提高稳定性和精氨酸脱羧酶的活性在碱性pH值胍基丁胺的生产
恩年轻的香港1、2,
Hyungdon云
Byung-Gee金- 1首尔国立大学化学与生物工程学院,韩国,首尔
- 2分子生物学和遗传学研究所,首尔国立大学、韩国首尔
- 3釜山国立大学化学工程系,韩国釜山
- 4生物科学与生物技术、建国大学,韩国首尔
- 5生物工程研究所、首尔国立大学、首尔,韩国
- 6工程研究所、首尔国立大学、首尔,韩国
胍基丁胺,参与各种细胞机制调节行为,是由精氨酸(Arg)通过脱羧反应使用精氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.19 ADC)。使用野生型的主要障碍大肠杆菌ADC (ADC西文)胍基丁胺生产大幅活动损失和不稳定在碱性博士,为了克服这一问题,介绍了一个新的二硫键是理性decameric界面区域的酶。在突变体中生成,W16C / D43C增加热稳定性和活动。半衰期(T1/2)W16C / D43C pH值8.0和60°C是560分钟,这是280倍的时间比野生型的,和特定的活动在pH值8.0还增加了2.1倍。Site-saturation诱变随后在ADC的活性位点残基西文使用双硫键突变(W16C / D43C)作为一个模板。最好的变体W16C / D43C I258A显示4.4倍提高催化效率与野生型相比。最后突变(W16C / D43C / I258A)已成功应用在体外胍基丁胺的合成和一种改进的产量和生产力(> 89.0%的收益率在5 h参数的基于100毫米)。
介绍
胍基丁胺((4-aminobutyl)胍)是一个关键的精氨酸通过ADC代谢物合成反应,它在体内的各种行为。这是一个潜在的候选治疗各种疾病,包括创伤疾病,情绪障碍,糖尿病、认知障碍和癌症(Aricioglu et al ., 2003;罗斯et al ., 2004;韦德et al ., 2009;一et al ., 2010;2011年诗et al .,斐;歌et al ., 2014;Rahangdale et al ., 2021)。最近的一个有趣的研究评估治疗胍基丁胺的药理作用在老鼠的后代在胎儿期暴露于酒精。结果显示潜在的治疗认知障碍和其他神经系统并发症与胎儿酒精谱系障碍(Aglawe et al ., 2021)。胍基丁胺也被证明有明显的肝和肾淤胆型动物的保护功能。这胍基丁胺的作用机制可能与抗氧化性能(Ommati et al ., 2020)。胍基丁胺的实用功能作为一种多元化的候选药物在体内也与其干扰相关的咪唑啉受体(Zomkowski et al ., 2002;nei et al ., 2016)。基于胍丁胺对各种疾病的有前景的结果,潜在的治疗靶点分子可能利用(Piletz et al ., 2013)。
ADC西文是一种有效的生物催化剂,生成胍基丁胺从参数进行脱羧反应的酶。研究表明,ADC西文有优秀的特点,如特定的活动和底物选择性高,相比adc从其他来源(Blethen et al ., 1968;莫里斯和Boeker, 1983年)。使用ADC的主要问题西文胍基丁胺的合成,酶的活性和稳定性很大程度上取决于不同pH条件。ADC西文使用吡哆醛5-phosphate (PLP)作为代数余子式脱羧基α-carboxyl群参数和消耗一个质子(图1)。结果,反应pH值增加在胍基丁胺的生成和显著影响ADC西文结构稳定性和活动。在酸性条件下,5为ADC西文自发decamer联系起来,成为一个活跃的形式,而水解为活性结构为中性或碱性条件下形成。虽然不知道为什么为结构是不活跃的,ADC西文获得其积极的功能取决于pH值(Andrell et al ., 2009;Kanjee et al ., 2011)。因此,它是理想的解决这个问题通过蛋白质工程应用酶稳定的胍基丁胺生产。
图1。胍基丁胺的一般化学合成方案。
各种二元胺来自可再生碳源成为基本建设一个可持续发展的化学工业,和脱羧酶经常申请这样的目的(崔et al ., 2020)。然而,类似于ADC西文、各种如赖氨酸脱羧酶脱羧酶(Kanjee et al ., 2011)、谷氨酸脱羧酶(两位et al ., 2003)和鸟氨酸脱羧酶往往失去活动取决于反应博士虽然缓冲区和酸碱浓度可用于维护的脱羧反应所需的pH值,大规模生产中添加剂的使用增加了额外的成本,稀释的浓度目标产品,和复杂的净化过程。因此,如果这种酶活跃甚至在碱性条件下没有添加剂,它可以减少最终的生产成本,便于工业化进程。出于这个原因,几项研究旨在改善各种脱羧酶活动在碱性pH值(Guirard斯奈尔,1980年;星期四Ho et al ., 2013;香港et al ., 2017)。即使有一项研究使用ADC生产胍基丁胺,重组野生型ADC用于反应(太阳et al ., 2015),没有尝试改变酶的性质进行了工业应用。
随机诱变,常用于定向进化改进所需的目标蛋白质的性质,产生各种各样的图书馆覆盖整个蛋白质序列。密集的劳动力需要找到理想的突变体在有限的时间内(波特et al ., 2016)。因此,有效地减少图书馆大小和屏幕有效的突变体,先进的生物信息学和计算工具通常用于创建智能库。通过严格的计算方法,计算保守分数基于多重序列比对分析假定的正突变网站称为“热点”(阴霾和迪杰斯特拉,1988年;克雷格和Dombkowski, 2013年),或同源性建模基于蛋白质的序列相似性是一些经常应用技术的例子,帮助选择关键残留酶(崔et al ., 2014 a;崔et al ., 2014 b;崔et al ., 2016;荣格et al ., 2018)。随后,蛋白质工程技术,如多个site-saturation诱变(SSM)) (Reetz Carballeira, 2007;太阳et al ., 2016)或定点诱变(SDM) (Bornscheuer波尔,2001)可以应用于选定的残留产生突变库。
在这项研究中,以提高ADC西文在碱性酶活性和稳定性,我们通过计算选定的残留物进行突变分析酶的结构变化和活跃的网站。热稳定性明显改善和特定的活动在碱性pH值是通过引进一个新的二硫decameric接口的ADC西文为子单元。我们的研究结果提供了一个一般的变异策略,提高酶稳定性的二硫键形成寡聚蛋白质状态,随后通过活性位点突变增强他们的特定活动。
材料和方法
ADC的建设西文在表达载体
DNA操纵进行根据Sambrook的方法,等等。Sambrook et al ., 2006)。大肠杆菌DH5α用于DNA操纵大肠杆菌BL21 (DE3)作为基因表达的宿主菌株。大肠杆菌BL21 (DE3)基因组DNA是用作阿布扎比投资局源基因,编码蛋白质ADC西文(加入基因库:CAQ34466)。来表达C终端His-tagged融合ADC西文阿布扎比投资局的编码区放大了PCR引物5′- TATAAT使用前进CATATGATGAAAGTATTAATTGTTGAA 3′和反向引物5′- ATATACTCGAGCGCTTTCACGCACAT 3”。PCR产品与限制性内切酶消化濒死经历我/ Xho我)并插入相应的限制性内切酶网站pET24ma向量(李et al ., 2010)此前报道(在香港,2017)。
二硫键ADC设计西文
ADC西文PDB结构使用DbD v2.12 (2 vyc)进行了分析,预测合适的一对残留的二硫键(克雷格和Dombkowski, 2013年)。使用Pymol预测对被识别,突变是由只选择二硫化渣对在界面区域。三disulfide-linked突变的引物序列W16C / D42C W16C / D43C, W16C / D42C D43C所示补充表S1。
Site-Saturation诱变
为积极的突变体选择屏幕ADC的残留物西班牙文,NNK基码用于site-saturated诱变(香港et al ., 2018)。相对应的引物补充表S1被用于PCR进行丙氨酸扫描和site-saturated突变。基因库处理Dpn我在37°C, 1 h,质粒变成了10μl图书馆大肠杆菌BL21 (DE3)。从单个残留筛选突变体,∼200殖民地被检查以确保突变的报道95%或更高。突变体库深井板块在96年培养20 h,离心法培养细胞后,上层是丢弃,突变体的相对活性测定。
ADC的表达和纯化西文变体
根据以前报道的方法,ADC的表达和纯化西文变异进行了(在香港,2017)。IPTG(0.2毫米)添加到文化当OD600年达到0.8,18 h诱导后细胞收获18°C。他的6标记融合蛋白纯化在4°C与Ni-NTA琼脂糖树脂从试剂盒(希尔登,德国)。包含纯化洗脱他的6标记的ADC西文变异是由超滤浓缩使用Centriplus YM-30(微孔,贝德福德,MA)的分子量截止100 kDa。
温度对ADC的影响西文变体
熔化温度的蛋白质(T米)的变异比较SYPRO橙色激发/发射波长配置文件(爱好者et al ., 2007)。1000 x SYPRO橙色是溶解在Tris-HCl(50毫米,pH值8.0)缓冲区,和20μlμg纯化酶的解决方案是添加到0.5。光周期计480 II系统(罗氏应用科学)是用于检测在特定时间点的荧光变化。由激发/发射曲线,ΔT米计算(在香港,2017)。
ADC的热活动评估是通过测量酶活性在不同的温度。纯化酶变异在33孵化1 h - 65°C,然后在冰上冷却10分钟。然后测量残余酶活性。
确认在酸性或碱性条件下热稳定性,纯化酶是放置在50 mM柠檬酸缓冲,pH值5.6,或50 mM磷酸钠缓冲区,pH值8.0,分别。样品被放置在60°C水浴。剩余活动计算基于ADC non-incubated酶的活动。所有反应都是一式三份。
酶测定
的相对反应速率突变体库是由比色法定量测定用甲酚红(pKa = 8.3) (在香港,2017)。脱羧酶反应测定使用5毫米pH8.0磷酸钠缓冲区,PLP L-Arg约4毫米,0.2毫米和0.2毫米的指标。库高通量筛选,运用相同的方法,培养突变体在96孔板检测。吸光度的增加在574 nm记录使用紫外分光光度计(BMG LABTECH、德国),并通过ΔOD活动确定的基础上解决方案包含所有物质以外的酶。
来确定k猫和K米值,200μl反应是在96 -孔板使用纯化的酶。确认该反应在45°C参数浓度从0.5增加到20毫米pH值8.0磷酸钾缓冲。k猫和K米计算的非线性回归分析Michaelis-Menten方程GraphPad棱镜7 (https://www.graphpad.com/科学软件/棱镜/)软件。
确定酶活性在不同pH值,获得反应的解决方案是使用以下60毫米缓冲区:柠檬酸钠(pH值5.0 - -6.0);磷酸钠(pH值7.0 - -8.0);和Tris-HCl (pH值8.8)。PLP L-Arg 30毫米,0.1毫米和7.5μg纯化酶的添加到反应混合物。酶活性测定用高效液相色谱法。
胍基丁胺生产批反应
比较胍基丁胺产量随着时间的推移,150μg纯化酶的添加到500μl反应混合物PLP Arg 100毫米和0.2毫米。反应是在45°C和量化的高效液相色谱法在一定的时间间隔。所有的反应都是一式三份。
底物和产品分析
定量分析参数和胍基丁胺使用Younglin执行高效液相色谱系统IonoSpher 5 C, G100x3列(安捷伦,美国)。洗提液的流量组成的0.6 g L−1柠檬酸,4 g L−1酒石酸,1.4 g L−1乙二胺、甲醇5% 95%水0.9毫升分钟−1在40°C。折射率(RI)检测是用于检测底物和产品。保留时间为参数和胍基丁胺分别为1.5和4.1分钟,分别。
分子建模研究
ADC突变体被建模通过引入突变残留到报道野生型结构(PDB 2 vyc)使用瑞士模式(Bordoli et al ., 2009)。模板和W16C / D43C / I258A ADC突变体有三个氨基酸差异,导致一个序列的身份接近100%。衬底的对接模型参数的ADC生成活性位点周围5,网站使用七弦琴AutoDock 1.1.2 (Trott奥尔森,2010)。
结果
ADC的设计和选择西文二硫桥变体
ADC西文已报告被激活取决于pH值由于其构象变化(Andrell et al ., 2009)。确认ADC的pH值相关的活动西文,具体活动测量pH值介于5.0和8.0之间。最高的ADC的特定活动西文观察到的pH值5.0,活动大幅减少当pH值增加。小活动剩余的pH值高于7.0,这是在良好的协议与报告活动概要文件(Kanjee et al ., 2011)(补充图S1)。
理性地创建一个集中、智能图书馆选择ADC西文突变体与增强结构稳定性在碱性pH值,二硫键的插入decameric接口是未遂。一个基于web的工具,“二硫(DbD) v2.12”设计,用于在网上设计新的二硫桥使用ADC的3 d结构西文(PDB 2 vyc)。计算算法预测两个C之间的距离β年代的一双半胱氨酸残当一个特定的目标是半胱氨酸突变(半胱氨酸)和验证可能的二硫键(克雷格和Dombkowski, 2013年)。83二硫化对候选人,5双是位于decamer界面区域。在五个公认的二硫键对,我们假定的突变目标缩小到残留参与pentameric内圈的形成。因此,N终端在螺旋翼域界面α1和螺旋α′′2地区选择和算作“热点”(Andrell et al ., 2009)(图2一个)。两个公认的二硫对候选人的热点地区,W16C预测与D42C或D43C形成二硫键,分别。W16位于螺旋α′1,而D42和D43残留在螺旋α′2另一个为亚基(图2 b)。检查活动和稳定ADC的变化西文通过半胱氨酸取代,生成两个突变体:W16C / D42C和W16C / D43C。
图2。提出了二硫桥在ADC接口西文。(一)潜在的残留物对DbD V1.20二硫的形成。的五个预测对位于decamer接口,只有两双的“热点”,内在界面只有decameric结构。(B)“热点”区域ADC decameric接口西文(PDB 2 vyc)。ADC的基本单位西文由五个为decamer结合。定义单体,单体,单体B是红色在蓝色的彩色。绿色结构代表了其他单体pentameric decameric单体之间的环。有两个二硫键对预测的接口。在螺旋W16α′1单体B是预测形成二硫键D42和D43螺旋α′2在单体,分别。
产生两个突变体的酶活性测定在pH值8.0使用他们的细胞提取物。鉴于在补充图S2,相对活动的变异使用ADC测量西文活动控制。在这两个突变体研究中,只有W16C / D43C突变主动向衬底。蛋白质表达水平相比时,W16C / D42C突变的蛋白质表达水平是类似于野生型,但这种突变失去活动(补充图S3);因此,只有W16C / D43C突变酶被选为进一步鉴定。
酶活性的纯化W16C / D43C突变体碱性小灵通
为了更好地理解和精确比较W16C / D43C突变体活动,进行了酶反应在不同碱性pH缓冲使用纯化的酶。在pH值为8.0,ADC的具体活动西文和W16C / D43C变异分别为3.01±0.10,6.28±0.12μmol /分钟/毫克,分别在pH值为8.8,而ADC的具体活动西文和W16C / D43C变异分别为2.73±0.11,5.05±0.6μmol /分钟/毫克,分别。有一点要注意的是,W16C / D43C变异显示增强的具体活动(即几乎1/2。,2。1和1。9 folds at pH 8.0 and 8.8, respectively) at alkaline conditions compared to the wild-type (图3)。的纯化酶反应pH值8.0活动增强显示高于细胞提取(补充图S2)。
图3。ADC的特定活动西文在碱性和W16C / D43C博士每个纯化酶对30 mM浓度参数进行了测试。值表示为μmol每分钟每毫克的纯化酶。实验分代表平均值的三倍复制。误差线代表标准差。
测定ADC的热稳定性西文变体
野生型的热稳定性和W16C / D43C被孵化的纯化酶相比60°C,解释的材料和方法部分。检查热稳定性在不同pH值,样本在pH值5.6(孵化图4一pH值)和8.0 (图4 b),分别。野生型活动几乎降为零,10分钟内pH值在5.6和8.0条件;然而,W16C / D43C维护活动与野生型相比,小灵通。当酶被加热在pH值为5.6,W16C / D43C异常稳定,近97%的初始活动保持10分钟后孵化。戏剧性的热稳定性增强计算半衰期(t1/2-pH5.6)所示补充图S4a。的t1/2-pH5.6W16C / D43C突变是2100分钟,1050倍的ADC西文60°C。在pH值8.0 (补充图S4b),t1/2-pH8.0W16C / D43C突变是560分钟,将近280倍的野生型表明戏剧性的热稳定性增强W16C / D43C突变体在酸性和碱性条件下维护。
图4。热稳定性W16C / D43C突变而ADC西文。的半衰期W16C / D43C突变与ADC西文通过孵化纯化样品60°C和测量剩余的活动。样本分别孵化(一)pH5.6使用柠檬酸缓冲和50毫米(B)pH值8.0使用50 mM钠磷酸盐缓冲剂。(C)来确定T50,其余酶活性测定酶变异孵化后从33°C为1 h。65°C封闭的循环代表ADC西文,开环代表W16C / D43C。实验分代表一式三份测量的平均值。误差线代表标准差。
T50岁,时的温度任何酶失去50%的活动1 h孵化后,还测量了(图4 c),W16C / D43C变异显示高12.7±3.2°CT50比ADC西文。所有的检查中综述了耐热性值表1验证,二硫键突变大幅提高了ADC的稳定。
表1。ADC的热参数变异。
Site-Saturation诱变活性位点残基
为了进一步提高的活动W16C / D43C二硫键突变,单一的活性位点残基的ssm ADC西文随后被执行。选择候选残留诱变基于ADC西文arg对接模拟和之前报道的胍基丁胺醛亚胺结构ADC西文活跃的网站(Andrell et al ., 2009)。中残留直接联系Arg代数余子式的或衬底,PLP残留与磷酸基交互和羧基组参数是经过细心挑选。在13残留物,七个磷酸基附近的残留的附近和六个残留羧基组参数选择(图5一个)。最小化导弹的实验,在这些残留在SSM丙氨酸进行扫描。当相应的氨基酸所选的残留物被取代的阿拉巴马州,只有两个突变体,C254A I258A,保持超过60%的原始活动对参数(图5 b, C)。活动的损失大部分Ala取代突变体有所预期,因为检查残留高度保守的基于保护分析使用热点向导2.0 (Bendl et al ., 2016)(图5一个)。
图5。(一)示意图显示稳定的交互的在ADC的活性部位西文(PDB2VYC)。厚厚的灰色线显示了口袋与基质交互参数。保护的程度是由不同的颜色表示,基于热点向导的结果。相对ADC alanine-substituted突变酶的活动西文残留的互动(B)PLP和磷酸基(C)羧基组参数。
C254和I258受到地对地导弹使用与二硫键突变(W16C / D43C)模板。退化NNK密码子使用图书馆建设,和至少172突变克隆被检查以确保突变覆盖率95%或更多的单舰导弹(2013年11月)。200年殖民地从每个渣库选择琼脂板的,总的来说,400年通过全细胞克隆活动比较文化96年孔板在pH值为8.0。在突变体中,12个殖民地与活动高于模板W16C / D43C被确定。然而,只有一个突变体显示增加1.4倍以上活动,及其突变网站被确认为W16C / D43C / I258A。有趣的是,最好的突变的导弹库位置I258是相同的变异由丙氨酸扫描。
ADC的表征西文变体
探讨对动能值突变的影响,动力学参数W16C / D43C I258A,最后突变W16C / D43C / I258A ADC测定净化后在pH值为8.0,如图所示表2。相比之下,ADC西文,所有的三个变体增加显示k猫在减少K米价值,导致增强的催化效率(k猫/ K米)。特别是,最后突变W16C / D43C I258A显示增强k猫Arg值增加(2.1折)和显示降低K米值(2.0折)减少,导致一个重要的k猫/ K米值增加(4.4折)比野生型的。
表2。基于Michaelis-Menten ADC变异方程的动力学参数。
为了确认更多的活性位点突变的影响(W16C / D43C / I258A)二硫突变(W16C / D43C),融化温度(TmADC的)西文变量测量使用差示扫描荧光测定术(DSF) (补充图S5)。二硫键的W16C高/ D43C突变展出18°CTm比ADC西文。然而,I258A突变单独伤害ADC的稳定性西文并显示低2.4°CTm价值。尽管如此,当单一突变(I258A)二硫化结合突变(W16C / D43C),最终的熔化温度突变(W16C / D43C / I258A)为81.7±0.01°C,这是比野生型高16.0°C。最后突变W16C / D43C I258A提供戏剧性结构稳定性对单一I258A突变。
ADC的批反应西文变体
最后,胍丁胺生产监控的时间进程与RI探测器使用高效液相色谱纯化酶变异(150μg)一起PLP Arg 100毫米和0.2毫米。胍基丁胺生产的起始pH值批反应使用Arg monohydrochloride衬底是6.7。所示图6,检查三个突变体鉴定优于ADC西文在将参数转化为胍基丁胺在整个反应。I258A和W16C / D43C / I258A突变体表现出一个初始转化率的1.4和1.5倍,分别在20分钟比野生型。最终的产量,W16C / D43C和W16C / D43C / I258A突变体与二硫键突变显示1.8 - 2倍增加的胍基丁胺收益率在5 h与野生型相比,分别。结果,由于稳定性和改进活动,W16C / D43C I258A变异显示胍基丁胺产量最高,ca。2倍改进(> 89%的收益率在5 h)与野生型相比,总在5 h)(> 43%的收益率。
图6。时间进程胍基丁胺生产。胍基丁胺生产相比在45°C使用ADC的纯化酶西文W16C / D43C I258A, W16C / D43C / I258A。反应混合物包含Arg 100毫米,0.2毫米PLP, 150μg纯化酶。
讨论
细胞内的ADC西文根据酸应激反应的激活大肠杆菌细胞,其脱酸机制,消耗一个质子在细胞质中。消费的质子在酸性条件下允许细胞保持中性pH值适合细胞生长。然而,ADC西文不再主动当pH值中性或碱性。这一现象发生,以避免过度退化参数的细胞(Andrell et al ., 2009)。然而,ADC的酸反应西文导致问题申请工业胍基丁胺生产因为pH值迅速增加由于高浓度底物在反应过程中使用。
ADC西文属于原核的鸟氨酸脱羧酶(pODC)的子类折叠1型PLP-dependent脱羧酶,由五个领域:一个N终端领域,链接器领域,PLP-binding域,天冬氨酸aminotransferase-like小域紧随其后C终端域(Andrell et al ., 2009)。的N终端翼域创建decamer结构至关重要。通过氢结合或静电相互作用在这一领域,ADC西文形式的积极decamer活动为根据特别是博士,前两个α-helices ADC中西文翼域创建pentameric结构至关重要的酶(Andrell et al ., 2009)。因此,这些特定的接口区域选择生成二硫桥突变体。
当创建的地对地导弹库,与残留接近活性部位和substrate-binding口袋被选中。我们特别感兴趣的残留与磷酸基交互代数余子式PLP,绑定所需的配体PLP-dependent酶(Denesyuk et al ., 2002)。PLP的残留与磷酸基交互检查为主。由于极高的保护检查七残留的分数(图5一个),所有的阿拉巴马州取代突变体失去了原来的活动。据报道其他氨基酸脱羧酶,研究二氧化碳释放过程的α-carbon衬底的病原反应一步脱羧反应(克鲁格和Rathgeber, 2008);因此,Arg的羧基在其附近的残留动态交互发生被选为进一步Ala扫描。虽然变异衬底相互作用残留很可能减少酶的原始活动(Toscano et al ., 2007),有趣的是,一个突变被发现与改善活动。
一些报告分析ADC催化效率不同的起源。在一个研究中,ADC的G。forsetii后评估分析各种形式的ADC的系统发育分布(伯勒尔et al ., 2010)。的k猫/ K米价值的G。forsetiiADC mM-1s-1 0.22 pH值8.5。考虑到突变W16C / D43C I258A在这项研究中值为1.03时mM-1s-1展出k猫/ K米在pH值为8.0,它是不容易的比较准确,因为活动略有不同碱性pH值条件用于评估。然而,粗略地讲,我们最后W16C / D43C I258A突变大约是4.7倍比的更活跃g . forsetiiADC在碱性条件。从另一个最近的研究中,ADC的催化效率Shewanella藻类特点是(裴et al ., 2021)。即使k猫(12.62±0.68 s−1),这种变体相对高,因为它的高K米(14.55±1.45毫米),当整体k猫/ K米值相比,最后W16C / D43C I258A突变本研究催化效率较低。与迄今报告的论文相比,W16C / D43C I258A突变体在我们开发的文章在碱性pH值具有更高的催化活性。
日益增多的活动W16C / D43C I258A变异表明,酶的催化活性可以改善氨基酸侧链的细微变化,报道(泰勒和只熊掌,2010年)。为了更好地理解活动增加的原因,最终的结构突变W16C / D43C I258A建模,与野生型相比(图7)。对ADC西文,之间的距离仲丁基I258侧链和Cα原子参数和之间的距离仲丁基I258侧链和胍基群参数被确定为9.6和6.3,分别。另一方面,在W16C / D43C I258A突变情况下,距离被确定为10.1和7.1,分别。基于蛋白质建模I258A突变的结果,当Ile的笨重的疏水侧链取代了阿拉巴马州更小型的氨基酸,这可能最小化的位阻,从而提高衬底绑定到活动网站。然而,很难解释亲和力改变由于长期结构性衬底之间的距离参数和阿拉巴马州I258A氨基酸残基(> 6)当对接模拟执行。因此,对接仿真结果不能显示的具体原因由于生产力改进交互改变酶的突变造成的。如果W16C的蛋白质结构/ D43C / I258A变异是通过进一步的研究解决,更准确的解释将是可能的。进一步研究分子动力学模拟等也可以解释的原因k猫增加和K米减少变异。
图7。ADC的结构性比较活跃的网站西文(左)和W16C / D43C I258A变异(右)。通过仿真参数被放置在活动网站。在ADC I258西文和阿拉巴马州I258A突变是黄色和红色所示,分别。
胍基丁胺生产的起始pH值批反应使用Arg monohydrochloride衬底是6.7。5 h后,使用ADC反应混合物的pH值西文达到8.1左右,而突变体达到8.4附近。最后的pH值越高反应使用变异表明,W16C / D43C I258A突变体的反应消耗更多的质子,意味着更多的胍基丁胺在碱性条件下比野生型生产。酶的稳定性增强可能是有利的在这个过程中胍基丁胺生产的发展。尽管Arg的水溶性高20°C,即。,149 g/L, the substrate solubility could be further increased at a higher temperature, and more significant amounts of agmatine production could be achieved using the mutant.
结论
总之,我们理性地选择突变ADC的目标站点西文基于其PDB结构的二硫键的形成(2 vyc)。我们选择最好的表演者通过创建智能,专注与导弹库。Protein-ligand对接模拟这种变异表明,当258年Ile疏水侧链的位置换成了小的氨基酸阿拉巴马州,底物的活性位点的空间将被扩大。由于在碱性pH值增强的活性和稳定性,最后突变W16C / D43C I258A显示更好的胍基丁胺生产在整个反应比野生型。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
作者的贡献
所有作者贡献的概念和主要的思想工作。嗯起草的主要文本、数字和表。B-GK监督工作并提供评论和额外的科学信息。S-GL HY还审查和修改后的文本。所有作者阅读和批准了最终版本的出版工作。
资金
这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(NRF - 2018 r1a6a3a01012771)和(NRF - 2019 r1i1a1a01059843)。这项工作得到了韩国医疗设备由韩国政府发展基金拨款(科学与信息通讯技术、贸易、工业和能源、卫生和福利部,食品和药品安全)(项目编号:KMDF_PR_20200901_0151)。这项工作得到了韩国医疗设备由韩国政府发展基金拨款(科学与信息通讯技术、贸易、工业和能源、卫生和福利部,食品和药品安全)(项目编号:KMDF_PR_21A0301L1-11)。首尔国立大学工程研究所为这项工作提供了研究设施。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
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补充材料
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引用
Aglawe, M . M。、甘蓝、m B。,Rahangdale, S。R., Kotagale, N. R., Umekar, M. J., and Taksande, B. G. (2021). Agmatine Improves the Behavioral and Cognitive Impairments Associated with Chronic Gestational Ethanol Exposure in Rats.大脑研究牛。167年,37-47。doi: 10.1016 / j.brainresbull.2020.11.015
Andrell, J。,Hicks, M. G., Palmer, T., Carpenter, E. P., Iwata, S., and Maher, M. J. (2009). Crystal Structure of the Acid-Induced Arginine Decarboxylase from大肠杆菌:可逆Decamer装配控制酶活性。生物化学48岁,3915 - 3927。doi: 10.1021 / bi900075d
Aricioglu F。,Korcegez, E., Bozkurt, A., and Ozyalcin, S. (2003). Effect of Agmatine on Acute and Mononeuropathic Pain.安。N。Y学会科学。1009年,106 - 115。doi: 10.1196 / annals.1304.010
Bendl, J。,Stourac, J., Sebestova, E., Vavra, O., Musil, M., Brezovsky, J., et al. (2016). HotSpot Wizard 2.0: Automated Design of Site-Specific Mutations and Smart Libraries in Protein Engineering.核酸Res。44岁的W479-W487。doi: 10.1093 / nar / gkw416
Blethen, s . L。,Boeker, E. A., and Snell, E. E. (1968). Arginine Decarboxylase from大肠杆菌。生物。化学。243年,1671 - 1677。doi: 10.1016 / s0021 - 9258 (18) 93498 - 8
Bordoli, L。,Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., and Schwede, T. (2009). Protein Structure Homology Modeling Using SWISS-MODEL Workspace.Protoc Nat。4,1-13。doi: 10.1038 / nprot.2008.197
Bornscheuer, T。,和Pohl, M. (2001). Improved Biocatalysts by Directed Evolution and Rational Protein Design.咕咕叫。当今。化学。医学杂志。5,137 - 143。doi: 10.1016 / s1367 - 5931 (00) 00182 - 4
伯勒尔,M。,Hanfrey, C. C., Murray, E. J., Stanley-Wall, N. R., and Michael, A. J. (2010). Evolution and Multiplicity of Arginine Decarboxylases in Polyamine Biosynthesis and Essential Role in Bacillus Subtilis Biofilm Formation.生物。化学。285年,39224 - 39238。doi: 10.1074 / jbc.m110.163154
两位,G。,De Biase, D., Aurizi, C., Gut, H., Bossa, F., and Grutter, M. G. (2003). Crystal Structure and Functional Analysis of大肠杆菌谷氨酸脱羧酶。EMBO J。22日,4027 - 4037。doi: 10.1093 / emboj / cdg403
崔,t U。,Ahn, J. H., Ko, Y.-S., Kim, J. W., Lee, J. A., Lee, E. H., et al. (2020). Metabolic Engineering for the Production of Dicarboxylic Acids and Diamines.金属底座。Eng。58岁- 18。doi: 10.1016 / j.ymben.2019.03.005
崔H。,Kyeong, H.-H., Choi, J. M., and Kim, H.-S. (2014a). Rational Design of Ornithine Decarboxylase with High Catalytic Activity for the Production of Putrescine.达成。Microbiol。Biotechnol。98年,7483 - 7490。doi: 10.1007 / s00253 - 014 - 5669 - 8
崔y . H。金,J。H., Park, J. H., Lee, N., Kim, D.-H., Jang, K.-S., et al. (2014b). Protein Engineering of α2,3/2,6-Sialyltransferase to Improve the Yield and Productivity of在体外Sialyllactose合成。糖生物学24岁,159 - 169。doi: 10.1093 / glycob / cwt092
崔y . H。金,J。H., Park, B. S., and Kim, B.-G. (2016). Solubilization and Iterative Saturation Mutagenesis of α1,3-Fucosyltransferase fromHelicobacter Pylorito Enhance its Catalytic Efficiency.Biotechnol。Bioeng。113年,1666 - 1675。doi: 10.1002 / bit.25944
克雷格,d . B。,和Dombkowski, A. A. (2013). Disulfide by Design 2.0: a Web-Based Tool for Disulfide Engineering in Proteins.BMC Bioinf。14日,346年。doi: 10.1186 / 1471-2105-14-346
Denesyuk,我。,Denessiouk, K. A., Korpela, T., and Johnson, M. S. (2002). Functional Attributes of the Phosphate Group Binding Cup of Pyridoxal Phosphate-dependent Enzymes.j·摩尔,杂志。316年,155 - 172。doi: 10.1006 / jmbi.2001.5310
Guirard, b . M。,和Snell, E. E. (1980). Purification and Properties of Ornithine Decarboxylase from乳酸菌Sp。30。生物。化学。255年,5960 - 5964。doi: 10.1016 / s0021 - 9258 (19) 70724 - 8
诗,斐B。,Bönisch, H., Cichon, S., Allam, J.-P., Novak, N., and Molderings, G. J. (2011). Effects of Exogenous Agmatine in Human Leukemia HMC-1 and HL-60 Cells on Proliferation, Polyamine Metabolism and Cell Cycle.Leuk。Res。35岁,1248 - 1253。doi: 10.1016 / j.leukres.2010.12.023
阴霾,B。,和Dijkstra, B. W. (1988). Model Building of Disulfide Bonds in Proteins with Known Three-Dimensional Structure.蛋白质中。Des,选取。2,119 - 125。doi: 10.1093 /蛋白质/ 2.2.119
在香港,e . Y。,Lee, S. G., Park, B. J., Lee, J. M., Yun, H., and Kim, B. G. (2017). Simultaneously Enhancing the Stability and Catalytic Activity of Multimeric Lysine Decarboxylase CadA by Engineering Interface Regions for Enzymatic Production of Cadaverine at High Concentration of Lysine.Biotechnol。J。12日,1700278。doi: 10.1002 / biot.201700278
在香港,e . Y。金,J。Y., Upadhyay, R., Park, B. J., Lee, J. M., and Kim, B.-G. (2018). Rational Engineering of Ornithine Decarboxylase with Greater Selectivity for Ornithine over Lysine through Protein Network Analysis.生物科技j .》。281年,175 - 182。doi: 10.1016 / j.jbiotec.2018.07.020
荣格,E。,Park, B. G., Yoo, H.-W., Kim, J., Choi, K.-Y., and Kim, B.-G. (2018). Semi-rational Engineering of CYP153A35 to Enhance ω-hydroxylation Activity toward Palmitic Acid.达成。Microbiol。Biotechnol。102年,269 - 277。doi: 10.1007 / s00253 - 017 - 8584 - y
Kanjee U。,Gutsche, I., Ramachandran, S., and Houry, W. A. (2011). The Enzymatic Activities of the大肠杆菌基本的脂肪族氨基酸脱羧酶表现出抑制的pH值区。生物化学50岁,9388 - 9398。doi: 10.1021 / bi201161k
一,O。,米irovsky, Y., Dekel, S., Gilad, V. H., and Gilad, G. M. (2010). Safety and Efficacy of Dietary Agmatine Sulfate in Lumbar Disc-Associated Radiculopathy. An Open-Label, Dose-Escalating Study Followed by a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial.疼痛医学。11日,356 - 368。doi: 10.1111 / j.1526-4637.2010.00808.x
克鲁格,R。,和Rathgeber, S. (2008). Catalyzing Separation of Carbon Dioxide in Thiamin Diphosphate-Promoted Decarboxylation.2月J。275年,6089 - 6100。doi: 10.1111 / j.1742-4658.2008.06739.x
李,黄永发。,Chung, S.-W., Lee, H.-J., Jang, K.-S., Lee, S.-G., and Kim, B.-G. (2010). Optimization of the Enzymatic One Pot Reaction for the Synthesis of Uridine 5′-diphosphogalactose.Bioproc。Biosyst。Eng。33岁,71 - 78。doi: 10.1007 / s00449 - 009 - 0365 - 2
莫里斯·d·R。,和Boeker, E. A. (1983). [18] Biosynthetic and Biodegradative Ornithine and Arginine Decarboxylases from大肠杆菌。Enzymol方法。94年,125 - 134。doi: 10.1016 / s0076 - 6879 (83) 94020 - x
nei, v B。,Bettio, L. E. B., Moretti, M., Rosa, P. B., Ribeiro, C. M., Freitas, A. E., et al. (2016). Acute Agmatine Administration, Similar to Ketamine, Reverses Depressive-like Behavior Induced by Chronic Unpredictable Stress in Mice.杂志。物化学。Behav。150 - 151,108 - 114。doi: 10.1016 / j.pbb.2016.10.004
爱好者,f . H。,Berglund, H., and Vedadi, M. (2007). The Use of Differential Scanning Fluorimetry to Detect Ligand Interactions that Promote Protein Stability.Protoc Nat。2,2212 - 2221。doi: 10.1038 / nprot.2007.321
Ommati, M . M。Farshad, O。穆萨维,K。Taghavi, R。,Farajvajari, S., Azarpira, N., et al. (2020). Agmatine Alleviates Hepatic and Renal Injury in a Rat Model of Obstructive Jaundice.PharmaNutrition13日,100212年。doi: 10.1016 / j.phanu.2020.100212
裴,x D。,Lu, L. H., Yue, S. Y., Li, Y., Liu, X. L., Li, F., et al. (2021). Characterization of a Novel Shewanella Algae Arginine Decarboxylase Expressed in大肠杆菌。生物科技摩尔。》。doi: 10.1007 / s12033 - 021 - 00397 - 6
Piletz, j·E。,Aricioglu F。,Cheng, J.-T., Fairbanks, C. A., Gilad, V. H., Haenisch, B., et al. (2013). Agmatine: Clinical Applications after 100 Years in Translation.药物。今天18日,880 - 893。doi: 10.1016 / j.drudis.2013.05.017
波特,j·L。,Rusli, R. A., and Ollis, D. L. (2016). Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.Chembiochem17日,197 - 203。doi: 10.1002 / cbic.201500280
Rahangdale, S。命运,R。,Gajbhiye, M., Kapse, M., Inamdar, N., Kotagale, N., et al. (2021). Involvement of Agmatine in Antidepressant-like Effect of HMG-CoA Reductase Inhibitors in Mice.欧元。j .杂志。892年,173739年。doi: 10.1016 / j.ejphar.2020.173739
Reetz, m . T。,和Carballeira, J. D. (2007). Iterative Saturation Mutagenesis (ISM) for Rapid Directed Evolution of Functional Enzymes.Protoc Nat。2,891 - 903。doi: 10.1038 / nprot.2007.72
罗斯,b . L。,Sheffler, D. J., and Kroeze, W. K. (2004). Magic Shotguns versus Magic Bullets: Selectively Non-selective Drugs for Mood Disorders and Schizophrenia.Nat。启药物。3,353 - 359。doi: 10.1038 / nrd1346
歌,J。,Hur, B. E., Bokara, K. K., Yang, W., Cho, H. J., Park, K. A., et al. (2014). Agmatine Improves Cognitive Dysfunction and Prevents Cell Death in a Streptozotocin-Induced Alzheimer Rat Model.延世医疗。J。55岁,689 - 699。doi: 10.3349 / ymj.2014.55.3.689
太阳,X。,Song, W., and Liu, L. (2015). Enzymatic Production of Agmatine by Recombinant Arginine Decarboxylase.Catal j·摩尔。B: Enzym。121年,1 - 8。doi: 10.1016 / j.molcatb.2015.06.008
太阳,Z。,Lonsdale, R., Wu, L., Li, G., Li, A., Wang, J., et al. (2016). Structure-Guided Triple-Code Saturation Mutagenesis: Efficient Tuning of the Stereoselectivity of an Epoxide Hydrolase.ACS Catal。6,1590 - 1597。doi: 10.1021 / acscatal.5b02751
泰勒,t·J。,和Vaisman, I. I. (2010). Discrimination of Thermophilic and Mesophilic Proteins.BMC结构。医学杂志。10 5 1 (5。1),S5。doi: 10.1186 / 1472 - 6807 - 10 - s1 s5
星期四,联合国。侯,c . Y。金,w . H。,和Kang, T. J. (2013). Expanding the Active pH Range of大肠杆菌谷氨酸脱羧酶,破坏其合作性。j . Biosci。Bioeng。115年,154 - 158。doi: 10.1016 / j.jbiosc.2012.09.002
Toscano m, D。,Woycechowsky, K. J., and Hilvert, D. (2007). Minimalist Active-Site Redesign: Teaching Old Enzymes New Tricks.Angew。化学。Int。。46岁,3212 - 3236。doi: 10.1002 / anie.200604205
Trott, O。,和Olson, A. J. (2010). AutoDock Vina: Improving the Speed and Accuracy of Docking with a New Scoring Function, Efficient Optimization, and Multithreading.j .第一版。化学。31日,455 - 461。doi: 10.1002 / jcc.21334
韦德,c . L。,Eskridge, L. L., Nguyen, H. O. X., Kitto, K. F., Stone, L. S., Wilcox, G., et al. (2009). Immunoneutralization of Agmatine Sensitizes Mice to μ-Opioid Receptor Tolerance.j .杂志。其他实验。331年,539 - 546。doi: 10.1124 / jpet.109.155424
关键词:二硫桥,酶催化,大肠杆菌精氨酸脱羧酶、蛋白质设计,site-saturation诱变
引用:香港迪士尼,李s g, Yun H和金姆B-G(2021)提高稳定性和精氨酸脱羧酶的活性在碱性pH值胍基丁胺的生产。前面。Catal。1:774512。doi: 10.3389 / fctls.2021.774512
收到:2021年9月12日;接受:2021年11月02;
发表:2021年11月23日。
编辑:
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