原始研究的文章

前面。Cardiovasc。地中海,2023年1月12日
秒。心血管生物制剂和再生医学
卷9 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.1056427

表达谱分析显示关键microRNA-mRNA交互患者大动脉转位和系统性左和右心室

马苏德Abu-Halima ^{1、2 *},

维多利亚瓦格纳 ^1、3,

Shusruto Rishik³,

挚友Raedle-Hurst²,

籍米斯^{1 __}和

Hashim Abdul-Khaliq^{2 __}

¹人类遗传学研究所,萨尔州大学医学中心,德国汉堡帽
²萨尔州大学医学中心的儿科心脏病学系,德国汉堡帽
³临床生物信息学中心,萨尔州大学,德国萨尔布吕肯

背景:患者大动脉转位(TGA)有不同的连接系统室,这决定了长期发病率和生存。发现已报告系统地识别microrna的有限,信使rna表达水平在这种群病人。在这项研究中,我们旨在描述microrna mrna, TGA患者和miRNA-mRNA交互网络,系统性左(LV)和右心室(RV)。

材料与方法:大型面板的人类microrna与信使核糖核酸微阵列进行了确定全基因组表达谱在16 TGA-RV患者的血液,16 TGA-LV患者和16岁的准确性控制。使用实时定量PCR (RT-qPCR)、微分验证一个microrna的表达水平。浓缩的分析改变microrna的使用生物信息学工具和信使rna表达水平确定。

结果:microrna的改变和信使rna表达水平观察TGA-RV和TGA-LV患者之间在一起或分开,而控制。在放松管制的microrna和mrna, 39岁和101年microrna TGA患者被确认为显著差异表达(TGA-RV和TGA-LV)和TGA-RV,相比匹配控制。此外,51个microrna患者被确认为显著差异表达TGA-RV相比TGA-LV患者。RT-qPCR相对表达水平与微阵列分析结果高度一致。同样,36,164 mrna被确定为显著差异表达TGA患者(TGA-RV和TGA-LV)和TGA-RV相比,匹配控制。此外,mir - 140 - 3 - p显示较高的表达水平明显心力衰竭患者(FC = 1.54;P= 0.001)和mir - 502 - 3 - p显示较高的表达水平的病人死于心脏死亡(FC = 1.41;P= 0.011)。综合分析导致21日和23日高的目标基因表达水平较低,分别为(r≥0.50和P< 0.05)。这些靶基因(即。,21和23target genes) showed an inverse direction of regulation with miRNA and exhibited a miRNA binding site position within the 3′UTR of the target gene.

结论:我们的研究结果提供了新的见解的潜在分子生物标志物(s) TGA患者可能指导更好的风险分层和新颖的靶向治疗的发展。未来的研究需要调查microrna的潜在意义和mrna TGA-related心血管疾病。

介绍

先天性心脏病(chd)是最常见的器官畸形影响全世界约有0.8 - -1.2%的活产(1)。尽管大量的研究来定义冠心病的病因引起,只有∼15%的病例可以归因于一个已知的遗传原因(1,2)。先天性心脏和血管缺陷异构形式的形态学和血流动力学表现,包括单一或组合不同的解剖畸形。这些冠心病,大动脉转位(TGA),特点是要么独自ventriculo-arterial不整合(D-TGA),或两者的结合不和谐的关系,包括房室和ventriculo-arterial不整合(L-TGA)。临床表现的两种形式的tga从严重的产后黄萎病出生时需要立即治疗和干预,如D-TGA的情况。虽然D-TGA儿童有一个系统后左心室动脉开关操作,他们有一个更好的结果,和更少的心脏事件和心脏衰竭,老年患者D-TGA接受心脏手术的初始时代只有开关的循环在心房水平(心房开关操作),还有房车系统性室。L-TGA患者血液先天性房室和ventriculo-arterial不和谐的连接和肺循环和体循环和被认为是生理上的,而不是在解剖学上,纠正。这些患者仍有RV在系统性位置和患者血流动力学和心脏的结果类似于D-TGA后心房开关操作。两个组别的病人(即。,D-TGA after atrial switch operation and L-TGA) may have similar hemodynamic situations (RV in systemic position) but they still have genetically different determined congenital malformations. Different surgical operations aim to correct the hemodynamic and morphological situation in order to achieve physiological blood flow in pulmonary and systemic circulations. These surgical operations underwent several modifications in the last six decades. Patients with TGA, who still have RV in a systemic position are known to be at risk for heart failure (HF), atrial and ventricular arrhythmia, and sudden death (3,4)。的发生明显的高频有负面影响冠心病患者的预后(5)。手术时代,初D-TGA患者接受了心房开关更没有系统性房车和严重的心血管疾病,和更少的生存患者比D-TGA解剖后动脉开关维修。因此,预防或早期治疗心力衰竭是至关重要的,以避免心力衰竭的恶化与这些患者的不良预后相关。虽然TGA发展的潜在的遗传机制知之甚少,一些已知蛋白编码基因发挥受限的功能作用在心脏发育和功能。然而,大多数这些基因的细胞和生物功能仍不清楚。基因表达在转录通过心脏发展是高度动态的,严格监管几个监管机构包括小分子核糖核酸(microrna) (6,7)。

microrna非编码,单链rna(大约年龄在18岁至25岁之间核苷酸长度),通常绑定到3 '非翻译区(3 'utrs)的信使rna (mRNA)抑制蛋白质翻译或造成信使rna降解(8)。目前,有2300个“真实和成熟”microrna识别(9),调节几乎每一个细胞和生物过程,包括过程控制冠心病(10- - - - - -15)。关于TGA患者,不久之后发表的两项研究报道了microrna的表达水平TGA患者使用基于数组的逆转录和定量实时PCR (RT-qPCR) (16)或单RT-qPCR分析(17)。在第一项研究中,11个microrna显示较高的表达水平在TGA患者心房开关操作miR-18a和mir - 486 - 5 - p是负相关的系统性右心室的收缩性(16),而在第二项研究中,mir - 423 - 5 - p未能与系统性右心室收缩功能(17)。最近,mir - 183 - 3 - p被发现是一个独立的生物标志物恶化的高频,因此可以使用作为一个额外的生物标志物TGA患者和系统性风险评估的房车(10)。这些研究表明microrna在冠心病的重要作用,microrna的表达水平的改变与心血管疾病和/或TGA-related表现。TGA患者(D-TGA或L-TGA),然而,microrna的综合分析和信使rna表达水平仍然缺乏。因此,可想而知,除了整个microrna的mRNA分析,寻找一个microrna的逆函数,它可以增加一个特定目标的翻译可能会展示另一层的分子多样性TGA和可能是一个有用的诊断和预后治疗的工具。因此,在这项研究中,我们确定了microrna和信使rna表达水平的改变患者D-TGA和系统性房车或LV,以及L-TGA患者已经系统性房车。结果相比,年龄和健康志愿者的准确性(HVs)。我们另外进行一个综合分析来识别管制microrna的mRNA的目标和确定潜在的microrna (s)和/或信使rna (s)可能参与TGA的机制。

材料和方法

研究人口和样本收集

总共48个参与者与TGA和健康对照前瞻性招募在常规心脏后续的萨尔州大学医院的心脏病。样本收集从TGA患者(n= 32)和年龄/准确性健康对照组(HVs,n= 16)(平均数±标准差:20.09±8.07,20.63±8.69,分别)。32 TGA患者参与的研究中,16日有一个系统性的右心室形态(TGA-RV)和16个病人有一个系统性的形态学左心室(TGA-LV)动脉后切换操作。所有患者经常出现在我们的诊所在1的基础上,进行了同样的研究协议,已经详细描述之前(12),包括12导心电图、经胸廓的二维超声心动图和实验室测试(表1)。身体检查和二维超声心动图进行可信度评估心脏研究结果和状态,包括测量血压、经皮血氧饱和度和二维超声心动图。对照组主要是招募我们的机构,由医务人员以及医学生;然而,为了避免选择性偏差,个人从其他非医疗机构也参加。收集血液样本(2.5毫升)在PAXgene™血管(BD生物科学,圣何塞、钙、美国),并储存在室温下2 h溶解血细胞前储存在−20°C到RNA,包括microrna的隔离。这项研究符合赫尔辛基宣言和良好的临床实践指南。这是萨尔州医学协会的伦理委员会批准。所有患者和健康对照组给予书面知情同意在入学之前的研究。

表1

表1。为控制和TGA患者的特征。

净化和质量评估

总RNA包括microrna从血液样本使用纯化PAXgene™血液microrna的装备在QIAcube™机器人(试剂盒、希尔登,德国)试剂盒的指示后,我DNase治疗步骤包括对每个样本(试剂盒)。只有样品A260 / A280比率在1.8和2.1之间使用NanoDrop 2000分光光度计(美国ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,MA)和RNA的完整性(RIN) > 7号使用安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)都包括在分析中。

分析微阵列的microrna

血液样本中的microrna的表达谱的TGA-RV患者(n= 16)和HVs控制(n= 16)得到从我们先前生成和发布原始数据使用SurePrint™8×60 k人类microrna的平台(安捷伦科技)(10)。至于TGA-LV病人,microrna测定分析使用纯化RNA分数从16 TGA-LV样品使用SurePrint™8×60 k人类microrna的平台(安捷伦科技)。这些平台包含探测器检测的2549人类microrna安捷伦科技的指令。短暂,125 ng RNA是标记,microrna的微阵列芯片杂交,清洗,使用安捷伦DNA微阵列图像获得扫描仪(安捷伦科技)如前所述18,19)。生成的数据导入R环境统计软件(版本R4.1.2)进行进一步的统计分析。

通过微阵列分析mrna

同样,mrna的表达水平进行了使用相同的样本,用于杂交到SurePrint G3的microrna的微阵列分析人类基因表达v3 8×60 k芯片,包含50599个生物特性(安捷伦科技),根据制造商的指示和轻微的修改。TGA-RV mRNA表达进行了分析(n= 16),TGA-LV (n= 16)和控制(n= 16)。短暂,125 ng总RNA是反向转录,放大,贴上cyanine-3 (Cy3),随后mRNA微阵列芯片杂交。数组被洗了,图片是获得使用安捷伦DNA微阵列扫描(安捷伦科技)。最后,生成的数据导入到R统计软件(版本R-4.1.2)环境进行进一步的统计分析。

逆转录和定量实时PCR (RT-qPCR)的microrna

一群不同识别microrna的微阵列分析选择进一步验证RT-qPCR在同一样品中使用的微阵列分析(n = 48)。总共有38个microrna选择从TGA (TGA-RV和TGA-LV) /控制,TGA-RV / TGA-LV, TGA-RV /控制的比较(补充表1)。这些差异表达和识别microrna的选择基于大量水平(调整P值),褶皱的变化,和生物相关性在冠心病或其他类型的混杂心脏和extracardiac异常。过程已经完成(如前所述)(20.,21)。短暂,75 ng总RNA是反向转录互补DNA(互补)使用TaqMan™微RNA逆转录工具包(ThermoFisher科学),根据ThermoFisher科学的指导。反转录后,2.5μl生成的cDNA pre-amplified使用TaqMan™前置放大器主混合(ThermoFisher科学)。最后,microrna的丰度水平检测到RT-qPCR使用Biomark HD / 96.96动态数组™IFC数组(Fluidigm公司)表示在Fluidigm microrna的协议分析(PN 68000130 E1)。生成的数据从Biomark中提取数据收集软件,然后进一步分析了使用Fluidigm实时PCR分析软件(Fluidigm公司)。导致循环阈值(Ct)值绘制每个microrna的分别,只有样品用Ct≤35岁被认为是进行分析。此外,没有模板控制(NTC)和RT-negative控制包含在每次运行。

生物信息学和统计分析

使用R软件,功能得到的原始数据被过滤排除mrna和microrna的检出率分别为每组(即不到50%。,病人和控制)。导致表达的信号被quantile-normalized, log2-transformed和丰富的microrna在病人的不同组相比,HVs样品确定后申请一个未配对的双尾t以及。P价值观是纠正使用错误发现率由Benjamini-Hochberg(罗斯福)控制过程。调整P值小于0.05被认为是重要的,火山情节和基于log2热图进行计算。fold-changes和调整P值,火山块不同丰富microrna和mrna绘制使用GraphPad棱镜(版本9.0.2)和/或R软件(版本R4.1.2)。生成所有情节显示,基地R功能使用和/或功能从ggplot2 v3.2.1 pheatmap v1.0.12, rcolorbrewer也,igraph v1.2.6、viridis v0.5.1、和grepel v0.8.1。包data.tablev1.12.8, openxlsx v4.1.4、尺度v1.1.0 stringr v1.4.0,和rfast v1.9.5被用来实现常见的数据操作任务。分析潜在的mRNA-miRNA使用R与数据交互进行。表v1.12.0 corrplot v0.84, viridisLite v0.3.0。每个microrna的预测能力是评估使用接受者操作特征曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)。调整P值为每个AUC值计算的基础上F以及与相应的变量逻辑回归模型训练,业务Benjamini多重比较检验(罗斯福< 0.05)。整个microrna与信使核糖核酸微阵列数据集包括差异表达microrna和mRNA公共存储库提供了基因表达的综合分配加入GSE179105数量。至于RT-qPCR数据,相对定量过程被用来检测单microrna的表达变化和一个未配对的双尾t以及。P值被用来计算重要性水平的差异。小核RNA(核内小RNA) RNU6B被选为参考内生控制规范化正如前面指出这种类型的样品(10- - - - - -14,18,19,22- - - - - -24)。每个显著不同的斯皮尔曼相关系数计算表示miRNA-mRNA对TGA组(TGA-LV和TGA-RV)和控制,以及P值的相关性。TargetScan 7.2¹(25),是用来预测的microrna的表现出一个结合位点3′UTR区域内的目标基因,显著的生物学意义,microrna是负相关评估在网上与miEAA 2.0 (26)。

结果

研究人口的特征

48参与者(包括32 TGA患者和16控制)参与了这个研究。参与者中列出的详细的临床特点表1。控制和患者(TGA-RV和TGA-LV)是明显不同的经皮血氧饱和度(%)(P= 0.0001),收缩末期容积的房车(ml) (P= 0.0022),舒张末期容积的房车(ml) (P= 0.0079)和射血分数的房车(%)(P= 0.0028)。然而,其他临床参数,如收缩期和舒张期血压和NYHA类和高灵敏度等实验室检测肌钙蛋白T,γGT,白蛋白,表皮生长因子受体没有显著不同。TGA患者和房车明显收缩末期和舒张末期容量大,比与LV TGA患者,由于慢性压力和体积形态RV的过载(表1)。有趣的是,生化标记的值中位数水平以上病人之间没有显著不同TGA患者左、右心室。

质量检查和microrna和mRNA数据聚类分析

无人监督的层次聚类分析microrna、mrna和样本,即。,patients with TGA-RV and TGA-LV vs. controls based on average linkage and Euclidian distance of the significantly expressed miRNAs and mRNAs, were carried out. Forty-eight samples [TGA-RV (n= 16),TGA-LV (n= 16)和控制(n= 16)]被纳入本研究。48个样品,46 [TGA-RV (n= 16),TGA-LV (n= 15)和控制(n= 15)]通过microrna的芯片质量检查和他们的表达水平包括在进一步分析中,和两个样品包括[TGA-LV (n= 1)和控制(n= 1)没有通过质量检查和被排除在进一步分析。同样,48个样品[TGA-RV (n= 16),TGA-LV (n= 16)和控制(n= 16)]通过信使核糖核酸微阵列质量检查和他们的表达水平是包含在进一步分析。至于microrna的聚类分析,患者TGA-RV TGA-LV,一起或分开,集群与的控制。对于这个任务,我们只包括最高的microrna表达差异(即。调整后P价值和更高的褶皱变化)。虽然是一个非常重要和TGA患者之间改变microrna的概要文件和控制,TGA-RV与控制,和TGA-RV与TGA-LV,没有清晰的聚类样本基于microrna的表达。有集群包含低表达水平检测主要是在控制和/或TGA TGA-RV或者TGA-LV,和表达水平从低到高不等TGA患者相比,控制。更详细的区分测试组基于microrna的无监督聚类系统树图,然而,并不是决定性的(补充图1- - - - - -3)。

至于mRNA聚类分析,患者TGA-RV TGA-LV,一起或分开,集群和控制。信使rna表达的差异TGA-RV病人和控制了非监督的层次聚类分析mRNA展出一个调整P值< 0.05和≥1.5倍变化对双方(即。,较低,较高的表达水平)。层次聚类分析生成的示例系统树图显示两个集群,集群包含主要TGA-RV病人和第二个集群包含大部分的控制,显示特定的信使rna表达模式在TGA-RV与正常对照组(补充图4,5)。基于这两个集群,一些mrna TGA-RV清楚表明微分表达水平和/或控制在低水平表达,反之亦然。TGA-RV和TGA-LV患者更清晰的区分和控制基于层次聚类的差异表达mRNA,然而,不可能的。

筛选差异表达的microrna并使用微阵列mRNA

使用高通量SurePrint微阵列平台、微分表达式分析识别microrna显示较高的表达水平或低表达水平在血液样本来自TGA患者(TGA-RV和TGA-LV)相比,年龄和准确性的控制。只考虑microrna展出一个调整P值< 0.05和≥1.5倍变化对双方(即。,lower, and higher expression levels), 39 and 101 miRNAs were identified as significantly differentially expressed in patients with TGA (both TGA-RV and TGA-LV) and TGA-RV when compared to matched controls (表2)。此外,51个microrna患者被确认为显著差异表达TGA-RV TGA-LV患者相比,表2)。然而,没有标识为显著差异表达microrna TGA-LV患者相比,匹配控制。最差异表达的低和高表达microrna在火山可视化情节(图1)。microrna的水平不同病人和控制之间的热图(补充图1- - - - - -3)。

表2

表2。相比大大丰富的microrna TGA患者的血液由芯片控制。

图1

图1所示。火山情节显示log2褶皱的变化最重要的microrna表达和microrna TGA患者的血液样本(TGA-RV和TGA-LV)匹配控制相比,由微阵列分析。

同样,高通量SurePrint微阵列平台被用来识别mrna显示较高的表达水平或低表达水平在血液样本来自TGA患者(TGA-RV和TGA-LV)相比,年龄和准确性的控制。只考虑mrna展出一个调整P值< 0.05和≥1.5倍变化对双方(即。,lower, and higher expression levels), 36 and 164 mRNA were identified as significantly differentially expressed in patients with TGA (both TGA-RV and TGA-LV) and TGA-RV when compared to matched controls (表3)。然而,没有标识为显著差异表达mrna TGA-LV患者相比,匹配TGA-RV和控制。最差异表达较低和较高的mrna在火山可视化图(图1)。microrna的水平不同病人和控制之间的热图(补充图4,5)。

表3

表3。相比,TGA患者的血液大大丰富mrna由芯片控制。

实时RT-qPCR确认单

进一步验证芯片结果,共有38个microrna选择来确定他们的微分表达水平RT-qPCR TGA (TGA-RV和TGA-LV) /控制,TGA-RV / TGA-LV和TGA-RV /控制比较所示补充表2。这些microrna选择基于微分表达水平在每个患者要么TGA-RV, TGA-LV或两者兼而有之,匹配控制。RT-qPCR分析的结果表明,大多数的microrna的表达模式与芯片结果一致(图2)。与匹配控制相比,16个25 microrna的显示表达变化的一个重要方向相同TGA的芯片结果,包括11个microrna表达水平较低的TGA (TGA-RV和TGA-LV)和5 microrna表达水平较高的TGA (图2)。其余的microrna RT-qPCR 25 microrna测试(9)即mir - 125 a - 5 - p, miR-18b-5p, mir - 454 - 5 - p, miR-29c-3p, mir - 590 - 5 - p, mir - 1275, mir - 6794 - 3 - p, mir - 193 - b - 3 - p,和miR-29b-3p显示(即同一方向的表达变化。,高和低表达的变化)没有统计学意义的变化。至于比较患者只有TGA-RV和匹配控制,25个测试RT-qPCR microrna显示表达变化的一个重要方向相同芯片结果,包括21个microrna表达水平较低和4 microrna表达水平较高(图2)。其余的microrna 34 microrna RT-qPCR测试(9)显示(即同一个方向的表达变化。,higher, and lower expression changes) with no statistically significant changes for 7 miRNAs including 5 miRNAs with lower expression levels (miR-1275, miR-339-5p, miR-574-3p, miR-29c-3p, miR-19a-3p, miR-6794, and miR-193b-3p) and 2 miRNAs with higher expression level (miR-18b-5p and miR-29c-3p) in patients with TGA-RV as compared to controls. Additionally, two miRNAs namely miR-29c-3p and miR-29b-3p showed an inverse direction of regulation, i.e., a lower mRNA expression level by RT-qPCR analysis and higher expression levels by microarray analysis. As for the compassion within TGA patients, 8 miRNAs namely miR-186-5p, miR-15b-3p, miR-93-3p, miR-145-5p, miR-99a-5p, miR-3200-3p, miR-454-5p, and miR-99b-5p showed a significant same direction of expression changes as the microarray results. All these miRNAs showed lower expression levels in patients with TGA-RV compared to patients with TGA-LV (图2)。

图2

图2。microrna表达水平的患者的血液样本TGA (TGA-RV和TGA-LV)相比,控制由RT-qPCR决定。数据给出的平均ΔCt TGA-RV或TGA-LV矫正性大动脉转位(TGA)和对照组(丰富低ΔCt、高级别)。RNU RNU6B作为内生控制microrna正常化,分别。Unpaired-two-tailed和平均数±标准差被用来评价表达水平的差异。P与罗斯福调整被认为是统计学意义(< 0.05*P< 0.05;* *P< 0.01;* * *P< 0.001)。

综合分析确定miRNA-mRNA TGA的交互网络

获得的见解更广泛的生物背景的不同确定microrna mrna TGA患者和控制操作,我们进行了一个综合网络分析使用显著差异表达microrna并被确认的mrna表2和表3。此外,我们计算的相关系数(r)的miRNA-mRNA双RV-TGA患者之间差异表达与控制。我们只考虑对相关系数的≥−0.5和3 'utr中的microrna的结合位点的目标基因。83 miRNA-mRNA相关性被发现,包括28个microrna的mRNA表达水平较高和较低的55 microrna的信使rna表达水平较低和较高的(补充表3)。所示图3,综合分析了21个高mrna表达和12低microrna表达和23 mrna表达较低,和28更高的microrna表达。这些目标mrna(即。,21和23target mRNAs) showed an inverse direction of regulation with miRNA (i.e., 12 and 28 miRNAs, 40 miRNAs) and exhibited a miRNA binding site position within the 3’UTR of the target gene. Interestingly, out of 40 miRNAs, 27 miRNAs were identified to be expressed in myocardium tissue, as indicated in补充表4。此外,群体所提供的分析结果为负相关microrna表示,一些microrna相关心血管类表现包括心律失常、心脏扩大、心力衰竭、心肌梗死、心肌炎。还显示术语通常与冠心病相关通路(补充表4)。

图3

图3。microrna的表达的不同的网络和他们的潜在目标mrna逆TGA患者和控制之间的相关性。只有对的相关系数≥-0.5,P< 0.05,microrna的结合位点3 'utr内的目标基因。

miRNA-mRNA与公开的心力衰竭和死亡的发生

为了进一步识别重要的microrna的信使rna与OHF相关发生和可能导致死亡,微分表达式进行了分析。至于microrna的分析,一个microrna即mir - 140 - 3 - p显示较高的表达水平明显心力衰竭患者(FC = 1.54;P= 0.001)和一个microrna即mir - 502 - 3 - p显示较高的表达水平的患者死于心源性猝死(FC = 1.41;P= 0.011)。而只考虑mrna展出一个调整P值< 0.05和≥1.5倍变化对双方(即。,lower, and higher expression levels), 124 differentially expressed mRNAs were identified in patients with OHF compared with subjects without OHF, including 75 genes with lower expression levels and 47 genes with higher expression levels in OHF patients compared to patients without OHF (补充表5)。同样,69年收集的血液样本中差异表达mrna的患者死于心脏性猝死与幸存的受试者相比,包括41个基因表达水平较低和28基因高表达水平(补充表6)。给定的可用性更高的microrna表达(即。,mir - 140 - 3 - p和mir - 502 - 3 - p)和较低的mrna表达(即。,75和41mRNAs with lower expression levels in OHF patients and patients who died due to sudden cardiac death, respectively), the integrative analysis was carried out to identify the inverse direction of regulation i.e., a lower mRNA expression level and an elevated miRNA expression level. Using the miRWalk algorithm, 11,292 and 14,754 potential target genes for the miR-140-3p and miR-502-3p were predicted, respectively. These potential target genes were cross-matched against the 75 and 41 genes identified by microarray analysis with lower expression levels in patients with OHF and patients that died due to sudden cardiac death. As a result, 42 and 38 target genes were yielded. These yielded target genes (i.e., 42 and 38 target genes) exhibited a miRNA binding site position within the 3’UTR of the target genes and were further investigated for a functional role in congenital heart diseases including in patients with TGA.

microrna的组合和心力衰竭的诊断价值标记

探索显著识别microrna的诊断价值,分析其诊断价值结合心脏衰竭标志物包括中位数水平以上病人,高敏感肌钙蛋白T)和表皮生长因子受体(27)(补充表7)。所示表4,每个心脏衰竭的AUC值标记为0.68,0.62,0.59,中位数水平以上病人,高敏感肌钙蛋白T)和表皮生长因子受体,分别。心脏衰竭标志物之间的组合与microrna的表达水平增加了诊断的力量有些microrna AUC值> 0.9 (补充表7可以使用),表明这些microrna与心力衰竭患者标记区分TGA-RV TGA-LV患者。

表4

表4。诊断的microrna结合TGA-RV患者的心力衰竭标志物相比TGA-LV病人。

讨论

在这项研究中,我们报告microrna的mRNA表达模式TGA (TGA-RV和TGA-LV)患者和健康对照组。microrna与mRNA分析连同RT-qPCR验证,我们发现差异表达microrna和mRNA TGA患者相比,控制。综合分析确定83 miRNA-mRNA microrna的(40 microrna)之间的相关性和mRNA目标mRNA (33)。在每个确定mRNA, microrna的结合位点的位置在3 'utr目标观察信使rna基因。相关40 microrna的,有趣的是,发现27个microrna表达在心肌组织,如示补充表4。浓缩的mrna分析受传播的microrna (microrna的结合位点的位置在3 'utr)强调了扮演一个角色在心血管类疾病和途径表现包括心力衰竭、心肌梗死、心肌炎。

TGA, RV引起的主动脉和肺动脉LV是主要的形态表现的患者群D-TGA和L-TGA。而血液循环,而不是L-TGA解剖学是先天纠正了额外的心房和心室之间的不整合(先天纠正TGA /双不整合),患者D-TGA分离肺循环和体循环,面对严重的黄萎病没有混合的可能性在增大卵圆孔未闭(卵圆孔未闭)(Rashkind机动)和保持动脉导管未闭(PDA)开放。在过去的几十年(60 - 80)许多D-TGA患者接受姑息手术过程纠正血液循环在心房水平通过保持RV系统性室。然而,在过去3年的解剖校正通过切换大动脉的解剖和生理有关心室成为d-TGA的标准治疗方法。RV在系统性的位置主要是压力和容量超负荷。一些可能发生心肌重构包括心室扩张和心肌纤维化的发展导致低心输出量和更少的物理性能。此外,房车扩张和心肌纤维化是心室性心律失常和心脏性猝死的高危因素(28)。D-TGA患者动脉后开关操作LV在系统性位置可能会少威胁生命的心脏事件,如心室性心律失常和心肌功能障碍患者一样系统性房车。长期心脏发病率从主动脉扩张主要是礼物,和supravalvular主动脉瓣狭窄(上海广电)(29日)。与其他结果。患者在我们的群体中,形态系统性房车大大扩大收缩末期和舒张末期室直径正如所料,由于慢性系统性房车的压强和体积过载(30.- - - - - -32)。有趣的是,心脏衰竭的常规生物标志物NT proBNP等对肝脏生化标记,标明心窝的拥堵,而不是明显不同的两组相似。这可能说明补偿患者血流动力学条件及心输出量系统性房车。的系统性室射血分数两组没有显著不同(表1)。此外,主动脉瓣的流速积分是两组相似,表明类似的心输出量。这也许可以解释的相似值中位数水平以上病人在两组表明类似的补偿系统室的性能。然而,我们的结果对丰富的microrna显示显著不同的表达模式,这可能表明这两个实体之间的遗传背景的差异,和血流动力学和形态学的差异状况。RV在系统性位置发生不同的重构大小、形态、和功能。当我们发现收缩压和舒张压参数的房车系统性位置明显扩大。显著增加心肌的纤维化是检测RV慢性压力和容量超负荷。microrna是否表明这样的重建仍不清楚。

在这项研究中,我们确定了六个microrna包括mir - 125 - 5 - p, mir - 125 b - 5 - p, mir - 181 b - 5 - p, miR-19a-3p, miR-20a-5p, miR-30b-5p显著与心力衰竭(HF) (补充表4)。这六个microrna, mir - 125家庭以前报道提供与高频和许多其他心脏症状显著相关(12,33- - - - - -35)。miR-19, mir - 181, mir - 125, miR-30水平与心肌水平在糖尿病心肌病的发展和心脏衰竭(33,36),和miR-30 miR-19家庭经常报道中特异表达与急性冠脉综合征(ACS)患者(37)。与其他研究一致(34,36),mir - 140在我们的研究中特异表达于TGA患者相比,高频TGA患者没有高频,这表明mir - 140可能TGA的发病机制中发挥重要作用。此外,mir - 502特异表达在慢性充血性心力衰竭(CHF)患者38),报告为一个生物标志物在冠状动脉疾病(CAD) (37)。此外,miR-20a表达强烈与超声心动图房车功能参数慢性血栓栓塞患者肺动脉高压(CTEPH)和miR-20a mir - 17有潜在价值的诊断CTEPH (39)。mir - 664 a - 3 - p表示cardioembolic中风患者血液中收集与控制(40)。这microrna (mir - 664 - a)表现出一个结合位点在许多相关靶基因的3 'utr所示图3,包括FOXO3 GCNT1 PIP4K2A、SESN3 SNCA, TRIM58 UBE2H, YOD1。FOXO3增加了这些基因的表达在收缩期心衰患者与控制(41),和SIVA1 EGR1作为目标,以抵消细胞凋亡在心肌组织(42)。有趣的是,我们的信使rna检测到目标,热休克蛋白A5 (HSPA5),这是一个直接的目标mir - 181 b - 5 - p,有助于starvation-induced自噬和凋亡心肌细胞(43)。EPB41蛋白亚型中区分不同心,形成特定的蛋白质复合物与心肌细胞Ca中心(2 +)代谢(44)。其他基因,microrna负相关,尚未报道与心血管疾病和/或任何生物功能TGA-related表现。综合实验验证mRNA目标的识别有上述HF-related microrna的结合位点可能导致小说签名与TGA、甚至提供新的预后参数,最终生成目标小说诊断和可能的治疗方法。有趣的是,许多生物通路识别(补充表4)与发展相关的心血管并发症(45)。以前的研究报道,mir - 423 - 5 - p可以用作强心力衰竭患者预后的生物标志物,以及其他许多microrna包括mir - 423 - 3 - p, miR-21, miR-23, miR-18a, miR-18b, mir - 106, mir - 301 a, mir - 128 (46)。所有这些microrna显示表达水平的改变在我们的研究对象即。相比,TGA患者匹配控制。尽管Tutarel et al。(17)没有找到相关性mir - 423 - 5 - p和患者心肺参数系统性右心室射血分数降低,我们发现mir - 423的表达水平较低5 - p和mir - 423 - 3 - p TGA-RV患者相比,匹配控制。此外,D 'Alessandra等人发现了一个协会之间的中位数水平以上病人浓度和mir - 423 - 5 - p左心室舒张末期容积(LVEDV)表明mir - 423 - 5 - p可以作为一个独立的预测患者LVEDV (47)。此外,miR-21的表达水平,mir - 126, mir - 423 - 5 - p与急性失代偿心力衰竭的预后有关48)。的注意,mir - 99 b - 5 - p, mir - 145 - 5 - p, mir - 125 a - 5 - p, mir - 125 b - 5 - p, mir - 150 - 5 - p, miR-23a-3p miR-15b-3p,显示最低表达水平在TGA-RV和TGA-LV病人相比,控制。这些microrna, 150 - 5 - p发挥抗凋亡功能通过直接抑制不同pro-apoptotic基因(49)或通过抑制p53活动是一个主要的细胞凋亡的诱导物(50)。因此,缺乏或减少的水平的mir - 150 - 5 - p可能在心肌细胞激活凋亡信号,这对心力衰竭的发展是至关重要的。此外,mir - 150的表达水平较低5 - p与公开的心力衰竭患者univentricular心(UVH) (12)。另一个microrna miR-23a-3p心血管效应,诱导血管生成中起着关键作用的缺血性心脏心肌梗死后连同其他microrna,包括miR-19a miR-21-5p, miR-22, miR-29, mir - 125 b - 5 - p,增强心肌细胞存活率,功能,减弱心肌纤维化(51)。在病理反应,它是合法的在高频假设microrna的表达的改变显示模式类似于许多其他心血管疾病,观察,类似于我们的病人和最近可能导致TGA研究。

在目前的研究中,综合microrna和mRNA网络分析生成利用TGA患者的血液样本收集和控制,而不是从心脏组织,通常提供一个特定的签名microrna的(s),信使rna (s),和/或蛋白质(s)表示只和/或无所不在地TGA患者和TGA相关子组(即。,TGA-RV TGA-LV)。因此,确认签名可能导致发现新生物标志物特征TGA而不是TGA患者提供基本信息功能机制。病人的心脏组织的分析也将是一个高度有趣的目标。然而,心脏组织的分析并不有助于证实我们的发现寻找生物标志物的诊断和预后。

我们想指出,这项研究也很多的局限性。少数病人和控制注册肯定是批评。特别是OHF患者和患者死于心脏性猝死太低评估预后和诊断价值mir - 140 - 3 - p和mir - 502 - 3 - p,分别。因此,一个更大的患者群和一个更大的对照组应该评估提供进一步洞察microrna的角色和他们的目标mrna在这些病人。此外,在目前的研究中,歧视或诊断识别microrna的力量结合心脏衰竭标志物(中位数水平以上病人,高敏感肌钙蛋白T)和表皮生长因子受体)之间进行了TGA-RV TGA-LV,和缺乏(即这些临床参数。中位数水平以上病人,高敏感肌钙蛋白T)和表皮生长因子受体)对照组让人无法区分TGA和控制。然而,这项研究的力量,它包括大量的microrna mrna TGA患者的筛选和控制以识别之间的综合网络miRNAs-mRNA有助于描述TGA患者和控制。据我们所知,目前文献中没有这样的数据。总之,根据我们的研究,我们确定了一套管制microrna和mrna TGA-RV TGA-LV患者,单独或在一起,而控制。自确定microrna mrna及其综合网络也有报告称,扮演一个角色在一些心血管疾病和/或CHD-related表现,推测可能是合法的角色识别microrna和mrna TGA患者。这些确定microrna的表达水平的改变与mrna为进一步的分析提供新的候选人,这可能有助于了解冠心病的发展未来。

数据可用性声明

公开的数据集进行分析。这些数据可以在这里找到:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/、GSE215941 GSE215940, GSE215939。

道德声明

涉及人类受试者的研究回顾和批准的机构审查委员会批准/ Ethikvotum Arztekammer des萨尔:[机构审查委员会(07/18号)]。书面知情同意参加本研究参与者提供的法定监护人/近亲。

作者的贡献

EM和HA-K同样这项工作。MA-H进行实验工作,并写了手稿。MA-H、大众和SR进行统计和生物信息学分析。MA-H、EM和HA-K设计研究,监督项目,并编辑了手稿。TR-H HA-K招募和检查控制,诊断病人,并收集血样。所有作者阅读和批准最终的手稿。

资金

这项研究是由Hedwig-Stalter-Foundation德国心脏基金会(2016)和法兰克福/主要研究德国成人先天性心脏病。

确认

我们感谢在Marsollek和Lea西蒙贝克的帮助在准备样品和实验工作。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcvm.2022.1056427/full补充材料

补充图1 |无人监督的层次聚类(欧式距离,完成链接)的患者TGA-RV和控制基于显著的差异表达microrna最高的方差。

补充图2 |无人监督的层次聚类(欧式距离,完成链接)的患者TGA-RV和TGA-LV基于显著的差异表达microrna最高的方差。

补充图3 |无人监督的层次聚类(欧式距离,完成链接)的患者TGA和控制基于显著的差异表达microrna最高的方差。

补充图4 |无人监督的层次聚类(欧式距离,完成链接)的患者TGA和控制基于显著的差异表达mrna最高的方差。

补充图5 |无人监督的层次聚类(欧式距离,完成链接)的患者TGA-RV和控制基于显著的差异表达mrna最高的方差。

脚注

^www.targetscan.org

引用

1。Bouma B,穆德B改变景观的先天性心脏病。中国保监会Res。(2017)120:908-22。doi: 10.1161 / CIRCRESAHA.116.309302