原始研究的文章

前面。Cardiovasc。地中海,2023年1月10日
秒。高血压
卷9 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.1066047

SUR2 / Kir6.1通道参与肺动脉高血压的生理病理学

海琳Le Ribeuz^1、2,

Bastien马森 ^1、2,

玛丽Dutheil^1、2、3,

安吉拉Boet ^1、2,

安东尼·博韦 ^1、2,

杰西卡Sabourin ⁴,

文森特·托马斯·德·Montpreville⁵,

薇罗尼卡Capuano^1、2、3,

奥拉夫Mercier ⁶,

马克·亨伯特^1、2、7,

大卫Montani ^1、2、7和

法布里斯Antigny ^{1、2 *}

¹将进医学院学习,大学Paris-Saclay法国-比塞特尔勒
²INSERM UMR_S 999年«高血压Pulmonaire Physiopathologie等创新Therapeutique»,友谊医院玛丽Lannelongue, Le Plessis-Robinson法国
³Hoptal玛丽Lannelongue,罗宾逊Le Plessis)、法国巴黎圣约瑟夫医院集团
⁴Inserm UMR-S 1180信号通知等Physiopathologie Cardiovasculaire,大学Paris-Saclay,法国奥赛
⁵病理学系Hoptal玛丽Lannelongue, Le Plessis-Robinson、法国巴黎圣约瑟夫医院集团
⁶服务de Chirurgie Thoracique, Vasculaire等移植Cardio-Pulmonaire,友谊医院玛丽•Lannelongue Groupe医院巴黎圣约瑟夫,Le Plessis)罗宾逊,法国
⁷援助巴黎Publique-Hopitaux (AP-HP)、服务de Pneumologie et参与Intensifs Respiratoires,中心de参考de l 'Hypertension Pulmonaire,友谊医院Bicetre,法国-比塞特尔勒

目的:我们假设ATP-sensitive K⁺通道()诱导调节亚基(ABCC9)有助于PAH发病机理。ABCC9atp敏感性钾通道基因编码两个调节亚基:SUR2A和SUR2B蛋白质。在诱导通道,SUR2子单元相关的K⁺Kir6.1频道。我们研究了如何SUR2 / Kir6.1通道有助于PAH发病机理和其潜在的治疗目标在多环芳烃。

方法和结果:使用在体外,体外,在活的有机体内方法,我们分析了SUR2A的定位和表达,SUR2B, Kir6.1肺脉管系统的控制和PAH患者在实验性肺动脉高压(PH)大鼠模型对多环芳烃生理病理学及其贡献。最后,我们破译的后果在活的有机体内激活SUR2 / Kir6.1野百合碱(MCT)全身的PH值模型。我们发现SUR2A、SUR2B Kir6.1表示在控制和PAH患者的肺和MCT-induced PH值大鼠模型。器官浴研究表明,由pinacidil SUR2激活诱导肺动脉在老鼠和人类的放松。在体外实验对人类肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞(hPASMCs和hPAECs)控制和PAH患者显示减少SUR2激活后细胞增殖和迁移。我们证明SUR2激活大鼠右心室(RV)心肌细胞减少了膜片钳的房车动作电位持续时间。慢性pinacidil政府控制老鼠增加心率没有血流动力学参数的变化。最后,在活的有机体内药理激活SUR2 MCT和Chronic-hypoxia (CH) -induced-PH老鼠表现出改善的PH值。

结论:我们发现SUR2A、SUR2B Kir6.1介绍hPASMCs hPAECs控制和PAH患者。在活的有机体内SUR2激活减少MCT-induced CH-induced PH表型,说明SUR2激活应该考虑治疗多环芳烃。

1。介绍

肺动脉高压(PAH)是一种严重而复杂的疾病,定义为海拔> 20毫米汞柱平均肺动脉(PA)压力,肺血管阻力(PVR) > 2木单位休息,和PA楔形≤15毫米汞柱压力(1)。多环芳烃是一个复杂和多因子疾病相关联的缩小远PA(直径< 500μm),导致右心室(RV)肥大和失败,并最终死亡(2)。在过去的二十年里,超过20个基因已经被鉴定与多环芳烃的遗传易感性,包括两个钾离子通道基因编码的蛋白质:KCNK3(钾两个孔隙域通道亚K 3)成员ABCC8(腺苷盒式亚C成员8)(3- - - - - -5)。2018年,Bohnen等人确定12损失函数(LOF)的突变ABCC8(5)。ABCC8SUR1蛋白质编码,ATP-sensitive-K的调节亚基⁺渠道(敏感)。ABCC8突变携带者比那些年轻的在诊断特发性多环芳烃(中位年龄在14年比42年)诊断(5)。

四个Kir6。x是诱导通道(Kir6.1或Kir6.2)和四磺酰脲类受体亚基(SUR1或者SUR2A SUR2B,取决于细胞类型)(6)。通过减少胞质通道被激活ATP浓度诱导或海拔nucleotide-diphosphate浓度(7)。经典,SUR1 / Kir6.2通道描述构成了胰腺诱导。然而,我们曾表明SUR1 / Kir6.2表示在肺循环和SUR1激活可能是多环芳烃的治疗目标(8)。SUR2,编码的ABCC9基因,可以拼接成两个亚型:SUR2A或SUR2B。SUR2A / Kir6.2通道通常被认为是心脏,诱导而SUR2B / Kir6.2和SUR2A / Kir6.1通常血管诱导通道(7)。

先前研究中使用的药理SUR1催化剂也可以弱激活SUR2,作为SUR2B的成绩单和Kir6.1以前观察到hPASMCs和大鼠肺动脉(9)。此外,选择性SUR2活化剂,pinacidil诱导肺动脉放松(10),无选择性诱导通道揭幕战iptakalim抑制扩散控制hPASMCs (11)。此外,以前的工作表明全球通道首场比赛nicorandil或诱导iptakalim PH值减少的严重程度的预防方法(12- - - - - -14)。我们假设SUR2和Kir6.1可以额外的演员在肺循环和PAH发病机理。我们调查了本地化、表达式和函数SUR2A, SUR2B,和Kir6.1控制,PAH-human肺动脉内皮细胞(hPAECs),和人类肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs)和肺动脉高压(PH)的实验模型。我们评估的后果SUR2 / Kir6.1通道激活增殖率和迁移的hPASMCs hPAECs。我们评估的角色SUR2 / Kir6.1通道在肺动脉语气使用肌动描记器实验孤立PA从控制老鼠和野百合碱(MCT)全身的PH值(MCT-PH)大鼠模型。此外,我们评估了药理效应的激活与pinacidil SUR2健康老鼠和临床前PH值大鼠模型(MCT和chronic-hypoxia老鼠)在治疗协议1毫克/公斤/天。

2。材料和方法

2.1。病人

人类得到了肺组织肺移植患者在12多环芳烃和肺癌肺切除术或叶切除术限制从10对照组。不是被孤立的地区远离肿瘤对照组的肺标本。经胸廓的超声心动图进行手术对照组排除PH值(15)。提出了多环芳烃和控制病人的人口统计信息补充表1。

病人研究肺动脉高压是法国网络的一部分,计划我们的制度伦理委员会批准,签署了知情同意表格(RCB协议N8CO-08 - 003、ID: 2008 - a00485 - 50,批准在6月18日,2008)。所有人类组织签署了知情同意从移植受者或器官捐献者家属按照《赫尔辛基宣言》。

2.2。人类PASMC PAEC文化

肺动脉外被切除肿瘤区域。hPAECs和hPASMCs培养如前所述(16,17),用于研究文章4 - 5。病人研究机构伦理委员会批准的程序的一部分,并给出书面知情同意(ID RCB: 2018 - a01252 53岁,6月18日批准,2006年)。

2.3。肺血管细胞增殖测定

细胞增殖是由量化评估的使用DELFIA BrdU细胞增殖工具包(AD0200 PerkinElmer)相应装备的建议。不同的治疗方法被用来评估细胞的增殖状态:hPASMCs和hPAECs控制和多环芳烃受试者治疗24小时与pinacidil(10μmol / L)或相同数量的DMSO溶液。细胞增殖是由中含有10%的边后卫+ EGF刺激+胰岛素的存在1μmol / L BrdU 24 h(珀金埃尔默)。96孔板的荧光信号读取读者想象2103板(珀金埃尔默)。

2.4。动物和外科手术

动物设施由法国农业部许可协议(N°c92 - 019 - 01)。本研究通过动物实验的伦理委员会(CEEA26帽Sud)。动物实验研究符合欧盟指导方针从指令2010/63 / 2010年9月22日欧洲议会的保护动物用于科学目的和遵守法国机构的动物保健和处理指南。

在活的有机体内实验研究进行中执行根据临床试验标准:动物被随机分散的团体之间,我们进行盲法分析。所有老鼠收到了数只被实验者管理治疗大鼠。安乐死(21)天之前,所有老鼠进行了评价与closed-chest右心导管术。这个实验是由一位失明实验者不知道之间的对应关系ID和治疗。盲目血流动力学参数进行了分析。

雄性Wistar鼠(4周)被用于不同的实验程序:

1。PH值是由一个特定诱导注射(60毫克/公斤,南卡罗来纳州。)。未经中华人民共和国交通部盐酸溶解在1 N和N氢氧化钠中和1。控制动物收到同样体积的生理盐水。

2。与pinacidil Pinacidil-exposed老鼠:Wistar鼠治疗(1毫克/公斤/天在DMSO,每日腹腔内注射)从第0天到21天。Pinacidil在DMSO溶液溶解。控制动物收到相同的DMSO溶液的体积。

3所示。与pinacidil MCT-exposed Wistar鼠治疗腹腔内注射(1毫克/公斤/天溶解在DMSO)从天14到21岁,从天0天21长期协议。Pinacidil在DMSO溶液溶解。控制动物收到相同的DMSO溶液的体积。

2.5。麻醉和安乐死

老鼠被放置在全身麻醉下(在室内空气感应:异氟烷5%)和自主呼吸异氟烷啮齿动物麻醉系统(Minerve Esternay,法国)在室内空气(维护:异氟烷2%)。在实验过程结束时,动物安乐死在全身麻醉下颈椎脱位(5%异氟烷)。

2.6。化学物质

未经中华人民共和国交通部和pinacidil获得σ。U46619得到从研发系统。

2.7。免疫印迹分析

总蛋白从人类或鼠肺孤立PA组织样本准备如前所述(8)。给出了所用抗体的列表补充表2。

2.8。反向transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)

使用试剂盒提取总RNA。总RNAμg之一是使用QuantiTect reverse-transcribed逆转录工具包(试剂盒,瓦伦西亚、钙、美国;猫。不。205311)。基因表达是使用qPCR量化标准协议后对即食TaqMan StepOne +实时PCR系统基因表达分析(技术)。预先设计探针集用于实验中所描述的补充表3。

2.9。血流动力学测量和组织收集

在全身麻醉下(2%异氟烷在室内空气)等血流动力学测量右心室收缩压(RVSP;毫米汞柱)、心输出量(CO);毫升/分钟)、平均动脉压(mCP;毫米汞柱),测定盲目地在不通风的麻醉大鼠使用一个封闭的胸部技术。盲目的血流动力学参数进行了分析。

导管插入后,动物安乐死在全身麻醉下颈椎脱位(5%异氟烷)。然后组织收集,富尔顿的索引(RV / LV + S)计算了考虑房车和LV +隔(S)。

2.10。成年大鼠右心室细胞隔离

心从控制老鼠装在Langendorff装置和通过主动脉灌注胶原酶(罗氏,Meylan法国)。解决方案用于分离细胞Hanks-Hepes缓冲溶液包含(毫米):氯化钠,117;氯化钾,5.7;MgCl2 1.7;KH2PO4 1.5;NaHCO3 4.4;消息灵通的,21;葡萄糖,11.7;肌酸,10;牛磺酸、20; bubbled with 100% O2; pH 7-1. Digestion time varied between 40 and 50 min. After the enzymatic digestion, the right ventricles (RV) were excised, chopped finely, and agitated manually to dissociate individual myocytes.

2.11。电生理记录

硼硅玻璃吸量管(哈佛装置)把萨特拉出器,解雇了抛光,1 - 2 MΩ之间的电阻。串联电阻补偿高达50%,期间不断监测实验。标准细胞外液的成分用于记录APs(毫米):氯化钠,140;氯化钾,4;氯化钙,1.8;MgCl2 1.1;消息灵通的,10;葡萄糖,10;pH值7.4 (LiOH)。APs记录时,吸管的解决方案包含(毫米):氯化钾,135; MgCl2, 4; Ethylene glycol-bis (2-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA), 10; Glucose 10; HEPES, 10; Na2-ATP 5; Na2-CP 3, pH 7.2 (LiOH). In a current-clamp configuration, action potential was measured in response to brief depolarizing current (1–2 ms) injections at 1 Hz as described (18)。

2.12。肌动描记器实验

人类,老鼠,和降主动脉被安装在一个emkaBATH4模块化组织浴系统(EMKA技术,法国巴黎)耦合IOX软件(EMKA技术)。人类不是被平衡设定在最佳长度对被动荷载为0.6 g。老鼠不是设定在0.250 g和主动脉1 g。

船只被沐浴在柠檬酸溶液包含(119年更易/ L)氯化钠,氯化钾的4.7,2.5 CaCl₂1.17 MgSO₄1.18 KH₂阿宝₄25 NaHCO₃,和11个葡萄糖在37°C和不断充气的有限公司₂/ O₂(5% / 95%)。老鼠不是被平衡设定在最佳长度对被动荷载为0.3 g。添加柠檬酸溶液之后,血管收缩了100更易与L K⁺包含解决方案(K100)。高原了,一次30分钟的船只与柠檬酸清洗解决方案。Pinacidil(10μmol / L)或同样体积的车辆(DMSO)作为预处理前的剂量反应氯化钾(10 - 90更易/ L)。血管收缩后的血栓素A2模拟U46619(1μmol / L) pinacidil被用来诱导放松通过增加浓度(100μmol nmol / L / L)。各种氯化钾浓度(K100 K10)准备的克分子数相等的替代生理盐水维持恒定的渗透性和(Cl^{- - - - - -}]相对于标准克雷布斯的解决方案。收缩反应被规范化的最大响应获得K100挑战。放松反应表示为最大的百分比与U46619收缩了。

2.13。超声心动图测量

Trans-thoracic超声心动图(TTE)进行了数字超声系统使用高频(生动的E9,通用电气医疗集团)相控阵换能器(12瓣的4 - 12 MHz,通用电气医疗集团)。超声心动图评估是在全身麻醉下进行自主呼吸和异氟烷啮齿动物麻醉系统(Minerve、Esternay、法国)在室内空气维护异氟烷(2%)。老鼠剃,体温控制在实验。老鼠的实验条件是未知的运营商在TTE检查和数据解释。测量肺动脉加速时间(非洲锥虫病)、心率(HR)和肺动脉速度时间积分(VTI)如前所述执行(18)。4-cavity视图中执行,我们测量房车和LV厚度、房车或LV舒张末期直径(分别房车EDd、LV EDd)和收缩直径(RV EDs, LV EDs)。房车和LV部分缩短(FS)对应于LV和房车腔直径的百分比变化。LV FS (%) = (LV EDd-LV EDs / LV EDd) * 100或房车FS (%) = (RV EDd房车EDs / RV EDd) * 100。

2.14。免疫荧光染色

石蜡包埋的厚部分肺样本(5μm厚度)被安装在SuperFrostPlus幻灯片(热科学、Villebon苏尔伊薇特、法国)。片在PBS饱和与人类血清(10%)在室温下1 h。我们使用初级抗体SUR2A (1/100), SUR2B(1/100),或Kir6.1(1/100)对α-Smooth肌肉肌动蛋白(σ,α-SMA F3777) (1/200)。主要与二次抗体抗体检测山羊anti-mouse和山羊anti-rabbit (1/400)。幻灯片是复染色4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。

肺血管评估了新血管形成疣状对alpha-SMA-FITC (SMC标记F3777σ)/血管性血友病因子(内皮标记,A0082 DAKO)。疣是量化LSM 700显微镜下(卡尔蔡司、Le Pecq、法国)。图像记录和分析与禅宗软件(卡尔蔡司)。

2.15。伤口愈合实验

经过48小时的饥饿(中没有生长因子:的边后卫,EGF和胰岛素),人类文化PASMCs镀在插入(猫。90209号;Ibidi)的密度1.2×10⁴细胞每在一个全新的媒介与阿糖胞苷(10μmol / L)。允许细胞连接24 h后,我们把文化插入和洗与磷酸盐去除non-adherent细胞的细胞。我们添加了新的媒介和DMSO pinacidil(10μmol / L)。我们拍摄的伤口在时间0到15 h hPASMCs介于0和8 h hPAECs(相应的大约50%的伤口恢复)。细胞迁移到伤口空间量化使用图像j .细胞运动性/入侵是评估的比例开始后伤口愈合的伤口关闭15 h{((区域T0-area T15)÷区域T15)×100}。

2.16。肺血管和右心室重构分析

肺在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,连续切片(5μm)。肺血管重构的肺血管大于50μm少于100μm确定每个组织切片在20个随机选择的微观领域。壁厚计算根据以下方程:[外部diameter-Internal直径)/(外径)×100,(如前所述)(19)。

心在4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片(5μm)。核心部分是沾小天狼星红(0.1%)来评估心脏纤维化。如前所述,房车纤维化是量化使用图像J软件(20.)。

2.17。统计分析

所有统计测试进行使用GraphPad棱镜软件(GraphPad, 9.0版本的Windows)。

Kolmogorov-Smirnov与Shapiro-Wilk检查后,达和皮尔森测试和Anderson-Darling测试正常测试样本数据是否遵循正态分布,两者之间的差异进行评估使用一个未配对t以及或Mann-Whitney测试条件参数测试不满足的时候。克鲁斯卡尔-沃利斯测试因果邓恩被用来比较三个或更多组(所有数据样本的大小n< 6 /组和倾斜的数据与样本容量n≥6 /组)或与Dunnett单向方差分析因果测试与样本正态分布数据n≥6 /组。所有值的平均值±标准错误报告的意思。代表图像/数据被选出来代表每个量化的意思。对所有实验,P -< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。SUR2 / Kir6.1通道表达在PAH患者的肺

检查定位和SUR2A的表达,SUR2B,在控制和PAH患者Kir6.1,石蜡包埋肺部分控制和PAH患者应用(图1一个)。SUR2A在两种情况下,SUR2B, Kir6.1表达hPAECs(蓝色箭头)和hPASMCs与平滑肌肌动蛋白(黄色箭头,colocalization同种型α(αSMA,绿色)]。随后我们量化的相对数量ABCC9和KCNJ8(Kir6.1编码)的mRNA水平控制和PAH患者,这表明ABCC9和KCNJ8信使rna水平持平在肺部的PAH患者(图1 b)。我们使用蛋白质免疫印迹分析执行控制和PAH患者确定SUR2A的相对数量,SUR2B, Kir6.1肺部组织。我们发现了类似的表达式SUR2A, SUR2B, Kir6.1蛋白质在PAH患者的肺组织和控制(图1 c)。

图1

图1所示。表达SUR2A、SUR2B Kir6.1蛋白质控制和PAH患者的肺。(一)SUR2A、SUR2B或Kir6.1疣状石蜡包埋肺部分的控制和PAH患者;PAEC(蓝色箭头)和PASMC(黄色箭头)染色是可见的。规模50μm酒吧。信使rna表达和代表西方滴ABCC9(编码SUR2A和SUR2B)和KCNJ8(Kir6.1编码)在肺部的控制和PAH患者((B, C)分别为(n= 9 - 12)。ns:非标准与控制。双尾未配对的学生t测试评估两组之间的差异。

3.2。药理的激活SUR2 / Kir6.1通道减少control-hPAECs扩散

免疫染色显示SUR2A的表达、SUR2B Kir6.1 hPAECs。用免疫印迹分析,我们在主hPAECs量化它们的相对表现。所示图2一个、SUR2A SUR2B, Kir6.1蛋白质控制和PAH-hPAECs表示。control-hPAECs相比,SUR2A和SUR2B蛋白质的表达是不变,和Kir6.1 PAH-hPAECs蛋白表达增加(图2 b)。因此,我们评估的角色的扩散和迁移SUR2 hPAECs SUR2 pinacidil(药理激活后21,22)(10μmol / L) 24 h。我们选用pinacidil SUR2作为活化剂,因为与其他渠道,诱导pinacidil激活SUR2B和SUR2A同样(23SUR1)和亲和力很低(24)。有趣的是,药物激活SUR2减少control-hPAECs的增殖率没有改变PAH-hPAECs扩散(图2 c, D)。SUR2 pinacidil没有激活的结果在hPAECs的迁移能力控制和PAH-hPAECs (图2 e, F)。

图2

图2。药理激活SUR2 / Kir6.1通道减少了扩散控制hPAECs。(一)代表西方滴SUR2A SUR2B, Kir6.1 hPAECs控制和PAH患者的肺部。(B)量化的SUR2A、SUR2B Kir6.1表达式hPAECs从控制和PAH患者(n= 4 - 6)。(C, D)分析溴脱氧尿苷(BrdU)测定hPAECs的增殖率控制和PAH患者接受pinacidil(10μmol / L)或DMSO (n= 4 - 5例)。(E, F)分析hPAECs的迁徙能力控制和PAH患者接受pinacidil(10μmol / L)或DMSO溶液。比例尺= 500μm (n= 5 - 7例)。ns:非标准。*p<0.05。双尾未配对的学生t测试评估两组之间的差异。

3.3。药理激活SUR2 / Kir6.1通道控制的增殖和迁移,减少PAH-hPASMCs PAH患者和生产PA放松

我们发现SUR2A、SUR2B Kir6.1蛋白质表达的控制——PAH-hPASMCs (图3一)。在PAH-hPASMCs SUR2A蛋白质高于控制。进一步,PAH-hPASMCs SUR2B表达式也倾向于增加,尽管并没有显著增加(p= 0.053)。Kir6.1蛋白表达在PAH-hPASMCs持平(图3 a, B)。药理激活SUR2减少hPASMCs同样的增殖率控制和PAH-hPASMCs (图3 c, D)。SUR2 pinacidil减少迁移能力激活的control-hPASMCs但不是PAH-hPASMCs (图3情况)。

图3

图3。药理激活SUR2 / Kir6.1通道减少控制和PAH-hPASMCs的增殖和迁移。(一)代表西方的屁股(一)和量化(B)SUR2A, SUR2B, Kir6.1 hPASMCs从控制和PAH患者(n= 5)。分析BrdU化验hPASMCs的增殖率控制的病人(C)和PAH患者(D)对待pinacidil(10μmol / L)或DMSO (n= 6 - 7例)。(E, F)分析hPASMCs的迁徙能力控制(E)和PAH患者(F)对待pinacidil(10μmol / L)或DMSO (n= 5 - 6例)。酒吧= 500μm规模。(G)剂量反应pinacidil (100 nmol / L到100μmol / L)和DMSO人类PA控制和iPAH合同(H)1μmol U46619 / L。图形代表放松30μmol百分比/ L PA pinacidil处理或DMSO (n= 6例)。ns:非标准。*p<0.05^{* *}p<0.001。

我们测量的结果SUR2激活在控制和考评的放松PAH患者(图3 g)。我们发现pinacidil诱发更强的PA放松控制的多环芳烃条件,表明SUR2有助于人类PA基调的规定,但SUR2-mediated PA放松减少PAH患者。

3.4。SUR2药理激活生产PA的放松控制和MCT-PH老鼠

我们显示的mRNA水平ABCC9减少肺部MCT-PH老鼠,而KCNJ8信使rna保持不变(图4 a, B)。此外,SUR2A表达严重减少,SUR2B表情不变,Kir6.1 MCT-PH老鼠的肺表达增加(图4 c, D)。

图4

图4。药理激活SUR2生产PA放松控制和MCT-PH老鼠。(A, B)ABCC9和KCNJ8信使rna表达量化控制和MCT-PH老鼠的肺n= 4 - 6)。(C)代表西方滴SUR2A、SUR2B Kir6.1从控制和肺MCT-PH老鼠(3周)。(D)量化的SUR2A、SUR2B Kir6.1表达式在肺部的控制和MCT-PH鼠(n= 4 - 6)。(E)剂量反应曲线(K100规范化)建立了氯化钾浓度增加(氯化钾)孤立PA从控制老鼠在DMSO溶液的存在或pinacidil (SUR2活化剂,在10μmol / L)。相应的量化EC50值(n= 5大鼠)。(F)剂量反应曲线(K100规范化)建立了氯化钾浓度增加从控制和孤立的PA MCT-PH老鼠的pinacidilμmol 10点/ L。相应的量化EC50值(n= 4老鼠)。(G)剂量反应pinacidil (100 nmol / L到100μmol / L)和DMSO预约控制老鼠PA 1μmol U46619 / L。图形表示收缩比例在10μmol / L PA pinacidil处理或DMSO (n= 5 - 9老鼠)。(H)剂量反应pinacidil (100 nmol / L到100μmol / L)和DMSO合同MCT-PH鼠PA 1μmol U46619 / L (n= 4 - 5老鼠)。图形表示收缩比例在10μmol / L PA pinacidil处理或DMSO溶液。ns:非标准。*p<0.05,^{* *}p<0.01,^{* * * *}p<0.0001。

接下来,我们调查的结果SUR2激活的PA的收缩和放松管制和MCT-PH老鼠。控制的收缩反应氯化钾浓度的增加(氯化钾,10到90更易/ L)转移明显向右pinacidil (图4 e),如所示增加EC50值(图4 e)。在PA隔绝MCT-PH老鼠,我们发现pinacidil应用程序类似的结果在PA诱导控制大鼠(图4 f和补充图1)。

PA 1μmol / L U46619 pre-contraction后,我们申请增加浓度pinacidil或二甲亚砜(DMSO) (100 nmol / L到100μmol / L)。所示图4 g控制,PA的收缩是逐渐减少剂量的增加pinacidil(直到几乎完全PA放松)增加剂量的DMSO溶液相比,表明SUR2 activation-mediated放松PA被减少了PA收缩(图4 h)。类似的结果在PA隔绝MCT-PH老鼠(图4 f和补充图1)。

SUR2激活诱导更有效放松MCT-PH PA的老鼠比控制,表明pinacidil-mediated PA放松主要取决于SUR2B表达MCT-PH老鼠。相比之下,SUR2A表达式MCT-PH受损的老鼠。

提出了在补充图2一个在缺乏内皮,放松由pinacidil减少40% (补充图2一个),这表明endothelial-SUR2同样会引起肺动脉基调的规定。

3.5。表达SUR2A、SUR2B Kir6.1 MCT-PH老鼠的心

因为SUR2 Kir6.1心中表达,我们量化SUR2和Kir6.1蛋白质的表达RV MCT-PH控制老鼠的免疫印迹分析。与控制的老鼠相比,我们发现一个SUR2A的表达式和一个不变的表情Kir6.1 MCT-PH老鼠。SUR2B蛋白表达RV的不是可以计量的控制和MCT-PH老鼠图5一个)。同时,SUR2B似乎表达了左心室(LV) (补充图3 b)。此外,SUR2A蛋白质减少,SUR2B Kir6.1表达式持平的LV MCT-PH老鼠(补充图3 b)。

图5

图5。后果SUR2 RV舱药理激活(在体外和在活的有机体内)。(一)代表西方滴SUR2A、SUR2B1 Kir6.1房车从控制和MCT-PH老鼠(3周),和量化SUR2A SUR2B, Kir6.1表达RV的控制和MCT-PH老鼠n= 5 - 8)。(B)代表在房车心肌细胞动作电位隔离控制老鼠在DMSO或pinacidil灌注后。分析的动作电位持续时间在50岁和90% AP去极化的基础条件和存在的10μmol / L pinacidil从四个不同的老鼠细胞(12 - 14)。(C)在活的有机体内实验设计。Pinacidil(1毫克/公斤^/一天3周)管理长期健康控制大鼠腹腔内注射。(D)RVSP(毫米汞柱;n= 6 - 8大鼠/条件)。(E)有限公司(毫升/分钟)(n= 6 - 8大鼠/条件)。(F)PVR (n= 5大鼠/条件)(G)富尔顿指数(n= 6 - 8大鼠每条件)(H)和颈动脉平均压力(n= x老鼠)。(我)分析了肺血管闭塞(%)hematoxylin-eosin赛染色(他)(n= 6 - 8大鼠/条件)。(J)non-muscularised和肌层血管[每鼠100艘船,n= 6 - 8老鼠)以对α-smooth肌肉肌动蛋白免疫染色(αSMA)和血管性血友病因子(VWF)。ns:非标准。*p<0.05。

研究的贡献SUR2房车动作电位,我们测量了pinacidil对动作电位持续时间的影响(adp)。pinacidil导致缩短adp的摄入没有静止膜电位的变化(图5 b左面板)。美国在控制房车心肌细胞中,美联社复极化的50%不是SUR2药理活性的影响(图5 b中间面板)。相比之下,美国的90% AP复极化明显下降(图7 b右面板)。

图6

图6。在活的有机体内长期pinacidil治疗干扰MCT-PH发展。(一)在活的有机体内实验设计。Pinacidil 3周(1毫克/公斤/天)在特定管理长期暴露在腹腔内注射。(B)RVSP(毫米汞柱;n= 5 - 10不同的老鼠每条件)(C)、心输出量(CO .);毫升/分钟)(n= 5 - 8不同老鼠每条件)。(D)PVR (RVSP /公司比率计算)(n= 5 - 8不同老鼠每条件)。(E)富尔顿指数(RV / LV +隔)(n= 6不同老鼠每条件)。(F)分析了肺血管闭塞(%)他(n= 3 - 5老鼠每条件)。(G)non-muscularised和肌层血管[每鼠100艘船,n= 4 - 7大鼠)以对α-smooth肌肉肌动蛋白免疫染色(αSMA)和血管性血友病因子(VWF)。(H)间质纤维化与天狼星红染色法分析了RV从控制舱,MCT + DMSO, MCT + pinacidil老鼠。(我)量化房车组织纤维化的百分比的每个条件(n从4 - 5 = 20图片/老鼠不同的老鼠)。ns:非重要,*P< 0.05,^{* *}P< 0.01,^{* * *}P< 0.001,^{* * * *}P< 0.0001。

图7

图7。在活的有机体内治疗pinacidil治疗降低PH值的发展MCT-PH老鼠。(一)在活的有机体内实验设计。Pinacidil(1毫克/公斤/天每天14 - 21)在特定管理短期暴露在腹腔内注射。(B)RVSP(毫米汞柱;n= 4 - 8不同老鼠每条件)(C)、心输出量(CO .);毫升/分钟)(n= 4 - 7不同老鼠每条件)。(D)PVR (RVSP /公司比率计算)(n= 4 - 7不同老鼠每条件)。(E)富尔顿指数(RV / LV +隔)(n每个条件)= 4 - 8不同的老鼠。(F)分析了肺血管闭塞(%)他(n= 3 - 5老鼠每条件)。(G)non-muscularised和肌层血管[每鼠100艘船,n= 6 - 8老鼠)]的疣状αSMA和VWF。(H)间质纤维化被天狼星红染色RV室的控制,未经中华人民共和国交通部+ DMSO, MCT + pinacidil老鼠。(我)量化房车组织纤维化的百分比的每个条件(n从4 - 5 = 20图片/老鼠不同的老鼠)。ns:非重要,*P< 0.05,^{* *}P< 0.01,^{* * *}P< 0.001,^{* * * *}P< 0.0001。

3.6。在活的有机体内药理激活SUR2增加控制大鼠的心率

评估的结果在活的有机体内pinacidil曝光控制老鼠,我们长期暴露健康大鼠1毫克/公斤/ d pinacidil 3周(图5 c)。在活的有机体内慢性暴露于pinacidil没有肺血管的后果,所表示的不变右心室收缩压(RVSP)、心输出量(CO)、肺血管阻力(PVR) (RVSP /公司比率计算),房车肥大(富尔顿指数)、系统性血压(以颈动脉)(图5 d - h)。Pinacidil政府并不影响肺血管重构和neo-muscularization (图5 i, J)。

我们观察到增加心率和减少pinacidil-exposed老鼠的周期长度(表1没有了心脏的形态学变化参数(补充表4),这是按照pinacidil-induced减少美国在房车心肌细胞。PA加速度(非洲锥虫病)和房车射血时间(RVET)减少,而非洲锥虫病防治计划/ RVET比率保持不变(表1)。所有的其他测量参数都不变,包括房车和LV厚度和直径(表1)。

表1

表1。评价右心室和左心室功能的超声心动图测量pinacidil或二甲基sulfoxide-exposed老鼠。

3.7。预防在活的有机体内SUR2药理激活减少MCT-induced PH值的发展

在这项研究中,SUR2激活PAH-hPASMCs的增殖率降低,造成PA MCT-PH老鼠放松。因此,我们评估的后果在活的有机体内药理SUR2通道的激活MCT-PH老鼠(图6)。我们管理pinacidil 1毫克/公斤/天在活的有机体内从天MCT-PH老鼠1至21日(图6)。我们测量减少RVSP (图6 b),增加公司(图6 c),PVR下降(图6 d),并降低房车肥大的MCT + pinacidil老鼠相比MCT + DMSO老鼠(图6 e)。此外,Dp / dt分钟下降,心率增加的MCT + pinacidil老鼠相比MCT + DMSO老鼠(补充表5)。与此同时,在系统性血压(没有区别图6 f)。

在活的有机体内预防治疗pinacidil减少MCT暴露引起的肺血管壁的增厚(图6克)和肺血管的neo-muscularisation能力降低,证明的增加non-muscularised船只和减少消化道血管(图6 h)。预防pinacidil治疗也降低房车纤维化MCT + pinacidil老鼠相比MCT-DMSO老鼠(图6我)。

3.8。在活的有机体内治疗药物激活SUR2减少其特定的严重程度和chronic-hypoxia (CH)全身的PH值

在治疗策略MCT-PH模型(每天14 - 21)(图7),pinacidil显著降低RVSP (图7 b),但不是有限公司(图7 c),RVSP /公司比(图7 d),富尔顿指数(图7 e)不是系统性血压(图7 fMCT-PH老鼠)和其他的形态学参数(补充表6)。此外,在活的有机体内治疗治疗引起的肺血管重建中华人民共和国交通部负责pinacidil减少接触(图7 g)和肺血管neo-muscularisation (图7 h)。此外,治疗pinacidil治疗没有显著降低房车纤维化MCT-pinacidil老鼠相比MCT-DMSO老鼠(图7我)。这些结果表明,pinacidil治疗可能降低PH值的严重性MCT-exposed老鼠。

最后,我们分析了SUR2A的蛋白表达,SUR2B, Kir6.1 CH-PH老鼠。我们发现SUR2A、SUR2B Kir6.1肺蛋白表达在大鼠相比normoxia CH-exposed持平(补充图4),就像在人类的肺组织。然后,我们评估的后果在活的有机体内药理活性的SUR2 pinacidil CH-PH老鼠(补充图4 b)。我们接受1毫克/公斤/天pinacidil CH-PH老鼠从天14到21岁。我们测量的改善RVSP (补充图4 c)有限公司(补充图4 d),PVR (补充图4 e),但不是富尔顿指数,系统性血压和心率(补充图4 f-h)。肺血管壁厚度和肺血管neomuscularization减少pinacidil治疗(补充图4 i, J)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们报告在几个重要的发现与SUR2 / Kir6.1表达式和函数在多环芳烃发病机理。首先,SUR2A SUR2B, Kir6.1 hPASMCs和hPAECs表示。第二,SUR2激活control-hPASMCs的扩散,减少control-hPAECs, PAH-hPASMCs control-hPASMCsc的迁移。第三,药理激活SUR2生产PA放松控制和PH值大鼠模型。第四,SUR2A Kir6.1表达RV水平都很高,导致潜在的复极化控制老鼠。第五,慢性在活的有机体内SUR2激活pinacidil增加心率没有令人不安的肺循环血流动力学控制老鼠。最后,在活的有机体内激活SUR2降低酸度的两个临床前模型的发展(MCT -和CH-PH鼠模型)。

4.1。SUR2A / SUR2B定位表达式

与SUR2B SUR2A股票99%的同源性(25)。然而,他们有不同的定位和ATP敏感性。在缺乏pinacidil,当SUR2B与Kir6.1有关,这个频道由ADP和ATP刺激而不是抑制ATP (26)。此外,half-maximal抑制ATP浓度为100年和300年SUR2A和SUR2Bμmol / L,分别为(27)。对于不同的本地化,SUR2A心中是主要的同种型,骨骼肌和大脑(28,29日),而SUR2B无处不在。的原位杂交技术表明SUR2B和Kir6.1 mRNA在许多系统性条件但不不是30.)。这里,我们首次展示,SUR2A SUR2B, Kir6.1表达在人类和大鼠肺组织的蛋白质含量和孤立hPAECs hPASMCs从控制和PAH患者。与Kir6.1 SUR2A和SUR2B主要是相关的,但它们也可以与Kir6.2有关,通常与SUR1有关。我们最近发现Kir6.2表示控制和多环芳烃hPAECs hPASMCs Kir6.2增加MCT-PH PAH-hPASMCs和肺的大鼠(8)。肺脉管系统,我们可以合理地假设SUR2A或者SUR2B co-assemble Kir6.1和Kir6.2。因此增加Kir6.2观察到的环境中多环芳烃可能修改敏感的属性(8)。

此外,建议由Videbaek et al。(31日)pinacidil更强有力的系统性和大鼠肺动脉。在目前的研究中,我们证实pinacidil应用程序更有效放松主动脉动脉肺动脉。诱导渠道,包括SUR2A和SUR2B,线粒体膜中的表达(32),可以抑制线粒体激进的氧物种(ROS)生产(33)。在多环芳烃(ROS是过度生产34),我们可以假设SUR2药理激活降低PH值的严重程度一定程度上是由于抑制活性氧的生产。

4.2。在RV SUR2函数

SUR2、Kir6.1 Kir6.2发现心(35)。然而,所有当前研究的角色SUR2心中涉及LV隔间。我们发现,房车心肌细胞也表达了SUR2A Kir6.2和Kir6.1 (8),而SUR2B出现低表达RV LV相比。LV从豚鼠心肌细胞接种pinacidil显示显著缩短adp (36)。相反,LV心肌细胞分离kir6.2^{- / -}老鼠显示美国长期在高葡萄糖浓度与野生型小鼠心肌细胞(37)。

此外,在控制老鼠的LV, SUR2A SUR2B局部出现在线粒体,表明也能诱导产生cardio-protection基于他们的角色作为诱导线粒体(32)。SUR2A / Kir6.1通道的作用在adp和心肌细胞的线粒体功能可能有心血管的后果,可以受益于房车功能障碍发生在MCT-PH模型(18,20.)。事实上,层等人证明了诱导调控心肌细胞Ca至关重要^{2 +}在基底和病理条件下体内平衡。减少诱导电流增加Ca^{2 +}过载通过阻止线粒体膜电位振荡在氧化应激(38)。在这里,我们表明,SUR2激活导致减少美国在控制房车心肌细胞。正如我们之前发现的那样,一个病态的房车的adp延长心肌细胞从MCT-PH分离大鼠(39的保护作用),我们可以假设SUR2 MCT-PH模型中的激活可以通过这些机制在房车心肌细胞部分行动。在LV心肌细胞,SUR2激活pinacidil已经证明调节动作电位持续时间(40,41)。此外,我们发现慢性pinacidil应用在健康大鼠的心率提高pinacidil-exposed老鼠,窦房结表明潜在的直接行动,这是占主导地位的哺乳动物的心脏起搏器。之前证明Kir6.1包含敏感通道有助于窦房结兴奋性和心率控制(42)。

4.3。ABCC9在坎图综合症

最近,功能的突变ABCC9是最重要的遗传原因Cantu综合症,表现为先天性多毛症,osteochondroplasia,心脏肥大,扩张血管,心包积液。有趣的是,一些Cantu综合症患者也开发肺动脉高压(43- - - - - -46)。十二个不同ABCC9突变是功能(43)或LOF-of-function突变(47)。病理生理机制涉及发展的PH值是复杂的,这表明本构SUR2A / Kir6.1开放导致系统性血管舒张和低血压,导致补偿心脏肥大和hypercontractility和PH值(35)。此外,一些病人也被诊断出患有多环芳烃由于LV疾病(48)。本研究发现,每日pinacidil政府控制老鼠1毫克/公斤/天3周没有影响血流动力学参数和肺血管重建。以前的工作表明,长期治疗(预防协议)与开证诱导治疗降低PH值的严重程度(12- - - - - -14)。我们的研究结果表明,治疗SUR2激活可能是一个有趣的治疗多环芳烃。

5。结论

我们表明,药物激活SUR2减少PAH-hPASMCs的扩散和迁移能力,SUR2有助于PA基调。此外,在活的有机体内SUR2治疗激活有效恢复或改善PH MCT-PH和CH-PH鼠模型。尽管SUR2功能突变是导致心血管异常Cantu综合症患者中观察到,我们的研究结果显示,药物激活SUR2应该考虑治疗多环芳烃。

6。限制

因为SUR2表达的其他细胞如成纤维细胞或其他组织(例如肝、(28,49),我们的结果并没有排除在活的有机体内SUR2激活降低PH值由代理在肺和心脏成纤维细胞(50)或通过改善肝功能在MCT-PH模型中,它的特点是肝脏功能障碍。心脏或平滑肌细胞的生成SUR2 overexpressing动物将构成一个强大的工具。表示在补充表1,我们的样品(肺、PAECs PASMCs)用于控制和多环芳烃的研究不同年龄的患者,所以我们不排除这些差异有什么后果SUR2 / Kir6.1表达式。然而,使用人类样本,没有替代策略。

数据可用性声明

最初的贡献在这项研究中都包含在本文展示/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和批准协议N8CO-08 - 003, ID RCB: 2008 - a00485 50岁,2008年6月18日批准。患者/参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。动物设施许可由法国农业部(协议号c92 - 019 - 01)。

作者的贡献

霍奇金淋巴瘤,VC、DM和足总进行构思和设计。霍奇金淋巴瘤,BM,医学博士,ABo血型,安倍,JS, VD, VC,足总进行了实验并进行数据分析。所有作者起草并把手稿的重要知识内容进行审核和批准最终版本的手稿。

资金

这项研究是由法国支持的法国Cardiologie协会”联盟。“这项研究也支持由法国国家健康与医学研究院(INSERM), Paris-Saclay大学玛丽Lannelongue医院和法国国家研究机构(ANR)(批准号anr - 18 - ce14 - 0023 (KAPAH)。HL接收anr - 18岁ce14 - 0023的支持。BM得到了治疗创新博士学校(ED569)。法国“嘟杂音”基金会支持安倍基础。

确认

作者要感谢伊冯Dutheil从INSERM U999,友谊医院玛丽Lannelongue,对她的帮助。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcvm.2022.1066047/full补充材料

引用

1。亨伯特M, Kovacs G, Hoeper M, Badagliacca R,伯杰R, Brida M, et al . 2022 ESC /人肺动脉高压的诊断和治疗指南。欧元和J。(2022)43:3618 - 731。doi: 10.1183/13993003.00879 -2022