安捷伦)。所有样本进行复制和MPro活动规范化蛋白质浓度,当对应,tinotamustine减去的荧光。

2.4.2 PLPro

试验条件(缓冲区,pre-incubation测定体积,微型板块,温度等)确定PLPro活动几乎是相同的对Mpro上面描述的化合物筛选。PLPro(0.1µM)与化合物pre-incubated 60分钟(25µM 5% DMSO v / v),然后开始通过添加peptidic底物的反应(5μM;Z-RLRGG↓amc、Bachem、瑞士)。整整规范化的目的,和零PLPro活动控制包括蛋白酶样品处理车辆(5% v / v DMSO溶液、100%活动)或缺乏底物活动(0%),分别为。增加产品形成测量的荧光(激发/发射,340/440 nm) 96孔酶标读者(Varioskan)。所有的样品都在重复进行测试。

2.5 SARS-CoV-2细胞感染试验

的anti-SARS-CoV-2活动点击确定使用384 -威尔斯微型板块fluorescent-based细胞感染试验(全et al ., 2020)。实验进行了符合韩国国立卫生研究院的指导方针,使用增强的生物安全三级实验室(BSL-3)控制过程批准使用由韩国疾病预防控制机构(KDCA)。维洛细胞来自美国类型文化收集(ccl写明ATCC - 81)和生长在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;Welgene v / v)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco)和1 x Antibiotic-Antimycotic解决方案(Gibco) 37°C和5%的股份₂的气氛。维洛细胞被播种在12000细胞在DMEM /好,补充了2%的边后卫,在黑色384 - 1 x Antibiotic-Antimycotic解决方案,μClear板块(他一一Bio-One),实验前24小时。然后,化合物或引用药物浓度(10点)和SARS-CoV-2(βCoV /侯尔/ KCDC03/2020;莫伊= 0.0125)被添加到井和潜伏期延长额外的24 h。氯喹二磷酸(σ),remdesivir (MedChemExpress)和lopinavir (Selleckchem)参考药物。24小时孵化后,通过免疫荧光细胞被固定和分析使用一个anti-SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N)抗体(嘉汉生物有限公司)和一个Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(h + L)二级抗体。细胞核染色了赫斯特33342年(分子探针)。荧光显微镜图像拍摄的轻歌剧CLS (PerkinElmer)和分析使用哥伦布™(PerkinElmer)来确定感染细胞的数量和比率。抗病毒活性是规范化的积极(v / v模拟没有病毒0.5% DMSO)和负0.5% (v / v DMSO)病毒的控制在每一个试验板。集成电路₅₀值计算的数据适合s形方程使用XLfit(版本5.5)或GraphPad棱镜(8)版软件。每个试验的质量控制的Z′因子的变异系数百分比(%的简历)。

3的结果

3.1整体学习导致改善行为回顾屏幕

表1显示了作文的训练、测试和验证集,以及如何测试和验证集,分别是富含的活性化合物提供化学库用于回顾性检查1(验证个人的浓缩性能模型和训练模型集合体)和回顾检查2(验证浓缩性能的集合体)。

表1

表1。活跃的和不活跃的化合物作文的训练、测试和验证集。测试和验证集与诱饵扩展,提供化学库用于回顾性屏幕1和2,分别。丫(活性化合物的产量)是指活性化合物的比例在相应的设置。

(即1000个独立的模型。,1,000 individual classifiers) were generated from the training set by applying a combination of feature bagging and Forward Stepwise on a pool of 1,613 Mordred descriptors. The individual classifiers were validated internally and externally, initially employing a score cutoff value of 0.5 to discriminate between active and inactive compounds. Internal validation results for the five best individual classifiers, according to their AUC ROC in the first retrospective screening, are summarized in表2。五个最好的个体模型和包含它们的分子描述符的含义补充材料。

表2

表2。最好的内部验证5个人模型首先回顾屏幕。交叉验证和随机测试,平均精度在500发通知;的标准差的意思是在括号。模型根据其性能已被命令在第一个回顾性审查。

由于个人的次优结果分类器在交叉验证,我们采取整体学习,希望能提高鲁棒性。个人的绩效模型和模型乐团已经相对评估在两个回顾性检查活动,在已知MPro抑制剂被播种在non-inhibitors(已知和假定的)。最好的个体模型显示的AUC ROC 0.934±0.007, BEDROC为0.274±0.057,0.221±0.038的AUPR,和一个英孚_0.01首先回顾0.29±0.07的屏幕,表明有很多改进的余地(注意,尽管良好的AUC民国,早期浓缩指标显然有最佳值)。

2到100个人的系统组合模型进行,使用五种不同运营商结合个人的分数模型(图1一个)。模型获得的整体结合22模型通过最小值操作符(MIN-22)提供了最好的结果在不同的指标,大大提高早期和整体浓缩。其结果在回顾屏幕所示表3;比较,结果最好的个体模型(模型25)也包括在内。

图1

图1。数据块从回顾性和前瞻性在网上针对MPro筛查。(一)AUC中华民国在回顾筛选获得的函数组合模型的数量为每个操作符。(B)两种不同的观点的PPV表面MIN-22合奏。Se / Sp指的敏感性和特异性比率。

表3

表3。性能最好的个体模型和最好的模型整体回顾筛选实验。浓缩的标准差指标(通过引导)提出了括号。

3.2未来的虚拟筛选

通过分析PPV表面(图1 b)建立在第一个回顾检查,一个优化分截止值为0.546时被选为MIN-22合奏来识别在网上支安打,对应估计特异性PPV为0.998,最小值为0.634 0.01的假设的丫。这表明,是的,不止一个每两个在网上点击确认预测当提交实验确认。如果认为0.1%的丫,平截断值将确定最小PPV为0.147,10的意义超过1在网上从理论上证实预测活动。注意,真丫的图书馆将被忽略先天的。

MIN-22应用在三个不同的化学库的虚拟筛选的药物再利用,DrugBank,中心和Sweetlead药物重定位和43个分子被选为潜在的MPro抑制剂。这些袭击所示的身份补充表S1以及他们的PPV估计,最初的迹象,以及他们是否已经测试MPro根据ChEMBL (Gaulton et al ., 2017),PubChem生物测定(王et al ., 2017)和PostEra月球探测器(大约一半的点击率已经化验MPro之间我们发起这项研究之前的那一刻在网上收购),如果他们提出任何Pan-Assay干扰化合物(痛苦)(Baell霍洛威学院2010;Magalhaes et al ., 2021)。43支安打所示的结构补充图S2,连同80活跃分子的结构的训练集(补充图S3)。

3.3实验验证

3.3.1 Atpenin和tinostamustine抑制MPro但不影响在体外SARS-CoV-2扩散

以下标准考虑的选择在网上预测MPro击中化验,对抗病毒蛋白酶:i)滥交的脚手架和痛苦被忽视;ii)药物和著名的分子目标(s)和生理效应;3)良好的溶解性、药效学资料;(四)是否已经测试的目标目前复合收购(已经测试点击被忽视);(五)商业可用性;(六)价格。四名候选人会议这些期望的特性都是购买和测试(图2)。

图2

图2。选择药物化验SARS-CoV-2蛋白酶。

为了让slow-binding的检测和低亲和力MPro竞争性抑制作用,药物(25μM)孵化1 h和酶,接下来,反应开始通过增加底物4倍子任务K_米浓度,分别。在这些条件下,atpenin tinostamustine MPro活动下降不到50%而INT131施加的抑制作用(22%抑制)和haloxon抑制(2%)是边际,null,分别为(表4)。控制药物ebselen知名MPro共价抑制剂(梅内德斯et al ., 2020),产生蛋白酶的抑制。为了验证的特异性在网上方法来识别MPro抑制剂选择性的方式,四个药物化验的第二个半胱氨酸蛋白酶(papain-like) SARS-CoV-2,即PL-Pro。除了滥交thiol-inactivating代理ebselen,据报道PL-Pro共价抑制剂(Weglarz-Tomczak et al ., 2021),药物没有(INT131和atpenin)或略微(17%和21%在25μM抑制haloxon tinotamustine,分别)影响PL-Pro活动(表4)。药物浓度导致50%抑制MPro在同一个数量级atpenin (IC₅₀= 1μM)和tinostamustine (IC₅₀= 4μM)和> 20倍降低ebselen (IC₅₀= 50海里;表4和图3一)。

表4

表4。抑制MPro SARS-CoV-2重组蛋白酶的药物发现在网上。

图3

图3。药物测试MPro和SARS-CoV-2。(一)量效MPro抑制剂的情节。数据拟合非线性(s形,atpenin和ebselen)或线性(tinostamustine)方程。(B)量效情节抗病毒和细胞毒性活动对SARS-CoV-2 Vero-infected细胞。病毒复制和细胞生存能力被测量水平的量化SARS-CoV-2核衣壳蛋白和宿主细胞核DNA的荧光显微镜。详情参见2.4.1节和2.5节。

量效曲线表明,atpenin MPro而部分抑制剂的抑制所tinostamustine显示了线性相关与药物浓度(图3一浓度范围内),尽管测试完整的酶抑制也就不能实现。

相比ebselen tinostamustine, MPro抑制由atpenin实现了明显的高原浓度高于1μM (图3一)。这种效果不能归因于有限溶解度的化合物(例如,在浓度高于5μM),因为理论LogP (10-based对数将辛醇和水的分离系数的分子)和日志(10-based对数的水溶性分子)值atpenin(分别为2.89和2.88−)低于估计为tinostamustine(分别为3.92和2.97−)的复合不显示饱和度三个订单内的酶抑制浓度范围。此外,atpenin只需要轻微的减少(16%)在MPro V_马克斯和明显K_米底物(表4),这表明这种药物是一个具有竞争力MPro抑制剂。

tinotamustine,动力学分析显示减少4倍MPro反应速度和不显著改变明显的底物K_米(表4),这是暗示的非竞争性(可逆)或不可逆抑制机制。为了确定两个机制的药物的抑制MPro,酶处理的化学计量学过剩tinotamustine酶抑制收益率∼50%,然后是化合物被diafiltration移除。超滤前后的活动未经处理和tinomastutine-treated MPro±14%和43%±9%,100%和100%±9%和46%±6%,分别。因为MPro活动无法恢复的药物,这一结果表明tinostamustine产生不可逆的抑制病毒蛋白酶。

增殖的抑制能力SARS-CoV-2(武汉应变)化验atpenin和tinostamustine细胞感染模型。Ebselen作为复合控制而氯喹、lopinavir, remdesivir作为临床药物控制。在浓度测试的所有分子拥抱级三个订单。所示图3 b没有一个浓度测试,atpenin和tinostamustine显著影响SARS-CoV-2扩散。相比之下,ebselen (IC₅₀= 9.7μM)和控制临床药物(情节没有显示;集成电路₅₀= 10.4μM氯喹,IC₅₀= 14.2μM lopinavir, IC₅₀= 9.9μM remdesivir)显示低micro-molar抗病毒活动范围。相比之下atpenin和ebselen tinostamustine导致明显细胞毒性浓度高于10μM (图3 b)。

4讨论

所示表2总百分比(准确性、Acc)良好的分类表现最佳的个体模型是可以接受的训练集(约80%)。在所有情况下,随机模型的均值Acc是类似于省,这是我们平衡训练集0.5。这些结果清楚地证明虚假的低概率的关系。对于交叉验证,意味着整个折叠Acc下降约10%(与训练集上的Acc相比)的四个表现最好的五个分类器,暗示某种程度的过度拟合和次优的鲁棒性。为一个单独的模型(442)强调这种行为,因为它显示了最高Acc训练例子(0.894)但意味着精度最低的交叉验证(0.673)。这个合理的采取模型结合,令人信服地表明,单个模型的选择性结合成一个meta-classifier改善了预测能力,尤其是早期浓缩在回顾筛选实验。

的在网上识别的方法应用抑制剂MPro证明成功的识别分子选择性活动对病毒蛋白酶。两种药物,心脏保护代理(atpenin)和一个抗癌剂(tinostamustine)剂、小数量的候选人(四)测试显示低µM抑制对从SARS-CoV-2 Mpro活动和不同的抑制机制。建模过程中的一些要点,可以解释我们的虚拟筛选活动的成功:

)精心策划的数据库的线性分类器是推断(后,著名的“垃圾,垃圾”原则在计算机科学中,即有缺陷的输入数据产生差输出);

b)的事实,我们选择分类器来推断模型,基于二进制分类的训练示例的“积极”和“不活跃”类别,而不是回归模型针对拟合和预测定量测量的活动,例如,K_我或图片₅₀。此外,我们雇佣了一个“安全”窗口标签活跃的和不活跃的化合物:对于那些数据点报告集成电路₅₀值,与IC化合物₅₀< 10µM被标记为活性化合物,化合物与IC₅₀> 20µM视为无效。在我们看来,这两个决策帮助减轻噪声与不当和实验室内部变化观察到的响应(注意,我们的数据集收集获得的数据在不同的实验室)。

整体学习c)的使用方法,提高预测的可靠性。值得注意的是,未来的虚拟屏幕的系综选择模型是基于最小操作符,这是相当保守的方式结合整体模型:如果只有一个模型提供了一个低分数给定的化合物,这种化合物会被贴上不活跃。换句话说,一个基于该操作符只会提供一个高分,如果所有的复合模型提供了一个高分,即。,如果他们同意在预测;

d)最后,我们相信一个临界点的协议是使用两个回顾性筛选实验来评估个人的浓缩行为模型和模型的集合体。出于这样的目的,我们使用不仅浓缩指标反映平均浓缩(AUC ROC)还早浓缩指标(BEDROC EF0.01),后者是最关键在执行虚拟筛选活动(Truchon Bayly 2007)。

Atpenin是一种抗真菌抗生素隔绝青霉菌sp,高亲和力ubiquinone-binding网站的琥珀酸脱氢酶(Miyadera et al ., 2003)。由于强有力的抑制atpenin施加于线粒体复杂二世,这种药物被用作抵消缺血再灌注损伤心血管代理(Wojtovich和布鲁克斯。2009;Drose et al ., 2011)。初步动力学特征表明MPro抑制由atpenin具有竞争力。SARS冠状病毒MPro已被证明接受重要的构象变化和pre-catalysis,最后包括substrate-induced蛋白质二聚作用(2009张。;吴et al ., 2013;Zhang et al ., 2020)。因此,一个可能的机制atpenin影响MPro活动可能包括单体和二聚体的扰动平衡(如二聚物的增加K_D)和/或二聚体单元之间的协同。

Tinostamustine是一个融合分子结合bedamustine强大的DNA损伤效应(Cheson和Leoni, 2011)pan-histone脱乙酰酶抑制剂vorinostat的一部分,提供一个first-in-class烷基化脱乙酰酶抑制剂(Festuccia et al ., 2018)。我们的实验数据是一致的不可逆抑制病毒蛋白酶tinotamustine。溶剂可访问和un-protonated半胱氨酸残基(即。,thiolate) of MPro qualify as nucleophilic targets for alkylation by tinostamustine. From the five cysteines in thiolate state present in MPro (Cys22, 38, 44, 128, and 145), three of them are located close to the protein surface: Cys22, Cys128, and Cys145 (科内尔et al ., 2020)。从动力学分析与非竞争性抑制MPro tinostamustine建议(障碍V_马克斯而不是在衬底K_米),催化Cys145是顶级候选人。这种药物可能是不可逆转的修改。尽管如此,还需要进一步的分析来阐明如果tinostamustine充当共价或MPro紧束缚(非共价)抑制剂。

缺乏抗病毒活性观察atpenin和tinostamustine可以解释为不可能,在我们的实验条件下,达到有效浓度在细胞内水平能够不影响病毒复制和细胞生存能力在24 h。由ebselen是满足了这一要求,控制化合物抑制50%的复制SARS-CoV-2浓度200 -折叠高于它的集成电路₅₀针对MPro(0.049μM;表4)。假设一个类似行为atpenin (MPro = 0.98μM IC50)和tinostamustine (MPro = 4μM IC50),抗病毒EC₅₀分别将196年和800年μM。这些值远高于最大浓度(50μM)进行测试。

一个额外的因素,可能导致观察到的低在cellulo活性的化合物可能与感染试验的条件,这是非常支持方面的要求高度活跃分子的检测。例如,我)维罗细胞,它依赖细胞株,SARS-CoV-2(武汉应变)已被证明显示最大复制动力学相比,人类结肠癌(CaCo-2)或肺癌(Calu-3)细胞(莫那et al ., 2022),2)病毒感染和复合治疗同时启动,确定和iii)病毒复制后24 h孵化。按照这种说法,并支持我们目前发现atpenin目标是一个重要的病毒蛋白,最近的一项研究在预印(还建议et al ., 2022)报告了一个电子商务₅₀的0.45和0.68μM atpenin A5对二SARS-CoV-2菌株感染Calu-3细胞治疗感染复合前24小时,然后孵化更多前48 h评估病毒载量(总试验时间= 72 h)。

关于tinotamustine,小说再利用策略COVID-19最近出现了。这种药物引起的高度乙酰化组蛋白的积累(与类似的作用方式和化合物)导致感应的染色质重塑和基因表达的调制,这种药被证明能重置管制免疫反应中观察到严重COVID-19,特别是通过降低炎症反应失控(Ripamonti et al ., 2022)。因此,在COVID-19 tinotamustine的潜在polypharmacological效应,即。,amelioration of host’s cytokine storm and inhibition of viral MPro, merits further investigation.

总之,我们的结果对回顾检查类似物(铺平了道路塞尔比et al ., 2010;Krautwald et al ., 2016;王H et al ., 2017和几个非常Mehrling和陈2016)atpenin tinotamustine。另一方面,高的预测率在网上方法应用于确定SARS-CoV-2 MPro支安打,及时向剩下的实验检查程度在网上候选人。

数据可用性声明

使用的数据集在网上研究(培训和验证数据)被释放补充材料. csv文件。

作者的贡献

概念化,和MAC;正式的分析、DNPG SR、MF、LNA、CLB,, DS, MAC;调查:DNPG、SR、MF、LNA、SP, JH,霍奇金淋巴瘤,K-HPP;原创作品草稿准备:在MAC;Writing-review和编辑:DNPG、MF、SP K-HPP, OP, DS, MAC;监督:在,DS, MAC;资金收购:DS, MAC。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。

资金

紧急的财政支持COVID-19筹款活动的巴斯德研究所和FOCEM(洋底对位拉Convergencia Estructural▽南方共同市场,格兰特咖啡数量03/11)。提供了额外的支持韩国国家研究基金会(NRF)由韩国政府拨款(MSIT,不。nrf - 2017 m3a9g6068254)。

确认

我们感谢希尔根菲尔德r .蛋白酶(德国感染研究中心,吕贝克大学,德国)和Dikic(马克斯普朗克研究所的生物物理学,法兰克福,德国)提供MPro和PLPro表达向量,分别。SR承认的支持Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas国家(阿根廷)博士后奖学金。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fddsv.2022.1082065/full补充材料

引用

Akshita G。,Chitra, R., Pradeep, P., Viswanathan, V., Naval, V., Punit, K., et al. (2020). Structure-based virtual screening and biochemical validation to discover a potential inhibitor of the SARS-CoV-2 main protease.ACSω5,33151 - 33161。doi: 10.1021 / acsomega.0c04808