方法的文章

前面。Cardiovasc。地中海,2023年1月10日
秒。心血管生物制剂和再生医学
卷9 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.1095141

方法的隔离和长期扩张的周从人类和动物组织

瓦Vincenza Alvino ^{1 __},

哈立德Abdelsattar卡塞姆穆罕默德 ^1、2中,

顾曰 ¹和

Paolo Madeddu ^{1 *}

¹布里斯托尔心脏研究所、布里斯托大学、布里斯托尔、英国
²心胸外科学系,医学院,Assiut大学,艾斯尤特,埃及

对周围人体每个器官的毛细血管。他们也存在血管滋养管,小血管供应较大的动脉和静脉的城墙。临床兴趣的周快速增长,承认他们的至关重要的作用在控制血管功能和可能的治疗在再生医学中的应用。尽管如此,用于定义差异方法,分离,扩大对印度很常见,可能影响再现性。连续的分离纯外膜细胞准备血管周的间充质细胞是具有挑战性的。此外,功能行为的变化和抗原表型以响应环境刺激,很难制定一个明确的定义善意的周。很少试图开发作为clinical-grade产品周围的周。因此,本文致力于评估当前方法的优点和缺点,提出标准化和协调改进。我们强调的重要性,开发升级协议创建周皮细胞治疗产品根据监管指南为临床制造业。最后,我们描述如何整合RNA-seq与单细胞的空间分析技术,和功能分析可以帮助实现全部潜力的周的健康、疾病和组织修复。

1。背景

本杰明作曲者是第一个描述并把他的名字给一个特定类型的细胞内的毛细血管基底膜与预测突出围绕血管壁(1)。齐默尔曼,1923年更名为这些作曲者细胞”的周。“在这种广泛的名字,其中包括多种形式的细胞从不同的组织起源位于毛细血管(2)。然后,研究周进入了冬眠期,直到20年前,当周围的周的再生潜力开始吸引平移利息(3,4)。尽管如此,文学的差异仍然存在与其他心血管细胞周围的周。例如,周中丰富的心。然而,只有73的出版物心脏的周在PubMed 2021(687年的出版物检索使用通用术语“的周”)与5400年相比心肌细胞和1150年冠状动脉内皮细胞。这些数据突显出还需要更多的研究在这个细胞群。

一些球队报道技术对周的隔离和推导。文化扩张允许股票作为产品的代细胞治疗和组织工程。尽管如此,共识pericyte-related技术仍然远远落后于人类内皮细胞(ECs) (5- - - - - -7)。特别是,多样性的周的属性和抗原表达在不同的器官,与其他血管周围间充质细胞重叠一起,代表了一个重要障碍,使用一个方法适合所有的实验条件。特别的标准操作程序(SOP)可能更好的实现不同的科学和医学的目标。例如,纯周皮细胞产品是必要的为病人的治疗获得监管部门的批准。Semi-purified准备更适合破译的过渡对不同抗原和功能表型以响应环境刺激。周是见的主要特征图1和相关的文本部分。

图1

图1所示。周的特征。(一)免疫荧光显微镜图像NG2成为积极的(绿色)的周,与内皮细胞标记红色和蓝色的细胞核。(B)卡通的周皮细胞内皮细胞的毛细管内部衬里。(C)周在文化的方面。(D)重叠与其他间充质细胞的抗原。为了清晰起见,请参考文本重叠血管周的成纤维细胞。(E)主要外膜细胞功能。形象(一)再现了原文的许可在阿沃利奥正et al。(3)。

2。的目标是

这个综述的目的是展示、比较和讨论派生的经验对不同器官和物种。我们最初报告当前的命名法,功能角色和抗原档案区分从其他血管周的周细胞数量。然后致力于审查的主体(我)记录当前隔离技术的利弊,扩张和表征善意的周(二世)建议标准化途径和协调,(三世)临床制造业升级协议,(四世)勘探的潜力小说在推进周皮细胞单细胞技术研究。

3所示。起源和周的命名法

头地区发育,周和胸腺源自neuroectoderm。的发现在肝脏,肺,心脏源于间皮。的中胚层产生对其他器官(如肾脏、肝脏和胰腺)(8- - - - - -10)。有趣的是,山崎等人提出的子群的周也可能来源于造血细胞系(11)。跟踪研究可能有助于揭示出额外的血管周发育因素。

在成年人的有机体,微血管周围的周是经典位于基底膜在不同器官的直接接触毛细管ECs。此外,对存在于血管动脉外膜,血管的外层附近血管滋养管(3,12)。这些血管内的周不一致的术语:“外膜基质细胞CD34+细胞”指的是原位CD34的表达,一种跨膜糖蛋白,“外膜pericyte-like祖细胞”表示他们的可塑性和积极性为典型的干细胞标记(12- - - - - -15)。为了清晰起见,我们将参考这些细胞外膜的周。

4所示。功能角色的周

周血管的生理稳定性至关重要,以突出pericyte-endothelial相互作用形成血脑屏障(16)。毛细血管减少丰富周围的周,周皮细胞分离,和权责发生制的衰老标记与脆弱性和微血管功能障碍相关,观察到在老化、缺血性疾病,纤维和神经退行性疾病、糖尿病、肿瘤、COVID-19 (17- - - - - -21)。此外,毛细管的周调节血流量在不同的器官。据报道小鼠大脑外膜细胞消融发达急性血脑屏障破坏,严重的血流量减少,神经元和快速损失(22)。周皮细胞收缩参与无复流现象,血液未能reperfuse后缺血组织血管阻塞被移除或绕过(23- - - - - -26)。

除了他们的血管功能,对发挥免疫调节任务,通过模式识别受体感应炎症刺激,促进单核细胞和中性粒细胞迁移和归航通过PDGFRβ信号机制(27,28)。他们也表达配体相互作用激活T细胞受体在适应性免疫反应(29日)。

最后,对组织修复中扮演关键的角色,推广,和稳定的修复新血管形成,回顾了纳瓦罗et al。30.)。因此,再生疗法使用外源性功能型测试(周围的周31日- - - - - -37)。周是作为分散制剂或作为一个“组织工程”的产品的一部分的模型心肌梗死(MI) (33,36,37),先天性心脏病(34,35)、肢体缺血(38),肌肉萎缩症和骨骼肌损伤(39- - - - - -42)、血脑屏障障碍(43- - - - - -48)、糖尿病性视网膜病变(49- - - - - -51)和肾纤维化(52)。这些临床前研究为未来铺平了道路在人类疾病治疗应用。

5。抗原与周围的周的功能和定位

像其他间充质细胞,对周是积极CD105、CD29、CD44、CD45和CD31 CD90和消极。他们通常表达血小板源生长因子受体β(PDGFRβ),细胞表面糖蛋白MUC18 (CD146) GTPase信号5 (RGS5),硫酸软骨素蛋白聚糖4(喜欢的《忍者外传2》),11 (Myh11),肌凝蛋白重链和跨膜metalloprotease CD13 (12,53- - - - - -55)。

抗原标记物的表达可以根据不同器官的位置。毛细管和外膜周表达喜欢的《忍者外传2》和PDGFRβ。然而,对于CD146毛细管的周是积极的,而外膜对CD34阳性和阴性CD146 (3,12,56,57)。Kramann等人,Crisan等人说明不同抗原的根据他们的血管周围的周网站。他们分类的周分为两类。毛细管(I型)的周(喜欢的《忍者外传2》⁺/肌间线蛋白^{- - - - - -}/α-SMA^{- - - - - -})和pre-capillary (II型)的周(喜欢的《忍者外传2》⁺/肌间线蛋白⁺/α-SMA⁺)(58,59)。作者等人发现post-capillary (III型)的周(喜欢的《忍者外传2》^{- - - - - -}/αSMA⁺)(60)。此外,冠状动脉的周分为endocardial-derived(喜欢的《忍者外传2》^{- - - - - -}/ PDGFRβ⁺/αSMA^{- - - - - -})和epicardial-derived(喜欢的《忍者外传2》⁺/ PDGFRβ⁺/αSMA⁺)(61年,62年)。三个不同的子组的主动脉的周被确定基于相似之处成纤维细胞(PDGFRβ⁺/ PDGFRα⁺/ CD34⁺),VSMCs (PDGFRβ⁺/αSMA⁺)和神经细胞(PDGFRβ⁺/ PLP1⁺/ CNP⁺)(63年)。

可以改变周围的周表型凌日时从静止到激活状态。喜欢的《忍者外传2》区分局部外膜细胞等属性的能力控制大脑血管通透性(64年- - - - - -66年),参与myofibroblast分化过程中心脏和肾纤维化(67年,68年),冠状动脉微脉管系统(祖细胞活动69年)。并发CD133的表达、CD34和激酶插入域受体(KDR)识别胎儿aorta-derived周分化成内皮的能力或肌肉血统(15)。成人主动脉瓣周表达具备干细胞标记SRY(性别决定区域Y)框2 (Sox2) (12)。周细胞和微血管心脏表达OCT3/4研制,但GATA−4,和蛋白质同源框NANOG (32)。另一个多能性基因的upregulation Kruppel-like因子4 (KLF4),标志着血管周的细胞分化较低的开关状态在肿瘤(70年)。

在血管生成,从静止到积极增殖抗原的周伴随着深刻的变化和分泌概要文件(71年)。alpha-smooth肌肉肌动蛋白的表达的差别(α-SMA)和对这些蛋白质酪氨酸激酶Tie2据说马克周皮细胞参与病理性血管生成(72年- - - - - -74年)。使用RNA-Seq转录组,我们推出了新的标记区分人类心脏的分化阶段pro-angiogenic,周围的周细胞收缩。天真的周表达细胞粘附分子3 (CADM3)。angiogenesis-related细胞视黄结合蛋白2的表达(CRABP2)和水通道蛋白1 (AQP1)杰出收缩从天真的周和冠状动脉VSMCs(周围的周55)。此外,我们报道了表观遗传修饰可以影响周皮细胞pro-angiogenic活动(75年)。移植的人类外膜周小鼠肢体缺血模型改进灌注恢复和肌肉血管生成。不同供体行之间的疗效不同。全基因组筛选表明,这种变化显著相关的启动子和基因的DNA甲基化状态的身体水平(75年)。

Gubernator等人发现两种类型的骨骼肌与周围的周脂肪形成和肌细胞生成(76年)。我就对抗原概要文件类型(喜欢的《忍者外传2》⁺/巢蛋白^{- - - - - -}/ PDGFRα⁺)是与脂肪细胞的分化命运和与脂肪堆积(77年)。II型表现概要(喜欢的《忍者外传2》⁺/巢蛋白⁺/ PDGFRα^{- - - - - -})与肌细胞与骨骼肌再生相关的承诺和(78年)。

6。区别于其他细胞内血管周的利基

内微环境或接近血管壁,血管周的利基,包含间充质基质细胞(msc)、成纤维细胞和周。血管周的msc CD146 CD105,碱性磷酸酶(ALP)⁺在人类,Stro-1 VCAM1, CD105, PDGFRα,Sca1, CD44, CD29, VCAM1鼠标(79年)。目前尚不清楚是否msc和周有血统关系或代表功能截然不同的间叶细胞数量,共享一个血管周的位置。一些研究支持的可能性构成更原始版本的msc(周围的周15,80年),而另一些人则认为所有msc对一些狭窄异常(81年)。符合后者的可能性,Crisan的一项研究表明,从不同器官分离的周表达几乎所有已知的msc标记,尤其是CD10 CD13, CD44, CD73, CD90、CD105 (82年)。

此外,一个严格的成纤维细胞和周之间的关系。成纤维细胞间充质细胞的间隙空间所有器官(83年)。PDGFRα,他们表达间充质标记,如波形蛋白和I型胶原蛋白,还有一些组织标记,如转录因子21 (TCF21)和periostin (84年)。在大脑中,血管周围成纤维细胞周围皮质穿透arteriole-capillary过渡区小动脉及其分支。不过,他们没有在周占上风的毛细区(85年)。最近老鼠单细胞转录组研究表明血管周的纤维母细胞在成年小鼠大脑表达相比其他壁画独特的标记细胞(86年- - - - - -88年)。心,periostin-expressing myofibroblast源于tissue-resident成纤维细胞和扮演重要角色在自适应治疗和纤维化,根据遗传谱系追踪心肌细胞(84年)。在斑马鱼的一项研究中,使用的组合在活的有机体内实时成像、基因消融和CRISPR突变分析,表明血管周的成纤维细胞扮演双重角色在稳定新生节间血管芽背主动脉和后来的功能为周皮细胞祖细胞(89年)。此外,Birbrair等人杰出的两个善意的周皮细胞亚型在老鼠的骨骼肌间质,1型(Nestin-GFP命名它们^{- - - - - -}/ NG2-DsRed⁺)和2型(Nestin-GFP⁺/ NG2-DsRed⁺)的周。在体外1型的周profibrotic,和2型的周肌原性的。后者的命运被证实移植后2型的周的年轻的老鼠,在较小程度上,在年长的老鼠。此外,2型参与正常和周围的周tumoral血管生成(77年,78年)。因此,周之间的过渡状态和共享功能和血管周的成纤维细胞可能在疾病共存。

鉴于没有single-specific周皮细胞标记,采用“确定包的概念似乎更为合理(82年)。

7所示。当前协议派生的周皮细胞数量

周皮细胞的不同步骤推导和净化图2。

图2

图2。不同的隔离方法的优缺点和净化方法。图中创建Biorender.com源。

7.1。组织收集和周皮细胞提取

收获过程会影响随后的隔离措施。例如,心脏外科医生使用两种技术隐静脉对冠状动脉旁路移植做准备。删除从静脉血管周的组织可能会损伤动脉外膜,从而阻碍了居民对周的隔离。我们宁愿分离从周围的周静脉通过“出手”技术(90年,91年)。最优时间从收获到细胞隔离根据不同组织来源。血管可以存储7天,而心脏样品必须为48 h内消化处理。

隔离一般使用酶消化或执行显微解剖技术。酶消化的方法是特别有用的周皮细胞隔离活检和手术的剩饭剩菜。组织是切碎并受一个或多个回合的酶消化。胶原蛋白含量高的样品应该进行机械分离增加细胞产量(39,46,47,92年,93年)。质量控制试剂的纯度和稳定性包括检查批酶活性,确定活动的衰减与存储,并确保最终的浓度是适当的组织来源和样本数量。高纯度的胶原酶I和II,商用Liberase TM,用来消化和隔离从人类和猪隐静脉和周围的周心(12,32- - - - - -35)。胶原酶的Dispase、Dnase我和Tosyl-L-lysyl-chloromethane盐酸盐(TLCK)用于分离猪和牛从大脑周围的周(45)。木瓜蛋白酶和Dnase我用来隔离小鼠大脑的周(43)。酶量的精确优化与组织的重量是必要的,以确保有效的细胞隔离(3,12)。过于激进的过程可以影响细胞的生存能力,而不完整的组织处理可以妥协细胞产生。组织的孵化时间消化也很重要。对于提取从心脏周围的周,我们对待剁碎组织Liberase长达1 h在37°C下温柔的旋转。

显微解剖通常应用于/外植体的文化产物。组织使用手术刀切割成小块或剪刀,清洗,以避免血红细胞污染,并分布在培养皿表面有或没有细胞外基质(ECM)涂层。预热然后添加到媒体完全覆盖了碎片。移植文化保持原状几天直到成为可见的迁移细胞从组织块周围的周(31日,41,94年)。这种隔离技术的优点是产量的增加收集细胞,低成本,避免破坏性压力引起的酶(95年)。然而,酶预处理有时可能成为必要,对于micro-vessels从胎盘(91年)。

激光捕获显微解剖(LCM)使操作员能够单独的兴趣从整个组织标本的细胞在显微镜下用紫外激光切割光束(96年,97年)。这种分离策略之前不需要机械或酶消化。因此,它允许保留原生细胞表型、基因表达和功能(98年)。缺点是由成本、复杂性和人员专业化(99年,One hundred.)。模块是用来隔离snap-frozen人类和老鼠的大脑(周围的周101年)。

酶解离和显微解剖通常后跟分离抗原细胞群的流式细胞仪或immunomagnetic列定义。这可能与使用选择性培养基中细胞扩张(31日,102年)。

7.2。净化

表1显示了正面和负面的标记用于排序表2说明了方法来提高纯度。

表1

表1。积极的和消极的周的标记不同的物种和组织。

表2

表2。不同的策略和方法提高纯度的隔离和净化的周从不同物种和组织。

准备immunomagnetic排序,从消化或显微解剖原油准备就是经过70 - 40 -,30-μm过滤器消除碎片。利用immunomagnetic列,细胞用配共轭微磁标记抗体和暴露于磁场(90年)。三个平台可用于这一目的:磁选机,无列磁分离装置包含细胞标记抗体,管和磁性粒子。标记细胞保留在管的墙壁,和标记细胞被丢弃。mac列和Dynabeads被广泛用于隔离的周由于过程的简单性和速度(32- - - - - -35,94年,103年)。严酷的磁场可能导致损坏或破裂的脆弱的细胞的细胞膜。此外,基于列的分离通常采用有限数量的正负标记,导致semi-purified细胞群。

Fluorescent-Activated细胞排序(流式细胞仪)比immunomagnetic列更可靠。最后的人口是高度纯为选定的抗原,但细胞产量可能立即应用程序要求大细胞数量不足。战略控制细胞可以产生深远影响深远的结果(12,39,41,42,44,52,90年,104年,105年)。

7.3。扩张

这一步需要微调环境条件对污染物的和一致的快速增长和抑制细胞。基本要素和组件包括适当的细胞播种密度、烧瓶/板涂料、媒体、生长因子(GFs)和抗生素。

周有细长的胞质过程启用在体外信息交流所必需的生产和分泌的“sensome,”一个新的术语用来表示不同的GFs感觉到这些细胞(106年)。因此,正确计算细胞播种密度是至关重要的,以避免增长逮捕和衰老造成的缺乏身体接触。支持周坚持文化的表面,0.1 - -0.2% (w / v)胶解决方案被广泛用于预涂。

杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)已经被用于扩大来自大脑周围的周(107年)、肾(108年)、肺(109年),骨骼肌(110年,111年)和皮肤(112年)。DMEM版本包括许多其他因素(例如,锌,胸苷)可以帮助提高增长率(113年)。的胎牛血清(的边后卫)讨论由于试剂的复杂性(114年- - - - - -116年)。另外,从心脏周围的周(32)、隐静脉(117年),脐带(31日)内皮细胞生长介质中被扩展2 (EGM-2),而骨髓培养了周围的周α-MEM包含的边后卫(105年)。抗生素治疗青霉素和链霉素通常是添加到培养基,以减少污染。

扩张的单细胞克隆允许进行批量制备中的祖细胞分类的周(118年,119年)。单个细胞分为寺崎多井板产生克隆和积累(12,111年)。机械和化学应力在排序过程中会导致贫穷的恢复和减少单独使用扩张。此外,流式细胞仪系统需要高水平的日常维护与不孕可能保护细胞培养环境的污染。

甚至采取了非常严格的协议扩张,扩张效率可能取决于供体的组织来源、年龄、和临床条件。使用一个良好生产practices-compliant SOP,我们扩大了几十个外膜细胞行隐静脉和心脏。新生儿心脏的周增长速度,比成人的周。从样品重量小于100毫克,我们可以获得5≈2000万细胞通道,在4 - 6周的文化扩张。十倍数量的静脉都必须达到这些量(32)。此外,老年患者接受周围的周在之前的段落(增生性衰老75年)。专家普遍认为细胞制备的最佳纯度和活力在90%以上。

8。从人体组织的隔离的周

对被孤立的从不同的组织。

8.1。大脑

大脑可以隔绝周围的周灰质和白质使用酶消化和外植体培养(92年,107年,120年- - - - - -122年)。他们表达PDGFRβαSMA CD13、喜欢的《忍者外传2》CD146和肌间线蛋白(121年)。大脑对扩大在文化与DMEM / F12补充10% (v / v)的边后卫(120年)。

8.2。心

心脏的周从心房和心室使用酶消化分离,过滤,获得CD31 immunomagnetic分离^{- - - - - -}/ CD34⁺细胞(21,32,55)。心脏扩大在周围的周专用培养基补充与人类重组GFs (ECGM2)和2%的边后卫。这个媒介是优于间充质基质细胞媒体如mac + 10%的边后卫和DMEM + 20%的边后卫(32)。

8.3。骨骼肌

骨胳肌源性主要是由外植体培养分离出周围的周。不同的人群,如碱性磷酸酶/ CD56^{- - - - - -}细胞和CD146⁺/喜欢的《忍者外传2》⁺/αSMA⁺/ CD45^{- - - - - -}/ CD31^{- - - - - -}/ CD34^{- - - - - -}可以净化细胞,流式细胞仪或immunomagnetic配(微77年,78年,93年,123年,124年)。I型collagen-coated板块扩张在DMEM含有5% (v / v)的边后卫(41,111年)。

8.4。骨髓

骨髓的周可以使用microbead细胞隔离immunomagnetically排序策略。骨髓样品处理聚蔗糖Histopaque 1077获得单核细胞。首先,细胞群与CD45负面纯化⁺/ CD34⁺分数。然后,CD146⁺细胞的选择和进一步扩大,最终确认CD45的纯度^{- /}CD34^{- - - - - -}/ CD146⁺结合流式细胞术和免疫细胞化学(105年)。骨髓可以生长在周围的周α-MEM基础培养基补充20%的边后卫(105年,125年)。

8.5。肾脏

肾周是必不可少的在调节渗透率、myofibroblasts的形成,血管生成和肾髓血流量(126年- - - - - -128年)。组织使用胶原酶消化后的鸡尾酒(IA、二世和IV),细胞FACSorted获得CD146人口⁺/ CD34^{- - - - - -}/ CD45^{- - - - - -}/ CD56^{- - - - - -}周,也表达了古典制造商PDGFRβ和喜欢的《忍者外传2》。文化扩张gelatin-coated盘子上执行(108年,128年,129年)。

8.6。肺

人类的肺外膜细胞隔离的方法包括酶消化、磁microbead排序和流式细胞仪选择(109年,130年- - - - - -132年)。然后,细胞收集CD45排序^{- - - - - -}/ CD31^{- - - - - -}/ CD326^{- - - - - -}/ PDGFRβ⁺分数(109年,130年)。此外,Kramann等人孤立肺周使用一个选择中包含AY16 (anti-Trop2单克隆抗体)-DT3C共轭消除上皮干细胞和内皮细胞(131年)。修改后的媒介选择细胞表达PDGFRβ和硫酸软骨素蛋白聚糖4 (CSPG4)。

8.7。皮肤

周从新生儿包皮分离或成年女性乳房皮肤(133年)。与II型胶原酶消化后或dispase (134年),一个VLA-1^展望/ CD45^{- - - - - -}人口按流式细胞仪或immunomagnetic配(微112年,133年,135年)。此外,皮肤的周表达人类高分子weight-melanoma-associated抗原(HMW-MAA) PDGFRβ,肌间线蛋白,αSMA,α1β1-integrin,α-γ-actin亚型,和肌凝蛋白(136年)。

8.8。脐带

人类脐带的周可以被酶消化和孤立的外植体培养(31日)。Helmbold等人执行immunomagnetic排序使用配以微CD146-conjugated CD146分离的细胞⁺人口(137年)。由外植体培养Cathery等人孤立的周。迁移后的细胞进行了immunomagnetic排序和CD31^{- /}喜欢的《忍者外传2》⁺人口收购(31日)。所有的孤立的种群显示特征- CD34的表达,和积极CD146的表达,喜欢的《忍者外传2》。

8.9。视网膜

从色素层分离后,通过酶解离人类视网膜的周是孤立的。细胞正在播种gelatin-precoated菜肴和培养DMEM / F-12包含的边后卫。视网膜的形态学特征对识别到喜欢的《忍者外传2》immunofluorescent染色,αSMA,胶质原纤维酸性蛋白和细胞骨架结构蛋白(138年,139年)。

9。从动物组织周围的周的隔离和扩张

尽管人类细胞构成最终产品对病人治疗,动物细胞代表一个合适的代理在临床前安全性和有效性研究(140年)。使用捐赠者和接受者来自同一物种,理想情况下相同的垃圾,而不是需要不需要免疫抑制,当人类细胞移植到动物模型(33)。最近的技术进步使swine-derived细胞、组织和器官对immune-compatible异种移植的吸引力。转基因细胞的免疫原性的因素。人类转基因可以表达抑制排斥反应(141年)。

缺乏一致性在细胞制造人类和动物物种之间可能会影响临床结果的解释和可译性。因此,健壮的方法隔离、文化扩张,表征和适当的在活的有机体内测试对在更大的动物是至关重要的。

9.1。协议隔离和扩张

动物主要细胞可能招致细菌或真菌污染,因为穷人的无菌条件用于收集原始材料。因此,使用抗生素和两性霉素B和操纵细胞层流柜是保持无菌的基础条件和避免相互传染扩散的细胞。一个精确的选择合适的培养基,GFs、血清的百分比,板涂层是模拟的关键在活的有机体内环境,允许足够的扩张(142年)。重大变化可能需要引入适应协议最初发明了对人类的周。例如,猪生长在周围的周自体或同种异体血清显示100%成功的扩张和高倍增时间与标准相比异基因的的边后卫用于人类的周(的增长12,32,33)。

10。周皮细胞由万能干细胞生成

诱导多能干细胞(iPSC)派生通过重编程体细胞多能性因素(OCT3/4 SOX2,原癌基因,KLF4)可以分化为特定细胞系,包括周。3 d-culture系统iPSC-derived心血管细胞提供了一个小说在体外模型来研究不同细胞类型间的相互作用和潜在开发新的个性化治疗先天性和获得心脏疾病(116年,143年- - - - - -145年)。

心脏的发育起源的周被认为是心外膜。心外膜细胞分化的细胞则可通过Wnt /β-catenin信号的调制和外膜细胞生长因子治疗,如PDGF-BB (144年,146年,147年)。问题等人应用中胚层诱导使用BMP4 VEGFA和激活Wnt /β-catenin信号进一步VEGFA和TGFβ抑制。流式细胞仪染色和排序PDGFRβ和CD31标记抗原特征和进一步扩张,基因表达和功能在一个内皮管形成试验。tri-cultured生物人工心脏组织模型使用iPSC-derived生成的周,心肌细胞和ECs研究血管化和纤维化在体外(145年)。Faal等人报道两个协议使用中胚层和神经嵴获得大脑的周细胞则来自健康受试者和阿尔茨海默氏症患者。简而言之,人类则是培养在Matrigel-coated板中胚层诱导培养基中生长因子。激活Wnt /β-catenin信号启动神经嵴分化通过特定的媒介和补充。中胚层和神经嵴细胞分化的周播种在明胶或Matrigel-coated板。周皮细胞类型都是通道、分裂和保存在周皮细胞介质的特性和功能与ECs trans-endothelial电阻测定(146年)。Jamieson生成等人从人类周围的周细胞则来自中胚层的血统。简而言之,则是支线层小鼠胚胎成纤维细胞培养,gelatin-coated盘子。分化的细胞则被分离与EDTA,紧张,和播种collagen-coated板使用α-MEM的边后卫,β-mercaptoethanol。进一步分离后,他们生长在EC生长介质,TGFβ抑制剂,VEGF促进血管细胞规范和扩散。酶解离后,DMEM +的边后卫被添加到一个裸板支持周皮细胞的选择。生成iPSC-derived周被用于开发一个微脉管的血脑屏障模型(148年)。

11。标准化和协调

已经表明,少于三分之一的生物医学论文也可以复制,导致每个在美国约280亿美元的相关费用,主要归因于浪费的后续工作,最初的研究激发了(149年,150年)。重现性结果同行评议的论文由制药公司的研究人员失败的利率高达75% (151年)。这反映了不一致的使用和通信标准化流程的实现效率,质量和一致性的性能。信息的主体对方法论可以从原始论文检索,这显示出较大的变异性有关细节的深度。致力于以下段落建议改善当前的方法。

11.1。越来越多的再现性

强烈建议整个SOP发表一篇材料或同伴纸和沉积在一个可访问的数据库(152年)。开放获取公共存储库,如Zenodo、¹寻求(153年)、OpenAIRE²fairshare³可用于SOP提交。

我们之前报道的人类外膜的SOP GMP生产的周,包括:(i)细胞分离,(2)(3)细胞分裂,细胞扩张(iv)细胞冷冻/解冻,(v)提取血清血。每个部分包含一个清单6 - 44的操作步骤,命名操作符(154年)。附加文档集合的细节报告,同事的代码示例NHS病人的记录和知情同意形式和伦理批准,代码和试剂的储存条件,设备,和偏离协议。电子副本存储在一个专用的文件夹的服务器在布里斯托尔大学的制度。

11.2。升级

GMP生产质量保证体系制药公司使用,以确保最终的药用产品符合适当的规范。GMP涵盖了最终产品的制造和测试。翻译的GMP概念细胞治疗和组织工程仍然是模糊的,这主要是因为大多数细胞产品早期原型研究学术实验室(155年)。我们所知,我们先前的研究仍然是唯一一个人类外膜对GMP(升级154年)。我们验证clinical-grade, xeno-free试剂如research-grade的工作。然后,整个生产过程转移到GMP设备在NHS血液和移植(NHSBT)单位在布里斯托尔。NHSBT人体组织授权的权威(HTA)和药物和保健产品监管署(MHRA)制造先进的细胞疗法治疗产品试验。

11.3。质量控制

引入质量和数量控制(QQc)系统生产的周提供了两个重要的改进。也就是,它减少了生产成本和产品认证的细胞。我们只处理样品超过最小重量。使用这个量控制标准,我们计算成本节约33%由于避免扩张失败。

细胞数量和质量控制分析包括可行性/死亡测试由钙黄绿素/ EDthIII化验和台盼蓝,重复使用正面和负面标记抗原特征排除污染物细胞出现在扩张,核型分析,确保细胞不会积累chromosomic损伤和功能描述(33,75年)。在使用最广泛的测试中,基底膜基质试验证明了周的改善ECs network-forming活动的能力,而测量血管生成因子在媒体上允许识别的周的能力释放典型血管生成因素,如肝细胞生长因子(HGF)和检验2 (Ang-2) (32)。更复杂的测试协助周的特征包括评估使用电气细胞收缩和舒张直观感知通性平台,通过分析膜屏障的完整性,使用ECs的培养渗透和周Transwell过滤器和微流体模型,mechano-transduction属性和昼夜节律调节周之间的串扰和内皮细胞(32,55,156年- - - - - -159年)。

11.4。集成方法

上面描述的所有派生技术优缺点。适当的组合可以提高产品的纯度和收率。例如,重复immunomagnetic分离可以帮助维持一个高纯度水平在扩张。当需要大规模生产的周,使用Multi-Flasks提供了一个最佳的细胞培养环境,简化了工作流通过消除多个步骤,减少污染的风险。一步,自动化的周皮细胞培养系统可以提供高吞吐量、高纯度、高产细胞生长,进行大规模的筛选,并运行几个平行实验,从而允许减少inter-assay可变性。

另一个吸引人的方法是基于使用multi-omics。强有力的技术,如单细胞RNAseq已经应用于外膜细胞的研究,提供一个空间图谱不同器官的血管利基,并揭示瀑特异性外膜细胞标记和身份(88年,160年,161年)。在大脑中,连续表型变化(分层)沿着动静脉轴ECs对壁画细胞被间断连续体叠置。在后者的人口中,周共存人口的纤维母细胞局部血管周的船类型除了毛细血管(88年)。在心脏,大规模的单细胞和single-nucleus转录组分析确定6解剖区域(162年)。ECs的血管隔间包括17个不同的人群,VSMC的周,间皮的细胞。4周形成集群,其中一个是转录远离其他血管细胞,而另一个构成之间的过渡状态的周和ECs。这个新的sub-classification应该验证的相关性在functionome的水平。多功能microwell数组,使单细胞功能分析已经被用于研究淋巴细胞(163年)。Live-cell成像和分析了细胞转变动力学不能被经典快照成像(164年)。其他新兴单细胞方法承诺定义细胞异质性的蛋白质和DNA表观遗传学水平(165年)。

12。结论

本文强调了重大努力由不同的团队开发有效的隔离和协议在体外人类对周的扩张。这些协议和共识的集成方法将有助于加快研究最高水平的再现性和可译性。此外,进一步的研究是需要解剖的功能多样化的周根据他们的纬向分布和周围的微环境。更多的工作还需要跟踪的周组织中血管重建。扩大和细化不同血管周的利基市场的阿特拉斯在单细胞水平将阐明周的神秘的表型的相关性表现偏差,以应对器官损伤。这部小说技术方法应该被集成到时间和空间的维度,例如,通过动态基因表达谱聚类从单细胞RNA-Sequencing数据库和关联记录functionomics分析。大多数研究已经完成了对啮齿动物模型。在大型动物模型需要更多的研究来证明治疗效用。

数据可用性声明

最初的贡献在这项研究中都包含在本文展示/补充材料,进一步调查可以针对相应的作者。

作者的贡献

点负责最后的写作和提交的数据。本文所有作者的构思和设计,阅读,和批准最终的手稿。

资金

这项工作是(i)的赠款支持英国心脏基金会(PG / 22 / / 10843,健康长寿基因转移到改善老年性心脏功能障碍),(2)中国高等教育的博士奖学金阿拉伯埃及共和国(MM24/21,外膜细胞组织工程预防动脉瘤开发和破裂),(3)英国心脏基金会奖学金(FS / 16/64/32480,推导的猪就对临床翻译),启用一击中的,(iv)英国心脏基金会(格兰特PG / 19/49/34440,小说外膜细胞机制涉及转录激活Nrf2),和英国(v)心脏研究转化项目授予“针对周停止与先天性心脏病肺动脉高压在婴儿”(RG2697/21/23)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是进行没有任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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脚注

引用

1。Attwell D, Mishra,大厅CN,奥法雷尔调频,Dalkara t外膜细胞是什么?J Cereb血流金属底座。(2016)36:451-5。doi: 10.1177 / 0271678 x15610340