euphane抗炎效应,tirucallane-type三萜孤立的从传统草药大戟属植物neriifolial
Stephen s . Chang
1、2
Hung-Tse黄1
Wen-Chi魏
1
I-Wen瞧1、3
林语辞
1
Chih-Hua曹国伟4、5
Geng-You廖6
Yuh-Chiang沈
1
Jih-Jung陈
7
Tsung-Lin李
3
Liang-Tzung林
8、9
Chen-Jei大2*
Yao-Haur郭
1,10*
Chia-Ching Liaw
1、11*- 1国家中医药研究所、卫生和福利部,台北,台湾
- 2博士计划在临床药物开发的草药,药学院,台北医学大学,台北,台湾
- 3基因组学研究中心学术研讨会,台北,台湾
- 4中药研究与开发中心、中国医科大学医院,台中,台湾
- 5学院制药、中国医科大学、台中,台湾
- 6医学院的生理学研究所国家杨明交通大学,台北,台湾
- 7制药部门,国家杨明交通大学,台北,台湾
- 8微生物学和免疫学,医学院,医学院台北医学大学,台北,台湾
- 9医学科学研究所,大学毕业的医学、台北医学大学,台北,台湾
- 10中医综合医学研究所,大学,中国医科大学,台中,台湾
- 11国立嘉义大学生化科技部门、嘉义、台湾
大戟科植物大戟属植物neriifolial .广泛分布于印度、泰国、中国东南部,台湾和用作驱风剂和祛痰剂来治疗一些炎症相关的疾病,如淋病、哮喘,和癌症。我们的搜索过程中潜在的抗炎因子的名为工厂,11杆的三萜大肠neriifolia在我们之前的努力孤立和报道。鉴于常用药用其丰富的丰度,这个后续的ethanolic提取探索导致额外的八个三萜的隔离,包括6个新的euphanes-neritriterpenols H和J-N (1和3- - - - - -7)——新tirucallane neritriterpenol我(2),和一个已知化合物,11-oxo-kansenonol (8)。他们的化学结构的基础上,阐明光谱数据,包括1 d和2 d NMR和HRESIMS光谱。的绝对立体化学neritriterpenols决心通过单晶x射线衍射分析,ICD光谱和DP4 + NMR数据计算。化合物1- - - - - -8同时进行了对他们的抗炎活动通过脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞细胞il - 6和TNF-α生264.7。有趣的是,euphane-type三萜烯(1和3- - - - - -8)在LPS-induced il - 6有抑制作用但不是TNF-α,虽然tirucallane-type三萜烯2表现出强烈的抑制il - 6和TNF-α。
1介绍
大戟属植物neriifolial,commonly known as a hedge or an ornamental horticultural cactus-like fleshy plant, belongs to the spurge family (Euphorbiaceae), one of the largest families of flowering plants (韦伯斯特,1994)。大肠neriifolia节目形态特征的无毛竖立分支多汁,耐旱性的灌木或树,1.8 - -4.5米高,结节状圆柱形或模糊five-angled分支(马里和应,2017年)。像其他大戟属植物植物,白色的橡胶(milky-sap-like流体产生当植物受伤)大肠neriifolia是有毒的和刺激皮肤和眼睛(Sultana et al ., 2022)。作为一把双刃剑,大肠neriifolia也是了不起的作为药用植物原产于印度,具有各种ethnomedicinal使用根据不同部分或整个植物。例如,乳白色乳液,这是传统上用作泻药,是有利于肿瘤,腹部的麻烦,白斑病疗法(马里和应,2017年)。尽管相当大的植物化学成分分析和现代药理研究大肠neriifolia据报道,提取或有毒的乳胶/ sap的各种成分,叶子,茎,或整个工厂的大肠neriifolia仍具吸引力,因为额外的生物活性,包括抗感染(Sultana et al ., 2022)和反人类冠状病毒(Pramanik et al ., 2022)、氧化剂(Kumar et al ., 2021),抗炎(•帕立特et al ., 2016致(进行),Sharma et al ., 2011;Pracheta 2013),hepatocarcinogenesis (Sharma Janmeda, 2013)和反血管增生(Qi et al ., 2020)活动,被发现的时候。
在过去的十年里,几个大戟属植物报告了萜烯和良好的药理作用,其中最著名的例子是ingenol-3-angelate,二萜大戟属植物peplus对癌前光化性角化病有效,获得了FDA的批准在2013年和2012年EMA (费德勒和戈德堡,2014年)。大部分的报道大戟属植物常用药用属于tirucallane, cycloartane羽扇烷,齐墩果烷,ursane和taraxane子类(Kemboi et al ., 2020)。最近,cycloartane三萜烯(euphonerins g)和ingol二萜大肠neriifolia已经发现展览death-receptor expression-enhancing活动(死亡受体表达在许多细胞类型,尤其是在免疫系统),表明大戟属植物三萜具有潜在的应用在免疫调节、抗炎和镇痛治疗(Bigoniya Rana, 2010;Toume et al ., 2012;马里和应,2017年)。在我们以前的生物活性成分的研究大肠neriifolia11常用药用具有抗炎和抗癌特性被孤立,确认为neritriterpenols g, (23E)-eupha-8 23-diene-3β25-diol-7-one, (+) - (24年代)-eupha-8 25-diene-3β24-diol-7-one (24R)-eupha-8 25-diene-3β24-diol-7-one, sooneuphanone B (Chang et al ., 2022)。解释之间的关系大肠neriifolia常用药用抗炎、抗癌的活动,我们继续分离和净化ethanolic提取95%的这些组件大肠neriifolia茎,并评估他们的抗炎活动通过LPS-stimulated生264.7巨噬细胞细胞。在本文中,我们报告的隔离和结构说明八三萜,包括六个新的euphane-type三萜1和3- - - - - -7(neritriterpenols H和J-N)和一个新的tirucallane-type三萜烯2(neritriterpenol I),以及一个已知化合物,11-oxo-kansenonol (8)(图1)。化合物1- - - - - -8被连续的柱层析法纯化,结构都从1 d和2 d-nmr阐明,IR, MS分析;与此同时,他们的手性羟基的配置是由旋光色散(OD),诱导圆二色性(ICD), DP4 + NMR数据计算分析,和单晶x射线衍射数据,以及光谱与文献报道的数据进行比较。此外,我们也评估这些孤立的抗炎活性化合物通过测量的影响1- - - - - -8在抑制il - 6和TNF-αLPS-stimulated生264.7巨噬细胞。
图1。化学结构的化合物1- - - - - -8从大肠neriifolia阀杆。
2材料和方法
2.1一般实验程序
光学旋转记录使用JASCO p - 2000旋光计。使用热红外光谱得到的那些时光iS5科学Nicolet FTIR光谱仪。圆二色性(CD)光谱测量使用JASCO j - 715分光偏振计。核磁共振(NMR)谱记录使用瓦里安统一Inova 500 - mhz仪器用5毫米SWPFG / TRPFG调查。高分辨率电喷雾电离质谱(HRESIMS)数据是使用热测量的科学问Exactive焦点Orbitrap质/ MS仪器最终3000 UHPLC系统。硅胶60(默克公司,70 - 230和230 - 400目),C18凝胶(Chromatorex 40 - 75目),和交联葡聚糖LH-20 (GE)被用于空心柱色谱法。薄层色谱法(TLC)分析进行预涂硅胶板(默克,Kieselgel 60 F254年1毫米),喷洒anisaldehyde-sulfuric酸试剂,然后加热在100°C。制备高效液相色谱法进行了使用日本岛津公司LC-8A泵和一个SPD-20A紫外检测器,配有COSMOSIL 5 c18AR-II列(身份证。250×20毫米,Nacalai Tesque Inc .)。力量D8风险单晶XRD衍射仪配备Mo-Kα辐射源是用来记录单晶x射线衍射。
2.2植物材料
的肉质茎大肠neriifolial .从传统草药市场购买天顺人参医学和草药,台北,台湾。博士发现的材料是作者之一Chia-Ching Liaw,馆长的中医药研究所研究的标本,台湾。凭证标本(en - 2018 - 10 - 001)沉积在NRICM的植物标本,台北,台湾。
2.3提取、分离和纯化
的肉质茎大肠neriifolial .(45公斤)被风干,切碎。干物质(12.0千克)提取95% EtOH (80 L) 50°С/ 24小时三次,和提取相结合,集中在减压下获得粗提物。EtOH提取(ca。1.9公斤)悬浮在H2O顺序分区己烷和CH2Cl2收益率三个分区层。CH的2Cl2层(266.1克,14.0%)由flash在硅胶柱层析法和色谱筛选了CH2Cl2/甲醇(97:3-3:1,v / v)收益率三个分数(ENDD1∼3)。分数ENDD2(97.3克,5.12%)分次使用高效液相色谱系统,筛选了与甲醇在H2O(60 - 100%)获得四个小分支(ENDD2.1 2.4∼)。的小分支ENDD2.2(23.2克,1.22%)色谱仪使用交联葡聚糖LH-20列和筛选了100%甲醇获得七个部分(ENDD2.2.1∼7)。ENDD2.2.4受到rp -使用一个C18列检测到210海里,然后,小分支得到(ENDD.2.2.4.1∼6)。化合物5(5.0毫克,0.00026%,Rt:67.9分钟)6(16.9毫克,0.00088%,Rt:65.4分钟)纯化的小分支ENDD2.2.4.2高效液相色谱和筛选了40%乙腈(流量:10.0毫升/分钟)。的小分支ENDD2.2.4.3由高效液相色谱纯化和筛选了45%乙腈化合物1(4.1毫克,0.00022%,Rt:56.7分钟)2(5.5毫克,0.00029%,Rt:88.4分钟)。的小分支ENDD2.2.4.4也由高效液相色谱纯化和筛选了乙腈获得50%8(14.2毫克,0.00075%,Rt:50.4分钟)。小分支ENDD2.2.4.5和ENDD2.2.4.6通过高效液相色谱法进一步纯化和筛选了乙腈,收益率为50%3(5.1毫克,0.00027%,Rt:62.4分钟),4(11.4毫克,0.0006%,Rt:60.3分钟)7(5.0毫克,0.00026%,Rt:108.2分钟)。
2.4光谱数据
2.4.1 Neritriterpenol H (1)
白色无定形粉末;(α)+ 28.9 (c0.1、甲醇);ν马克斯(KBr) 3429, 2927, 1672, 1465, 1376, 1270, 1183, 1037厘米−1;CD (c0.02、甲醇)216(+ 10.67),265(−11.65),349(+ 5.26)海里;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMS在m / z495.3451 [M + Na)+(计算的。对于C30.H48O4Na, 495.3445)。
表1。1核磁共振光谱数据的化合物1- - - - - -8(CDCl3和500 MHz)。
表2。13理化性质在化合物光谱数据1−8(CDCl3和125 MHz)。
2.4.2 Neritriterpenol我(2)
白色无定形粉末;(α]−8.3 (c0.3、甲醇);ν马克斯(KBr) 3442, 2967, 2932, 2871, 1716, 1660, 1458, 1376, 1272, 1183, 1121, 1077, 1040厘米−1;CD (c0.02、甲醇)216(+ 11.40)和249(+ 3.62)纳米;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMS在m / z493.3287 [M + Na)+(计算的。对于C30.H46O4Na, 493.3288)。
2.4.3 Neritriterpenol J (3)
无色晶体;(α)+ 22.7 (c0.3、甲醇);ν马克斯(KBr) 3417, 2967, 2925, 1640, 1462, 1378, 1292, 1240, 1173, 1072厘米−1;CD (c0.02、甲醇)215(+ 11.94),261(+ 4.06)和313(−0.55)海里;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMS在m / z497.3618 [M + Na)+(计算的。对于C30.H50O4Na, 497.3601)。
2.4.4 Neritriterpenol K (4)
白色无定形粉末;(α)+ 12.9 (c0.3、甲醇);ν马克斯(KBr) 3419, 2970, 2871, 1643, 1596, 1460, 1381, 1267, 1173, 1075, 1025厘米−1;CD (c0.02、甲醇)215(+ 11.73),257(+ 8.26)和313(−2.17)海里;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMSm / z473.3638 [M−H]−(计算的。对于C30.H49O4473.3265)。
2.4.5 Neritriterpenol L (5)
无色晶体;(α)+ 5.8 (c0.2、甲醇);ν马克斯(KBr) 3432, 2923, 2854, 1672, 1467, 1378, 1270, 1235, 1183, 1037厘米−1;CD (c0.02、甲醇)216(+ 11.49)和270(+ 19.50)纳米;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMS在m / z511.3397 [M + Na)+(计算的。对于C30.H48O5Na, 511.3394)。
2.4.6 Neritriterpenol米(6)
白色无定形粉末;(α)+ 9.2 (c0.3、甲醇);ν马克斯(KBr) 3439, 2975, 2873, 1670, 1462, 1416, 1381, 1267, 1233, 1183厘米−1;CD (c0.02、甲醇)215(+ 12.08)和273(+ 10.23)纳米;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMS在m / z511.3399 [M + Na)+(计算的。对于C30.H48O5Na, 511.3394)。
2.4.7 Neritriterpenol N (7)
白色无定形粉末;(α)+ 10.5 (c0.3、甲醇);ν马克斯(KBr) 3454, 2975, 2933, 2871, 1670, 1645, 1383, 1267, 1233, 1188厘米−1;CD (c0.02、甲醇)219(+ 10.54)和271(+ 16.17)纳米;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMS在m / z515.3734 [M−H]−(计算的。对于C32H51O5515.3742)。
2.4.8 11-Oxo-kansenonol (8)
白色无定形粉末;(α)+ 18.5 (c0.4、甲醇);ν马克斯(KBr) 3412, 2970, 2360, 2341, 1668, 1034厘米−1;CD (c0.02、甲醇)215(+ 11.96)和276(+ 21.4)纳米;1(H) - 500 MHz13C - NMR光谱数据(CDCl (125 MHz)3)表1,2分别;HRESIMSm / z469.3323 (M - H)- - - - - -(计算的。对于C30.H45O4469.3312)。
2.5 x射线晶体化合物3和5的数据
neritriterpenols J的无色晶体(3)和L (5)测量使用布鲁克D8风险单晶x射线衍射仪配备了双微焦点x射线源在Mo-Kα辐射。
2.5.1 Neritriterpenol J (3)
晶体数据neritriterpenol J (3C):30.H52O5;水晶大小:0.56×0.10×0.02毫米3;波长(λ)= 0.71073;晶系:单斜;P21空间群;单胞尺寸,一个= 12.0641(5)(α= 90°),b= 7.0406(2)一个(β= 94.7800(10)°),和c= 17.1863(7)(γ= 90°);(9)体积= 1454 .70美元3;Z= 2;密度(计算)= 1.125毫克/ m3;吸收系数= 0.074毫米1;F (000) = 544 K, T = 200 (2)。共有27930个反射收集,其中5130个独立的反射(Rint= 0.0678)我>2σ(我)被用于分析。最后的指标是R1 = 0.0392和或者说是2 = 0.0878,拟合优度= 1.059。绝对的结构参数是0.1 (10)。所有的数据所示补充表S3。剑桥晶体的晶体数据存入数据中心(CCDC)下沉积数量2208741。
2.5.2 Neritriterpenol L (5)
晶体数据neritriterpenol L (5C):30.H50O6;水晶大小:0.60×0.08×0.03毫米3;波长(λ)= 0.71073;晶系:斜方晶系的;空间群P212121;单胞尺寸,一个= 6.9896(3)(α= 90°),b= 12.3010(6)(β= 90°)c= 33.8198(17)(γ= 90°);体积= 2907。8 (2)3;Z= 4;密度(计算)= 1.157毫克/ m3;吸收系数= 0.079毫米1;F (000) = 1112 K, T = 200 (2)。共有15236个反射收集,其中5135个独立的反射(Rint= 0.0676)我>2σ(我)被用于分析。最后的指标是R1 = 0.0513和或者说是2与拟合优度= 1.054 = 0.0963。绝对的结构参数是−1.0 (14)。所有的数据所示补充表S4。剑桥晶体的晶体数据存入数据中心(CCDC)下沉积数量2208742。
2.6莫2(OAc)4修改后的圆二色性分析
确定绝对构型的循环和非循环维克二醇是通过使用过渡金属络合试剂,dimolybdenum四乙酸(密苏里州2(OAc)4]。测试了化合物(每个化合物,0.5毫克)直接溶解在密苏里州的一个解决方案2(OAc)4复杂在DMSO(5毫克/ 10毫升)的摩尔比率2(OAc)4/ 1:0.5的化合物和混合物随后测量诱导的CD光谱没有复合物的制备和隔离。
2.7 DP4 +概率分析的计算分析
矫形器发现利用GMMX包中实现高斯16 (弗里希et al ., 2019)MMFF94力场和矫形器能量窗口5千卡每摩尔受到几何优化和频率计算的气相在B3LYP /我感觉(d)水平。NMR化学位移在甲醇或CHCl计算3使用gauge-independent原子轨道(GIAO)方法在PCM / mPW1PW91/6-31G + (d, p) / / B3LYP /我感觉(d)水平与玻尔兹曼人口精制溶剂化作用模型中基于密度(SMD)甲醇或CHCl3在一个新的水平(M06-2X /我感觉+ (d, p) / / B3LYP /我感觉(d)) (Zanardi et al ., 2020)。Grimblat等人提供的Excel表是用于DP4 +概率分析(Grimblat et al ., 2015)。
2.8细胞培养和可行性分析
生264.7巨噬细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)。在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫)+ 1%青霉素和链霉素37°C公司为5%2在湿润孵化器。细胞被镀的密度5×104细胞在96孔板每24小时之前治疗脂多糖(LPS, 1μg /毫升)车辆或表示化合物剂量的5、10、20μM。经过24小时的治疗,通过MTT测定细胞生存能力评估。
2.9确定TNF-α和il - 6的分泌
264.7原始细胞被播种在24-well盘子2×10的密度5细胞/ pre-incubated 24 h。然后,细胞处理有限合伙人(1μg /毫升),有限合伙人+地塞米松(敏捷,0.25µM),或有限合伙人+各种剂量的表明化合物(5、10和20µM) 24 h。测定的条件培养基收集使用ELISA试剂盒TNF-α和il - 6水平(il - 6的分泌酶联免疫试剂盒、BD、富兰克林湖,新泽西,美国;TNF-α酶联免疫试剂盒,表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国),根据制造商的指示。
2.10统计分析
给出的数据至少代表三个独立的实验和表达为均值±标准差(SD)。所有统计分析使用Prism 7.0(美国GraphPad软件)单向方差分析,其次是图基的多个范围测试如果方差分析是重要的(*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001)。
3结果与讨论
ethanolic提取的大肠neriifolial .茎是悬浮在H2啊,然后按顺序分区己烷和CH2Cl2获得两个有机层和水层。CH的2Cl2提取色谱仪在C18然后在交联葡聚糖凝胶flash列LH-20列。的小分支进一步受到制备反相高效液相色谱法产生8个化合物(1- - - - - -8)(图1)。所有筛选分离化合物的抗炎活动的抑制il - 6和TNF-αLPS-stimulated生264.7巨噬细胞。
3.1分离化合物的结构说明
复合1获得了与白色无定形粉末(α)+ 28.9 (c0.1,甲醇),其分子式C30.H48O4与七度的未饱和(窦)推导出从HRESIMS pseudomolecular离子峰m / z495.3451 [M + Na)+(计算的C30.H48O4Na+495.3445)。红外光谱显示吸收带,表明羟基(3429厘米)的存在1)、烷烃(2927厘米1)、羰基(1672厘米1)、甲基(1465和1376厘米1),切断(1037厘米1)官能团。的13C -和DEPT-NMR光谱1把30个碳分成七甲基(δC15.2,16.3,17.6,18.9,19.7,25.7,27.6),8个亚甲基(δC27.4,27.8,31.0,31.3,31.8,33.7,35.9,和42.8),一个sp2亚甲基(δC111.0),三次甲基(δC35.6、48.5和49.3),三个oxymethine (δC68.1、76.2和78.3),四个脂肪族季碳(δC39.1,39.6,46.2,48.0),和三个sp2季碳(δC140.4、161.2和147.8)组和一个羰基(δC200.1)组,1核磁共振光谱证明显然七甲基(δH0.74,0.90 (d,J= 6.5 Hz), 0.94 (s), 1.02, 1.17, 1.28,和1.79 (s))和三个甲醛(δH3.34 (m), 4.06 (t,J= 7.0赫兹),4.72 (t)J= 8.5赫兹)组和一个烯亚甲基(δH4.88 (br)和4.97 (brs)]。上述数据表明,1具有象征性tetracyclic-fused环一部分包含七甲基三羟基,共轭double-ketone系统和终端烯烃。根据碳氢键单键的相关性1HSQC频谱,1H - - -13理化性质的作业1测定(表1,2)。的平面结构1阐明了1H -1H惬意和HMBC谱(图2):3,11-diol-8-en-7-one-containing 6/6/6/5-fused环的成立1H -1H安逸的相关性H21 (δH1.58和2.47)/ H22 (δH1.78,2 h) / oxymethine H-3 (δH3.34),H-5 (δH1.68)/小时26 (δH2.44和2.50),oxymethine H-11 (δH4.72)/小时2-12 (δH1.83和2.43),和H2-15 (δH1.46和2.12)/ H2-16 (δH1.35和1.96)/ H-17 (δH1.62),以及从Me-28 HMBC相关性(δH0.94)和Me-29 (δH1.02)oxymethine颈- 3 (δC78.3),c - 4 (δC39.1)和c - 5 (δC49.3);从十九个(δH颈- 1 (1.28)δCC 33.7)、C - 5烯季碳C-9 (δC161.2)和C-10 (δC39.6);从我18 (δH0.74)技术(δC42.8)、c13 (δC46.2),碳14 (δC48.0)和c - 17 (δC48.5);从我的30 (δH1.17)烯季碳8 (δC140.4)、c13碳14,C-15 (δC31.8);从H-5 (δH1.68)和H26 (δH2.44和2.50)羰基即(δC200.1)。然后,24-diol-25-ene-contained C8-side链连接在连接了c - 171H -1H H-17舒适的相关性(δH1.62)/ H-20(δH1.51)/ Me-21 (δH0.90)/小时2-22 (δH1.24和1.60)/ H2-23 (δH1.49和1.61)/ oxymethine H-24 (δH4.06)和烯亚甲基H2-26 HMBC相关性(δH4.88和4.97)和Me-27 (δH1.79)oxymethine C-24 (δC76.2)和烯季碳C-25 (δC147.8)。
图2。1H -1H惬意和化合物的关键HMBC相关性1- - - - - -3,5,7。
的平面框架1表明化合物1属于lanostane——或者euphane-type三萜烯,一对立体异构体有两个不同的构象在刚性Δc13和碳148日,24日6/6/6/5-tetracyclic三萜烯(lanostane 13R,14R趋向,而euphane相反的13年代,14年代方向),这两个手性碳原子的手性不能确定完全由一个关系我18,我30。根据定期构象lanostane和euphane常用药用,H-5之间的反向关系(α-oriented)和十九个(β-oriented)成立,而ßH-17被分配明确的配置。1 (NOESY谱的图3),ß方向为H情商1、H斧头2,H斧头-12年,H-17 H情商-16年,十九个Me-21 Me-28,我30是由十九个/ Me-28的修正,十九个/我的30,十九个/小时情商1 (δH2.47),十九个/小时斧头2 (δH1.78),Me-28 / H斧头2,H情商1 / H斧头2,我的30 /小时斧头-12 (δH2.43),我的30 / H-17, H情商-16 (δH1.96)/ Me-21, H-17 / Me-21。与此同时,一个相关性Me-29 / H-3 Me-29 / H-5 Me-29 / H情商6 (δH2.44),H-3 / H-5 H-3 / H斧头1 (δH1.58),H斧头1 / H-11 H-11 / H情商-12 (δH1.83),H-11 /我18,我18 / H斧头-15 (δH1.46),我18 / H斧头-16 (δH1.35),我18 / H-20, H斧头-15 / Me-29表示他们的逆α-orientations H斧头1、H-3 H-5, H情商6 H-11 H情商-12年,我18 H斧头-15年,H斧头-16年,H-20, Me-29。完整的配置任务,ß我30—构成和α-form我18画报的13年代,14年代手性的1,因此,复合1被认为是一个euphane-type三萜烯。同样,ßOH-3和OH-11的方向1决定了下行方向H-3和H-11刚性四环的一部分。的空间配置在C-24解析为一个哦R—构成配置相比之下的化学变化与已知化合物,即(24年代/R)-eupha-8 25-dien-3β24-diol-7-one (徐et al ., 2009;Chang et al ., 2022),3β,11α,24年代/R-trihydroxylanosta-8 25-dien-7-one (施et al ., 2020)(SupplementaryTable S1)。此外,配置C-24进一步决定在网上GIAO NMR计算(Grimblat et al ., 2015;Zanardi et al ., 2020)在mPW1PW91/6-31G + (d, p)水平上两种可能的形式2(24R),2 b(24年代)。DP4 +计算结果表明C-24的概率R为100% (图4)。综上所述,复合1确定的结构(24R11)3β,β,24β-trihydroxy-eupha-8, 25-dien-7-one名叫neritriterpenol H。
图3。选择NOESY相关性的化合物1,4,6。(绿色箭头:α-orientation;粉色箭头:ß趋向)。
图4。DP4 +概率化合物1和2mPW1PW91/6-31G + (d, p)水平。
Neritriterpenol我(2)有一个分子式C30.H46O4建立了八斗从HRESIMS离子峰m / z493.3287 [M + Na)+(计算的。对于C30.H46O4Na+493.3288),环碳信号13理化性质数据(表2与相比)是几乎相同的1,这意味着2有相同的平面tetracarbocyclic框架1。的红外吸收光谱2表达了羟基官能团(3442厘米1)、羰基(1716厘米1)和烯烃(1660厘米1)组和1H -1H惬意和HMBC相关性(图2)透露,2有相同的平面3 11-dihydroxyl-8-en-7-one四环的一部分是吗1,唯一的区别是在侧链。根据13C -和DEPT-NMR光谱2C8-side连锁2是由两个甲基(组装δC9.3和18.7)和两个亚甲基(δC26.0和34.0)组和一个脂肪族次甲基(δC35.6),一个sp2次甲基(δC154.9),一个sp2季碳(δC139.3),和一个醛(δC195.3)组。安逸的片段的组合H-17 / Me-21 / H-20 / H2-22 /小时2-23 / H-24和HMBC相关性从Me-27烯次甲基C-24,烯季碳C-25和醛C-26 (图2)这个C8-side链2-methyl-6λ提供3在c - 17 -hept-2-enal单元,连接。显著地,1核磁共振化学位移(δH0.95、维JMe-21 = 6.5 Hz),消极的旋光性(−8.3°),和NOESY相关性2(补充图S1显示的不同几何四环的一部分1,这表明2属于tirucallane骨架,一个20年代立体异构体的euphane三萜。的关键方向Me-21进一步证实了DP4 +概率计算在mPW1PW91/6-31G + (d, p)水平在两个可能的姿势,C-20的同分异构体,2(20年代),2 b(20R),计算结果表明2最喜欢的结构是近100%概率分布(图4)。因此,化合物的结构2被阐明(5R,10年代,13年代,14年代,17年代,20年代)3β,11β-dihydroxytirucalla-8, 24E-dien-7 26-dione。
至于3(neritriterpenol J)4(neritriterpenol K)而言,这两个化合物被认为是一对立体异构体,因为他们的极端的相似之处1H - - -13理化性质数据(表1,2),相同的分子式C30.H50O4(6窦)推导出HRESIMS离子峰的3和4在m / z497.3618 [M + Na)+(计算的。对于C30.H50O4Na, 497.3601)和473.3638 (M−H)−(计算的。对于C30.H49O4,分别473.3265)。分析了13C -和DEPT-NMR光谱3和4,两人的30个碳被发现是由八个甲基,九个亚甲基,3脂肪族次甲基,两个oxymethine,四个脂肪族季碳,氧合季碳,和两个烯季碳组,以及一个羰基,揭示3和4也常用药用。然后,并列的1H - - -13理化性质数据3和1显示几个共同特征这两个化合物,一个羟基δH3.27 (dd,J= 11.0、5.5赫兹);δC78.9),tetrasubstituted双键(δC共轭酮(161.5和139.6)δC199.1),和一个multi-methyl组,表明化合物3也有类似的不饱和共轭6/6/6/5-fused环一半1。的6/6/6/5-fused四环的环3估计是一个eupha-8-en-3-ol-11-one一部分通过HMBC相关性(图2)我18 (δH0.93)技术(δC51.1)、c13 (δC44.7),碳14 (δC51.2)和c - 17 (δC50.3);从十九个(δH颈- 1 (1.22)δC34.1),c - 5 (δC51.7),C-9 (δC139.6)和C-10 (δC37.1);从Me-28 (δH0.85)和Me-29 (δH1.06)oxymethine颈- 3 (δC78.9),c - 4 (δC39.0)和c - 5;和我的30 (δH1.04)8 (δC161.5)、c13、碳14,C-15 (δC30.0)。此外,24日25-diol-containing侧链连接在c - 17从Me-26 (HMBC相关性表明δH1.18)和Me-27 (δH1.24)oxymethine C-24 (δC79.3)和含氧季碳C-25 (δC73.2)。类似的1H -1H惬意和HMBC相关性4(图2)相同的平面结构3,确认他们的立体异构的关系。
自3和4被认为是一对立体异构体,一些明显不同的化学变化被发现在c - 21 C-24的对齐1核磁共振数据(补充图S2),这表明替换哦组让C-24唯一不同的手性中心。没有可识别的一个相关识别24R和24年代配置。幸运的是,无色晶体3成功从自然蒸发了吗3溶解氯仿/甲醇(1:1)解决方案配置决心通过x射线晶体分析(图5),复合3是显明地确定为(5R,10年代,13年代,14年代,17年代,20R,24岁年代)-eupha-8-en-3β24β,25-triol-11-one,而复合4因此一个24R差向异构体有24β-hydroxyl组。24R/年代配置进一步证实了dimolybdenum四乙酸(密苏里州2(OAc)4全身的)圆二色性(CD)方法的快速配置诊断非循环24日25 -秒,叔二醇(Di巴里et al ., 2004)euphane-type常用药用(图6)。图6显示两个R/年代异构体3和4可以螯合莫2(OAc)4在密苏里州的DMSO水溶液形成复合物2(OAc)41、2-diol-containing分子和一个复杂的有两个设想结扎的姿势,“赤道”(主要)和“轴”(小)的位置大部分与二醇侧链残留−dimolybdenum加合物(图6 b)。的重要的是,吸收区域dimolybdenum发色团在CD光谱获得超过250海里,而CD乐队305纳米左右与二醇基板上的绝对构型。因此,积极(313 nm)和消极(316海里)棉效果观察到的接口控制文件(图6 c)3和4分别表示C-24的绝对构型3和4,24年代和24R,分别。
图5。x射线晶体化合物的图3和5。
图6。(莫2(OAc)4全身的)圆二色性光谱的CD活性化合物的复合物3和4。(一)反应(莫2(OAc)4]在DMSO溶液。(B)(Mo的模型结构2(OAc)4复杂的。(C)CD光谱(密苏里州2(OAc)4复杂的。
同样,加合物钠离子峰m / z511.3397 [M + Na)+和m / z511.3399 [M + Na)+(计算的。对于C30.H48O5HRESIMS光谱的Na, 511.3394)5和6推导出相同的分子式,C30.H48O5(7窦),这表明化合物5和6是一个立体异构体。此外,他们1H - - -13理化性质数据(表1,2)是非常接近的3和4(补充图S2),表明之间的关系5和6是一样的3和4,这两对同源染色体。在13理化性质数据5/6和3/4最显著的区别在于,亚甲基(δC29.7)氧化成酮组(δC199.9/200.0)5和6。此外,HMBC修正从H26 (5:δH2.44和2.50;6:δH2.45和2.55)酮即(δC24岁的199.9/200.0)说明了平面eupha-8-en-3 25-triol-7, 11-dione的5和6。相同手性的刚性环的一部分5和6决定由他们NOESY修正,而24的取向,25 -秒,叔二醇在5/6是公认的x射线晶体分析5(图5)。C-24的手性6是决定的吗R形式的比较与已知化合物的化学变化,neritriterpenols A, B, G (Chang et al ., 2022)和ganodermanondiol (Fujita et al ., 1986;Arisawa et al ., 1988)(补充表S2(Mo),以及类似的2(OAc)4全身的]CD的结果5和6的3和4。最后,核磁共振对比化合物分配5在24年代手性,而6在24R分布。化合物5和6分别命名为neritriterpenols L和M。
复合7,得到白色无定形粉末,具有分子式C32H52O4(7窦),根据HRESIMS pseudomolecular离子m / z515.3734 [M−H]−(计算的。对于C32H51O5515.3742)。这种化合物被认为是一个烷基化的导数5和6,一个ethanoxylated C-255和6的观察1H -1H安逸的相关性H21”(δH3.45)/我2”(δH1.18)和H的HMBC相关性21′C-25 (δC77.4)(图2)。此外,年代配置C-24手性中心的化合物7耦合常数决定的H-24 (δH3.42,弟弟,J= 2.5和9.0赫兹),接近3 (δH3.30,弟弟,J= 2.0和10.5赫兹)和5 (δH3.25,弟弟,J= 2.0和10.0赫兹),显示7有相同的立体化学neritriterpenol L (5),名叫neritriterpenol N。
至于化合物8,它被认为是一个已知的三萜、11-oxo-kansenonol由之前报道的比较数据包括核磁共振、HRESIMS,紫外线和旋光性(王et al ., 2003)。
3.2评价抗炎活性的孤立的三萜
抗炎活性的孤立的三萜1- - - - - -8测试评估促炎细胞因子的分泌,il - 6和TNF-α在脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞。生264.7巨噬细胞治疗与有限合伙人和不同浓度的化合物1- - - - - -8(5、10和20μM) 24 h,紧随其后的是条件培养基收集。细胞毒性分析表明,孤立的化合物对细胞生存能力几乎没有影响的剂量5、10和20μM巨噬细胞。所有孤立的化合物(1- - - - - -8)表现出抑制活动在LPS-stimulated巨噬细胞对il - 6分泌剂量依赖性的方式(图7)。其中,化合物2显示最强的抑制活性的抑制LPS-induced il - 6分泌。另一方面,大多数孤立的化合物(1和3- - - - - -8),除了化合物2显示,弱或不活动的抑制LPS-stimulated TNF-α在原始264.7巨噬细胞(分泌图7 b)。只有20μM化合物2表现出显著的抑制作用在LPS-stimulated TNF-α分泌细胞类似于敏捷团队。
图7。抑制作用的化合物1- - - - - -8il - 6和TNF-αLPS-stimulated生264.7巨噬细胞分泌。264.7原始细胞co-treated有限合伙人(1μg /毫升)和各种剂量的表明化合物(5 10或20µM) 24 h。(一)il - 6和(B)使用酶联免疫试剂盒TNF-α浓度测定。平均数±标准差的值提出了三个独立的实验,分析了使用单向方差分析和图基事后测试(*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001)。
虽然据报道,TNF-α之间有密切的相关性,il - 6在几个炎症相关的疾病,il - 6和TNF-α扮演各自的角色和功能在一个给定的情况下(Kany et al ., 2019;小王和他,2020年)。因此,特定的发现il - 6抑制剂,有效降低il - 6的水平应该有用但不是TNF-α发展成药物减少不利的副作用。当前可用IL-6-specific抑制剂是单克隆抗体,比如叫目标白介素受体阻断il - 6信号(凯和西格尔,2020年),而小分子白介素抑制剂很少。在目前的研究中,我们孤立和阐明euphane-type三萜烯(1和3- - - - - -8)《植物拥有强有力的药理作用明确的抑制il - 6但不是TNF-α,鼓励发展成更有效的IL-6-specific抑制剂。另一方面,javamide-II确定从咖啡也显示类似的抑制活性与il - 6但不是TNF-α和IL-1βmacrophage-like THP-1细胞(公园et al ., 2020)。众所周知,特异表达il - 6可能是多种疾病的主要原因,例如,风湿性关节炎,COVID-19。此外,一些证据表明,il - 6与升高的持续时间和/或严重性COVID-19的事实,食品药品管理局批准使用il - 6抑制单克隆抗体(例如叫)COVID-19患者全身炎症。因此,寻找和开发新的和更有效的IL-6-specific抑制剂是至关重要的,因为它满足未满足的医疗需要(Stenvinkel et al ., 2005;周et al ., 2020;鲁宾et al ., 2021)。我们的结果应该向开发新药物开辟了新途径,能够调节il - 6和/或TNF-α。
4结论
在我们持续寻找ethanolic提取物的抗炎成分大肠neriifolial,we successfully isolated and identified eight 6/6/6/5-fused triterpenes, including six new euphane-type triterpenes (compounds1和3- - - - - -7)和一个tirucallane-type三萜烯化合物2),以及一个已知化合物,11-oxo-kansenonol (8)。基于抗炎试验,euphanes3- - - - - -8显示选择性抑制il - 6在剂量依赖性的方式很少或根本没有影响TNF-αtirucallane相比2表现出强烈抑制il - 6和TNF-α。证据确凿的,特异表达il - 6可能导致反应的免疫反应,从而导致不利后果。抑制il - 6显然是一个很好的策略来应对IL-6-associated特异表达类风湿性关节炎等疾病。鉴于TNF-α和il - 6各有自己的独立的角色,他们,然而,往往是本着合作的精神共同监管和功能在许多方面的免疫反应。,这并不让人感到意外,大多数报告直到现在抑制il - 6和il - 6抑制剂TNF-α作为一个整体,tirucallane2这里是(图7 a, B)。尽管困境,新孤立三萜大肠neriifolial,especially compounds4和8,有选择性地抑制il - 6特异表达免疫反应。总之,我们的研究有助于扩大的抗炎化合物来源于知识大肠neriifolial
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以发现:https://www.ccdc.cam.ac.uk/-、2208741、2208741。
作者的贡献
SC、H-TH wang, I-WL、Y-CL C-HC:执行隔离和生物测定的实验。I-WL、Y-CL J-JC, C-CL:阐明化学结构和写论文。G-YL wang, Y-CS:分析和解释生物测定数据。I-WL G-YL,几率,C-CL:写论文。的几率,L-TL C-JT, C-CL:建议在实验和修正。C-JT、Y-HK C-CL:构思和设计实验和编辑。C-CL:融资收购。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作得到了科技部、中华民国(大多数111 - 2321 - b - 077 - 001)。
确认
作者真诚地感谢所有实验室的所有成员,Y-HK, Y-CL和C-CL支持和帮助这个研究。他们也感谢国立台湾师范大学的仪器中心的单晶x射线衍射测量。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或那些出版商编辑和评论员。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fchem.2023.1223335/full补充材料
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关键词:大戟属植物neriifolial,大戟属植物ceae, neritriterpenols, euphane, tirucallane, anti-inflammatory activity
引用:Chang党卫军,黄谷岩,含水量,瞧我,林Y-C,曹国伟碳氢键,廖G-Y,沈Y-C,陈j j,李T-L,林L-T,郭大C-J Y-H euphane和Liaw碳碳(2023)抗炎效应,tirucallane-type三萜烯与传统草药大戟属植物neriifolial前面。化学。11:1223335。doi: 10.3389 / fchem.2023.1223335
收到:2023年5月16日;接受:2023年6月14日;
发表:2023年6月23日。
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