Arylmalonate Decarboxylase-A多功能生物催化剂的合成光学纯羧酸
罗马市安娜·k·Schweiger
吴克群宫本茂2和
罗伯特Kourist- 1格拉茨科技大学的分子生物技术研究所,奥地利格拉茨
- 2生物科学和信息学、庆应义塾大学、日本横滨
细菌arylmalonate脱羧酶(AMDase)是一个有趣的cofactor-independent酶具有广泛的底物谱。特别是高度立体选择多样化arylmalonic酸转换为相应的手性α-arylpropionates导致了生物催化剂的广泛认可。,30多年后发现,本机衬底和AMDase仍未被发现的功能,从多个领域长期以来带来了一批实力强大的AMDase变异来访问各种各样的光学纯α-substituted类。本文旨在提供一个全面的概述的发展AMDase从酶与未知函数到一个强大的定制合成的生物催化剂工业相关的光学纯α-arylpropionates。历史视角以及最近的成就将会在这个领域的工作。
介绍
Arylmalonate脱羧酶(EC 4.1.1.76 AMDase),最初从土壤中分离细菌博代氏杆菌属bronchiseptica,能够催化α-aromatic进行脱羧反应的酶或α-alkenylmalonic酸产生相应的光学纯mono-acid没有代数余子式的帮助。而野生型酶表现出严格的(R)选择性、酶工程提供有效(年代)选择性或外消旋酶变异(图1一个)。本机函数或AMDase的天然底物,然而,迄今为止仍未知。独特的反应性和广泛的底物公差允许的生产不同的芳基或alkenylaliphatic羧酸在杰出的光学纯度,其中几个α-arylpropionates非甾体抗炎活动,所谓的profens (宫本茂Kourist, 2016)。
图1。(一)概述在AMDase催化不对称羧野生型(与Cys188变异)和(年代)选择性变异(Cys74)和AMDase催化外消旋化(变体Cys188 / Cys74)。(B)假定反应通路α-phenylmalonic acid-converting微生物(上)并提出对α-chiral酸路线通过同一decarboxylative活动(底部)。(C)脱酸后检测反应产物13C-labelled手性丙二酸基板由野生型AMDase表明,pro - (R)羧酸盐是消除在任何情况下的反应。(D)首先基于假设,假设机制,AMDase充当硫醇脱羧酶。硫代酸酯形成在衬底和半胱氨酸后活性部位,pro - (R)羧酸盐裂解,生成的烯醇化物拆分的质子化了的如果的脸。
发现Arylmalonate脱羧酶
宫本茂et al。发现arylmalonate脱羧酶(AMDase)在1990年代在筛选确定酶手性分子的一代前手性的丙二酸酯的酶法脱羧(宫本茂太,Hiromichi 1990;宫本茂和研究员合作,1992)作为malonyl-ACP进行脱羧反应的酶代谢的关键一步,似乎可能细菌分解代谢可能拥有丙二酸盐脱羧酶。筛选后的假设脱α-phenylmalonic酸1可以代表最初的一步新陈代谢,紧随其后的是氧化产生2-oxo-2-phenylacetic酸。因此,它提出了类似的脱酸双取代的丙二酸酸会导致α-chiral酸,进一步氧化不可能(图1 b)。
微生物的生长能力的测定phenylmalonic酸1作为唯一碳源导致土壤细菌的鉴定产碱杆菌属bronchisepticusKU 1201(现在:博代氏杆菌属bronchiseptica)。它可以显示,整个细胞的细菌也转换α-methyl-α-phenylmalonic酸2并与各种芳香残留物(宫本茂类似的基质太,Hiromichi 1990;宫本茂和研究员合作,1992 b)。脱羧酶纯化的微生物,名叫arylmalonate脱羧酶(AMDase),由于其对α-arylmalonates偏好。纯化酶的特征表明它没有代数余子式和biotin-independent。然而,本地角色和基质AMDase仍不清楚,作为芳基丙二酸酯不自然丰富的(宫本茂和研究员合作,1992 b)。
说明酶机制和选择性
酶被发现后不久,宫本茂et al。旨在揭示酶的立体选择性通过同位素标记研究(宫本茂et al ., 1992 b)。为此,两对映体13C-labelledα-methyl-α-phenylmalonic酸2合成的地方。酶促反应的产物进行了分析通过13透露,如果C NMR光谱(年代)衬底,(R)配置产品仍然包含了13C-labelled羧酸盐,而在案件的R)衬底,浓缩的13C中没有检测到剩下的羧酸盐(R)配置的产品(图1 c)。这些结果表明,在两种情况下,完全赞成(R)羧酸盐裂解,产生最终产品通过反演的配置。后来,这一发现被Okrasa证实et al。使用18对映异构的标签羧酸盐组(Okrasa et al ., 2009)。
观察,AMDase被巯基试剂表明AMDase可能是硫醇脱羧酶(宫本茂和研究员合作,1992 b)。因此,第一步的反应被认为是形成职业之间的硫代酸酯(年代)羧酸盐基质和半胱氨酸残基的活性部位(cf。激活在脂肪酸生物合成辅酶A) (图1 d)。观察到的反转配置,然而,在其他已知的脱羧酶差异,配置严格保留(金姆和Kolattukudy, 1980年)。这促使作者提出一个年代E2型与完整的反转,共同机制或中间层烯醇化物的形成,进一步被拆分的方式从质子化了的如果脸(图1 d)(宫本茂et al ., 1992 b)。形成一个带电中间被发现也支持基质轴承吸电子集团(ewg)转换以更高的速度,因为它们能够稳定负碳离子形成的所谓中间(宫本茂和研究员合作,1992 b)。
AMDase基因的鉴定及序列分析透露,这种酶包含四个半胱氨酸残基(C101, C148, C171 C188) (宫本茂和研究员合作,1992)。都出现在减少国家和只有突变的C188丝氨酸(C188S)证明不利于酶活性(公斤ydF4y2Ba猫),表明其关键作用的反应机理(宫崎骏et al ., 1997)。然而,不久之后,很明显,硫代酸酯形成不AMDase机制发挥作用。相反,它是建议Cys188,而作为质子给予体。这成为显而易见的野生型酶后,有更多的酸性活性中心的半胱氨酸残基,在pH > 9灭活,而没有相应的C188S变体。有趣的证据被发现在相当远程相关(同源性30%)消旋酶的酶和异构酶家族(Matoishi et al ., 2004)。这些酶,研究关于他们的机制,也在这一地区,呈现出一个高度保守的半胱氨酸残基函数作为一个质子捐赠残渣(Glavas坦纳,1999年)。
反演的选择性和消旋酶活动的介绍
一些酶发现AMDase约有30%的同源性通过PSI-BLAST (position-specific迭代基本局部比对搜索工具),都属于类的异构酶(EC 5)。谷氨酸消旋酶(乳酸菌fermenti)、天冬氨酸消旋酶(乳酸链球菌),hydantoine消旋酶(假单胞菌sp.应变NS671)和马来酸异构酶(粪产碱杆菌属)所有与AMDase分享守恒的半胱氨酸在188的位置,而酶从异构酶类有一个额外的半胱氨酸残在74 (图2一个)(Ijima et al ., 2005)。谷氨酸的反应机理和晶体结构消旋酶已经被充分研究过的,两个半胱氨酸残基提出了两岸的底物为外消旋活动至关重要,通过抽象或捐赠质子从相反的网站在一个所谓的两种基本机制(Glavas坦纳,1999年)。
图2。(一)氨基酸序列之间的同源性AMDase和选择消旋酶识别通过PSI-BLAST。谷氨酸消旋酶的乳酸菌fermenti天冬氨酸消旋酶,乳酸链球菌,hydantoine消旋酶的假单胞菌sp.应变NS671,马来酸异构酶粪产碱杆菌属和AMDase博代氏杆菌属bronchiseptica。(B)提出绑定模式和交互的网络α-methyl-α-phenylmalonic酸2(左)和enediolate中间(右)的活性位点AMDase WT。pro - (R)羧酸盐所示蓝色和灰色dioxyanion洞。
受这些发现,Ijimaet al。决定引入半胱氨酸在甘氨酸残基的位置74而不是出现在AMDase (Ijima et al ., 2005)。此外,先前的研究表明,突变G188S导致大幅减少本地AMDase活动(宫崎骏et al ., 1997)。虽然proton-donating丝氨酸已经很低的能力与半胱氨酸相比,作者提出一种氨基酸没有任何酸性质子将是有益的对映体过量的获得产品。令人惊讶的是,突变G188A被证明是完全不活跃。因此,double-variant G74C / C188S准备,和被发现产生相反的对映体在94 - 96年%ee与野生型相比AMDase。然而,活动G74C / C188S变体甚至跌破C188S极大地降低活动(Ijima et al ., 2005)。有趣的是,还为(年代)选择性变异S36N / G74C / C188S,偏爱乳沟的pro - (R)观察羧化物同位素标记研究(Terao et al ., 2006 a),从而证实拆分reprotonation烯醇化物中间是决定性的最后配置的产品(宫本茂et al ., 2007 a)。已经观察到Ijimaet al。单一氨基酸交换G74C呈现arylmalonate脱羧酶消旋酶(Terao et al ., 2006 b)。值得注意的是,AMDase脱羧酶活性的保存在G74C变体,收益率从arylmalonates外消旋arylpropionates。动力学分析透露,催化效率(公斤ydF4y2Ba猫/K米),脱酸(0.96 s−1毫米−1)超过了外消旋化(0.56 s−1毫米−1),这也反映出了外消旋反应的产品已经在早期检测到(Terao et al ., 2006 b)。
晶体结构和机制
尽管AMDase晶体结构仍然没有解决,直到2008年,已经收购了当时相当大的启示,其中包括建议酶机制(宫本茂et al ., 1992 b;宫本茂et al ., 2007 a;Matoishi et al ., 2004),识别关键残基(Matoishi et al ., 2004;Terao et al ., 2007),在选择性开关(Ijima et al ., 2005;Terao et al ., 2006 a)和消旋酶活动的介绍(Terao et al ., 2006 b)。然而,的确切机制稳定高度不稳定enediolate中间仍然难以捉摸。而其他酶相关的烯醇化物中间体使用Mg2 +稳定(Gerlt et al ., 2005),活动AMDase不依赖于金属离子或其他辅助因子(宫本茂和研究员合作,1992 b)。此外,离域电子密度到稳定的芳环系统可能部分解释enediolate但也不足以解释观察到的高效酶脱酸(Okrasa et al ., 2008)。
通过求解第一晶体结构的野生型AMDase (PDB: 3 dg9) Okrasaet al。能够解决关键特性的详细酶活性和选择性。有趣的是,在核心结构组成的两个四股平行β-sheets几个α-helices包围,一个紧密地绑定磷酸盐离子活性部位附近发现了半胱氨酸188。总共六个氢键Thr75由侧链和骨干作用,建立了Ser76, Tyr126, Cys188 Gly189,属于两个相邻oxyanion孔(Okrasa et al ., 2008)。作者表明,磷酸盐可能像enediolate中间的位置。在回顾,这种结构性主题称为“dioxyanion洞”也发现了在异构酶家族的相关酶和突变研究Thr75 Ser76或Tyr126 AMDase已经证明了这一地区的重要作用酶活性(Terao et al ., 2007;Okrasa et al ., 2008)。
确认损失后的pro - (R)羧酸盐18O-labelling策略,enediolate中间造成脱α-methyl-α-phenylmalonic酸2被放置在活动网站。很明显,苯基一部分占据了大量溶剂的口袋里,而小甲基取代基在一次迎新会上,只有小空间可用。考虑到这些限制的固定位置pro - (年代)羧酸盐滞留在dioxyanion的洞,这是暗示pro - (R)羧酸盐必须指向一个小疏水口袋(Leu40、Val43 Val156, Tyr48),可以作为动力羧由疏水不稳定图2 b)。因此,关键cofactor-free脱羧,AMDase提出了广泛的羧酸盐的稳定,而另一个是面临不利的静电相互作用(Okrasa et al ., 2008)。
这个提议绑定模式确认与系统抑制剂benzylphosphonate AMDase co-crystallized时(K我= 5.2毫米)(PDB: 3 ip8) (Okrasa et al ., 2009)。同样,膦酸酯二阶阴离子被六紧密参与氢键的残留dioxyanion洞和苯残渣被定位在大口袋内堆放Gly189-Gly190酰胺债券和Pro14通过范德华相互作用。
Obataet al。解决了晶体结构的G74C /含有乙酸配体2-phenyl C188S变体(港口拥有ixl, PDB: 3图3一)和G74C变体(PDB: 3 ixm,图3 c)和WT酶(PDB: 3数字电视,图3 d硫酸)相关表单(Obata Nakasako, 2010)。的总体结构AMDase G74C / C188S主要是保存与野生型相比结构包含BnzPO (PDB: 3 ip8,图3一)或订单43−(PDB: 3 dg9)的活性部位(RMSD Cα原子约。0.25),相当大的构象差异成了明显的对比42−野生型的相关结构和G74C变体(PDB: 3 dtv和3 ixm)。建议一个位置的Cys188-Gly189-Gly190转向Gly74-Thr75诱导配体结合,从而引发的形成一个疏水网络覆盖活性部位(Val43, Thr154 Val156)。unliganded (42−相关)的晶体结构,集群没有观察到,如相应的循环区域不联系对方。此外,在这种构象,剩余188的关键是旋转的配体对疏水口袋,而“非生产性”取向(图3 c, D)。这些观察表明存在一个“打开”或“关闭”构象,受配体绑定(图3)(Obata Nakasako, 2010)。类似的行为结构的空和配体之间相关的谷氨酸消旋酶酶被发现(Puig et al ., 2009))。
图3。表示的活性部位(一)AMDase G74C / C188S与醋酸2-phenyl港口拥有ixl) (PDB: 3和叠加(B)AMDase WT在复杂benzylphosphonate (BnzPO) (PDB: 3 ip8),(C)AMDase G74C在复杂42 -(PDB: 3 ixm)和(D)AMDase WT在复杂42 -(PDB: 3 dtv)。的活性位点残基AMDase G74C / C188S所示颜色和各自的叠加结构灰色。虚线代表H-bonds之间形成羧酸盐和残基侧链(红色)或骨干NH组(蓝色)。图用PyMOL创建。
然而,最重要的是观察到的位置Cys74 G74C / C188S变种确实是在镜面对称C188 AMDase WT关于Cα原子enediolate的中间,这就使质子化反应,从而证实了早期选择性反转(提出理由Ijima et al ., 2005;Terao et al ., 2007)。在绑定模式下,最终产品的配置只依赖于enantioface-selective质子化作用,而发生的如果面对Cys188或再保险面对Cys74,导致(R)或(年代)2-phenylpropionate分别根据实验数据(Miyauchi et al ., 2011)。
计算模拟酶的机制
的反应机理AMDase也计算研究的主题。林德和Himo研究了机制通过密度泛函理论(DFT)计算(林德Himo, 2014)。集群采用量子化学方法,机制,静止点,研究了选择性的帮助下两种不同截断活性位点模型。较小的模型只有部分包含的残留dioxyanion洞和催化Cys188(81原子),而第二个模型另外包括残留的小型和大型绑定口袋(223原子)。使用小模型的结果表明一个两步机制进行通过平面enediolate中间似乎是合理的,与脱羧一步被病原。然而,绑定模式导致的乳沟pro - (R)或pro - (年代能源(1.9千卡)羧酸盐非常类似摩尔−1首次绑定的姿势;1.5千卡摩尔−1过渡态)可能由于缺乏约束力的口袋取代基决定剩余的方向,因此无法解释观察到的选择性与这个小模型(> 99%ee对应于至少三千卡摩尔−1)。通过使用较大的模型,计算能量的绑定和脱酸分别为14.1和18.3千卡摩尔−1高的形成(年代)对映体比(R)产品,主要是由于不利的空间冲突的大芳基取代基的残留小绑定的口袋里。当小α-methyl-α-vinylmalonic酸进行了研究,模棱两可的结果关于绝对过渡态的能量,可能是太小和刚性模型的结果绑定的口袋。绑定模式和过渡状态,然而,在能源相比更接近α-methyl-α-phenylmalonic酸2。这将表明,立体选择性完全取决于衬底绑定笨重的芳香族化合物,而较小的基质,脱羧过渡态也可能导致enantiodiscrimination (林德Himo, 2014)。就在最近,Dasguptaet al。强调几何约束等介绍了量子化学的研究可能导致构件(如虚振动频率和受损的整体效率优化过程(达斯古普塔和赫伯特,2020)。因此作者介绍了软谐波限制势的终端原子模型,从而避免了人工fixed-atom截断活性位点模型的变形和刚度。通过使用这个系统,他们可以复制从先前的研究结果(林德Himo, 2014),并进一步声称,这种方法很容易实现,可以大大降低优化工作(达斯古普塔和赫伯特,2020)。
前面描述的建模方法中,结果大大依赖截断酶模型的大小(林德Himo, 2014;达斯古普塔和赫伯特,2020)。为了获得一个更全面的概述AMDase选择性的分子水平上的起源,一个完整的酶模型将是非常可取的。特别是违反直觉的影响观察后迭代内饱和突变AMDase活性部位腔(Okrasa et al ., 2009;Miyauchi et al ., 2011;吉田et al ., 2015)需要考虑整个第一协调球体。因此,实证价键(EVB)方法是我们选择的方法论,这是由metadynamics模拟进一步补充Warshel Weiss, 1980;Barducci et al ., 2008;胆汁et al ., 2020)。EVB模拟能够繁殖实验观察活化能障碍(在三千卡摩尔−1)和优惠的乳沟pro - (R)羧酸盐集团已经决定在米歇利斯基板定位中复杂。然而,奇怪的是,(年代)选择性CLGIPL变异显示优惠乳沟的pro - (年代)集团仍然导致预期的形成(年代由于反应)对映体通过不同的基质构成有约束力。化合物,没有或者只差转换AMDase和变异,增加灵活性和能动性在模拟期间观察活性部位。由此产生的基板定位不足而且允许水进入活性中心,可能会破坏脆弱的交互网络重要催化(胆汁et al ., 2020)。通过咨询网格不均匀溶解理论(要点)(阮et al ., 2012;阮et al ., 2014)来分析当地的疏水性AMDase内活跃的网站,我们发现明显证据的机制由基态扰动由羧酸盐截留to-be-cleaved疏水环境中。这些分析还显示额外的疏水空腔的出现CLGIPL变体,这种变体可以反应通过另一个绑定的姿势和意想不到的乳沟的pro - (年代)羧酸盐。而改变的疏水口袋CLGIPL变体不是通过设计,针对工程活性部位的疏水性为未来AMDase工程提出了一个重要的方法。WT-MetaD模拟进一步证实反应绑定姿势(根据EVB模拟)也伴随着人口最多绑定姿势米歇利斯观察到复杂的大多数研究案例。因此,AMDase选择性部分已经在衬底的阶段确定绑定,但选择性扰动不同羧基(导致极化子扰动)似乎是最终的反应过渡态(真正的决定因素胆汁et al ., 2020)。
布希et al。用半经验的QM / MM计算研究的机制AMDase消旋酶变异G74C (Busch et al ., 2016)。MD模拟显示,两个催化半胱氨酸在deprotonated状态需要成功的催化作用。在谷氨酸消旋酶相比,co-catalytic残留激活半胱氨酸(Glavas坦纳,2001年),水是建议deprotonate相应的残留AMDase G74C衬底之前绑定,然后进一步稳定硫醇盐洞。这也可能解释的明显pH-dependency反应。半经验的进一步计算表明分段机制类似于脱羧、基质内,离域π-electron系统必须稳定enediolate中间(Busch et al ., 2016)。同样的先前的研究(林德Himo, 2014),没有迹象显示为一个协调机制描述谷氨酸消旋酶(Puig et al ., 2009))。
另一项研究由Karmakaret al。针对模拟有限公司2从活性部位和产品发布(Balasubramanian Karmakar和,2016年)。通过执行(操纵)MD模拟表明,释放的脱羧产物大力不利,甚至超越了脱羧一步,所以可能会呈现产品发布真正的病原反应步骤(WT:∼14千卡摩尔−1脱羧和∼23千卡摩尔−1产品发布)。作者声称,这也会一定程度上减少活动占G188S / G74C变体(20000倍)(Miyauchi et al ., 2011),作为产品发布的计算能量势垒在这种情况下甚至更高(∼20千卡摩尔−1对脱羧和∼37千卡摩尔−1产品发布)(Balasubramanian Karmakar和,2016年)。
底物范围
已经被发现后AMDase,宫本茂和太彻底的特征酶及其底物范围(宫本茂和研究员合作,1992 b)。这些基本的发现,在没有获得任何酶结构和机械知识,为研究提供了基础至今通过展示AMDase基质的基本限制。1)空间小的取代基效应发挥着至关重要的作用,作为mono-substituted丙二酸酯是转换速度比相应的甲基化基质。此外,乙模拟转换。2)芳香族取代基是必不可少的活动,作为与苄-基质,含苯氧基的——或者phenylthio——而不是一个苯基惰性(宫本茂太,Hiromichi 1990)。这也适用于丙二酸(Rl= H)或methylmalonic酸(Rl= CH3)。3)只有自由酸丙二酸可以作为基质,相应的mono -和二元酸酯没有接受。4)吸电子取代基的芳基提高反应速率,更好的稳定提出了负碳离子的中间。表1总结了基质研究AMDase催化脱羧和外消旋化。
表1。概述AMDase衬底上的范围。
大的取代基Rl提供衬底支架内的重大变化。苯基-(宫本茂太,Hiromichi 1990;宫本茂和研究员合作,1992 b;宫本茂et al ., 1992 a;宫本茂et al ., 1994;宫崎骏et al ., 1997;福山et al ., 1999;Matoishi et al ., 2000;Terao et al ., 2006 b;Terao et al ., 2007;Okrasa et al ., 2008;Okrasa et al ., 2009;田村et al ., 2008;Kourist et al ., 2011 b;Miyauchi et al ., 2011;吉田et al ., 2015;列文et al ., 2015),2-naphthyl - (宫本茂和研究员合作,1992 b;Ijima et al ., 2005;Terao et al ., 2006 a;Terao et al ., 2006 b;Terao et al ., 2007;Miyauchi et al ., 2011)和噻吩基-(宫本茂太,Hiromichi 1990;宫本茂和研究员合作,1992 b;Ijima et al ., 2005;Terao et al ., 2006 a;Terao et al ., 2006 b;Terao et al ., 2007;列文et al ., 2015)丙二酸酸是典型基质AMDase和无处不在的文学。随着时间的推移,底物范围扩展到了大量的各种取代苯基衍生物(o加(宫本茂太,Hiromichi 1990),p加(宫本茂和研究员合作,1992 b;Kourist et al ., 2011 b),p- - - - - -iso丁(吉田et al ., 2015),p-不2(Kourist et al ., 2011 b渗出性中耳炎),(宫本茂太,Hiromichi 1990;宫本茂和研究员合作,1992 b;Kourist et al ., 2011 b),F (宫本茂et al ., 1992 a;宫本茂和研究员合作,1992 b)、Cl(宫本茂太,Hiromichi 1990;宫本茂和研究员合作,1992 b;宫本茂et al ., 1994),CF3(宫本茂et al ., 1992 a),pph -米- f (Kourist et al ., 2011 b;Gaßmeyer et al ., 2016),米-COPh (Kourist et al ., 2011 b))、萘衍生品(1-naphthyl (宫本茂和研究员合作,1992 b),6-methoxynaphthalen-2-yl(宫本茂太,Hiromichi 1990;Kourist et al ., 2011 b;Miyauchi et al ., 2011;吉田et al ., 2015;Gaßmeyer et al ., 2016)杂环(pyridinyl (Kourist et al ., 2011 b;列文et al ., 2015),furanyl和双环系统(列文et al ., 2015))和烯基(Okrasa et al ., 2009;Kourist et al ., 2011 b)基质。
至于小取代基R年代,很快就认识到,除了H和CH3,其他小组像D (Matoishi et al ., 2000),F (宫本茂et al ., 1992 a),哦,或者NH2(田村et al ., 2008)通常是容忍,而较大的烷基组(乙(宫本茂和研究员合作,1992 b)或丙(Terao et al ., 2006 b;Kourist et al ., 2011 b)没有或只有在很低的汇率转换(Terao et al ., 2006 b;Kourist et al ., 2011 b)。这是后来用结构分析来解释,因为只有有限的空间是可用的位置留给这组(Okrasa et al ., 2008;Obata Nakasako, 2010)。
宫本茂已经暴露et al。1992年,存在羧继续免费di-acid是必不可少的宫本茂和研究员合作,1992 b)。这也是证明有效的外消旋化活动AMDase,羧酸盐衍生物如醇、酰胺、腈(Terao et al ., 2006 b)、酯(Terao et al ., 2006 b;Kourist et al ., 2011 b)、硫代酸酯、酮、醛(Kourist et al ., 2011 b)是完全不活跃。因此,自由羧酸盐的稳定通过dioxyanion洞内的复杂网络似乎至关重要,无论脱羧和外消旋化。到目前为止是唯一已知的特殊情况(nitromethyl)苯、接受作为衬底的AMDase消旋酶G74C和G74C / V43A (Kourist et al ., 2011 b)。一般认为基质的结构看起来更决定性的成功转换,比α-proton酸度α-aryl类(Kourist et al ., 2011 b)。
的空间布置,宫本茂et al。提出的平面对齐苯基和α-substituent允许最优的重叠π-orbitals以稳定烯醇化物上的电荷形成中间(宫本茂et al ., 1994)。在的情况下昊图公司代替基质如α- (o-chlorophenyl)丙二酸,两个构象来考虑,即syn- - -反-periplanar安排(图4 a, B)。
图4。(一)共面安排的芳环和α-substituent R syn——或者反-periplanar构象的昊图公司取代基X(大胆的灰色的债券)。Indane-1, 1-dicarboxylic酸(IDA)作为构象上限制模型底物为底物接受研究的贡献。(B)碳碳键旋转的势能图α- (o-chlorophenylmalonic)(黑色方块)和α-酸(o-chlorophenyl) -α-methylmalonic酸(灰色圆圈)和高频/ 3-21G *计算。苯基环是用矩形表示各自的纽曼式旋转异构体。图中提供基于数据创建的宫本茂et al。(1994)。
动力学的研究显示,尽管AMDase的活动对α- (o-chlorophenyl)丙二酸甚至超过α-phenylmalonic酸1,相应的α-methyl-substituted化合物不被接受。这导致了假设,syn-periplanar AMDase-mediated去安排是必要的,这可能反过来失宠与额外的α-substituent基质,由于空间的冲突昊图公司取代基(宫本茂et al ., 1994)。从头开始从而进行评估计算的能量沿着C旋转过程中遇到障碍α- c基于“增大化现实”技术债券。结果为α- (o-chlorophenyl)丙二酸表示两个对应于一个稳定的构象syn——或者反-periplanar取向(约。0°、360°和180°)。小能量区别这两种结构(< 1千卡摩尔−1)所示,空间之间的排斥力ocl和α-H可以忽略不计。令人厌恶的贡献主要是相互作用引起的氯残留羧化物(图4 b)。的α- (o-chlorophenyl) -α-methylmalonic酸,一个反-periplanar取代基或垂直排列的大力支持,而syn-periplanar-like构象被发现是不稳定的(图4 b)。
这是进一步提出,通过构象上限制indane-1, 1-dicarboxylic酸(IDA),syn-periplanar构象会模仿,从而降低活化熵ΔS‡(图4一)。事实上,模型底物接受了IDA AMDase与相应的α-methyl-α- (o甲苯基)丙二酸,从而强调后者无法克服转动能量障碍走向一个合适的syn-periplanar安排转换(宫本茂et al ., 1994)。非常低的K米值观察IDA相比其他基质研究进一步肯定了这样的空间安排是否适合AMDase-catalyzed脱酸(宫本茂et al ., 1994;川崎et al ., 1996)。在这种情况下也提出,疏水口袋内的活性位点可能负责正确定位无限制的基质通过CH-π交互(西et al ., 1995),从而减少活化熵在类似的方式(川崎et al ., 1996)。
酶工程
鉴于最初创建的极大地降低了效率与倒生的变体(Ijima et al ., 2005)或外消旋活动(Terao et al ., 2006 b)本机酶相比,相当大的努力恢复甚至提高酶工程的活动了,直到今天。
酶工程(年代)选择性C188X / G74C-Based变体
当时,当Ijimaet al。首先描述AMDase G74C / C188S变体,选择性的反演获得的仅仅是用人还发现空间镜面对称的残留188年和74年是有趣的。然而,活动的变体遭受的损失将减少公斤ydF4y2Ba猫(见表2)(Ijima et al ., 2005)。早期的尝试恢复活动通过随机诱变导致变异(S36N / G74C / C188S)增加(10倍)活动共有50000筛选克隆(Terao et al ., 2006 a)。这反映出酶进化纯粹依靠随机化的难度缺乏理性的指导。
表2。动力学参数的AMDase WT (年代2)选择性变异对α-methyl-α-phenylmalonic酸根据吉田et al。(2015)。相对活动计算除以催化效率(公斤ydF4y2Ba猫/K米)每个变体的催化效率G74C / C188S变体。
AMDase结构数据变得可用,之后,灵感来自前发现,疏水口袋里残留的变化可以强烈增强酶活性(Okrasa et al ., 2009)Miyauchiet al。也试图G74C / C188S定向演化的变体。这一次,结构信息提供了三轮定向进化的基础通过迭代饱和突变(ISM) (Reetz et al ., 2008首先Ser188),残留的疏水口袋(Leu40、Val43 Tyr48, Leu77, Val156, Met159)在接下来的回合(NNK引进的20种氨基酸密码子)(图5)(Miyauchi et al ., 2011)。Cys188-substituting残留酶活动的关键作用是证明了早些时候由G74C / C188A变体完全不活动(Ijima et al ., 2005)。从第一轮筛选,变体G74C / C188G被认定向α-phenylmalonic酸具有活性增加5.6倍1。通过使用这种变体作为第二代的一个模板,一个三突变体(G74C / M159L / C188G)与活动演变高出210倍。有趣的是,从最后一轮筛选突变体选择(Y48F / G74C / M159L / C188G) 920倍增加活动进行突变Y48F,在第二代已经找到有益的突变体。疏水口袋内的所有确认有益突变是由于疏水替换,从而突显出的高度重视为脱酸不稳定的环境。
图5。酶变异进化从AMDase G74C / C188S三轮定向进化通过迭代饱和突变(ISM)对α-phenylmalonic酸和具体的改进活动1。第一次(灰色),二(绿色)和三(蓝色)筛查如箭头所示。从Miyauchi复制等。Miyauchi et al。(2011)从皇家化学学会的许可。
的选择是基于转换α-phenylmalonic酸1、活动向α-aryl-α-methylmalonic酸显著不同。虽然G74C / M159L C188G变异显示相对增加合成萘普生的活动8 b从其相应的丙二酸酯(220倍更高的特定活动),四变体Y48F / G74C / M159L / C188G,优越的转换α-phenylmalonic酸1,只表现出减少活动。此外,略微受损的选择性G74C / C188S变体完全废除C188G-based变体(> 99%ee),表明潜在的不利的交互丝氨酸一半的烯醇化物中间(Miyauchi et al ., 2011)。
由于以前创建的变体,协同效应通过多个氨基酸交流疏水口袋内的强烈暗示。吉田et al。同时进行饱和突变(SSM)在以前进化G74C / M159L C188G(轻型导弹巡洋舰)变体(Miyauchi et al ., 2011),它允许多个站点同时变化(吉田et al ., 2015)。此外,作者认为,进化对甲基取代α-arylmalonic酸会有利而简单α-phenylmalonic酸1,相应的光学纯产品的主要兴趣(Kourist et al ., 2011 a)。再次,残留的疏水口袋被选为诱变目标,由于附近的芳基残渣(Leu40 Val156)或proton-donating Cys74 (Met73)。AMDase轻型导弹巡洋舰被用作起始变体,由于其优越的合成萘普生的活动8 b(Miyauchi et al ., 2011)和一组有限的介绍了氨基酸在选定的网站通过VTK密码子(Ile低浓缩铀,Val和满足)。令人惊讶的是,只有变异突变在V156从第一代选择库,从而表明其脱羧机制至关重要的作用。最好的变体CLG-L (G74C / V156L / M159L / C188G)被选为第二轮舰导弹(见表2),周边地区重要的残留Val156 Met159目标(Val43和Ala125)。有趣的是,从这三个选择变异与改善活动,包括两个突变A125P,这看起来奇怪,A125α-helix的一部分。这种筛查中发现最活跃的变体是CLGL-IP (V43I / G74C / A125P V156L / M159L / C188G),催化效率(公斤ydF4y2Ba猫/K米)提高2.1倍比CLG-L和超过9000倍比最初G74C /(见C188S变体表2)。
CLGIPL变体是高度(年代选择性和最活跃的在年代对所有测试基板)选择性酶变异。值得注意的是,丙二酸酯7一个转换了AMDase CLGIPL 1.3 U毫克−1(不是由G74C转换/ C188S)也超过两个的速度比野生型酶(0.53毫克−1)。还萘普生8 b你是由CLGIPL(17毫克−1)高的活动,但超越的(R)有选择性的野生型(88毫克−1)(吉田et al ., 2015)。的AMDase CLGIPL变体也变成了高效的丙二酸酯的转换6U(55毫克−1)与野生型相比(33.1毫克−1)和(年代U(15.8毫克)选择性轻型导弹巡洋舰变体−1)(Gaßmeyer et al ., 2016)。有趣的是,AMDase野生型具有较高的活动对萘普生的形成8 bFlurbiprofen相比6 b,而AMDase CLGIPL显示了一个倒生的偏好。这强调再一次的固有反应底物不果断AMDase活动相比,生产能力的绑定的活性部位和sterical电子相互作用产生的。
酶工程(R)选择性WT-Based变体
通过解决AMDase WT晶体结构在复杂系统抑制剂苄基膦酸酯,Okrasaet al。能够进一步合理化酶活性位点残基的相互作用和衬底支架(Okrasa et al ., 2009)。他们进一步提出,烯基根也可能承担合适的离域电子密度的反应,类似于以前研究与芳基残留基质。事实上,测试了烯基基板被证明是适合AMDase-catalyzed脱羧,然而在低效率作为芳香同行。尽管他们相对较低的营业额数字(公斤ydF4y2Ba猫),大多数的烯基基质常常表现出更高的亲和力(K米)AMDase比相应的苯衍生物。证明虚拟交互模式在活性中心,两套残留物(Pro14, Pro15 Gly190从绑定的大口袋和Val43 Met159疏水口袋)被选为三轮迭代饱和突变(NNK所有20种氨基酸编码)。由于设置,建立突变体筛选α-phenylmalonic酸1,但后来还测试了对新引入烯基基板(Okrasa et al ., 2009)。
通过引入单点突变M159V,相对活动向α-phenylmalonic酸151-fold长大,因此同时暗示,它不是本机AMDase衬底(表3,输入1)。双突变P14V / P15G表现出增强的活动对不同基质(表3,输入2 - 4),这可以归因于一个普遍提高灵活性较大的约束力的口袋内。M159V的适用性和P14V P15G变异后来还与一系列例证α-heterocyclic前手性的丙二酸的酸(列文et al ., 2015)。substrate-fit的重要性也证明了G190A变体,它转换α-methyl-α-vinylmalonic酸4所有测试的最小的基质,增加4.6倍活动(表3,条目5)。作者建议稍微降低了空间袋内可能有利于小乙烯基集团的绑定,这也反映在降低K米值(0.8毫米)比野生型(7.8毫米)(Okrasa et al ., 2009)。
表3。对不同底物动力学参数AMDase wildtype-derived变体。相对活动是取自文献,要么是计算除以催化效率(公斤ydF4y2Ba猫/K米)每个变体的野生型的催化效率AMDase(1 - 5)或相应的具体的活动(6项)。
Gaßmeyeret al。表明,通过转移的氨基酸替换之前发现有益的(年代)选择性CLGIPL变体(V43I / A125P / V156L M159L C188G / G74C除外),一个强有力的(R)有选择性的变体(IPLL)的生产(R)-Flurbiprofen6 b被创建。四变量转换相应的丙二酸酯与209 U毫克−1收益率(R)-Flurbiprofen6 b在98%ee代表增加6倍的具体活动相比,本机AMDase (表3条目6)(Gaßmeyer et al ., 2016)。
酶工程Racemising G74C-Based变异的活动
有限的活动AMDase G74C消旋酶对笨重和工业相关α-aryl丙酸衍生物(也称为profens)促使Kouristet al。创造更多合适的消旋酶变异通过理性的酶工程(Kourist et al ., 2011 b)。而试图引入co-catalytic残留物(Asp, Glu,他)出现在相关的谷氨酸消旋酶GluR (Glavas坦纳,2001年)在相应的位置AMDase (Val13、Pro14 Gly190)只导致无效突变体,疏水口袋里残留的变化证明更成功。疏水口袋内扰动对脱羧、至关重要,然而,只有扮演配角的角色外消旋化。然而,大部分构成残留在反应中心的距离,从而间接影响消旋酶的活动。对于AMDase G74C, MD模拟显示,Val43和Met159强有力的工程目标,由于附近的小的取代基。的两个变体设计,AMDase G74C / V43A和G74C / M159L,表现出增强的外消旋化活动被发现,而效率同时对脱酸的水平降低,从而突显出不同的淫乱活动的决定因素。总的来说,活动G74C / V43A变体是20倍从脱酸外消旋化。值得注意的是,活动ketoprofen向外消旋化9 b也是提高30倍(Kourist et al ., 2011 b)。在以后的研究中,structure-guided消旋酶的蛋白质工程执行基于STD-NMR (saturation-transfer-difference NMR)分析,这最终导致了四变体V43A / G74C / A125P / V156L通常增加对所有测试profen衍生品活动,最多40倍大脑都会对萘普生8 b(Gaßmeyer et al ., 2015)。
最近的应用程序
非甾体抗炎药的生产
手性α-aryl类成员的非甾体抗炎药(非甾体抗炎药)和具有抗炎和镇痛属性(Brogden 1986)。这种药类的成员属于畅销的非处方药,用于治疗风湿性疾病(muscoskeletal疼痛)和急性或慢性疼痛(布鲁克斯,1998年)。非甾体抗炎药抑制前列腺素的生物合成,作用于cyclo-oxygenase (COX)酶系统,这同时引起常见的不良影响胃肠道功能的非特异性抑制不同的考克斯同种型(Brogden 1986;布鲁克斯,1998年)。在俗称profens,只有萘普生8 b销售是纯(年代)对映体,而布洛芬7 b,Ketoprofen9 b或Flurbiprofen6 b在混合连同他们的活动管理(R)对映体(布鲁克斯,1998年)。然而,单向在活的有机体内不活跃的互变现象(R)——药物活性(年代)对映体可以在不同程度上发生(特蕾西和大厅,1992;布鲁克斯,1998年)。尽管Flurbiprofen6 b主要是出售外消旋体,(年代)对映体主要占抗炎效应(阿卜杜勒•阿齐兹et al ., 2012)。然而,其他生物的影响(R)-Flurbiprofen6 b描述(吉耶特,2007;金et al ., 2010;刘et al ., 2012),从而使双方的可访问性对映体纯形式的一个理想的目标。AMDase的能力将前手性的丙二酸酯光学纯arylpropionic酸是早期识别的上下文中profen合成,但受到的可用性高效酶变异或有限的丙二酸酯前体的稳定性(Terao et al ., 2003)。表4应该概述非甾体抗炎药前兆研究AMDase催化脱羧和相应的迄今为止表现最好的酶变异。
表4。概述与相关性研究和行业AMDase基质。
有趣的是,一些工业应用路线profen采用化学合成丙二酸盐脱羧(1981年希尔顿和沃克;水岛et al ., 2014)。由于固有的不稳定在中间形成了丙二酸、酯水解和脱酸通常是同时进行的,因此产品收益率外消旋混合物(1981年希尔顿和沃克;陆et al ., 2006;水岛et al ., 2014)。然而,努力获得纯的对映体,再结晶的非对映的混合物或酶动力学分辨率,通常是乏味的和遭受低收益率或有限的对映体过量(Terao et al ., 2003)。在这方面,也在温和条件下酶外消旋化可能导致更高的整体收益率通过回收决议过程不受欢迎的对映体(Kourist et al ., 2011 b)。
在Flurbiprofen的合成6 b相应的丙二酸、低稳定性衬底与吸电子氟取代基是一个严重的问题为其检查和隔离α-arylmalonic皂化后的酸酯。受保护组策略研究员合作宫本茂和用于制备isotope-labelled pseudochiral丙二酸酯(宫本茂et al ., 1992 b),我们实现了氢解作用苄酯代替烷基酯水解,以避免相关问题自发脱酸(Gaßmeyer et al ., 2016)。这种策略特别适合所有取代基丙二酸酯与electron-poor更大。
然后,我们开发了一个综合对Flurbiprofen chemo-enzymatic通路6 b包括AMDase-mediated脱羧和前面介绍的保护组策略(Gaßmeyer et al ., 2016;金针菇et al ., 2019 a)。我们设想两个潜在chemo-enzymatic路线与前所述化学合成策略,然而适应相应的二苄基丙二酸酯(图6)(Terao et al ., 2003;陆et al ., 2006)。有趣的是,AMDase-catalyzed反应步骤(图6步骤(八)),计划在两个不同阶段的过程。在铃木耦合,从而使用既定的丙二酸酯6底物(图6步骤(八世)),在铃木耦合,这将要求AMDase展览活动对α- (4-bromo-3-fluorophenyl) -α-methylmalonic酸(图6步骤(viii-b)) (金针菇et al ., 2019 a)。
图6。(一)对光学纯Flurbiprofen Chemo-enzymatic合成路线6 b。上层路线了,改编自一个工业化学合成和下路线适应向往chemo-enzymatic过程的条件。(B)Chemo-enzymatic N-heteroaromatic缺电子的合成丙酸。
建立了必要的适应后,最初的化学步骤中央中间二苄基α- (4-bromo-3-fluorophenyl) -α-methylmalonic酸酯(图6步骤(1)- (v)),作者集中在下半年的级联,包括Pd-catalyzed铃木耦合(步骤(vi)),去的dibenzyl-protected丙二酸酯(步骤(七))并最终AMDase催化脱羧(步骤(八))。建议在钯炭(Pd / C)应该是一个合适的催化剂对铃木耦合和苄酯的乳沟。值得注意的是,在氢解作用,中央中间没有反应(步骤(vii-b))相比,二苄基flurbiprofen丙二酸酯(步骤(第七)),更多的稳定对自发的脱羧、为获得高最终被证明是有利的ee的产品(金针菇et al ., 2019 a)。而铃木耦合在温和的条件下在水里,用Pd / C作为催化剂和Ph值4BNa苯基捐赠者,据报道(步骤(vi-b)) (陆et al ., 2006),这些特定的条件被证明是不切实际的相应反应替代路线(步骤(vi-a)),由于溶剂不兼容的试剂。另类铃木耦合策略在有机溶剂不认为在这一点上,追求环保的良性反应条件的原因。最终的事实证明,AMDase变体也积极向然而但一个个衬底在步骤(viii-b)为114.3毫克−1(WT), 480.3毫克−1(IPLL), 41.7毫克−1(轻型导弹巡洋舰)或40.7毫克−1(CLGIPL)对丙二酸酯与活动6。两种对映体的Flurbiprofen6 b因此可以生产高产量和> 99%ee(金针菇et al ., 2019 a)。
脱酸的合成Heteroaromatic丙二酸酸
去保护策略也成功申请N-heteroaromatic缺电子的制备丙二酸的酸(布莱克莫尔et al ., 2020)。这种化合物类的固有的不稳定甚至超过他们的一个常见的芳香,因此完全阻止成功的隔离,没有不受欢迎的自发的脱羧甚至通常温和的氢解作用条件下。优化后,氢解作用在小心翼翼地平衡的基本条件进行了两相的系统(5 wt % Pd / C;10毫升g−10.5 Tris-HCl, pH值8.5;2 eq。氢氧化钠;2毫升g−1甲苯、20°C, 4 h),提供相应的丙二酸酯二阶阴离子缓冲水相。这一层分离,直接用于酶脱酸(3.5 wt %冻干CFE, 20°C, 18 h),从而绕过中介隔离的不稳定的丙二酸衍生物。的可用性缩短hydrogenation-AMDase过程演示了规模120 g,生产光学纯的10 b在76%的收益率和98%ee(R)(图6 b)。防止不受欢迎的自发的脱羧AMDase基质,仔细的pH值和温度控制的重要性在整个过程中突出显示。
合成光学纯Alkanoic酸
AMDase要求衬底上的取代基π-electron系统,不转换脂肪族丙二酸酸。然而,enantiopure alkanoic酸可以访问两个步骤结合AMDase-mediated脱羧和非活性的双键(见减少表5)。与其他催化方法,这种分子并不容易,特别是由于化学催化剂的难度区分结构类似的取代基(金针菇et al ., 2019 b)。而野生型的活动AMDase对烯基丙二酸酸已经报道(Okrasa et al ., 2009),其他的反应(R)和(年代)选择性酶变异还没有研究这类底物。
表5。顺序chemo-enzymatic一连串AMDase催化脱酸α-alkenyl-α-methylmalonic酸C = C债券减少紧随其后原位二酰亚胺生成的。biocatalytic反应一步完成后,肼情商(20)和CuCl20.01 (eq)直接添加到反应混合物。所述转换指的是最后的反应步骤,检测后23 h。
已经证明与其他基质类型,AMDase IPLL CLGIPL比野生型酶和其他(年代)选择性变异,然而19 - 170和190 - 2200倍减少活动,分别与芳香基质。这反映了烯烃的低容量稳定enediolate中间(金针菇et al ., 2019 b)。
有趣的是,所有测试酶变异被证明是高度立体选择的转换α-methyl-α-vinylmalonic酸4由AMDase CLGIPL只是例外。这个反应产生(年代)2-methylbut-3-enoic酸出奇地低66%ee(年代)(表5,输入2)。在这种情况下,要么另一种质子给予体(如。水)或绑定模式讨论了导致这种选择性受损,与其他控制反应,高度选择性AMDase变体排除了外消旋副反应作为低对映体过量的来源(林德Himo, 2014)。此外,AMDase CLGIPL脱羧α-vinyl丙二酸酯与其他取代基出现在烯烃(11- - - - - -12个一个)与杰出的选择性,从而反映出脆弱的交互网络负责配体识别和绑定。
关于化学C = C键减少,双键异构化的潜在风险在过渡金属催化还原,这将导致产品外消旋化,可能最终消除使用原位生成的二酰亚胺作为还原剂。高对映体过量后观察AMDase-catalyzed脱羧可能因此保留直到最后化学还原步骤(表5)(金针菇et al ., 2019 b)。
固定的Arylmalonate脱羧酶
固定化酶可以显著促进经济使用生物催化剂(如。:稳定、重用),促进下游处理(Cantone et al ., 2013)。考虑到有限的纯化工艺条件下AMDase (t的稳定1/2= 1.2 h) (Aßmann et al ., 2017 a),不同的固定策略最近进行了测试,包括特定站点(黄et al ., 2010)或保守的(Gaßmeyer et al ., 2016;Aßmann et al ., 2017 b;Aßmann et al ., 2017 a)共价固定、吸附、络合(Aßmann et al ., 2017 a)、截留或组合方法(表6)(Markošova et al ., 2018)。黄et al。研究了phosphopantetheinyl转移酶(Sfp)催化ybbR-tagged蛋白(12-mer固定N终端标签)CoA-functionalized聚苯乙烯纳米粒子(表6输入1)(黄et al ., 2010)。共价和网站链接是有效地实现在温和的条件下,获得的生物催化剂显示高操作稳定四个周期(约。7%的损失的活动)。然而,观察到的K米值高出大约三倍与自由酶相比,而K米值AMDase和ybbR-AMDase相似,因此表明不利的纳米颗粒和基体之间的相互作用导致效率这种观察到的损失而不是固定本身(黄et al ., 2010)。
表6。概述了固定化技术研究AMDase催化脱羧。
最近,Markošovaet al。试图诱捕AMDase的聚乙烯醇(PVA)凝胶(表6条目2)(Markošova et al ., 2018)。而AMDase显示增强稳定性,制定活动遭受严重损失后重复使用,可能由于浸出的酶。在一个综合的方法(表6、条目4)的组合操作稳定的共价结合AMDase磁性微粒(MMP)和简单的处理PVA凝胶珠提供生物催化剂,稳定在8 biocatalytic反应和存储在4°C(64%保留活动3个月后)(Markošova et al ., 2018)。
共价固定上的氨基C2丙烯酸酯承运人证明实际获得一个稳定的生物催化剂(约。活动率20%)半衰期为16.5 h和总转化率(TTN)超过20000 (表6条目5)(Gaßmeyer et al ., 2016)。相同的策略被Aßmann进一步研究和应用et al。在一个高档的过程(年代)甲氧萘丙酸8 b通过脱酸合成8(Aßmann et al ., 2017 a;Aßmann et al ., 2017 b)。这个例子演示了酶工程和过程工程的互补性。而酶工程可以恢复最初的活动(年代)选择性变异数百倍的水平与野生型,固定化酶取得了实质性改进的稳定。(相比年代)选择性变异G74C / C188S在溶液中,蛋白质和反应工程取得了极大的提高了生产率的酶变异的TTNs在5批次(83000 - 107000Aßmann et al ., 2017 a;Aßmann et al ., 2017 b)。也在这种情况下,固定增加了K米值对8从0.08到22毫米,突显出传质限制的强烈影响。同时,不同的固定其他支持材料和绑定策略进行评估(表6条目5 - 12)。总的来说,共价结合酶制剂显然是首选的酶在重复加载和长期稳定性批次。例如,活动AMDase固定化EziG1是强大的,然而酶之间的协调绑定的6 xhis-tag和铁(III)或公司(II)承运人相当弱,从而导致大量浸出在重复实验。固定在氨基C2丙烯酸酯进一步优化利用CFE代替纯化蛋白,这无疑导致了降低催化活性纯化AMDase相比(30%),没有一个增强的长期运行稳定(t1/2= 8.6 d) (Aßmann et al ., 2017 a)。
用固定化AMDase Aßmannet al。的集约化和伸展的合成(年代)甲氧萘丙酸8 b。仔细分析,极大地促进了动力学参数内联反应监测通过拉曼光谱。重要的是,AMDase CLGIPL抑制了产品,但只有在某种程度上,原位除产品并不是必要的。140公斤的生产力产品公斤酶−1计算的实现过程,这超过了最低指定值50 - 100公斤的制药过程产品公斤酶−1。此外,产品隔离通过降水是优化和(年代)甲氧萘丙酸8 b被隔离在92%的收益率,99%ee(Aßmann et al ., 2017 b)。
Arylmalonate脱羧酶与其他生物
在搜索类似的反应活性和特色生物AMDase产碱杆菌属bronchisepticus(现在:博代氏杆菌属bronchiseptica研究员合作)KU1201,和同事能够识别两个进一步的菌株降解α-phenylmalonic酸土壤样本的能力1(宫本茂et al ., 2007 b;Yatake et al ., 2008)。菌株KU1311 (宫本茂et al ., 2007 b)和KU1313 (Yatake et al ., 2008)是最活跃的,确定为无色菌sp.和肠杆菌属下水道,分别。各自的基因从基因组DNA和异种的放大生产大肠杆菌表征。两个基因编码240个氨基酸的蛋白质长度,符合最初确定从应变KU1201 AMDase (宫本茂和研究员合作,1992)和共享的序列同源性高达94% (KU1311)和85% (KU1313)。因此,观察到的底物选择性和活动都与原始AMDase和所有的共享相同的严格enantiopreference (宫本茂和研究员合作,1992,1992 b;宫本茂et al ., 2007 b;Yatake et al ., 2008)。
虽然这三个AMDases显示相当大的相似性,移位的最佳pH值(pH值5.5)对酸性环境下的AMDase应变KU1313是有趣的。它是唯一的微生物,这表明AMDase活动酸性土壤样本筛选时,其他相当活跃在中性轻微基本pH值(酸碱度7 - 8.5)(表7)。
表7。概述在AMDases识别不同的生物体。
Okrasaet al。试图确定小说AMDase酶蛋白质序列相似性的30 - 52%和必需的半胱氨酸残基的酶的相对位置一样b . bronchiseptica。假定的AMDases特征,然而只有酶Mesorhizobiumsp。(现在:Chelativoranssp) BNC1,表现出相似性最高,显示令人满意的脱羧酶活性,而其他候选人,而作为消旋酶(Okrasa et al ., 2008)。
识别的难度小说AMDases伴随着的问题不恰当的基因注释Maimanakos解决的工作et al。,他开发了一种基于搜索算法更可靠的预测的酶具有AMDase活动(Maimanakos et al ., 2016)。序列信息的确认AMDases用于指定12保守序列模式(如。残基的疏水口袋,dioxyanion洞,芳基绑定口袋和残留C188 G74包括周围环境),反过来,被用于简洁数据库筛选。这样,58额外orf编码假定AMDase-like酶被发现和用于生成一个隐藏的马尔可夫模型(HMM)、家具六特定主题(表8),并在应用中实现搜索算法。为了证明这些搜索条件的可靠性和适用性,这种酶Polymorphum gilvumSL003B-26A1确认通过数据库搜索的特点是结合两种酶Variovoraxsp, HH01 HH02确认通过土壤样本的筛选。所有这三个酶显示所需的AMDase活动在周围常见嗜中温温度和中性至微酸性pH值(表7)(Maimanakos et al ., 2016)。
表8。确定保守序列图案和残留的催化机理AMDase(以粗体显示)。Unconserved残留标有编号根据x。残渣b . bronchisepticaAMDase (Maimanakos et al ., 2016)。
有趣的是,所有公认的AMDase-encoding orf Maimanakos确认et al。属于类的α-β和γ-proteobacteria。有趣的是,当AMDase侧翼区域进行了分析,基因编码mandelate消旋酶/ muconate内酯化酶或几个转运蛋白(如。三方tricarboxylate运输车双塔,陷阱或ABC转运蛋白)是常见的。根据这些侧翼地区和序列相似性,AMDases被分为八个酶集群。而这种酶的自然作用仍然难以捉摸,事实上,近亲的AMDase-producing细菌通常不编码这种酶,强烈表示,这个基因是经常迷失在进化,因此可能对生物体在一定生理只是暂时的有利条件(Maimanakos et al ., 2016)。
结论
30年之后发现,AMDase到达工业应用阶段。这种独特的脱羧酶是典型的历史研究在生物催化技术进步在过去的几十年。AMDase后发现,基于纯函数式屏幕,第一重要的里程碑通过太组识别相应的基因,使重组酶的生产。Enzymological表征和研究isotope-labelled pseudochiral丙二酸酸允许初始机械的见解:在反应期间,只有一个羧基裂解,这一步是不直接确定stereooutcome的反应。本文针对基于同源性模型,完全倒置,滥交,独特profen消旋酶生成。然而,说明AMDase晶体结构的配体的形式在2010年代初是突破性的配方假想的脱羧机制,这是近年来证实了一些计算研究。尽管一些晶体结构的可用性,但它仍是极难准确预测的影响疏水口袋中的特定氨基酸替换酶活性。代替可预测性,同时site-saturation诱变和饱和突变被证明是有效的方法来提高酶的活性变异的两个对映体的合成α-aryl丙酸,为不同的基质和确定最优变异。
的趋势α-arylα-methylmalonic酸进行自发的去证明是一个障碍对于工业应用程序,尤其是与大取代基electron-poor基质进行脱羧反应的酶。通过开发一个精心平衡去保护策略相应的丙二酸酯,条件导致自发的脱羧可以避免。路面去/脱酸方法导致了一个健壮的、可行的反应,允许获得α-aryl类在他们(年代)或(R)—构成杰出的光学纯度。而酶的活动通常是高,固定稳定性大大增加,导致一个优秀的生产力。
从一个完全不为人知的酶与未知的机制产生profens的“错误”的对映体,生物催化、酶学、结构说明、分子建模、蛋白质工程、有机化学和过程强化成功创建一个强大的工具箱AMDase变异提供很大的多样性α-substituted类enantiopure形式。
作者的贡献
本文设计和准备数据,RK和公里参与规划的文章,导致文本。
资金
所有的资金来源已经提交。RK由奥地利科学基金资助(FWF) P34820。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
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关键词:脱羧酶、选择性、不对称合成、生物催化、光学纯羧酸
引用:Schweiger AK,宫本茂K和R (2021) Arylmalonate Kourist Decarboxylase-A多功能生物催化剂的合成光学纯羧酸。前面。Catal。1:742024。doi: 10.3389 / fctls.2021.742024
收到:2021年7月15日;接受:2021年9月13日;
发表:2021年10月12日。
编辑:
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