环己烷转换成使用重组6-Hydroxyhexanoic酸假单胞菌taiwanensis在搅拌釜反应器

介绍

可生物降解聚合物如聚已酸内酯(PCL) polyhydroxyalkanoates,聚乳酸是获得利益由于高生态足迹的非降解性塑料。PCL聚合通常是通过开环聚合ε-caprolactone(ε-CL)或通过缩聚6-hydroxyhexanoic酸(6公顷)(Labet首,2009年)。然而,传统的单体生产过程从环己烷与多个反应步骤涉及的中间体,高温和压力变化,和使用的有毒易爆化学品(Wittcoff et al ., 2012)。在“一锅”单体生产在较弱的条件下,例如,在一个生物过程,会缓解这样的关键方面。在这种背景下,ε-CL和6公顷的生产环己醇与重组大肠杆菌据报道(Srinivasamurthy et al ., 2019;Srinivasamurthy et al ., 2020)。在我们以前的工作,一个分4步酶促级联的转换通过环己醇,环己烷环己酮,ε-caprolactone 6-hydroxyhexanoic酸一直在理性的设计p . taiwanensisVLB120 (谢弗et al ., 2020 a)。高整体特定活动的44 U g_CDW⁻¹和完整的转换取得了5毫米的环己烷6-hydroxyhexanoic酸(谢弗et al ., 2020 b)。现在这项研究报告的评估有前途的应变关于其性能在工艺条件下,包括各自的生化工程。

微生物的催化性能取决于功能酶的生产和依赖于细胞机械刺激酶合成和反应本身与能源和减少等价物。具体来说,不同的途径涉及氧化还原酶通常通过共基质的形式连接到细胞代谢氧化还原代数余子式。必要的代谢活动提供能量和氧化还原当量密切相关细胞的生理状态,从而培养条件。使用细胞增长,一方面,使有效的(重新)合成的酶和能源载体,因此可以传达优越的生物催化剂的稳定性,但另一方面,可能会遭遇要求之间的权衡生物质合成和氧化还原生物催化(Peralta-Yahya et al ., 2012)。使用新陈代谢活跃但不生长(休息)细胞,诱导条件的缺乏或损耗,例如,氮在介质(或镁源越来越Dijkhuizen, 1983年),导致了优越的全细胞活动相比,氧化还原生物催化生长细胞(布勒公司et al ., 2008;定形et al ., 2012)。根据催化反应(s),静息细胞可以更容易处理和可重用的,但往往患有稳定性差(Julsing et al ., 2012;Zhang et al ., 2012)。最近,杂交物种的概念被用来生产单体己二酸,6-aminohexanoic酸,或1,6-hexanediol从环己烷(王et al ., 2020;Zhang et al ., 2020;Bretschneider et al ., 2021)。

一个重大的挑战对于biocatalytic环己烷转化率与基质的理化性质有关。以其高蒸汽压(77毫米汞柱)和低水溶性(55毫克L⁻¹650µM),环己烷构成高度在标准条件下挥发性化合物(亨利定律常数K_空气/水atm m = 0.15³摩尔⁻¹)(ChemSpider 2020)。等毒性问题可以避免通过底物喂养策略。non-water-miscible第二有机相可以作为衬底水库,不断提供适当的水浓度的底物(礼来公司,1982;范Sonsbeek et al ., 1993)。这两个液体阶段概念已成功申请了苯乙烯环氧化作用(Volmer et al ., 2019)、甲苯羟基化(柯林斯et al ., 1995;Willrodt et al ., 2015)和多步pseudocomene氧化(布勒公司et al ., 2003)。或者,基质以液体形式可以通过泵(Srinivasamurthy et al ., 2019)或通过气相(Karande et al ., 2016)。众所周知,此外,一些菌株特性自适应溶剂耐受性机制涉及,例如,溶剂排出系统和/或膜流动性和表面性质的改变,这符合他们作为有前途的主机应用程序涉及有毒反应物和产物(井上Horikoshi, 1989;Heipieper et al ., 2007)。p . taiwanensisVLB120展览等功能,主要在其megaplasmid编码(科勒et al ., 2013)。

本研究的目的是评估环己烷6-hydroxyhexanoic酸的生物转化规模生物反应器,与重组p . taiwanensis_6HA作为生物催化剂(谢弗et al ., 2020 a)。biocatalytic性能研究的发展,静息细胞格式(图1)。此外,休止细胞的催化潜力评估在生物反应器设置环己烷是美联储通过气相。

材料和方法

菌株、质粒、媒体和化学物质

这项工作中所使用的微生物菌株和质粒中列出补充表S1。细胞生长在溶原性肉汤(磅),M9 (Sambrook和罗素,2001),M9 * (Panke et al ., 1999),或者RB介质(Riesenberg et al ., 1991;Volmer et al ., 2019在pH值为7.2(调整10 M氢氧化钠)和0.5% (w / v)补充葡萄糖为唯一碳和能量来源。卡那霉素(50μg毫升⁻¹)必要时申请选择。除非另有规定,所有化学品都购自Sigma-Aldrich (Steinheim、德国)或卡尔罗斯(德国卡尔斯鲁厄)纯度最高,使用前未经纯化。6公顷收购abcr(德国卡尔斯鲁厄)。分子生物学方法和质粒施工详细解释补充材料。

增长的细菌培养

查看进行30°C和200 rpm Multitron瓶(公司、Bottmingen、瑞士)。Pre-cultivation通常始于一个磅文化(∼20 h)的基本培养基pre-culture (1% v / v)接种和孵化20 h。后者用于接种的主要文化在450 nm (OD光学密度_450年0.2)。外源基因表达与1毫米诱导β-异丙酯d1-thiogalactopyranoside (IPTG)文化达成OD_450年0.5∼。孵化持续最大7.5 h。

感应动力学评价

主要文化收获在90分钟的时间间隔诱导后离心(RT 5000克10分钟)和10毫升resuspended磷酸钾缓冲含有1% (w / v)葡萄糖(Kpi-g)最后一个细胞浓度的0.5 g_CDWl⁻¹。细胞悬液转移到100毫升困惑螺旋帽摇动烧瓶和平衡10分钟30°C和250 rpm。生物转化是开始通过增加5.46µL纯环己烷(它对应于5毫米的水相体积)瓶,然后紧闭。10分钟后停止了试验移液1毫升的样品在1 M盐酸(100µL)达到3的pH值,其次是离心和存储−20°C进行高效液相色谱分析,或0.5毫升含有0.2毫米n-decane冰冷的乙醚作为内部标准。后者样本提取通过涡流的2分钟。短暂离心后,有机相在无水的Na干₂所以₄和转移到GC瓶进行分析。

长期的生物转化规模摇瓶

细胞通过离心收获(10分钟,RT 5000 g)后6 h(感应在RB -或M9 *摇瓶培养和resuspended最终生物量浓度为0.5 g_CDWl⁻¹要么Kpi-g 20毫升,Kpi-g包含1毫米IPTG (Kpi-g-I),或包含1毫米IPTG的各自的生长介质。在100毫升平衡后困惑和螺旋帽摇动烧瓶,10.9µL环己烷(5毫米指水相体积)添加到启动反应。取样2.1毫升的液体体积进行了通过使用一个注射器通过硅胶/聚四氟乙烯隔膜10后,60、110和160分钟的反应时间。一毫升提取与0.5毫升乙醚或稀释1 M盐酸(100µL Kpi和RB中、200µL M9 *介质)为GC和高效液相色谱分析,分别如上所述。此外,OD_450年决心,100µL天然气采集标本不透气的玻璃注射器(汉密尔顿,雷诺,NV)。

毒性试验

环己烷毒性评估是基于对增长率的影响p . taiwanensisVLB120。细胞被precultivated如上所述,接种在M9 *主要文化OD_450年0.1。不同的环己烷添加了大量种植4 h后,和水瓶被关闭密封。抽样与注射器通过隔了盖子。通过OD增长之后_450年测量7 h。水环己烷浓度估计通过亨利系数通过GC和验证。

产物抑制试验

p . taiwanensis_6公顷种植如上所述,收获4 h后归纳。细胞resuspended 6毫升Kpi-g缓冲区包含定义6公顷浓度(pH值调整到7.4)生物量浓度为1.5 g_CDWl⁻¹和转移到100毫升螺旋帽厄伦美厄烧瓶。之后,1毫升采样,细胞平衡10分钟30°C。生物转化是开始通过增加5.5µL纯环己烷和停止后1 h HPLC和GC分析之前所描述的。

单酶的抑制6公顷

p . taiwanensisVLB120含有质粒pSEVA_Cyp, pSEVA_CDH、pSEVA_CHMO或pSEVA_Lact在M9 *介质如上所述栽培,收获后6 h的感应。细胞被resuspended生物量浓度为0.25 g_CDWl⁻¹Kpi-g缓冲区包含定义6公顷浓度(pH值调整到7.4)。然后,10毫升细胞悬液转移到100毫升螺旋帽厄伦美厄烧瓶(p . taiwanensisVLB120 pSEVA_Cyp / pSEVA_Lact)或1毫升细胞悬液为2毫升反应管(p . taiwanensisVLB120 pSEVA_CDH / pSEVA_CHMO)。细胞平衡10分钟30°C,和生物转化开始通过增加5毫米衬底对水相体积(pSEVA_CDH pSEVA_Cyp的环己烷、环己醇、环己酮pSEVA_CHMO)或10毫米ε-CL pSEVA_Lact。的反应是5或10分钟后停止反应时间和准备GC和高效液相色谱法分析如上所述。

生物反应器的实验

生物反应器实验3.6 L搅拌釜Labfors 5通过虹膜生物反应器控制软件(公司AG)、Bottmingen、瑞士)。Precultivations进行磅和RB媒体如上所述。RB precultures被用来接种含有1 L RB-medium (10 g L的生物反应器⁻¹葡萄糖,pH值7.2,1.2 vvm曝气,30°C, 1500 rpm搅拌器速度)。pH值自动控制是通过增加25% (v / v)氨和30% (w / v)磷酸。分批培养进行直到葡萄糖消耗(细胞浓度∼3 g_CDWl⁻¹),其次是包含730 g L指数喂养的一个解决方案⁻¹葡萄糖和19.6 g L⁻¹MgSO4.7 H₂O保持特定的增长率µ0.1 h⁻¹直到13 g的生物量浓度_CDWl⁻¹是达到了。在过去的4 - 6 h,细胞与1毫米IPTG诱导。然后,细胞被离心收获(3124 g, RT, 30分钟)和resuspended 1 L Kpi-g-I缓冲最终细胞浓度的10 g_CDWl⁻¹。pH值设置为7.4,自动控制通过添加10 M氢氧化钠和30% (w / v)磷酸。经过十分钟的平衡,曝气转向cyclohexane-saturated空气(0.051或0.3 L的分钟⁻¹L)和压缩空气(1.2分钟⁻¹)。葡萄糖溶液(730 g L⁻¹葡萄糖和19.6 g L⁻¹MgSO₄7小时₂O)被送入反应堆的传说图5,6。5毫升样品是在每个采样点,用于GC样品制备如上所述,OD_450年测量、频谱分析和差异。其余的样品是离心机(17000 g, 4°C, 10分钟)。颗粒(sds - page)和上层清液(用于高效液相色谱分析)存储在−20°C。

分析方法

通过测量OD悬浮生物量浓度测定_450年使用一个天秤座S11分光光度计(Biochrom,剑桥,英国)。为p . taiwanensis,一个OD_450年单位对应于0.186 g_CDWl⁻¹(Halan et al ., 2010)。重组基因表达进行了分析通过sds - page根据Laemmli (Laemmli 1970),加载30每车道μg的总蛋白质,通过有限差分光谱量化活动Cyp像之前描述的那样执行(谢弗et al ., 2020 b)。

环己烷、环己醇、环己酮和ε-CL浓度由GC, 6-hydroxyhexanoic酸和己二酸浓度测定像之前描述的那样通过高效液相色谱法(谢弗et al ., 2020 a)。

葡萄糖、葡糖酸和α-ketoglutarate被使用Dionex终极300高效液相色谱分离量化模块(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)配备了配位体交换柱(Hi-Plex H, 30厘米长,直径7.7毫米,8μm粒度,安捷伦,圣克拉拉,CA,美国)。葡萄糖是量化使用示差折光检测器,保持柱温箱的温度恒定在15°C和使用MilliQ去离子水作为流动相的流速0.4毫升分钟⁻¹。葡糖酸和α-ketoglutarate量化、可变波长检测器是在210海里,柱温箱温度控制在40°C, H和5.5毫米₂所以₄在去离子水应用流动相流速为0.4毫升分钟⁻¹。

O₂是量化使用跟踪1310气相色谱仪(热费希尔科学)配备TG-BOND Msieve 5毛细管柱(30米,我。D: 0.32毫米,膜厚度:30μm热费希尔科学)和热导检测器操作在100°C灯丝温度为300°C和参考气体流速2毫升的分钟⁻¹。应用氩气作为载气以恒定流量5毫升的分钟⁻¹。注入温度设置为50°C,和分流比2应用。烤箱温度保持不变在35°C 5分钟。N₂被用来作为内部标准。

动力学参数V_马克斯,K_年代,K_我计算了在MATLAB 6.1和安装下列方程使用最小二乘的方法:

V₀,最初的反应速度U g_CDW⁻¹;V_马克斯最大反应速度;年代,水环己烷浓度;K_年代明显的底物吸收常数(环己烷浓度,反应速度是half-maximal);和K_我,抑制常数。

结果

在我们以前的工作,p . taiwanensis_6HA (p . taiwanensisVLB120含有质粒pSEVA_6HA_2)已经被开发出来,使环己烷转化率6公顷的独家产品(谢弗et al ., 2020 a)。在这项研究中,我们评估如何以及在多大程度上可以利用这一毒株的催化性能在工艺条件。为此,生理学和催化性能p . taiwanensis_6HA特征在不同媒体和生理状态与客观寻找合适的条件搅拌釜反应器(STR)设置。

栽培介质的影响p . taiwanensis_6HA生理学和特定的活动

在第一步中,p . taiwanensis_6HA生长生理和级联活动进行了在不同标准的媒体,也就是M9, RB, M9 *。M9相比,M9 *含有磷酸三倍高盐浓度较高的缓冲能力(Sambrook和罗素,2001),而RB中含有铵比M9和M9 *媒体和中间磷酸盐浓度(Volmer 2016)。先前的研究已经表明,低磷酸盐和氨浓度导致葡萄糖酸积累和更高的增长率铜绿假单胞菌和p . taiwanensisVLB120 (Buch et al ., 2008;Volmer 2016)。这些因素对biocatalytic性能的影响,然而,并没有研究。消费增长,葡萄糖,葡萄糖酸积累,和具体6公顷活动形成了利用这些标准媒体(补充数据S1, S2)。

的p . taiwanensis_6HA增长生理学研究在三个媒体(补充图S1)。增长率最高的M9培养基和RB中仅略低,但它在M9 *介质(低30%表1)。同时,葡萄糖酸显著差异积累与微不足道的观察积累在M9 *介质,导致了一个相对稳定的pH值在培养期间(补充图S1)。然而,在M9培养基中葡萄糖酸是暂时性的积累到4 g L⁻¹,导致一个重要的pH值降低,而培养RB中导致一个中间葡萄糖酸积累。瞬态葡萄糖酸积累并不影响整个生物质产量,在所有三个媒体测试(类似表1)。

调查是否这些明显的生理差异影响的催化性能p . taiwanensis_6HA,短期活动期间与细胞取样化验进行查看(图2)。一般来说,类似的感应动力学(RB中稍快)在所有三个媒体观察最大比活度达到6 h后。最大活动达到RB和M9 *媒体,然而,患病率高于M9培养基,一些泄漏也观察到。这表明栽培介质显著影响细胞生理学和外源酶的催化性能和/或表达式。sds - page分析证明了不恰当的检测表达差异未加标签的级联酶,我们调查了标记的表达媒介影响CHMO (补充图S2)。的确,我们观察到一个较低的CHMO M9的表达水平比M9 *介质,与较低的全细胞CHMO活动相关,表明葡萄糖酸积累的负面影响和/或相应的波动的pH值(补充图S1)重组基因的表达。

生理状态影响p . taiwanensis_6HA催化活性

对苯乙烯monooxygenase-based在活的有机体内催化作用,新陈代谢活跃休息大肠杆菌细胞表现出更高的比活度苯乙烯环氧化作用比种植细胞(Julsing et al ., 2012),而相反的观察p . taiwanensisVLB120ΔC (库恩et al ., 2012 a;库恩et al ., 2012 b)。调查是否p . taiwanensis_6HA受到这些差异,其biocatalytic性能研究种植或休息时,身体的细胞在一个扩展的时间范围。增长细胞(GCA),休息休息nitrogen-limited细胞(RCA),细胞的诱导物(RCA + IPTG)生长在RB或M9 *中应用(图3)。M9培养基不像只低特定的测试活动在短期内取得了化验(图3)。在静息细胞格式中,细胞生长在M9 *和RB媒体显示高初始活动∼43 U g_CDW⁻¹,但下降了超过50%的第一个小时内反应,进一步∼10.5 U g_CDW⁻¹2 h后,导致最后6 ha滴度为1.1±0.1,1.4±0.1毫米,分别为(图3 a, D)。

调查如果全细胞活动由持续诱导静止细胞的格式,我们添加了IPTG的静息细胞悬浮液和分析具体的活动(图3 b, E)。再次,细胞生长在介质达到初始活动40 U g_CDW⁻¹。RB-grown细胞表现出类似的活动减少IPTG的缺席,到达最后一个活动14.4±0.7 U g_CDW⁻¹和一个6公顷效价为1.5±0.1毫米,表明没有诱导物的突出效果。然而,M9 *生长细胞表现出更少的活动降至22.6±0.8 U g_CDW⁻¹2 h后生产2.2±0.1毫米6公顷,双重的超过在IPTG的缺失。

细胞增长的初始活动(与IPTG诱导)在媒体是30%低于静息细胞和降至13.2±0.4 U g_CDW⁻¹在M9培养基和16.7±0.8 U g_CDW⁻¹RB中孵化(2 h后图3 c、F)。较高的增长率RB中导致更高的最后6公顷的浓度3.1±0.1比1.8±0.1毫米在M9培养基。气相O₂饱和浓度(顶部空间)达到5%后160分钟增长RB中,表明O₂限制作为活动减少可能的原因。在其他实验中所示图3啊,气相₂饱和浓度仍高于15%,表明O₂不是一个主要的限制因素。环己烷限制可以活动减少可能的原因为其在水相的浓度降至50µM(浓度)。因此,全细胞动力学分析是下一步,也被优化的关键环己烷喂养6公顷产量最大。

全细胞动力学为环己烷生物转化底物抑制或中毒

了解全细胞活动的依赖在环己烷浓度(Karande et al ., 2016),在静息细胞全细胞动力学进行了分析化验。一种底物抑制动力学被发现,所给出的参数图4。事实上,获得衬底吸收常数K_年代(169µM)表明,底物限制发生在衬底浓度呈现(减少)所示的实验图3。结合底物抑制,这使得最大活动≥40 U g_CDW⁻¹要实现的水环己烷浓度范围∼100 - 500μM,其中就包括125年的最初的水性底物浓度在生物转化µM化验。除此之外,在静息细胞生物量浓度化验从0.54±0.01 g L⁻¹0.21±0.01 g L⁻¹(ca。60%)在测定时间10分钟1毫米水环己烷浓度。这表明细胞中毒,可将影响代谢和催化活性高的环己烷浓度。在早期的研究中,70%的细胞被报道permeabilized暴露在1.1毫米的水环己烷浓度(Karande et al ., 2016)。底物的限制,另一方面强烈的抑制或中毒p . taiwanensis_6HA通过环己烷另一方面要求设置一个控制环己烷供应最大限度利用biocatalytic能力的细胞。

连续的环己烷喂养在搅拌釜反应器允许6公顷产量

建立这样一个控制环己烷供应在搅拌釜反应器工艺条件下,应用程序的第二个有机相作为基质储层测试,但并不是很令人满意,甚至低通气率导致实质性的环己烷剥离,从而低收益率的环己烷和底物限制(Hoschek et al ., 2019 b)。直接环己烷喂养可能减少剥离但可能涉及一个浓度梯度和细胞中毒。相反,通过气态环己烷喂养是评估。为此,曝气流是饱和与环己烷在一个单独的容器,导致气相浓度为5.42±0.04毫米。这个cyclohexane-saturated空气和纯空气混合创建一个曝气气流提供所需的环己烷数量(补充图S3)。因此,cyclohexane-saturated空气的一种变体纯空气流量比允许的调优气态环己烷浓度反应堆。第一组实验中,我们选择了环己烷进给速率为0.276更易分钟⁻¹l⁻¹,对应于一个水相浓度的30µM与气相平衡。因此,系统操作在底物限制的条件下最小化环己烷毒性效应。

在RB细胞最初生长在批处理模式中葡萄糖耗尽之前,他们与一个指数进一步生长在馈料式模式饲料使µ= 0.1 h⁻¹。在馈料式培养,细胞诱导基因表达不同的级联,其次是收获和再悬浮在葡萄糖和IPTG-containing Kpi缓冲区。在第一个2 h,细胞浓度略有增加从9.2到11.4 g_CDWl⁻¹,可能是由于剩余养分栽培介质,然后保持不变在接下来的4 h (图5一个)。O₂限制避免了维护溶解氧浓度(pO₂)20到50%的饱和。葡萄糖酸积累最终浓度为8.5 g L⁻¹后6 h的生物转化。在前3 h,水环己烷浓度保持低(图5 b),而cyclohexane-limited特定活动从8∼6 U g略有下降_CDW⁻¹,大致相关细胞密度增加将导致更严重的底物限制(图5 c)。在这个时期,∼50更易与环己烷是美联储通过气态和13.3±0.3更易与产品积累(大约25%的转换)。3 h后,环己烷浓度增加和稳定在∼18μM,而具体的活动减少∼4 U g_CDW⁻¹。这是低于10.3 U g_CDW⁻¹预计在18µM环己烷根据动力学参数(图4和情商。)。考虑到没有通路中间体积累,这可能是由于损失Cyp活动(第一反应步骤)或改变细胞生理学(传质细胞膜和代谢活动)。作为评估通过有限差分光谱(图5 c),活跃Cyp的数量下降了30%在第一反应的3 h,然后保持稳定,这不能完全解释活动课程。最终产品的浓度为22.8±1.0毫米(达成图5 b),包括主要产品6公顷,氧化过度产品己二酸(AA)(产品总数的1.2%)。总体而言,生物质产品收益率的0.28 g g_CDW⁻¹和平均效率为0.50 g L⁻¹h⁻¹获得(表2)。

更高的环己烷浓度导致增强初始活动但可怜的生物催化剂的稳定性

评价基质限制多少可以缓解而不损害生物催化剂性能、底物通过气相进给速率增加了6倍,对应于一个水环己烷浓度147µM(有关详细信息,请参阅材料和方法)。细胞浓度略有增加在第一次4 h从8到9 g_CDWl⁻¹然后降至7 g_CDWl⁻¹8 h后(图6)。在连续的阿宝₂增加,这表明细胞代谢,抑制/中毒导致明显的积累也葡萄糖和葡萄糖酸(50和20 g L⁻¹分别)。此外,小α-ketoglutarate形成(1.6 g L⁻¹)被观察到。水环己烷浓度不断增加从0.1毫米到0.4毫米的初始值8 h后生物转化(图6 b),表明环己烷溶解度的增加由于生物学和biotransformation-related水相组成的变化。这个也被观察到在无空气STR cyanobacteria-based环己烷羟基化的第二有机相(Hoschek et al ., 2019 b)。它已经表明,一些微生物物种,包括假单胞菌,产生表面活性剂增加底物溶解度,因此可用性(Margaritis et al ., 1979;慕克吉et al ., 2006)。同时,添加疏水性化合物大肠杆菌文化在一个充气STR被发现导致细胞分数的外观与疏水表面性质(柯林斯et al ., 2015)- - -这样的溶解度增加。另一个可能的原因提要加息导致高2.5倍初始22.8±2.2 U g全细胞活动_CDW⁻¹,紧随其后的是一个更大幅减少4.7±1.9 U g_CDW⁻¹前3 h内的反应(图6 c),因此不会导致整体生物转化性能的改善(图5,6;表2)。有趣的是,活跃的Cyp数量保持稳定的反应时间,没有积累途径中间体,指示一个限制引起的细胞生理学/代谢的变化,而不是通过胞内酶量。

识别可能的原因观察到的活动减少,我们评估产品(6公顷)抑制由环己烷和细胞中毒。事实上,增加6公顷浓度导致减少特定的活动(图7),因此,可能会导致活动损失在生物反应器。微生物6公顷出口的模式是未知的,但可能需要主动运输由于其带电字符pH值7.2。引人注目的是,只有Cyp和内酯酶被抑制6公顷当细胞包含一个级联酶测试(补充图S4)。另一方面,环己烷抑制的增长P。taiwanensis VLB120与half-maximal增长率观察到的水环己烷浓度∼450µM (图7 b)。在第一反应堆(环己烷浓度图5 b)则要低得多,但他们在第二个反应堆(达到0.4毫米图6 b)。总的来说,环己烷的毒性和产物抑制过程条件下生物催化剂稳定性影响因素。

讨论

聚已酸内酯(PCL)属于集团的可生物降解聚合物来自化石资源。PCL常用于混合和应用药用(塞拉诺et al ., 2010)、包装(毛重和卡尔拉,2002年),和电子行业(Labet首,2009年;高et al ., 2017)。其酯债券主要负责hydrolysis-based生物降解能力,取决于其分子量和结晶度(毛重和卡尔拉,2002年)。至少39种细菌类厚壁菌门和变形菌门几天内已确定降解PCL (Tokiwa et al ., 2009)。最近,我们开发了重组p . taiwanensisVLB120菌株,从环己烷合成聚已酸内酯单体转换和营业额的100%每摩尔45000摩尔单体Cyp的第一和病原反应酶的改造在活的有机体内级联(谢弗et al ., 2020 a)。在这项工作中,我们研究了培养条件的影响p . taiwanensis反过来,_6HA生长和生理和特定的活动为了评估如何以及在多大程度上可以利用其催化潜力的生物反应器设置环己烷转换到6公顷。

栽培介质和条件影响葡萄糖酸积累和全细胞活动

p . taiwanensis_6HA特征在不同的媒体和全细胞生物催化剂格式。M9, RB, M9 *媒体是标准的最小媒体用来培养异养生物(Riesenberg et al ., 1991;Sambrook和罗素,2001)。他们的成分可以影响细胞生理学和催化性能,证实了在这个研究p . taiwanensis_6HA。的培养铜绿假单胞菌,黑曲霉,和p . taiwanensisVLB120在低磷和葡萄糖酸铵浓度报道涉及积累(Buch et al ., 2008;穆勒,1986;Volmer 2016)。我们发现磷酸葡萄糖酸积累可以预防通过增加三倍在M9 * M9培养基相比,内容涉及减少,然而,比生长速率(图2;表1)。磷酸一个中间水平,RB中葡萄糖酸积累导致40%低于M9培养基但并不显著影响增长率。葡萄糖酸是由periplasmatic葡萄糖脱氢酶(Gcd)和扩散通过毛孔进入介质,它是已知函数作为磷酸盐增溶剂(Buch et al ., 2008;德尔卡斯蒂略et al ., 2007)。据报道,过多的葡萄糖酸形成阻碍polyhydroxyalkanoate合成(Poblete-Castro et al ., 2013)和异丁酸产量(朗et al ., 2014)。虽然在RB中葡萄糖酸形成,没有区别的具体活动p . taiwanensis观察_6HA相比M9 *介质(图2),表明葡萄糖酸形成RB中不影响生物催化剂的性能。p . taiwanensis然而,_6HA显示特定的活动在M9培养基(低图2)。葡萄糖酸更明显的形成和一个不稳定的pH值在M9培养基组成这种差异可能的原因(图2;表1)。另一项研究显示,高增长率观察真菌木霉属reesei在M9培养基中导致降低外源蛋白质合成(短发et al ., 2005)。因此,不同的蛋白质合成减少导致的低活动出现p . taiwanensis_6HA生长在M9培养基(补充图S1)。总的来说,M9培养基可以被认为是不适合6公顷产量p . taiwanensis_6HA由于葡萄糖酸积累和较低的特定活动。一项研究报道,新陈代谢活跃的休息大肠杆菌细胞有苯乙烯环氧化作用能力高于在RB细胞培养介质(Julsing et al ., 2012)。相反,增加细胞的更稳定的活动使他们更适合流程设置(库恩et al ., 2012 b)。这些结果表明,细胞生长状态明显影响全细胞活动,特别是在长期培养。静息细胞p . taiwanensis_6HA表现出特定的活动迅速下降50%以上的第一个小时内反应(图3 a, D)的诱导物IPTG静息细胞导致一些活动稳定(图3 b, E),可能由于蛋白质再合成基于氨基酸来自蛋白质水解变性和过时的蛋白质(Konovalova et al ., 2014)。最初的活动而日益增长的细胞显示低于休眠细胞,他们的活动损失不明显(图3 c、F),因为它可以从他们的预期更常数和高代谢和蛋白质合成活动。然而,底物限制,产物抑制,和/或环己烷不能排除中毒的其他因素导致观察到的全细胞活动减少,尽管6公顷和水环己烷仍低(低于3.5毫米和125μM,分别)。细胞增长,RB中比M9 *似乎更有前途。因此,恒定体积的产品堆积速率和低啊₂气相中的水平表明,缓慢的特定活动的减少可能是由于越来越O₂限制在摇动烧瓶内的细胞浓度增加。

衬底的供应和产品去除反应工程的关键方面

环己烷是一种小型(84 Da)和疏水分子和线粒体外膜和内膜可迅速通过p . taiwanensis(陈,2007;Nikaido 2003)。此外,其疏水性质(logP_辛醇/水= 3.4)支持其在细胞膜的积累,这使得微生物剧毒(膜解体600µM) (Sikkema et al ., 1994)。因此,环己烷供应一个搅拌釜反应器生产单体是最关键的一步。先前的研究要么执行shake-flask实验(王et al ., 2020;Zhang et al ., 2020)或从减少毒性和挥发性底物环己醇生产单体通过级联反应(Srinivasamurthy et al ., 2019)。利用的催化性能p . taiwanensis_6HA在受控环境中启用高啊₂转让、连续aeration-mediated气态环己烷饲料bioreactor-based生物转化成立(补充图S3)。考虑由此产生的水基质浓度(图5 b,6 b),这两种不同的饲料率可望应用于涉及一线和零级动力学(图4)。而最初的活动确实是2.5倍高的饲料率(图5 c,6摄氏度),具体的活动获得的摇动烧瓶内没有到达,和较高的进给速率相对较快的活动减少有关。稳定的Cyp数量在整个non-cyclohexane-limited生物转化(图6 c)表明,产物抑制和/或一个受损的代谢活动,因此NADH再生可能由于环己烷毒性阻碍生物催化剂活性。环己烷的毒性确实是发现一个关键因素,增长率减少一半的∼450µM (图7 b),大致相当于它的浓度在年底non-cyclohexane-limited生物转化(图6 b)。支持这样一个可能的毒性作用更突出活动减少cyclohexane-limited生物转化(图5)。代谢相关的活动毒性效应也被观察到其他低logP-compounds如氧化苯乙烯,即使在显然subtoxic水平(库恩et al ., 2013;Kadisch et al ., 2017 a;Kadisch et al ., 2017 b)。此外,产物抑制的贡献/毒性不能排除(谢弗et al ., 2020 a),尽管6公顷浓度最突出活动的时间减少只有轻微影响静息细胞活动(图7)。substrate-limited的生物转化,环己酮浓度仍低于25µM因此不是有毒的范围(图5 b)。然而,适度活动减少也观察到这里,,尽管初始活性越低,仍然使最终产品比较集中获得更高的饲料率(表2)。在这种情况下,产物抑制,特别是对生物转化,构成了温和的活动减少(最有可能的原因图7)。

Srinivasamurthy et al。(2020)开发了一种全细胞过程大肠杆菌获得了更昂贵的185毫米ε-caprolactone但波动较小和更少的有毒的底物环己醇。他们通过注射泵应用连续衬底饲料和脂肪酶纯化获得6公顷为主要产品(Srinivasmurthy et al ., 2020)。结果70 h过程稳定,导致最终产品高7倍比我们的全细胞过程以环己烷为底物浓度(表2)。在这项研究中提出的方法使使用更便宜的基质和不涉及一个昂贵的酶,过程性能需要进一步提高达到工业相关性。气态环己烷喂养不允许高基质转换(表2),因此需要通过缩合、环己烷回收,然而,可以被认为是标准的技术。两者之间的最优环己烷进料浓度可能是测试环己烷浓度但不能指望完全避免衬底和产品的毒性和抑制作用。此外,长时间接触环己烷全细胞活动的影响需要评估调整水基质浓度。原位产品除出现强制,这是具有挑战性的6公顷由于其亲水特性。它已经表明,固相萃取可以提高产品效价2000倍(菲利普斯et al ., 2013)。此外,使用超临界流体萃取构成一个选项(Khosravi-Darani Vasheghani-Farahani, 2005)。它已被证明原位聚合与脂肪酶PCL是可能的,这可能是结合产品提取成第二个有机或超临界阶段(施密特et al ., 2015;Scherkus et al ., 2016)。第二阶段也可以用作环己烷水库减轻其毒性作用(Hoschek et al ., 2019 b)。使用环己烷作为有机相,solvent-tolerant VLB120细胞表型可能构成另一个选项(Volmer et al ., 2014)。然而,溶剂耐受性高能源需求(空白et al ., 2008;库恩et al ., 2012 a)和环己烷的波动性和爆炸性充气系统是这一方法的缺点。

尽管越来越多的细胞有一个高能源需求增长(布勒公司et al ., 2008),显示较低的初始活动(图3),值得测试它们在生物反应器设置级联反应被发现显示产物抑制/中毒(那么严重Julsing et al ., 2012)。这可能涉及到一个能量依赖性宽容机制和更有效的蛋白质再合成,从而提高过程稳定性。这样一个更高的稳定性也会意识到采用连续生物膜毛细管反应堆代替str (Heuschkel et al ., 2019)。这样一个系统可以允许环己烷氧化率0.4 g L⁻¹h⁻¹好几天(Karande et al ., 2016)。异养的结合p . taiwanensis自养的集胞藻属sp.启用更高的稳定性和环己烷100%转换(Hoschek et al ., 2019 a)。

结论和展望

这项研究报告的成功转移一个分4步级联拥有通过重组p . taiwanensisVLB120成生物反应器格式转换的环己烷聚合物构建块6公顷,讨论遇到的挑战。栽培介质成分被发现高成就的一个关键因素全细胞活动。标准的M9培养基是不适合由于过度从葡萄糖,葡萄糖酸的形成是与较低的催化活动相关。RB和M9 *媒体都合适,RB中使更快的增长较高的细胞密度。新陈代谢活跃的静息细胞表现出反应条件下比较快的活动减少,而越来越多的细胞显示更加稳定,但较低的初始活动。添加一个诱导物可以稳定静止细胞,是应用于生物反应器设置包括气态环己烷饲料。24毫米。这种方法使产品效价的进一步分析表明,中毒的基质环己烷是一个关键因素,导致底物毒性和衬底之间的微妙平衡限制。同时,产物抑制被发现在高6 ha水平成为至关重要的。优化环己烷的饲料、气体回收,原位产品移除,连续反应格式构成策略来进一步提高产量和生产力。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

作者的贡献

磅,IH KB、RK和BB参与研究的概念和设计和数据解释。磅,IH兆瓦,毫升收集数据并参与数据分析。磅的初稿写手稿。KB、RK和BB贡献的文章结构和编辑。所有作者都参加最后的编辑和批准提交的版本。

资金

LS, IH毫升PolyBugs ERA-IB资助的项目(身份证:16006)和Sachsisches Ministerium毛皮科学和Kunst (SMWK)(项目ID: 100318259)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们承认使用设施中心的生物催化(MiKat)亥姆霍兹环境研究中心的,这是欧洲区域发展基金支持的(EFRE,欧洲基金萨克森)和亥姆霍兹协会。作者要感谢安德烈亚斯•施密德为有益的讨论。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fctls.2021.683248/full补充材料

引用