小说类C14-sulfonate-tetrandrine衍生品作为潜在的肝细胞癌的化疗药物
太白江
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Zhirui曾
俊杰局域网
Tengxiang陈- 1基础医学院/国家重点实验室的药用植物的功能和应用,对天然产物化学重点实验室贵州省和中国科学院,中国,贵阳,贵州医科大学
- 2中医学院制药、贵州大学、贵阳,中国
- 3贵州省级重点实验室常见的慢性疾病,发病机制和药物研究生理基本医疗科学学院,贵州医科大学、贵阳,中国
- 4药房、贵州省人民医院,贵阳,中国
- 5精密医学研究所的贵州,贵州医科大学附属医院,贵阳,中国
- 6制药科学学院、贵州大学、贵阳,中国
肝细胞癌(HCC),最常见的肝脏恶性肿瘤,展品高复发和转移。结构修改的自然产品是抗肿瘤药物的重要资源。本研究旨在合成碳14的导数汉和评估其对肝癌的影响。四十碳14磺酸盐汉衍生物及其合成在体外抗增殖是评估对四个肝癌(HepG-2 smmc - 7721, qgy - 7701和SK-Hep-1)细胞系。对所有测试细胞,大部分的修改比铅化合物化合物更加活跃,汉。(特别是14-O) - 5-chlorothiophene-2-sulfonyl汉(33)表现出最强的抗增殖效果,half-maximal抑制浓度的值1.65,2.89,1.77,2.41分别μM四的肝癌细胞系。此外,33发现诱导细胞凋亡通过mitochondria-mediated内在途径通过流式细胞术和免疫印迹分析。此外,集落形成、伤口愈合和transwell化验证明33显著地抑制HepG-2和smmc - 7721细胞增殖,迁移和入侵,表明它可能是潜在的候选人anti-HCC疗法在未来。
1介绍
肝癌展品第二个全球所有癌症中死亡率最高(唱et al ., 2021;西格尔et al ., 2022)。肝细胞癌(HCC)占> 90%的肝癌病例。根据治疗指南,建议早期肝切除和移植,和化疗和射频消融术是晚期肝癌患者推荐(刘c . et al ., 2015;Dimitroulis et al ., 2017)。目前,常用的肝癌治疗药物在临床实践中包括化疗药物(5 -氟尿嘧啶、铂和阿霉素)和靶向药物(索拉非尼和lenvatinib) (金正日et al ., 2017)。尽管显著进步与化疗和靶向治疗肝癌的治疗,许多患者经历复发,有毒副作用和耐药性(Anwanwan et al ., 2020)。此外,高成本的靶向药物对肝癌患者一个沉重的负担。因此,有必要发展新的有效,便宜anti-HCC药物。天然小分子化合物具有结构和功能的多样性。他们开发新药物的重要来源(Rishton 2008)。临床常用药物的很大一部分是直接或间接来自天然化合物。药物来源于天然产物及其衍生物占全球总数的10%和23%小分子抗肿瘤药物,分别在过去30年(纽曼和克拉格,2020年)。天然产品仍然是最有希望的途径之一,为未来抗肿瘤药物开发。
汉,孤立和确定了从野生抚育摩尔在1930年代,对该类碎片丰富是一种生物碱组成的两个耦合的两个醚键形成不规则eighteen-membered环(Bhagya Chandrashekar, 2016)。这是一个潜在的抗癌生物活性分子(Bhagya Chandrashekar, 2022),抗炎(高et al ., 2016)、氧化剂(施et al ., 1995),抗菌(易et al ., 2022)和其他药理属性(海斯特和波斯顿2020)。研究表明,汉能诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤效果,包括活性氧激活(林et al ., 2016),一种蛋白激酶的抑制/ forkhead盒O3a信号通路(Zhang et al ., 2015)和信号传感器和转录激活三个磷酸化(马et al ., 2015)。由于其优良的抗肿瘤活动,许多研究人员都集中他们的努力在汉发现新的抗肿瘤药物的结构修饰的候选人。汉的结构改性主要集中在两个站点,c - 5和碳14,一些金融衍生品可以是增强的抗肿瘤活性通过引入卤素和烷基组在这些位置(吴et al ., 2013;魏et al ., 2016)。同样的效果可以通过将叔胺氮转换为季胺氮形成季盐在这两个网站(李et al ., 2017)。
以前,我们组合成一系列取代基的碳14汉衍生品,包括尿素、硫脲、酰胺碎片。在体外筛查抗肿瘤活性表明这些化合物表现出良好的抑制效应在不同肿瘤细胞系,包括肝细胞癌(MHCC97L和PLC /脉冲重复频率/ 5)(局域网et al ., 2017)、白血病(冥界和K562)、乳腺癌(mda - mb - 231),前列腺癌(生物)和黑色素瘤(WM9) (局域网et al ., 2018;歌et al ., 2018)细胞系。然而,我们合成的活性化合物结构来自C14-amino-tetrandrine。尽管他们潜在的抗癌药物,这些衍生品的生物利用度低,水溶性差,这限制了它们的进一步发展。因此,我们希望能够改变这些不良的情况下通过修改碳14替换。磺酰群体通常以稳定的结构和高极性。引入磺酰组织可以减少pKa价值和增加目标衍生品的生物利用度而改变他们的生物活性(Jamieson et al ., 2006)。此外,磺酰团体可以提供两个氢键受体,这有利于提高ligand-protein交互。最近,高等人报道,C7-O-sulfonate-d-tetrandrine衍生品显示潜在的抗癌特性在人类肺癌细胞在体外(高et al ., 2021)。
鼓励我们之前研究的结果和相关文献,我们一直致力于修改碳14的位置汉发展小说anti-HCC药物候选人。在这项研究中,我们设计并合成了一系列sulfonate-substituted汉衍生品和评估他们对HepG-2增殖抑制的影响,qgy - 7701, SK-Hep-1 smmc - 7721肝癌细胞系。导数33显示明显高于anti-HCC活动相比,汉。我们也进行了初步研究探讨可能的抗癌机制33。
2材料和方法
2.1化学
2.1.1一般信息
汉(纯度≥98%)是购自南京京珠生物技术有限公司有限公司(中国南京)。所有试剂和溶剂都来自商业公司,金刚石(上海,中国)和能源化工(上海,中国),并使用没有额外的净化,除非另有说明。无水二氯甲烷(DCM)蒸馏前干/氢化钙在氩气氛。列色谱仪充满了300 - 400目硅胶(青岛海洋化工有限公司、青岛、中国)和筛选了使用二氯甲烷,甲醇和二乙胺。薄层色谱法(TLC;0.25毫米;GF254;青岛海洋化工有限公司、青岛、中国)是用于监控反应,紫外线(254海里)或10%磷钼酸/乙醇被用于可视化。力量皇冠三世600 MHz光谱仪(力量Biospin, Billerica,美国)被用来收集核磁共振(NMR)谱(1H,13C,19F)。高分辨率质谱得到使用热科学问Exactive焦点(热科学问Exactive聚焦)。熔点测定使用WRX-4微熔点仪(Tansoole、上海、中国)。
2.2的方法合成
2.2.1合成过程制备C14-nitro-tetrandrine (M1)
浓硝酸(68%,7毫升,56更易)添加一滴一滴地,乙酸酐(10毫升,105.6更易)在0°C获得混酸。然后,混酸(15毫升)慢慢加入汉的溶液(5克,8.03更易)在DCM(25毫升)在0°C。反应监测通过TLC每10分钟,直到完成。饱和水的反应就熄了碳酸氢钠和提取DCM(3毫升×300毫升)。用无水硫酸钠干燥结合有机分数,其次是过滤和真空浓缩。C14-nitro-tetrandrine得到通过硅胶柱层析法使用DCM /甲醇(50/1 v / v, 0.5% DEA)。淡黄色无定形固体(95%的收益率,纯度> 95%,高效液相色谱法)。议员:176.2°C。1核磁共振(600 MHz, CDCl3)δ:7.41(年代,1 h), 7.37 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 7.12 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 6.77 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 6.54(年代,1 h), 6.52(年代,1 h), 6.30 - -6.28 (2 h, m), 5.98(年代,1 h), 3.98(年代,3 h), 3.90 (dd,J= 10.8,6.0赫兹,1 h), 3.75(年代,3 h), 3.66 (dd,J= 13.8,10.8赫兹,1 h), 3.50 (d,J3.45 - -3.40 = 10.8赫兹,1 h) (m, 1 h), 3.37(年代,3 h), 3.30 - -3.23 (m, 2 h), 3.18(年代,3 h), 2.98 - -2.92 (m, 1 h), 2.90 - -2.82 (m, 3 h), 2.76 - -2.68 (m, 2 h), 2.63(年代,3 h), 2.54 (dd,J= 13.2,1.8赫兹,1 h), 2.33 (dd,J= 16.8,4.8赫兹,1 h), 2.21 ppm(年代,3 h)。13理化性质(CDCl3,150 MHz)δ:152.4,152.2,151.5,148.7,148.3,146.6,144.3,143.6,137.6,136.5,133.1,130.5,130.5,129.0,128.2,127.8,121.6,121.5,121.4,119.9,117.3,112.6,108.3,105.9,63.7,61.8,60.4,56.4,55.8,55.8,45.4,43.3,42.7,41.6,38.0,36.9,25.4,21.6 ppm。HRESI-MS:m / z668.2987 [M + H]+,计算出C38H42N3O8:668.2966。
2.2.2合成过程制备C14-amino-tetrandrine (M2)
C14-nitro-tetrandrine溶液(5克,7.5更易)在甲醇添加5%钯碳(200毫克,湿ca。55%水),和混合物加热到80°C的保护下氩。水合肼(37.5 85%,12.5毫升,更易)补充道,反应混合物搅拌后60分钟。完整的转换,钯碳过滤棉,甲醇被移除在真空内。残渣溶解在DCM,用饱和氯化钠溶液(3毫升×200毫升),并对无水硫酸钠干燥。有机分数被集中在真空内,C14-amino-tetrandrine通过硅胶柱层析法使用DCM /甲醇(30/1 v / v, 2% DEA)。白色无定形固体(93%的收益率,纯度> 95%,高效液相色谱法)。议员:164.7°C。1核磁共振(600 MHz, CDCl3)δ:7.28 - -7.27 (m, 1 h), 7.18 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 6.60 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 6.50(年代,1 h), 6.46(年代,1 h), 6.31(年代,1 h), 6.29(年代,1 h), 6.12 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 5.87(年代,1 h), 3.95 (d,J= 9.0赫兹,1 h), 3.88(年代,3 h), 3.77 (dd,J= 11.4,5.4赫兹,1 h), 3.74(年代,3 h), 3.68 - -3.62 (m, 1 h), 3.46 - -3.41 (m, 1 h), 3.34(年代,3 h), 3.21 (dd,J= 12.6,5.4赫兹,1 h), 3.11(年代,3 h), 3.05 (dd,J= 14.4,9.0赫兹,1 h), 2.94 - -2.83 (m, 4 h), 2.74 (t)J2.67 - -2.65 = 11.4赫兹,1 h) (m, 1 h), 2.59(年代,3 h), 2.42(年代,3 h), 2.39 - -2.33 ppm (m, 2 h)。13理化性质(CDCl3,150 MHz)δ:156.7,151.8,149.5,148.8,148.6,144.4,142.1,141.0,138.2,133.4,132.7,129.4,128.3,127.9,127.5,122.8,122.2,121.5,121.0,120.6,120.4,112.4,105.9,100.7,64.4,61.7,60.0,56.3,55.7,55.6,45.1,43.4,42.5,41.0,40.1,39.0,24.8,20.7 ppm。HRESI-MS:m / z638.3225 [M + H]+,计算出C38H44N3O6:638.3245。
2.2.3合成过程制备C14-hydroxyl-tetrandrine (M3)
C14-amino-tetrandrine的解决方案(10更易,1.0枚。)在硫酸(2米,50毫升),NaNO2(10.5更易,1.05 eq)慢慢加入准备重氮盐在0°C。反应是监控使用淀粉碘化钾试纸,直到反应是完整的。新鲜的重氮盐在慢慢掉进硫酸(10米,50毫升)在110°C,监控通过薄层色谱,反应是在30分钟完成。过量的硫酸和20%氢氧化钠中和在冰水里,8和9,pH值调整。与DCM的水相萃取三次,有机相结合,用水洗了三次。有机相的恢复通过与无水硫酸钠脱水和干燥,过滤,集中在减少压力。C14-hydroxyl-tetrandrine得到通过硅胶柱层析法使用DCM /甲醇(50/1 v / v, 0.5% DEA)。白色无定形固体(61%的收益率,纯度> 95%,高效液相色谱法)。议员:216.9°C。1核磁共振(600 MHz, CDCl3)δ:12.54(年代,1 h), 7.28 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 7.20 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 6.57 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 6.53(年代,1 h), 6.48(年代,1 h), 6.37(年代,1 h), 6.31(年代,1 h), 6.15 (dd,J= 8.4,2.4赫兹,1 h), 5.90(年代,1 h), 3.92 (d,J= 9.6赫兹,1 h), 3.89(年代,3 h), 3.77 - -3.74 (m, 4 h), 3.64 - -3.58 (m, 3 h), 3.48 - -3.43 (m, 1 h), 3.39(年代,3 h), 3.22 (dd,J= 12.6,5.4赫兹,1 h), 3.14(年代,3 h), 3.08 (dd,J= 14.4,9.6赫兹,1 h), 3.02 - -2.84 (m, 4 h), 2.76 (t)J2.72 - -2.68 = 12.0赫兹,1 h) (m, 1 h), 2.58(年代,3 h), 2.49(年代,3 h), 2.48 - -2.42 ppm (m, 2 h)。13理化性质(CDCl3,150 MHz)δ:157.3,152.5,152.2,149.2,149.0,148.6,143.7,141.9,138.0,133.5,132.8,129.3,128.5,127.8,126.9,121.6,121.1,120.9,120.7,120.1,119.8,112.2,105.5,101.6,64.5,61.4,60.3,56.2,55.8,55.5,53.4,45.1,42.9,42.5,40.3,39.7,39.0,24.7,20.6 ppm。HRESI-MS:m / z639.3062 [M + H]+,计算出C38H43N2O7:639.3065。
2.2.4一般程序第1 - 40 C14-O-sulfonyl-tetrandrine衍生品的准备
C14-hydroxyl-tetrandrine(0.079更易,1.0枚),1-ethyl——(3-dimethylaminopropyl)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI 0.1185更易与1.5电化学当量),和4-dimethylaminopyridine(更易与深度贴图,0.0158,0.2枚。)溶解在无水DCM(2毫升)在氩气氛下,混合物冷却到0°C。更易与磺酰氯(0.1185,1.5枚。)在慢慢添加在这个温度下,反应混合物是搅拌30分钟。然后,在反应混合物加热至25°C和搅拌16 h。反应就熄了的冰水(5毫升)。随后,有机相的恢复通过与无水硫酸钠脱水和干燥,过滤,集中在减少压力。将所需的产品通过硅胶快速柱层析法纯化的残留物从DCM /甲醇(60/1 v / v, 1% DEA)。详细的核磁共振(1H,13C,19F)和高分辨率质谱数据40汉衍生品中可以找到补充材料。
2.3生物化验
2.3.1细胞培养
所有肝癌细胞系(HepG-2 smmc - 7721、SK-Hep-1 qgy - 7701)从Procell获得生活科技有限公司有限公司(武汉,中国)。所有的细胞系生长在10%胎牛血清的边后卫杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;美国Gibco)补充链霉素和青霉素(Solarbio,北京)湿润5%二氧化碳培养箱在37°C。
2.3.2细胞生存能力分析
(3)- 4 5-dimethyl-thiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)进行分析来确定half-maximal抑制浓度(IC50HepG-2)值,smmc - 7721, SK-Hep-1, qgy - 7701细胞。四个logarithmic-growing细胞系被播种在96孔培养板5000细胞/好,允许遵循前12 h测试药物补充道。没有或不同浓度的细胞治疗(0.625、1.25、2.5、5、10、20µM)化合物的48 h,之后20µL MTT试剂添加到每个和孵化进一步4 h在37°C。96孔板中的介质是丢弃,甲瓒晶体溶解在二甲亚砜(150µL),以及由此产生的解决方案是评估在490 nm吸光度。
2.3.3集落形成实验
HepG-2和smcc - 7721 (1.0×103)细胞接种到six-well板和处理不同浓度(0,1,2,4μM)33。它孵化37°C 2 - 3周有5%二氧化碳和饱和湿度和宏观克隆板上形成时删除。立即移除后上层清液,细胞被洗两次与磷酸盐(PBS)和多聚甲醛(Servicebio、武汉、中国)执行固定15分钟。与0.1%的结晶紫染色后5分钟在室温下,殖民地可视化光学显微镜下(×4放大)。
2.3.4伤口愈合实验
HepG-2和smmc - 7721细胞接种在six-well板和生长,直到汇合的单层被观察到。一夜之间,细胞被serum-starved治疗前200μL带头创建一个伤口在单层细胞。碎片被洗涤了PBS,新鲜low-serum(2%的边后卫)DMEM取而代之33(0,1,2,4μM)。伤口关闭图像获得使用光学显微镜从0到48 h。
2.3.5 Transwell化验
培养HepG-2和smmc - 7721细胞与基底膜基质膜上transwell resuspended室5×10的密度4/与400μL血清DMEM和低transwell室挤满了600μL DMEM 10%的边后卫。然后两个细胞系处理不同浓度(0,1,2,4μM)33。48小时后,细胞迁移的底部插入膜固定和沾0.5%结晶紫20分钟。最后,用倒置显微镜、照片的入侵细胞。
2.3.6流式细胞术分析
膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / propidium碘(PI)从Absin凋亡分析工具(上海,中国)被用来衡量凋亡细胞的数量。HepG-2 six-well板和smmc - 7721细胞治疗与不同浓度(0,1,2,4μM)化合物33。24小时孵化后,细胞被洗了三次PBS和沾染了PI膜联蛋白V-FITC后24 h。结果测定使用安捷伦科技流式细胞分析仪(安捷伦,美国)和分析使用NovoExpress 1.6.0(版本)。
2.3.7免疫印迹
HepG-2和smmc - 7721细胞总蛋白提取使用放射免疫检定法沉淀溶解缓冲区包含1%氟化phenylmethylsulfonyl裂解缓冲(Servicebio,武汉,中国)。Bicinchoninic酸(Solarbio,北京)蛋白质分析是用来确定样品的蛋白浓度。蛋白质分离使用10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(Servicebio,武汉,中国)和转移到聚乙二烯二氟化物膜(热科学、美国)。膜被5%的脱脂奶粉,主要添加了抗体,隔夜孵化是在4°C。主要的抗体使用Bcl-2-associated X(伯灵顿),细胞lymphoma-2 (bcl - 2), caspase-3,细胞色素C, anti-glyceraldehyde 3 -磷酸脱氢酶。膜进一步二级抗体室温孵育,紧随其后的是洗PBS。一个Bio-Rad ECL化学发光的染色工具(Bio-Rad)用于可视化蛋白质乐队和确定它们的密度。
2.4统计分析
所有实验数据报告为三个独立实验的平均值加上均值的标准误差和分析使用GraphPad棱镜软件(8.0.2版本)。实验和对照组之间的差异进行了分析使用单向方差分析。p< 0.05被认为是具有统计学意义。
3结果与讨论
3.1合成汉的衍生品
在这项研究中,我们关注汉衍生品的设计和合成磺酸酯替代碳14,探索对四个肝癌细胞系的生物活性。所示方案140衍生品汉被合成。汉的苯环含有多个甲氧基组,使其电子丰富和容易发生亲电反应。首先,选择性C14-nitrification汉是由混合浓硝酸和乙酸酐在0°C形成汉的硝基衍生物(M1)。然后,快速和高效的减少M1来平方米实现了在甲醇使用水合肼作为还原剂和钯碳催化剂。随后,M3是来自平方米通过重氮盐的氧化水解中间产物。M3当时与磺酰氯反应,EDCI,深度贴图给C14-sulfonyl-tetrandrine导数在温和的收益率(29% - -89%)。
方案1。汉衍生品的一般合成路线。(我)混合酸HNO3(CH3有限公司)2O = 3:5, v / v), CH2Cl20°C, 45分钟(2)Pd / C (10%)、N2H4⋅H2O,甲醇,80°C, 1 h (iii) 1) 2 M h2所以4、纳米2,0°C, 10分钟;2)10 M H2所以4110°C, h (iv)磺酰氯(RSO2Cl) 1-ethyl——(3-dimethylaminopropyl)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI) 4-dimethylaminopyridine(深度贴图),以0°C, 8 h。
3.2生物评价
3.2.1之上在体外抗癌活性
抗肿瘤活性评估使用MTT测定合成汉衍生品第1 - 40()对四个人类肝癌细胞株,即HepG-2 Sk-Hep-1 smmc - 7721和qgy - 7701细胞系。5 -氟尿嘧啶和汉被用作积极的控制标准。所示表1与汉相比,70%的衍生品对四个肝癌行显示显著的抑制活性。复合33是最有效的,集成电路吗50值为1.65±0.05,2.89±0.12,1.77±0.05,2.41±0.08μM兑四肝癌细胞株,分别。值得注意的是,33有超过20倍anti-HCC扩散效果的5 -氟尿嘧啶相比,常用抗癌药物在临床设置。因此,33被选为进一步测试其生物活性。验证的增殖抑制33在肝细胞肿瘤,我们选择HepG-2和smcc - 7721细胞集落形成试验。从图1,可以看出能力显著降低肝细胞肿瘤形成的殖民地政府的浓度增加,表明33具有抗增殖影响HepG-2和smcc - 7721细胞。
表1。研究化合物的细胞毒性活动对HepG2 Sk-Hep-1 smmc - 7721, qgy - 7701细胞。
图1。复合33抑制肝细胞癌(HCC)细胞增殖在体外。(一)HepG-2和smmc - 7721细胞处理不同浓度(0,1,2,4μM)化合物33分析集落形成。(B)数据被表示为平均值±标准平均误差(SEM)三个独立的实验。*p< 0.05,* *p< 0.01。
基于集成电路5040衍生品,以上结果的初步构效关系(SAR) C14-sulfonate-tetrandrine分析进行了分析。在这项研究中,我们取代磺酰氨基磺酸盐集团首次在汉的碳14位置根据bioisostere原则,发现这些小说衍生品是抗肿瘤活性显著增强相比原型化合物。我们假设不同的取代基对磺酸盐组可能会影响化合物的anti-HCC活动。然而,取代苯环上的取代基吸电子或电子基的取代基磺酸盐对衍生品抗肿瘤活性几乎没有影响。有趣的是,化合物29日,与三异丙基取代基对苯环磺酸盐组,表明选择性smcc - 7721细胞在四个肝癌细胞株,而复合28用类似的替代结构,显示显著的抑制活性对四个肝癌细胞株。对化合物30.- - - - - -33磺酸盐衍生品与杂环替换显著增强的抗肿瘤活性,5-chlorothiazole磺酸盐衍生物,化合物33显示,40之间的最佳抑制活动衍生品对四个肝癌细胞株。不幸的是,取代基脂肪族磺酸盐组有限效应增强的抗肿瘤活性。实际上,这些化合物的结构与活性关系的更多细节需要在将来的研究中进一步说明。
3.2.2迁移和入侵检测
肿瘤转移是一个多步骤、多因素和极其复杂的过程。虽然不同肿瘤的转移特点各有不同,一些关键步骤的转移过程本质上是相同的,迁移和入侵是最常见的特征(Zeeshan和穆,2017)。有证据表明,汉不仅可以抑制人肝癌细胞的转移,但也抑制不同的人类肿瘤细胞的迁移和入侵,如前列腺癌、肾癌、直肠癌腺癌(刘w . et al ., 2015;陈et al ., 2017)。进一步调查汉衍生品在肝癌转移的影响,化合物的影响33HepG-2和7721个细胞的迁移和入侵。进行愈合化验检查抑制smmc - 7721和汉HepG-2细胞迁移的衍生品。所示图2,划痕区域几乎是覆盖在对照组48 h后,伤口愈合率为69±1.4和63±3.1%,分别。相比之下,细胞治疗33显示缓慢复苏的挠地区增加浓度(1、2和4μM)。此外,细胞入侵是评估使用标准transwell HepG-2和smmc - 7721细胞的分析。在所有浓度测试,33显著抑制入侵HepG-2和smmc - 7721细胞。与对照组相比,添加4μM33显著降低入侵HepG-2和smmc - 7721细胞的数量从644±35和475±21到161±22岁至49岁±14日。这些结果表明,33抑制HepG-2的迁移和入侵和smmc - 7721肝癌细胞在体外。
图2。复合33抑制肝癌细胞的能动性在体外。(A, B)HepG-2和smmc - 7721细胞处理不同浓度(0,1,2,4μM)33分析伤口愈合。(C)入侵细胞数进行了分析使用transwell HepG-2和smmc - 7721细胞中测定不同浓度处理(0,1,2,4μM)化合物33。*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。
3.2.3凋亡分析
积极参与细胞凋亡的过程中,起着至关重要的作用在肿瘤细胞的破坏、基因控制。大多数天然药物及其衍生物诱导癌细胞凋亡(Sadeghi et al ., 2019;Ashrafizadeh et al ., 2020)。检查凋亡活性化合物33在HepG-2和smmc - 7721细胞。膜联蛋白V-FITC / PI双染色。所示图3,细胞凋亡的增加存在剂量依赖的相关性观察治疗后的两个细胞系33,HepG-2细胞的凋亡比例改变从3.05到6.39,12.49和16.76%,和smcc - 7721凋亡比例的改变从2.25到8.78,22.17和28.73%,分别。这些结果表明,诱导细胞凋亡可能是一个潜在的作用机制33对其抗增殖活动。
图3。复合33诱发肝癌细胞的凋亡在体外。(一)HepG-2和smmc - 7721细胞的细胞凋亡与不同浓度(0,1,2,4μM)33分析了通过流式细胞术。(B)。基于三个独立的实验中,GraphPad棱镜软件(8.0.2版本)被用来量化凋亡细胞的比例。三个独立实验的结果提出了均值±SEM。*p< 0.05,* *p< 0.01。
3.2.4免疫印迹
基于流式细胞术结果,复合33可以诱导肝癌细胞的凋亡。有趣的是,多个蛋白质可以参与凋亡信号通路。根据半胱天冬酶的启动细胞凋亡可分为三个基本途径,死亡受体、线粒体和内质的reticulum-mediated细胞凋亡(爱尔摩,2007)。Pro-apoptotic因子,细胞色素C中起着重要作用(Pistritto et al ., 2016)。此外,线粒体凋亡是由pro-apoptotic蛋白质伯灵顿和抗凋亡蛋白bcl - 2。阐明细胞凋亡的机制33HepG-2和smmc - 7721细胞,测定凋亡诱导蛋白的水平通过西方墨点法。总细胞溶解产物准备治疗后免疫印迹分析33(0,1,2,4μM) 48 h。如图所示图4一,减少bcl - 2蛋白表达水平和伯灵顿的增加和细胞色素C蛋白表达水平后被观察到33治疗,表明线粒体和内质网功能可能会中断,导致细胞色素C的释放。通过mitochondrial-mediated机制,33监管在HepG-2和smmc - 7721细胞凋亡。通过释放细胞色素C, caspase-9被激活,然后激活其他下游分子,如caspase-3,导致细胞死亡的最终执行阶段。调查是否裂解caspase-3也参与HepG-2和smmc - 7721细胞凋亡的诱导33免疫印迹分析进行确定的水平caspase-3分开。见图4 b,裂解caspase-3水平增加剂量依赖性的方式。此外,33诱导HepG-2和smcc - 7721细胞的细胞凋亡是一个caspase-mediated凋亡途径。
图4。复合33诱发HepG-2和smmc - 7721细胞的细胞凋亡通过线粒体途径。(一)西方墨点法透露,33增加线粒体通路在HepG-2和smmc - 7721细胞蛋白表达。(B)免疫印迹结果统计使用GraphPad执行的软件(8.0.2版本)。三个独立实验的结果提出了均值±SEM。*p< 0.05,* *p< 0.01。
4结论
总之,C14-hydroxyl-tetrandrine中间体得到第一次40汉衍生品设计和合成及其抗肿瘤活动进行评估与四个肝癌细胞株在体外。引入磺酸盐组改善汉对四个肝癌细胞株的细胞毒性。其中,化合物33发挥最好的活动对肝癌细胞,与集成电路50值为1.65±0.05,2.89±0.12,1.77±0.05,2.41±0.08μM四肝癌细胞株,分别是5 -氟尿嘧啶的20多倍,常用anti-HCC药物在临床实践中。33诱导HepG-2和smmc - 7721细胞的细胞凋亡,这可能是有关caspase-dependent引起的线粒体凋亡途径。此外,33抑制增殖、迁移和入侵HepG-2和smmc - 7721细胞通过克隆形成、划痕和入侵检测。的作用机制的更多细节33针对HepG-2和smmc - 7721细胞通过增殖、迁移和入侵检测。因此,C14-sulfonate-tetrandrine衍生品33可能是一个潜在的候选人小说反人类肝癌细胞疗法的发展。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到相应的作者。
作者的贡献
WP和TC的构思和设计实验。TJ和GX的合成、纯化和表征目标化合物。TJ,杰和霍奇金淋巴瘤在体外生物的研究。TJ写的手稿。人力资源、ZZ和JL纠正语言和修订后的手稿。所有作者批准提交的版本出版。
资金
这项工作是由中国国家自然科学基金资助(81960635),贵州省科学技术部门(QKHJC-ZK(2021) 558年,QKHZC (2022) YB125]和贵州省人民医院人才基础[YRCXM (2022) -24)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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关键词:汉衍生品、磺酸盐衍生物,anti-migration anti-HCC细胞凋亡
引用:江T,谢G,曾庆红Z,局域网J,刘H,李江,陈任H, T和潘W(2023)小说类C14-sulfonate-tetrandrine衍生品作为潜在的肝细胞癌的化疗药物。前面。化学。10:1107824。doi: 10.3389 / fchem.2022.1107824
收到:2022年11月25日;接受:08年12月2022;
发表:2023年1月10日。
编辑:
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